Universidad Autnoma Benito Jurez de Oaxaca Facultad de Medicina y Ciruga

CIENCIA-ARTE-HUMANISMO

Biologa Molecular TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

Estudiante: Pacheco Lpez Nashielly Jessica Catedrtico: Lpez Martnez Jael Grado: 2 Grupo: G

Oaxaca de Jurez Oaxaca. Diciembre del 2012

INDICE UNIDAD 8 TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

Introduccin 8.1 Amplificacin de secuencias especficas (PCR) 8.2 Clonacin celular del DNA: 8.2.1 Enzimas de restriccin 8.2.2 Vectores de clonacin 8.3 Secuencia de cidos nucleicos 8.3.1 Mtodo enzimtico 8.3.2 Mtodo qumico 8.3.3 Hibridacin de secuencias especificas

INTRODUCCIN

Desde su nacimiento en la dcada de 1970, la tecnologa del DNA recombinante ha revolucionado la biologa Molecular. Hoy en da es posible alterar la manera precisa e intencionada la dotacin gentica de los organismos. La tecnologa del DNA recombinante es el fruto de varias dcada de investigacin bsica sobre DNA, RNA y virus. Se basa, en primera instancia, en la existencia de enzimas capaces de cortar, unir y replicar el DNA y de realizar la transcripcin inversa del RNA. Las enzimas de restriccin cortan molculas muy largas de DNA dando lugar a fragmentos especficos, fciles de manipular; las DNA ligasas unen los fragmentos entre s. Hay muchos tipos de enzimas de restriccin disponibles. Utilizndolos con habilidad, los investigadores pueden tratar las secuencias de DNA como si fuesen mdulos que se pueden mover a voluntad de una molcula de DNA a otra. Por tanto la tecnologa del DNA recombinante se basa en la enzimologa de cidos nucleicos. La tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible investigar ms a fondo la estructura y funcin de los genes, especialmente de los genes eucariticos que eran inaccesibles por otros mtodos. Estas investigaciones generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen profundas implicancias ticas. BIOQUIMICA, Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko 2008 pag. 138

8.1 Amplificacin de secuencias especficas (PCR) Considerando hoy en da como una herramienta imprescindible en el laboratorio de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica, el objetivo de esta tcnica es la amplificacin directa de un gen o un fragmento de DNA, o indirecta de un RNA, presentes mezclas de muy diversas fuentes, sin necesidad de una purificacin previa de la muestra integra original. Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987 quien gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento. Utilizo el PCR para amplificacin del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme. La PCR es un mtodo muy adecuado para preparar cidos nucleicos en una cantidad muy superior a la muestra original, tanto como mtodo de clonacin acelular como para la detencin. OBJETIVO BSICO DE LA PCR: amplificar DNA Amplificacin propiamente dicha: para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo, con fines diversos. Deteccin: para poderlo detectar en muestras con pequeas cantidades del DNA diana. Las aplicaciones de la PCR son muy numerosas y variadas. Como ejemplos: clonacin acelular de fragmentos de DNA, deteccin de secuencias sin purificacin previa, secuenciacin de cidos nucleicos, establecimiento de polimorfismos de secuencia, rastreo de mutaciones, tipado de DNA para trasplantes, diagnsticos de enfermedades genticas, etc. Principio del Mtodo La PCR es una metodologa resultante de la aplicacin prctica de tres conceptos: 1. Desnaturalizacin del DNA para dar hebras sencillas. 2. Hibridacin (etapa de templado) especfica de la hebra sencilla con un oligonucletido. 3. Replicacin de la hebra sencilla por una de DNA polimerasa a partir del oligonucletido anterior como cebador, tambin elongacin o extensin del cebador o polimerizacin. Mediante la aplicacin en forma cclica de estos tres procesos se consiguen mltiples copias del fragmento de cido nucledo en un corto espacio de tiempo. La PCR se realiza en un Thermo Cycler Termociclador. Es una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos
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cortos de tiempo. Se consigue amplificar secuencias de tamaos diversos, comprendidos entre 50pb y 2.5 kb.

Para la realizacin prctica se precisan en la mezcla de reaccin los siguientes reactivos: a) Los cuatro dNTPs, en exceso como sustratos para la sntesis de las innumerables copias de DNA. Acompaados de Mg2+ para su reconocimiento. b) Dos oligonucletidos de cadena sencilla oligos, generalmente sintticos, de 18 a 30 nt. Sus secuencias han de ser complementarias, de los extremos 3 de la regin diana, uno en cada hebra, de modo que los oligos puedan ejercer de cebadores para la replicacin de las dos hebras en la regin diana.

c) Una DNA polimerasa termoestable, enzimticamente activa a temperaturas relativamente altas (al menos 75C y estable con frecuencia hasta de 95C) impidiendo la formacin de hbridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso. La enzima ms empleada se llama polimerasa Taq (bacteria Thermus aquaticus). Etapas del proceso Se requiere una sucesin de ciclos generalmente entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de duracin cada uno de desnaturalizacin, hibridacin y replicacin, para conseguir una enorme amplificacin de nmero de molculas que contienen la secuencia de inters o diana. La duracin total es de alrededor de 2 horas, dependiendo de las condiciones experimentales concretas. 1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma. Templado (o hibridacin): enfriamiento rpido por debajo de Tm, de forma que se permite la hibridacin de las hebras sencillas del DNA de inters con los oligos cebadores. Generalmente se usan temperaturas de 37 a 65C que se mantienen entre 10 y 120s. Elongacin (o replicacin): etapa de la amplificacin propiamente dicha (72-75 C, 1-3 min), en la que la DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicacin transcurre en direccin 53
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a partir del extremo 3-OH de cada cebador, empleando como sustrato los cuatro dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de desnaturalizacin. Adems de las 3 etapas de cada ciclo, se aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. La previa, a elevada temperatura, sirve bsicamente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, as como para asegurar la desnaturalizacin completa del DNA de partida, especialmente si ste es de gran tamao o posee regiones muy compactas. La etapa final, consiste en una prolongacin de la ltima elongacin, para permitir que se completen todos los fragmentos. Adems de la amplificacin global, por aumento del nmero de molculas de DNA, debe notarse cmo el nmero de copias de diana aumenta mucho ms rpidamente que el de otras copias ms largas. Todo ello hace que en la mezcla final, al terminar la PCR, los fragmentos diana superen abrumadoramente en nmero a cualquier otro tipo de fragmento, incluyendo las molculas de DNA originales de la muestra.
N DE CICLOS RELIAZADOS 1 2 3 4 5 10 20 40 X N TOTAL DE COPIAS 2 4 8 16 32 1.024 106 1012 2X N DE COPIAS LARGAS 2 4 6 8 10 20 40 80 2X N DE COPIAS DIANA 0 0 2 8 22 1.004 106 1012 XX-2X DIANAS/TOTAL 0 0 25% 50% 69% 98% 99.996% 100

