Fonte: http://www.zoo1.ufba.br/teclab1.html TCNICAS DE LABORATRIO 1.

MANUAL DE USO E MANUTENO PARCIAL DE MICROSCPIO Introduo Embora os aparelhos modernos sejam mais sofisticados, os princpios de construo do microscpio ptico, do uso e da manuteno adequados, ainda so os mesmos. No entanto, as regras mais elementares de utilizao so freqentemente ignoradas, at mesmo por usurios experientes, comprometendo assim no s a durabilidade do equipamento, mas tambm a no utilizao de possveis recursos. Muitas vezes os microscpios que so enviados para conserto esto apenas com as lentes sujas e podem ser restaurados rapidamente. No entanto recomendvel uma manuteno preventiva por ano, a qual deve ser feita por tcnicos especializados . Este pequeno manual visa portanto, mostrar o uso apropriado, particularmente do microscpio composto, tcnicas de regulagem da iluminao e de manuteno parcial. USO DO MICROSCPIO Em primeiro lugar essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas dos microscpios, tendo o cuidado de ler e absorver as instrues contidas nos manuais que os acompanham, e/ou seguir as orientaes do instrutor de classe. Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para mant-lo seco, cubra com capa de flanela pois evita o p e a multiplicao de fungos (Obs: as capas devem ser lavadas periodicamente). No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas. Jamais comer ou beber prximo ao equipamento. Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na base, ou com as duas no brao, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfcie plana, evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o aparelho com a lmpada acesa ou logo aps ter sido apagada. Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho retirar o excesso de lquido com papel de filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina ; em de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio. Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: Escolha uma estrutura na preparao, mova a lmina at que o objeto fique exatamente no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para evitar o choque com a lamnula. Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macromtrico muito lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalizao com o micromtrico. o uso da objetiva de imerso mais delicado pois, a distncia focal entre a face da objetiva e a parte superior da lamnula, diminui quando a ampliao aumentada. em primeiro lugar, assegure-se da existncia de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento. certifique-se que a iluminao e o objeto esto bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma gota de leo no centro da operao; o leo deve ter o mesmo ndice de refrao da objetiva; abaixe o tubo at colocar a lente frontal em contato com a gota de leo ainda convexa, at a mudana de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalizao com o micromtrico; Apesar das precaues mencionadas caso a imagem no fique no ponto, verifique se o revlver est bem centrado, se a preparao est invertida ou muito espessa ou se a lamnula no to fina quanto deveria. Finalmente citamos algumas causas de insucesso na prtica da microscopia:

Campo escuro: resultante de m centralizao de iluminao; veja as instrues no item "regulagem da iluminao"; Falta de nitidez da imagem: se persistir aps a regulagem da iluminao e de uma focalizao cuidadosa, a causa deve ser buscada metodicamente: a preparao pode estar suja em uma das faces e isto pode ser reconhecido pela movimentao de estrias e sombras, ao mesmo tempo que a preparao; deve-se limp-la com um leno de papel extra-macio, embebido em lcool ou ter; a ocular est suja: ao gir-la veremos corpos estranhos movimentando ao mesmo tempo; seguir a instruo de limpeza descrita no item "limpeza e lubrificao"; a objetiva pode estar com algum lquido na lente frontal ou com poeira na lente posterior; ver abaixo a maneira de solucionar; ao usar a lente de imerso servir-se de leo de imerso suficientemente fludo e nunca deix-lo secar sobre a objetiva ou sobre as preparaes. Ao terminar as observaes certifique-se que nenhuma lmina permanea sobre a platina, ponha a objetiva de menor aumento em posio, mova o macromtrico at o limite mximo (mais alto), e cubra o aparelho. Regulagem da iluminao Nos microscpios cujos condensadores ABBE so mveis, para verificar a centralizao, feche completamente o diafragma e examine a imagem com a objetiva de menor aumento focalizada numa preparao; em microscpios que possuem condensador de campo (por onde passam os feixes de luz), este tambm deve ser fechado, reduzindo assim o cone de luz. Em ambos os casos a centralizao feita girando os parafusos laterais do condensador Abbe at que a ris do diafragma esteja exatamente no centro, ou seja, coincidindo com o eixo ptico do sistema de lentes. A imagem da ris do diafragma, uma vez centralizada, deve ser regulada movimentando o condensador, para cima ou para baixo, at que sua borda azulada esteja ntida; abre-se ento o condensador de campo ou o diafragma para preencher todo o campo, obtendo-se assim um feixe luminoso exatamente centrado. Esta iluminao crtica ou de Khler portanto, obtida quando o condensador focaliza a luz no objeto e a luz transmitida do objeto para a objetiva quase que preenche completamente as lentes. LIMPEZA E LUBRIFICAO A. Parte ptica Vimos que a falta de nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Isto pode ser evitado pelo hbito de limpeza peridica.

1. Oculares Com a objetiva de menor aumento focalizada em uma preparao, gire as oculares e verifique se existem partculas que acompanham o movimento; caso existam elas, podem estar nas duas superfcies e neste caso ambas devem ser limpas com um bulbo de borracha e cotonete. Para retirar eventuais manchas de leo, dedos; umedecer um cotonete com solvente apropriado (lcool a 70%GL ou ter), tomando cuidado para no inundar as lentes , e secar imediatamente com um leno de papel. Freqentemente basta projetar o hlito na superfcies das lentes e limp-las. Limpe freqentemente as oculares com leno de papel fino; pois o contato com os clios e mesmo poeira podem suj-las. Nunca toque as lentes com os dedos, pois gordura atrai poeira. Uma precauo especial requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol, pois podem penetrar na rea de fixao das lentes dissolvendo a cola, bem como produzir pelcula sobre as lentes. 2. Objetivas Cada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revolver e aps a limpeza recolocada na posio original, para tanto, usar o mesmo mtodo descrito para as oculares. No entanto, como as superfcies das lentes so menores que as das oculares, recomendamos inspecion-las com uma pequena lupa manual. Para retirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de plo muito macio.

