07-08.03.

2013
1
MEDICAMENTE BIOLOGICE
CURS 2
ef lucr. dr. Codru#a Maier
07-08.03.2013
Obiective
Definirea termenilor
Metode de ob#inere a medicamentelor biologice
Extrac#ia din organe
Inginerie genetic%
Hibridarea celular%
Tehnologia ADN recombinant
Animale/plante transgenice
Librarii de bacteriofacgi
07-08.03.2013
2
Tehnologia ADN recombinant
Codul genetic informa#ia genetic% con#inut% n ADN
Codon triplet de nucleotide ce contine informa#ia despre sinteza
unui aminoacid (64 codoni)
Codul genetic este universal
Bazele din structura ADN
Purinice
Adenina (A) (i guanina (G)
Pirimidinice
Timina (T) (i citozina (C)
Tehnologia ADN recombinant
Organizarea genomului
De tip procariot
ADN cromozomial
Citoplasma
Ribozomi
Plasmida
Membrana celular%
Flageli
De tip eucariot
Nucleu
Citosol
Reticul endoplasmatic
Aparat Golgi
Ribozomi
Mitocondrii
Membrane interne
Vacuole
Centrioli
07-08.03.2013
3
Tehnologia ADN recombinant
ADN-ul recombinant este o form% de ADN artificial modificat
prin inser#ia uneia, sau mai multor por#iuni de ADN,
respectiv combinarea unor secven#e de ADN care nu se
g%sesc n mod normal mpreun%
Tehnologia ADN recombinant. Principiu
ORGANISM DONOR VECTOR = transportor ADN
Ineser*ia fragmentului ADN ntr-o
molecul% vector
Ob*inerea AND-ului recombinant
Extrac*ia ADN-ului +i fragmentarea n
por*iuni ce con*in genele de interes
Fragment ADN capabil capabil de
replicare autonom%
Combina*ie nou% de ADN provenit dintr-un genom donor (orice organism) +i ADN-
ul vectorului care poate fi de origine complet diferit%
07-08.03.2013
4
Tehnologia ADN recombinant
Elemente implicate
Gena de interes
Fragment ADN ce cuprinde secven#a de nucleotide corespunz%toare
produsului polipeptidic de interes
Enzime
Intervin n metabolismul acizilor nucleici
Vectorul de clonare (vehiculul)
Structur% ADN ce poate fi acceptat% de un organism gazd% ce are
capacitatea de a se replica autonom
Receptorul = celule gazd%
Celule cu rol de a accepta ADN-ul recombinant
Tehnologia ADN recombinant
Enzime
Endonucleaze de restric#ie de tip II
ADN ligaze
ADN polimeraza I (E.coli)
Reverstranscriptaza
Polinucleotidkinaza
Transferaza terminal%
Exonucleaza
Bacteriofag , exonucleaz%
07-08.03.2013
5
Tehnologia ADN recombinant
Enzime
Endonucleaze de restric#ie
De tip I, II (i III
Tip I (i III
Mari, structuri complexe cu multe subunit%#i, scindeaz% ADN n pozi#ii
aleatorii
Au nevoie de ATP
Tip II
Structuri simple, nu au nevoie de ATP, scindeaz% ADN la nivelul de
recunoa(tere
Recunosc secven*e de 4 pn% la 8 nucleotide
Sunt produse de c%tre bacterii
> 100 disponibile actual
Numele abrevierea speciei de la care provine
Endonucleaze de restricie
T * C G A Thermophilus aquaticus Taq I
C * C C G G G Xanthamonas malvacearum Xma I
G G * T C G A C Streptomyces albus Sal I
G A G C T * C Streptomyces stanford Sst I
C C C * G G G Serratia marcescens Sma I
C T G C A * G Providencia stuartii Pst I
*G A T C Moraxella bovis Mbo I
G G T A C * C Klebsiella pneumoniae Kpn I
G T T * A A C Haemophilus parainflenzae Hpa I
Rd A* A G C T T Haemophilus inflenzae Hind III
G C G * C Haemophilus haemolyticus Hha I
G G * C C Haemophilus aegyptius Hae III
* C C A/T G G Escherichia coli R245 Eco RII
RY 13 G* A A T T C Escherichia coli Eco RI
A* G A T C T Bacillus globigii Bgl II
G* G A T C C Bacillus amyloliquefaciens Bam HI
C* C/T C G A/G G Anabaena variabilis Ava I
Secven*a *int% Numele speciei bacteriene de origine Enzima
07-08.03.2013
6
Tehnologia ADN recombinant
Enzime de restric*ie
Caracteristici
Cea mai mare parte a situsurilor de recunoa+tere sunt secven*e
nucleotidice inversate +i repetate = extremit%*i coezive (sticky ends)
EcoRI: 5! GAATTC 3! / 3! CTTAAG 5!