Algunas caractersticas del proceso Rendimiento: puesto que cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulacin de copias es exponencial en vez de lineal. En la prctica el rendimiento de cada etapa no es completo, por lo que las cifras se ven algo reducidas. A pesar de ello, siguen siendo muy elevadas. El nmero de copias al final de los ciclos realizados se pueden calcular como:

Duracin: la duracin de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el nmero de ciclos debe optimizarse, dependiendo de la secuencia concreta que se quiera amplificar. Especificidad: es muy elevada. Est determinada por la secuencia de los dos cebadores utilizados y por las condiciones de templado. Se puede determinar la especificidad analizado por electroforesis los productos generados: la aparicin de una banda nica indica que la tcnica es especfica. Capacidad de deteccin (sensibilidad): es muy alta, tanto que la PCR puede permitir detectar una nica molcula de DNA en casi cualquier tipo de muestra clnica, forense o arqueolgica. Supone tambin un elevado riesgo de contaminacin por molculas de origen ajeno a la muestra. Fidelidad: capacidad de copiar secuencias con precisin, sin introducir mutaciones. Depende sobre todo que la enzima empleada tenga o no actividad correctiva de pruebas. Automatizacin de la PCR La automatizacin es sencilla y de bajo costo, dando el carcter cclico del proceso, el empleo de componentes estables al calor y el desarrollo de termocicladores para programar los cambios de temperatura. Slo mediante la automatizacin se hace factible la realizacin de un nmero elevado de ciclos y se aumenta la precisin del proceso. Variantes del mtodo Han surgido numerosas modificaciones derivadas del mtodo bsico inicial, con el propsito de mejorar el rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares, amplificar molculas de RNA en lugar de DNA. A continuacin se comentan las variantes ms significativas. PCR larga: Reaccin de amplificacin que permite generar un producto, de miles de pares de bases, mas extenso que mediante una PCR convencional. PCR anidada: aumenta la especificidad al realizarse una segunda reaccin de PCR, con dos iniciadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado en la primera reaccin, permitiendo la obtencin de productos de PCR ms cortos y especficos PCR inversa: permite realizar una amplificacin de las regiones flanqueantes de un fragmento de ADN que solo se conoce su secuencia interna. PCR con adaptadores: permite amplificar una regin de ADN de secuencia desconocida, ligando a fragmentos de restriccin, secuencias adaptadoras, es decir oligonucletidos sintticos con extremos cohesivos compatibles con los
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generados en la muestra. Los iniciadores son especficos para las secuencias 3 de los adaptadores, permitiendo la amplificacin del conjunto de adaptadores y secuencia diana PCR asimtrica: variante de la PCR convencional que consiste en la amplificacin preferencial de una de las cadenas del ADN blanco.
RT-PCR amplificacin del RNA: Variante de la PCR donde primero se realiza una Transcripcin reversa a partir de ARN para sintetizar el ADN complementario que luego es amplificado mediante una PCR convencional.

8.2 Clonacin celular del DNA: El mtodo clsico de clonacin de cidos nucleicos es el que aprovecha la capacidad de las clulas para replicar el DNA. Surge gracias a la aparicin de una serie de tcnicas que permiten el aislamiento del DNA y al descubrimiento en los aos 70 de las enzimas de restriccin, que hace posible en el laboratorio cortar el DNA e incorporar los fragmentos a vectores, que a su vez se introducen en clulas anfitrionas, donde tiene lugar su replicacin. En principio, esta tecnologa slo se planteaba para clonacin del DNA, existen actualmente variantes que amplian su eficiencia y extienden su ampliacin al RNA. Introduccin a las nucleasas Las endonucleasas de restriccin son enzimas que desempean una funcin propia en las clulas procariotas en las que se descubrieron, son de uso experimental en varias reas de la Biologa Molecular, as como el diagnstico clnico. Esencialmente en el proceso de la clonacin molecular del DNA, aplicacin en la secuenciacin del genoma y el estudio de los polimorfismos. Introduccin a las nucleaseas Genticamente nucleasa es cualquier enzima con capacidad de escindir los enlaces fosfodister de la cadena polinucleotidica de los cidos nucleicos; son por tanto, fosfodiesterasas. Su especificidad puede analizarse con respecto a tres criterios: 1. Escisin en posiciones internas o terminales en la estructura primaria: Exonucleasas: hidrolizan exclusivamente enlaces fosfato en los que participan el nucletido terminal. Generan una cadena polinucleotdica acortada y un nuclesido (N), un nuclesido-monofosfato (pN o Np) o un nuclesidobisfosfato (pNp). Endonucleasas: solo hidrolizan enlaces internos de la cadena, es decir, sin afectar a los nucletidos terminales. Generan dos fragmentos polinucleotidicos.
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2. Actuacin sobre uno de los dos enalces tipo fosfofiester. Algunas nucleasas (tipo a) actun especficamente hidrolizando los enlaces fosfato formando con el OH 3, mientras que otras (tipo b) hidrolizan los formados con OH 5. De este modo, las de tipo a dan lugar a extremos 3 -OH y 5-P, mientras que las de tipo b producen extremos 3-P y 5-OH. 3. Reconocimiento de nuclesidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada (slo en algunas nucleasas): desoxirribonucleasas o DNasas, que actun slo sobre DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA finalmente, algunas nucleasas distinguen entre nuclesidos purnicos y primidnicos. 8.2.1 Enzimas de restriccin: caractersticas generales Las enzimas de restriccin tambin llamadas nucleasas de restriccin, endonucleasas de restriccin o enzimas restrictivas o restrictasas. Pertenecen a este grupo una gran diversidad de endodesoxirribonucleasas, descubiertas como enzimas propias de distintas bacterias y caracterizadas en los aos 70. Se dispone hoy comercialmente de un gran nmero de ellas con elevadas especificidad, estabilidad y pureza. Se nombran con tres legras tomadas del gnro y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra ms, que identificar el serotipo y finalmente por un nmero romano que las identifica en el caso de que en una misma variante se haya encontrado varias enzimas con distinta especificidad.

Su importancia radica en su especificidad de reconocimiento de una secuencia corta de DNA dplex y la consiguiente hidrlisis de un enlace fosfodister en cada hebra, justamente en secuencias concretas del DNA llamadas sitios de reconocimiento o de restriccin. Los fragmentos de DNA originados son tiles para inicial la clonacin celular o acelular, para el anlisis de DNA, para elaborar mapas de restriccin para la deteccin de polimorfismo, etc.

Papel biolgico del sistema metilacin restriccin. La existencia natural de las endonucleasas de restriccin en muchas bacterias ofrece a estas un mecanismo de defensa contra la entrada de material gentico de otro organismo, concretamente de virus bacterifagos (cuya reproduccin depende de la maquinaria gentica de la bacteria); se trata de los sistemas restriccin-modificacino metilacin-restriccin. Para cada enzima de restriccin, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de restriccin y une covalentemente grupos metilo a determinadas bases del ADN en dicha secuencia. En el caso de enzimas de tipo II, la metilasa es una protena independiente, mientras que las de tipo I y III poseen las actividades nucleasa y metilasa en su molcula oligomrica, como subunidades que actan coordinadamente. El mecanismo de defensa es el siguiente: el ADN propio de la bacteria es metilado de una forma especifica, caracterstica de cada especie bacteriana (en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La metilacin de las bases impide la unin de la enzima de restriccin, con lo que el ADN propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la clula ADN de otro organismo, no metilado o con un patrn de metilacin diferente, este ADN puede ser degradado por la enzima de restriccin, ya que carece de los grupos metilo en la secuencia diana (por razones puramente aleatorias, en cualquier genoma habr un cierto nmero de secuencias de 4, 6 u 8 pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habr secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo de accin combinada surgi precisamente el nombre de enzimas de restriccin: la accin de la nucleasa restringe la posibilidad de infeccin por virus.

Si esta metilada una sola hebra del ADN, el sitio no es reconocido por la enzima de restriccin, pero s por la metilasa, que aade el grupo metilo a la otra hebra. Esto es lo que ocurre, por ejemplo, al final de la replicacin, donde el dplex est formado por una hebra molde, preexistente y, en consecuencia, metilada, y otra hebra recin sintetizada que an carece de grupos metilo. Esta accin de las metilasas asegura que todo el ADN de las dos clulas hijas quede metilado lo antes posible. La metilacin del ADN afecta principalmente a citosinas y adeninas de la secuencia reconocida. En la reaccin, las metilasas utilizan como donador del grupo metilo al compuesto S-adenosilmetionina. Accin de las enzimas de restriccin tipos II Son las ms simples y las mejores estudiadas por su utilidad en Ingenieria Gentica, a modo de tijeras para el corte del DNA. El sitio de restriccin es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrlisis. Se hidrolizan de forma muy especifica enlaces fosfoster del DNA, uno en cada hebra, generndose dos fragmentos de restriccin. En enlace hidrolizado es siempre 3-P, por lo que el fosfato queda unido a 5, dejando en ambos fragmentos extremos 3-OH y 5P. La reaccin no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por enzimas de tipo I y III.

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Ilustracin de los distintos tipos de extremos resultantes de la accin de enzimas de restriccin:

Clonacin celular de Molculas de DNA El objetivo central de esta clonacin es la produccin de un gran nmero de copias de una regin de DNA o de cDNA (formado a partir de un mRNA). se trata de un proceso de clonacin celular que, por contraposicin a la clonacin acelular por PCER, in vitro, se puede considerar que se realiza in vivo. Se basta esta clonacin, al igula que la PCR, en la realizacin de mltiples rondas de replicacin, pero en este caso catalizadas por la DNA polimerasas propia de la clula en la que se lleva a a cabo el proceso, clula antrofiana. Para ello, el fragmento de DNA o cDNA a clonar (llamado inserto) se une a otro DNA (vector de clonacin), y las molculas de DNA recombinante formadas se incorpora a la clula anfitriona donde tiene lugar la amplificacin por replicacin. Una vez detectada la presencia del DNA de inters y seleccionados los clones que lo han amplificado, se asla del gen o fragmento de DNA o cDNA, que se emplea con distintos fines.

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La clonacin se describe en siete etapas: dos de preparacin de muestras, cuatro sucesivas de clonacin propiamente dicha y, segn los casos, una de expresin. En ocasiones, se aade la amplificacin por PCR del DNA clonado. Hoy da, todas la etapas se realizan de forma rutinaria, a veces incluso automatizada, al disponerse de forma comercial de las enzimas, sustratos, vectores etc, e instrumentos adecuados para su realizacin.

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Preparacin del DNA para su clonacin Esta primera etapa de la clonacin, la preparacin inicial del cido nucleico que se quiere clonar es la parte esencial del proceso. Insertos de ADN Se parte de clulas nucleadas, normalmente sanguneas, lisadas por sonicacin o por suspensin en un medio hipotnico. Una vez eliminadas las molculas acompaantes, tanto ARN (ARNasas o hidrlisis alcalina) como protenas (con proteasas) y enzimas o fragmentos proteolticos (en sistemas bifsicos fenol/agua), se precipita y concentra el ADN (con etanol y sales). ste posteriormente se fragmenta con enzimas de restriccin, para dar lugar a una mezcla cuyo contenido, en nmero y tamao de fragmentos, depende del nmero de sitios de restriccin y de su accesibilidad para las enzimas. El fragmento que se va a clonar debe aislarse o separarse del resto, mediante alguna tcnica adecuada, por ejemplo electroforesis en gel de agarosa, centrifugacin en gradiente de densidad, cromatografa lquida de alta presin (HPLC), etc. Cuando se desee expresar el
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fragmento clonado, es necesario preparar adems un inserto auxiliar que contenga elementos reguladores de la expresin gnica.