T%ierea se face sub form% de cap%t superpozabil fie sub form% de cap%t
drept:
Tehnologia ADN recombinant
Enzime
ADN ligaze
Tip particular de enzime ce
Pot forma leg%turi fosfodiesterice covalente
-i pot ligatura sau conecta lan*urile ADN
07-08.03.2013
7
Tehnologia ADN recombinant
Vectorul de clonare element extracromozomial capabil s%
se multiplice (i s% exprime o gen% str%in% ata(at% de el in
vitro
Vectorul de clonare propriet%#i
Capacitate de replicare rapid% (i n num%r mare
Dimensiune ct mai redus%
S% nu con#in% gene generatoare de molecule nedorite
S% posede cel pu#in un marker genic
S% aib% n structur% un num%r limitat de locuri de clivare pentru
enzimele de restric#ie
S% con#in% elemente de reglaj
Tehnologia ADN recombinant
Vectori de clonare
Material extracromozomial capabil de replicare +i de a
exprima o gen% ata+at% de el in vitro
Plasmide bacteriene
Vectori virali (fagi)
Bacteriofagul ,
Bacteriofagul filamentos M13 RF
Cosmidele
Cromozomii artificiali de drojdie (YEC)
Cromozomi artificiali bacterieni (BAC)
07-08.03.2013
8
Tehnologia ADN recombinant
Vectori de clonare
Plasmide bacteriene = Molecule de
ADN circulare care se replic%
independent de cromozomul gazdei
Dimensiuni: 1 100 kb
Con#in gene de rezisten#% la antibiotice
(avantaj)
Origine de replicare ori (avantaj)
Pot fi inserate segmente mici de (<10 kb)
(dezavantaj)
P%trundere (i propagare bacterian%
ineficient% (dezavantaj)
Con#in gene de rezisten#% la antibiotice =
selectie
Tehnologia ADN recombinant
Vectori de clonare
Bacteriofagi = Fagi ,
Dimensiuni: 40 45 kb
Pot fi inserate fragmente ADN de
18 25kb (cantitate limitat% la
dimensiunea capsidei
bacteriofagului)
Materialul genetic recombinant
poate fi mpachetat in vitro n
particule fagice infec#ioase
(avantaj)
Cre(tere semnificativ% a eficien#ei:
1000X mai eficien#i dect
plasmidele (avantaj)
Fagi
07-08.03.2013
9
Tehnologia ADN recombinant
Vectori de clonare
Cosmide
Dimensiuni: ~8 kb
Con#in por#iunile cos ,:
semnalele de mpachetare a bacteriofagilor , ce permite
moleculelor de ADN recombinant s% fie asamblate n particule
infec#ioase
Pot fi inserate fragmente ADN de 30 48 kb
Con#in gene de rezisten#% la antibiotice = selectie
Origine de replicare ori
Tehnologia ADN recombinant
Receptori
Bacteria Escherichia coli
Primul organism folosit
Genom bine cunoscut
Metabolismul moleculei de ADN propriu
bine cunoscut
Exista numerosi vectori plasmidici utilizabili
Poate fi cultivat la scara mare in
fermentatoare
Nivele de expresie ridicate (cantitate
crescuta de proteine g/L)
Dezavantaje
Secretia redusa a proteinelor in mediul de
reactie
Contaminarea bacteriana
07-08.03.2013
10
Tehnologia ADN recombinant
Receptori
Drojdia Saccharomyces cerevisiae
Organism eucariot
Genom bine cunoscut (numai 14milioane
perechi de baze)
U(or de men#inut (i crescut la scar% de
laborator
Dezavantaje
Secretia redusa a proteinelor in mediul
de reactie
Randament mai redus
Alte celule eucariote
Celule CHO (chinese hamster ovary)
Cultura de masa in bioreactoare
Proteine complexe
Dezavantaje
Pret crescut
Randament redus
Tehnologia ADN recombinant
Etape ale clon%rii ADN:
Ob#inerea fragmentului de ADN
Clivarea ADN-ului donor
Preg%tirea vectorului de clonare
Legarea covalent% a celor dou%
fragmente de ADN
Selec#ionarea vectorului de
clonare (capabil de autoreplicare)
ADN-recombinant
Transferul ADN-lui recombinant
ntr-o celul% gazd%
Selectarea celulelor ce con#in
ADN-recombinant
Etapele clon!rii ADN
07-08.03.2013
11
Tehnologia ADN recombinant
Medicamente ob#inute prin tehnologia ADN recombinant:
Insulin% recombinant%
Interferon 2a recombinant, interferon 2b recombinant, interferon
1b recombinant, interferon 1b recombinant
Interleukina 2 recombinant%
Urokinaza recombinant%
Somatotropin% recombinant%
Factor VIII recombinant
Factor IX al coagularii
Eritropoetina umana recombinant%
Vaccin antihepatita B recombinant, etc.