Insertos de ADN complementario procedente de ARNm En muchos casos interesa clonar la secuencia codificante de un gen eucariota, para lo cual se parte de muestras de ARNm que debe ser convertido en el ADNc (ADN complementario) correspondiente para poder se clonado. En este caso no es indiferente la eleccin de las clulas de partida, pues cada tipo celular expresa un conjunto de protenas diferente y, por consiguiente, no contiene los mismos ARNm. Una vez lisadas las clulas del organo, tejido, tipo celular, estadio de desarrollo, etc., elegidos, se purifica el ARNm, generalmente aprovechando la presencia en su molcula de la cola de poliA. Se empleo para ello cromatografa de afinidad en columna o microesferas magnticas de afinidad; en ambos casos, la matriz cromatogrfica o microesfera magntica llevan unido un oligo(dt) . Cuando el ARNm a clonar no es abundante, se puede amplificar mediante PCR, facilitando as su clonado posterior en clulas. Para preparar el ADNc se emplea la transcripcin inversa
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8.2.2 Vectores de clonacin: preparacin En general, un vector es una molcula de ADN de tamao pequeo, fcil de aislar y caracterizar, con secuencia y mapa de restriccin conocidos, de fcil introduccin en la clula anfitriona y una vez all concapacidad de replicacin autnoma, es decir, independiente de la replicacin del genoma de la clula anfitriona. Es conveniente que el vector posea el mayor nmero posible de sitios de restriccin, para insertar el fragmento de ADN que se quiere clonar y que incluye al menos un gen marcador (por ejemplo, un gen de resistencia a un antibitico) que permita identificar y/o seleccionar las clulas que llevan el ADN recombinante. Lo comn es que los vectores naturales no posean todas estas caractersticas, por lo que habitualmente se emplean vectores modificados (a su vez obtenidos por tcnicas de ADN recombinante, pero ya disponibles comercialmente en todas las prestaciones deseadas). La misin del vector es unirse con el fragmento de ADN que se quiere clonar (llamado entonces inserto) para facilitar su entrada en la clula anfitriona y su replicacin. Para poder unir con facilidad ambos, se debe cortar el vector con las mismas enzimas de restriccin que se utilizaron para escindir el ADN de la muestra o con enzimas que proporcionen extremos compatibles; de ese modo, sus secuencias complementarias pueden asociarse y ser unidos por la ligasa, dando lugar a una sola molcula de ADN de doble hebra, llamada ADN recombinante (ADNr). En funcin de los objetivos de la clonacin (amplificacin y expresin), se suele hablar de dos grandes grupos de vectores. Por un lado, los vectores de clonacin, que se emplean nicamente para amplificar el ADN de inters, tambin se
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los llama a veces vectores de insercin o vectores de propagacin. Tericamente, solo incorporaran el inserto de inters. Por otro lado, los vectores de expresin, que poseen adems caractersticas que facilitan la expresin por la clula anfitriona del ADN de inters. En este caso deber incorporarse, adems de ste, el ya mencionado inserto auxiliar con una regin de control de la expresin. En la prctica, los vectores de expresin comerciales suelen incluir ya una regin de control, comnmente un promotor potente que se induzca fcilmente bajo condiciones experimentales controlables, vlido para expresar cualquier inserto de inters que se site tras l en el ADNr.

Formacin de la molcula de ADN recombinante Consiste en la unin covalente, in vitro, del inserto de ADN al vector fragmentado, mediante una ligasa. La especificidad de la unin depende del tipo de extremos que hayan resultado al preparar el inserto y el vector. Si son cohesivos, su secuencia es la especfica de la enzima de restriccin empleada y slo se asocian los extremos compatibles; una vez asociados por apareamiento de bases, la ligasa establece la unin covalente sellando las dos mellas. Si se trata de extremos romos, no pueden asociarse, pero la ligasa los puede unir, aunque con menor eficacia y no supone ninguna diferencia la enzima de restriccin con la que se prepararon (se puede decir que todos los extremos romos son compatibles).

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En la prctica, pueden ocurrir diversos tipos de asociacin entre fragmentos de restriccin con extremos compatibles, todas ellas catalizadas por la ligasa. En primer lugar, siempre pueden darse la asociacin intramolecular, es decir, entre los extremos de una misma molcula (vector o inserto); si se trata de un vector circular, da lugar a su recircularizacin. Esta interaccin est favorecida cuando la concentracin de ADN es baja (pues la probabilidad de que dos molculas se encuentren es menor). En segundo lugar, puede tener lugar una asociacin intermolecular, tanto la que conduce al ADNr (vector+inserto) como otras que conducen a productos no deseados: vector+vector, inserto+inserto, unin de ms de dos molculas, etc., todas ellas pueden ser circulares o lineales. Estas interacciones son ms probables para concentraciones elevadas de ADN.

Para evitar la formacin de estos productos secundarios, que disminuye el rendimiento de la clonacin, se acude a estrategias experimentales, previas a la mezcla de vector e inserto, tales como la escicsin con dos enzimas de restriccin diferentes, que evita la recircularizacin del vector o, como se describe a continuacin, la desfosforilacin del vector con fosfatasa alcalina.

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Tipos de vectores Los vectores empleados para la clonacin de insertos de DNA son muy variados. Pueden clasificarse segn varios criterios, tales como: Su procedencia procaritica o eucaritica. El tipo de molcula a partir de la que se praparan: o Plsmidos: bacterianos, de levadura o de plantas. o Virus: que infectan bacterias (bacterifagos o simplemente fagos), plantas, invertebrados o vertebrados. o Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosmicos de fagos (PACs), de bacterias (BACs) o de levaduras (YACs). o Quimeras: es decir, molculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es diferente. El tipo de clula anfitriona en la que el DNA recombinante resultante se puede luego incorporar (etapa 4). El gen de resistencia que contiene el vector para su posterior deteccin o seleccin (etapa 6). El tamao del DNA que admiten como inserto.

Plsmidos El plsmido pBR322 de E. coli, muy popular para los tcnicos en gentica, se desarroll a finales de los aos 1970. La p significa plsmido, BR se refiere a los cientficos en l involucrados: Bolvar y Rodrguez. El nmero 322 diferencia el plsmido de otros del mismo laboratorio, como pBR325, pBR327, etc.

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pBR322 contiene genes para las enzimas de resistencia a antibiticos: la tetraciclina y la ampicilina. Diferentes endonucleasas de restriccin pueden cortar el plsmido en lugares de corte especficos. Finalmente tambin se insertan all los fragmentos de ADN cortados. Si se utilizan EcoRI no se corta ningn gen de resistencia a antibiticos; sin embargo, esto s sucede si se corta por ejemplo con BamHI. Entonces se corta el gen de resistencia a tetraciclina y se inserta un gen exgeno en medio del gen tc (insertion).Las clulas son, pues, resistentes a la ampicilina, pero no a la tetraciclina, y as pueden seleccionarse fcilmente.Las clulas que no han captado el vector son sensibles a los dos antibiticos. Las clulas que contienen pBR322 sin insercin son, en cambio, resistentes a ambos antibiticos.

Bacterifagos El fago lambda () puede destruir a su husped o incorporar una parte de l. En el primer caso, en la lisis se generan rpidamente protenas y ADN virales y se
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empaquetan en partculas de virus que conducen a la destruccin de la clula husped (ciclo ltico). En el segundo caso, el ciclo lisognico inserta el ADN del virus en el genoma de la clula husped. Su ADN se replica durante generaciones, sin daar al husped. Mediante determinados cambios ambientales el virus ADN durmiente puede activarse de pronto. Se separa del genoma e inicia el ciclo ltico. El fago lambda tiene 48 kb de ADN y una gran parte son importantes para una infeccin con xito. Los genes para el ciclo lisognico tambin pueden provenir de ADN exgeno, ideal para un vector. Para la clonacin de ADN se desarrollan fagos mutantes dirigidos. Su ADN puede cortarse en dos lugares (en lugar de cinco) mediante EcoRI. Con ello se originan tres productos de corte, de los cuales se separa el central. En su lugar se introduce, mediante ligasas, un segmento prueba de ADN largo (aproximadamente 10 kb). El fago an es contagioso, pero slo puede producirse el ciclo ltico y no el lisognico (o sea, no espera durmiendo). stas son propiedades muy deseables para un vector de clonacin. La ventaja de los fagos lambda es que los virus manipulados pueden penetrar fcilmente que las clulas bacterianas e incorporar cortes de ADN mayores. El M13 es un fago filamentoso. Se trata de un virus en forma de hilo (900 nm de longitud, con slo 9 nm de dimetro), con un ADN en forma de anillo de una nica hebra (tambin denominada hebra +) y una cubierta proteica de 2710 subunidades proteicas idnticas. El virus penetra E. coli a travs del pilus, que posibilita el intercambio de ADN entre bacterias. M13 es muy til por la posibilidad de obtener ADN en forma de hebras simples. Las hebras simples de los genes clonados se necesitan especialmente para la secuenciacin del ADN y la mutagensis in vitro. El ADN de M13 no se integra (como en el fago lambda) en el genoma bacteriano. No provoca tampoco la lisis de las clulas. La bacteria crece y se divide, sin embargo, ms lentamente que las clulas no infectadas. Las clulas hijas liberan todava fagos M13. Por generacin se originan aproximadamente mil nuevos fagos M13. Puesto que el husped no muere, se pueden cultivar y cosechar fcilmente en grandes cantidades.

Cosmidos Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de ADN plasmdico. Los csmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmdicas de replicacin y de genes de resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped que los contienen.
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El ADN de los csmidos que contiene insertos de ADN se empaqueta en la cpside proteica de lambda para formar partculas fgicas infectivas. Una vez el csmido entra en la clula husped, se replica como un plsmido. Puesto que la mayora del genoma de lambda se ha delecionado, los csmidos pueden transportar insertos de ADN mucho ms grandes que los que lambda puede llevar. Los csmidos pueden transportar casi 50kb de ADN insertado, mientras que los vectores fgicos pueden acomodar insertos de ADN de unas 15kb y los plsmidos generalmente estn limitados a insertos de 5-10kb.

Cromosomas artificiales Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) Para cartografiar y analizar genomas eucariticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso denominadocromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un plsmido que se replica independientemente y que est implicado en la transferencia de informacin gentica durante la conjugacin bacteriana. Puesto que los factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseados para que funcionen como vectores de ADN eucaritico. Los vectores BAC tienen los genes de replicacin y de nmero de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibitico y sitios de restriccin para insertar el ADN exgeno que se desee donar. Adems, el sitio de donacin est flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar molculas de ARN y expresar as el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosmico, y para secuenciar el ADN del inserto clonado.