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Transfer de gene mediat prin ADN
Animale/plante transgenice
Biblioteci de gene
07-08.03.2013
12
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Plante transgenice
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Animale transgenice
07-08.03.2013
13
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Animale transgenice
Se define(te ca fiind un animal n genomul c%ruia a fost inserat%
n mod deliberat o gen%. Gena str%in% este ob#inut% folosind
metoda ADN-ului recombinant.
Fragmentul ADN con#ine de obicei (i alte secven#e care i permit:
ncorporarea n ADN-ul gazdei
exprimarea corect% de c%tre celulele gazdei
Exist% dou% metode de ob#inere:
Metoda celulelor embrionice stem (EScell)
Metoda pronucleilor
Au fost ob#inute:
Capre (i oi transgenice exprim% proteinele str%ine n lapte
Pui transgenici exprim% proteinele str%ine n ou (partea alb%)
oareci transgenici anticorpi monoclonali, n cercetare
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Metoda celulelor embrionare stem (EScell) - etape
Cultivarea celulelor embrionare stem (CSE) pe medii de
cultur%
Ob#inerea fragmentului de ADN de interes, prin tehnica
ADN-ului recombinant
Modificarea celulelor stem embrionare prin ncorporarea
fragmentelor de ADN
Injectarea acestor celule n masa celular% interioar% (ICM) a
blastocitului murin
Transferul embrionului
Preg%tirea unui (oarece femel%, pseudogestant% (prin
mperecherea cu un mascul vasectomizat, ceea ce duce la
modific%ri hormonale f%cnd uterul receptiv schimb%rilor
ulterioare).
Transferul blastocitului modificat n uterul femelei
Testarea urma(ilor
Examinarea ADN-ului urma(ilor pentru identificarea genei
dorite
mperecherea urma(ilor homozigo#i = linie transgen%
Prelevarea celulelor
embrionare stemmodificate
Injectarea ICM
07-08.03.2013
14
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Metoda pronucleilor - etape
Ob#inerea fragmentului de ADN de interes
Modificarea ovulului fertilizat, care implic%
Prelevarea ovulelor recent fecundate n stadiul de
pronuclei
Injectarea pronucleului masculin cu fragmentul ADN
dorit
Men#inerea ovului n mediul de cultur% pn% la
ncheierea fuziunii pronucleilor (i ob#inerea nucleului
diploid
Transferul embrionului la o mam% adoptiv%
pseudogestant%
Testarea urma(ilor
Examinarea ADN-ului urma(ilor pentru identificarea
genei dorite
mperecherea urma(ilor homozigo#i = linie transgen%
Prelevarea ovulelor fecundate
Injectarea pronucleului
masculin
Tehnici derivate din tehnologia ADN
recombinant
Biblioteci de gene
Cele mai frecvente sunt bibliotecile de bacteriofagi
Genele care codific% proteinele dorite vor fi integrate n materialul
genetic al unui bacteriofag ducnd la exprimarea la suprafa#a
bacteriofagului a proteinelor ce alc%tuiesc regiunea variabil% a
anticorpilor.
Infectarea microorganismelor de E. coli
Are loc un proces complex de replicare cu ob#inerea unui num%r
semnificativ de bacteriofagi ce exprim% la suprafa#a lor proteina de
interes
Fagii sunt separa#i prin tehnici cromatografice de afinitate. Faza
sta#ionar% con#ine lizozim (i lizeaz% molecula fagului, concomitent cu
separarea, punnd n libertate proteinele de interes
Proteinele pot fi ulterior fuzionate cu alte fragmente proteice prin diferite
tehnici de biologie molecular%
Aplica#ii: ob#inerea anticorpilor monoclonali umani
07-08.03.2013
15
Bibliografie
**** - Reglement%ri privind autorizarea (i supravegherea produselor
biologice de uz uman, Buletin Informativ ANM
**** - Farmacopeea European%, edi#ia a IV-a, 2003
Dinu V, Tru#ia E, Popa Cristea E, Popescu A Biochimie Medical%. Mic
Tratat, Editura medical%, Bucure(ti, 2000
Mitrea N, Lupuleasa D, Andries A, Enoiu M Biotehnologii utilizate in
prepararea medicamentelor, vol.1, Editura Medicala, Bucuresti, 2001
Kuby D. Immunology. Academic Press, 2004
Fridman WH, Principles of the therapeutic use of monoclonal antibodies
in oncology, Acadmie des sciences. Elsevier SAS, C. R. Biologies 329,
2006
Andrew G, Urch C, Methods in Molecular Medicine, Diagnostic and
Therapeutic Antibodies, Humana Press, 2004
Walsh G, Biopharmaceuticals, Biochemistry and Biotechnology, Antony
Rowe Ltd, Chippenham, Wilts, 2007