Cromosomas artificiales de levadura (YAC) Los YAC (yeast artificial chromosomes) son vectores sintticos que contienen las tres regiones relacionadas con la funcionalidad de un cromosoma: secuencias constituyentes de un centrmero, de dos telmeros y de un origen de replicacin. Adems, incorporan en general marcadores seleccionables y un
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sitio de clonado mltiple en el que admiten un inserto de gran tamao, que puede alcanzar 1 Mb, lo que constituye una caracterstica fundamental. En ocasiones, este tipo de vectores se denominan ARS/CEN/TEL, por los 3 tipos de secuencias que contienen. La secuencia centromrica permite la segregacin correcta de las copias hijas del cromosoma durante la divisin de la clula, mientras que los telmeros estabilizan los cromosomas a lo largo de sucesivas divisiones. El origen de replicacin o secuencia de replicacin autnoma (ARS, autonomously replicating sequence) permite la formacin de copias del cromosoma artificial de forma independiente a la del genoma propio de la clula anfitriona. Los YAC se utilizan en particular para preparar genotecas de genomas muy grandes o para mantener un gen completo en un nico clon. Incorporacin del ADN recombinante a la clula anfitriona La replicacin de las molculas del ADNr (clonacin) requiere que stas se introduzcan en una clula anfitriona (receptora u hospedadora, incorrectamente llamada clula husped). Para que esta incorporacin que en general tiene lugar por mecanismos poco conocidos, sea eficaz es preciso emplear clulas especializadas (con un genotipo seleccionado), adecuadas al vector de clonacin utilizado y con capacidad de divisin. Tipos de clulas anfitrionas Con frecuencia, las clulas anfitrionas son procariotas, principalmente cepas de E. coli, por ser fciles de obtener, manipular, multiplicar y conocerse su gentica. Al proceso de introduccin del ADNr plasmdico se le denomina transformacin. La(s) molcula(s) de ADNr plasmdico incorporadas se replican luego varias veces dentro de la clula, de acuerdo con las propiedades de los plsmidos. El inserto de ADN puede permanecer unido al plsmido (o ms frecuente) o recombinante con el ADN del cromosoma. Si se integra en el vector ms de un tipo de ADN, por ejemplo, dos genes o un gen y un regulador de la transcripcin, el proceso de incorporacin a la clula anfitriona del ADNr se llama cotransformacin. Las clulas anfitrionas eucariticas son ms dificiles de obtener y mantener, por lo que slo se utilizan con fines especficos, fundamentalmente para el anlisis de la regulacin gnica, la expresin de una protena eucaritica, etc. De entre ellas, las ms manejables en cultivo son las levaduras que, aunque mantienen algunas caractersticas similares a procariotas (clulas individuales, crecimiento rpido y econmico, manipulables, etc.), tienen una organizacin celular propia de eucariotas y son de inters biotecnolgico por su capacidad de expresin y maduracin de protenas.
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Entre las clulas animales que pueden establecerse en cultivo, se citar las clulas HeLa de carcinoma epidrmico humano, los fibroblastos ratn y BHK de rin de hmster, los ovocitos de ratn, etc. En general, dividirse multitud de veces conservando los mismos caracteres, por lo rendimiento de clonacin es elevado.

pueden NIH de pueden que su

Mtodos de introduccin del ADNr Puesto que normalmente la membrana plasmtica muestra una permeabilidad selectiva y no admite grandes fragmentos de ADNr, se acude a diversos mtodos para facilitar su captacin por alteracin de la permeabilidad celular (mtodos pasivos) o introducir el ADNr directamente (mtodos activos). En muchos casos, los mecanismos son poco conocidos y los mtodos resultan ms o menos eficaces dependiendo del tipo de vector y de clula. El proceso suele denominarse transformacin o transfeccin, aunque estrictamente el primer trmino corresponde a la introduccin en bacterias anfitrionas y el segundo al empleo de virus como vectores. Los mtodos utilizados pueden dividirse tambin en fsicos y qumicos.

El tratamiento ms frecuente es de tipo fsico-qumico y se dice que la clula se hace competente. Se comienza con una incubacin en presencia de CaCl2 a 0 C, seguida de un cambio brusco a 37-43 C, que induce a las bacterias a aceptar molculas de ADN. Se dispone de cepas establecidas especialmente susceptibles a este proceso. La incorporacin pasiva de ADN se favorece cuando sus molculas se han agregado o coprecipitado por interaccin con cationes, tpicamente fosfato clcio o DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano, un polmero policatinico). Otros agentes qumicos, en especial el polietilenglicol (PEG), aumentan la permeabilidad de la membrana celular, con lo que se incorpora ms fcilmente el ADNr, tambin de forma pasiva. El ADN se puede incorporar en liposomas, que luego con facilidad se fusionan con la membrana celular y liberan su contenido al interior (incluyendo el ADN que, en realidad, parece asociarse a la superficie exterior hidroflica del liposoma). Un mtodo con gran eficacia es el empleo de vectores de tipo vrico, que por su va natural de infeccin introducen en la clula anfitriona su ADN, en este caso recombinante. Para este tipo de incorporacin se ha acuado el trmino transfeccin. Aplicando descargas elctricas en forma de pulsos breves de alto voltaje se consigue la apertura de poros transitorios en la membrana, por los que puede pasar el ADNr. Este mtodo de electroporacin es bastante habitual para clulas eucariticas, aunque de resultados muy variables. Un mtodo curioso y de aplicacin creciente, la biobalstica, consiste en el bombardeo de las clulas anfitrionas con microesferas (de tungsteno u oro) recubiertas con el ADNr. Se emplean dispositivos adecuados (pistolas de
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genes) que impulsan esos microproyectiles mediante un gas a presin, pudiendo aplicarse sobre suspensiones celulares en cultivo o incluso in vivo (sobre la piel, hojas). Algunos de los proyectiles impactan y penetran en las clulas, cuya membrana se resella rpidamente, quedando el ADN incorporado en su interior. En casos donde la eficiencia de suministro del ADNr debe ser mxima se acude a la inyeccin directa del ADN en la clula o en su ncleo, empleando micromanipuladores y agujas de vidrio (microjeringas o micropipetas, de punta extremadamente fina), bajo observacin al microscopio. Obviamente, el inconveniente es el escaso nmero de clulas que se pueden tratar por este mtodo manual, por lo que generalmente se utiliza slo sobre oocitos y cigotos. Dado su carcter directo, se puede incluso prescindir del vector y suministrar el fragmento de ADN deseado sin modificar.

Propagacin en cultivo La divisin de las clulas anfitrionas en cultivo producir, junto con la replicacin de su propio genoma, la formacin de copias del ADNr que haya podido incorporar y, por tanto, la clonacin propiamente dicha. En la prctica, se suele hacer una primera siembra celular sobre una placa de agar para que crezcan las colonias (cada colonia proviene de una clula, son clones) y una resiembra posterior de las colonias en medio lquido, que forma poblaciones con mltiples copias de cada clula original (clones celulares). Dependiendo de las propiedades del vector, el ADNr puede replicarse de forma rpida e independientemente del genoma de la clula anfitriona.

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Simultneamente con esta etapa de propagacin suele tener lugar la seleccin de clones recombinantes y la expresin opcional del gen clonado. Deteccin y seleccin de clones recombinantes Dado el gran nmero de clulas empleadas en la clonacin y la diversidad de productos que pueden originarse en el proceso de creacin del ADN recombinante, es esencial poder diferenciar qu clulas (o colonias a las que han dado lugar en cultivo) han incorporado realmente el ADN recombinante deseado. Esta deteccin se puede combinar con una seleccin, es decir, conseguir que slo las clulas adecuadas sobrevivan en el cultivo. Esto facilita mucho la tarea de propagacin celular, reduciendo el nmero de clones que se deben seguir cultivando. Dependiendo del mtodo utilizado, es posible distinguir clulas que han incorporado el vector (recombinante o no), que han incorporado ADNr o incluso que han incorporado el ADNr con el inserto dispuesto correctamente. Se pueden considerar tres tipos de mtodos de deteccin: Mtodos de hibridacin: deteccin de una secuencia de ADN clonado o ARNm transcrito a partir de l, por hibridacin con una sonda marcada. Mtodos inmunoqumicos: deteccin de la protena codificada por el gen clonado, mediante un anticuerpo especfico. Mtodos genticos o de seleccin fenotpica: en ciertos casos, la expresin del propio inserto produce cambios apreciables en la clula anfitriona, que sirven para reflejar su clonacin con xito. Sin embargo, la estrategia ms comn es la deteccin y seleccin basadas en la presencia de genes marcadores en el vector. Genes que codifican una protena detectable, comnmente una enzima para la que se dispone de un ensayo. Por ejemplo, la b-galactosidasa (gen lacZ de E. coli) trasnforma el sustrato sinttico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-ogalactopiransido) en un producto de color azul. Genes de resistencia a un antibitico, que codifican una protena que permite el crecimiento de la clula anfitriona en presencia de un determinado antibitico. Por ejemplo, el gen ampr codifica una b-lactamasa capaz de degradar la ampicilina, una penicilina semisinttica. El gen de resistencia a tetraciclina ( eta) codifica una protena de membrana que acta como una bomba, extrayendo este antibitico de la clula. Genes que complementan defectos nutricionales. En este caso, se emplean cepas mutantes de la clula anfitriona, que no pueden crecer en ausencia de un nutriente. Por ejemplo, clonando en levaduras con un defecto metablico en la ruta de biosntesis de triptfano, se emplea un vector que contiene el
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gen TRP1 correcto, con lo que slo las clulas transformadas crecen sin Trp en el medio. Los planteamientos experimentales son muy diversos y generalmente combinan varios de estos marcadores. Un concepto importante es el uso de la inactivacin insercional, la inclusin de un policonector o sitio de clonado mltiple en el interior de un gen marcador hace que la accin de ste se ejerza slo en las clulas que han incorporado vector sin inserto.

Expresin gnica En algunos casos se pretende no slo la amplificacin del ADN clonado, sino su expresin, bien para estudiar este proceso o para investigar el producto (ARN o protena). Lgicamente, el ADN clonado ser en estos casos un gen y por ello con frecuencia se tratar de un ADNc. Para conseguir esta expresin se emplean vectores de expresin, especializados, distintos de los vectores de clonacin por presentar caractersticas que favorecen la transcripcin del gen una vez incorporado a la clula anfitriona. Tpicamente, un vector de expresin incluye (o se debe insertar en l a la vez que el gen) un promotor, regin reguladora de la transcripcin. Es frecuente emplear promotores inducibles, ajenos al organismo del que procede el
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gen clonado pero que se activan bajo condiciones experimentales controlables, como la adicin de un nutriente u otro tipo de compuesto, disparando entonces la transcripcin del gen clonado. 8.3 Secuencia de cidos nucleicos La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos adenina, guanina, citosina y timina (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (en plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin de cientficos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. 8.3.1 Mtodo enzimtico

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice sencilla. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacterifago T4. La ADN Polimerasa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer". Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, adems, este cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de insercin del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente. Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos trifosfato en cada reaccin. Por ultimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han
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perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.

Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido. Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde)

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est la base correspondiente al nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente. Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva sntesis en la direccin 5' 3'.

8.3.2 Mtodo qumico En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN basado en la modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas8 Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental artculo de Sanger y Coulson sobre su mtodo de
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secuenciacin "ms-menos",9 10 la secuenciacin de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del mtodo de terminacin de la cadena (ver ms adelante), la secuenciacin de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de productos qumicos peligrosos y dificultades para escalarla. Adems, a diferencia del mtodo de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico estndar. En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molcula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un 20%. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia. Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio de las interacciones entre ADN y protenas (huella gentica), estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes.

8.3.3 Hibridacin de secuencias especificas Complementariedad e hibridacin La bsqueda molecular utiliza una o varias formas de complementariedad para identificar las molculas que nos interesan, dentro de un nmero grande de otras molculas. La complementariedad es el reconocimiento molecular especfico de la forma o especfico de la secuencia, que se presenta cuando dos molculas se unen. Por ejemplo, las dos bandas del ADN en doble hlice se unen porque tienen secuencias complementarias; de la misma manera, un anticuerpo se une a una regin de una molcula protenica, porque tienen formas complementarias.
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La complementariedad entre una molcula "sonda" (probe) y una molcula "blanco" (target) puede resultar en la formacin de un complejo sonda-blanco. Si la molcula sonda se marca con radioactividad o con una enzima, entonces este complejo podr ser localizado y servir para obtener informacin sobre la molcula blanco. En solucin, los complejos moleculares hbridos pueden existir dentro de los siguiente tipos: 1. ADN-ADN. Una molcula "sonda" -de una sola banda de ADN- puede formar un hbrido de pares de bases de doble banda con otra molcula de una sola banda de ADN "blanco", nicamente si la secuencia de la sonda es el complemento reverso de la secuencia del blanco. 2. ADN-ARN. Una molcula "sonda" de ADN de una sola banda puede formar un hbrido de una doble banda con una de ARN "blanco", si la secuencia es el complemento reverso de la secuencia del "blanco". 3. Protena-protena. Una molcula de anticuerpo "sonda" puede formar un complejo con una molcula de protena "blanco", si el sitio de unin del antgeno del anticuerpo puede unirse al epitopo (pequea regin) de la protena blanco. En este caso se le llama complejo "antgeno-anticuerpo". Existen dos caractersticas importantes de la hibridacin: 1. Las reacciones de hibridacin son especficas. Las sondas se unen a los blancos, solamente cuando tienen una secuencia complementaria (en el caso de los anticuerpos cuanto tienen sitios con una estructura tridimensional correcta). 2. Las reacciones de hibridacin se llevan a cabo en presencia de grandes cantidades de molculas similares pero no idnticas al "blanco". Esto es, que una sonda puede encontrar una molcula del blanco en una mezcla de millones de molculas relacionadas pero no complementarias. Estas propiedades permiten que la hibridacin se use para buscar una molcula de ADN o de ARN o una protena, en una mezcla compleja que contenga otras molculas similares. Estas tcnicas son necesarias ya que las clulas contienen miles de genes, miles de diferentes especies de cidos ribonucleicos mensajeros (ARNm) y miles de protenas diferentes. Cuando la clula se rompe experimentalmente para extraer el ADN, ARN o protenas, la resultante es una mezcla compleja de todos los ADNs, ARNs o protenas, por tanto es imposible estudiar un gen especfico, un ARN o una protena en tal mezcla, a menos que se tengan tcnicas que permitan discriminar con base en la secuencia o la forma. Por tanto, las tcnicas de hibridacin permiten seleccionar una molcula que nos interese dentro de una mezcla compleja de componentes celulares, de tal modo que las estudiemos de forma particular. Definiciones bsicas Los blots (transferencias) se definen por la molcula "blanco": Southern Blot. ADN (blanco) cortado con enzimas de restriccin, la "sonda" es ADN radiactivo. Northern Blot. ARN (blanco), la "sonda" es ADN o ARN radiactivo.
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Western Blot. Protena (blanco), la "sonda" es un anticuerpo marcado enzimticamente o radiactivo. La formacin de hbridos en solucin es de poco valor experimental, ya que si se mezclauna solucn de ADN con una solucin de una "sonda" radiactiva, se termina slo con una hibridacin radiactiva. En estas condiciones no se puede distinguir a los hbridos de las molculas no hibridizadas. Por esta razn, primero se debe separar fsicamente la mezcla de molculas que son "sonda" con base en un parmetro adecuado. Estas molculas deben ser inmovilizadas en un soporte slido de tal modo que permanezcan en posicin durante el marcaje con la sonda y el lavado. Ahora se aade la sonda y la sonda no unida especficamente se elimina y se detecta la verdadera sonda. El lugar donde se detecta la sonda, corresponde al sitio de la molcula "blanco" inmovilizada.

Electroforesis La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico. La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa.

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Vista lateral de un cmara de electroforesis

La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida. Southern, Northern y Western Blot Existen diferentes tcnicas que emplean la separacin en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas molculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la deteccin de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utiliz el mismo sistema para detectar ARN y se lo denomin Northern Blot (en clara alusin al nombre del cientfico inventor de la tcnica basada en ADN). Estas dos tcnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias especficas (sondas) complementarias a la molcula de cido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridacin de cidos nucleicos para la deteccin de las molculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho ms fcilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas ms precauciones. Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electrofortica hasta lograr que las molculas se separen por tamaos de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los cidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridacin con sondas especficas para detectar la presencia de determinadas secuencias. Estas dos tcnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar
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mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qu genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos clulas del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material gentico y el Northern Blot, la expresin de diferentes genes. Si luego queremos detectar protenas, usaremos otra tcnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa protenas mediante la utilizacin de anticuerpos especficos. Una vez que la muestra con las protenas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una membrana especial donde las protenas quedan ancladas o adheridas. Despus, se incuba esta membrana con el anticuerpo especfico contra la protena blanco, y se revela. Con esta tcnica pueden obtenerse datos aproximados del tamao de la protena y su concentracin en la muestra sembrada. Southern Blot La tcnica consiste en cortar el ADN con enzimas de restriccin para producir fragmentos de diferente tamao. Los fragmentos se separan por su tamao molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tincin con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que acta como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solucin salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades qumicas. Despus los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestin. Despus de la hibridacin, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografa o mediante fluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo).

Northern Blot Una tcnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda. Northern blot o anlisis Northern es bsicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite tambin determinar el tamao de la trascripcin de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular
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se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de cido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de inters. Northern Blot es similar a la tcnica anterior, pero permite detectar ARN en vez de ADN (Innis y Gelfand, 1990). En sntesis la tcnica consiste en extraer el RNA de las clulas pertinentes y su posterior separacin por tamao mediante electroforesis en gel. Las molculas de ARN son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Despus de la hibridacin con una sonda marcada (y posterior a la deteccin segn el mtodo de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicacin de los tipos de ARN que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de ARN de tamao adecuado, se puede conocer el tamao de los ARN que se han identificado. As, la tcnica permite conocer el tamao preciso de un mARN, luego del empalme transcripcional. Adems, sirve para identificar diferentes tipos de mARN codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido especfico (o tipo de clulas) en que se encuentra un mARN especfico. As, ser posible determinar los niveles de actividad gnica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un perodo definido de la vida, o despus de haber sido sometido a los organismos a diferentes estmulos fisiolgicos (Russel, 1998). El Northern Blot es una tcnica muy similar al Southern Blot que permite la identificacin de secuencias especficas de ARN. La muestra de ARN a analizar no requiere fragmentacin y se somete a electroforesis en geles de agarosa, donde las molculas de ARN se separan desde mayor a menor tamao. Una vez terminada la electroforesis, y sin teir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de nitrocelulosa a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, especfica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de cido nucleico, por ejemplo cADN, que reconocer a la secuencia de ARN inmovilizada en el filtro, a travs del reconocimiento de secuencias complementarias de cidos nucleicos.El nombre de la tcnica deriva por analoga al Southern Blot.

Western Blot El Western blot se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de poliacrilamida, mediante la aplicacin de corriente elctrica la cual hace correr estas protenas y glicoprotenas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si ste tiene anticuerpos contra las estructuras virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas. Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen mltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece
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ninguna banda y un resultado indeterminado es cuando slo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser considerado como positivo.

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