Aps o uso da objetiva de imerso, retirar o excesso de leo com um papel de filtro e terminar a limpeza com um cotonete levemente embebido de ter . Jamais usar lcool na limpeza do leo de imerso, pois este no dissolvido pelo lcool, mas forma com ele um precipitado branco. Nunca tente desmontar as objetivas ou oculares, pois poder desalinhar as lentes ou coloc-las na ordem ou posio erradas. Se houver necessidade de limp-las internamente, deve-se envi-las ao servio especializado. 3. Condensador Tanto o condensador de campo como o que contm o diafragma devem ser limpos com lcool ou ter. Cuidadosamente limpe as lentes, primeiro retirando a poeira, em seguida aplicando o lquido de limpeza e enxugando com papel macio. B. Parte mecnica A lubrificao tambm deve ser regular, especialmente do macromtrico, que a parte mecnica mais vulnervel, evitando assim o acmulo de poeira e areia. Antes de proceder a lubrificao, a sujeira das partes metlicas devem ser eliminadas com lcool, e enxugadas com tecido de algodo macio e re-lubrificadas, colocando um pequena quantidade de lubrificante na base da cremalheira. Depois move-se para cima e para baixo, a fim de espalh-lo. A cremalheira do condensador assim como macro- e micromtrico podem ser lubrificados com vaselina neutra. Importante: Esses procedimentos s so vlidos para equipamentos que tm cremalheiras visveis. Nunca force um macro ou micromtrico que esteja emperrado ou duro. Evite deixar o equipamento em locais que recebam luz solar ou calor por muito tempo, pois estes podem derreter as graxas, danificando o mecanismo, ou descolar as lentes. til reservar uma pina para limpar detritos ou fragmentos acumulados em reentrncias, bem como dispor de alicates e chaves de fenda ( fendas, estrela, philips), para apertar ou folgar alguma pea deslocada. Para as partes expostas, suficiente limp-las com tecido umedecido com gua e sabo neutro, mas, pode-se aplicar platina uma diminuta quantidade de vaselina neutra. C. PARTE ELTRICA Se o equipamento apresenta problemas na hora de acender a lmpada pode-se verificar a tomada, o fusvel e a lmpada do mesmo. Tomadas: devem estar inteiras, com os fios bem firmes a ela, caso contrrio, aconselha-se a sua substituio.

Fusveis: Desligue e retire o equipamento da tomada e procure o fusvel geralmente localizado na parte inferior ou posterior do equipamento. So constitudos por um tubo de vidro com duas extremidades de metal (uma de cada lado) com um diminuto fio no meio. Este fio deve estar inteiro. Caso contrrio, o fusvel dever ser trocado por outro do mesmo tipo. A sua identificao fica em uma das partes de metal (caso no tenha identificao, consulte o manual do equipamento). Lmpadas: verifique se ela est bem atarraxada no bocal e se seus "filamentos" encontram-se inteiros. Evite pegar na lmpada com os dedos, faa-o com um leno de papel, pois existem lmpadas halgenas, que ao serem tocadas com os dedos, queimam. PROPOSTA DE CONTROLE E USO Geralmente, laboratrios ou salas de aula possuem muitos equipamentos, tornando o controle de conservao difcil. Aqui temos algumas dicas. O equipamento deve ser identificado com uma etiqueta onde contenha o seu nmero de srie, a que laboratrio pertence e a que bancada. Pode ser como no exemplo dado. No de srie: Tombo: Laboratrio de: Bancada no: Todas as bancadas devero ter uma identificao que contenha a relao de equipamentos que fazem parte dela.

Antes da aula de laboratrio, o responsvel deve dar as instrues cada lder de grupo (por equipamento) ou usurio. Este usurio receber uma lista contendo todos os itens a serem checados antes e depois do uso. Encontrando alguma irregularidade, deve comunicar ao responsvel ou professor, que dever fazer a apurao do fato para que o usurio ou grupo responsvel pelo equipamento, assuma os custos do reparo. Obs: ver exemplo de lista de verificao, abaixo:

Verificao do equipamento no: Data: ____ /_____ /_____ turno: ITENS Oculares Obj. 4x obj. 10x obj. 20x obj. 45x obj.100x tomada lmpada charriot espelho revlver Antes ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim Depois ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim ( )bom ( )ruim

condensador ( )bom ( )ruim

Obs: Autores: Solange Peixinho - Departamento de Zoologia - UFBA Tatiana Cardeal de Souza Monteiro - Tcnica em microscopia Bernardino de Almeida Monteiro Fo. - Of. De Manuteno de Eq. pticos NUMEP - UFBA Fonte: http://www.zoo1.ufba.br/teclab1.html Tcnicas de Laboratrio 2: Manuteno de cutelaria e vidraria, preparao de espcimes 2.1. Cutelaria :Os instrumentos metlicos podem ser limpos em lcool a 95 , seguido de ter, guardados em recipiente forrado com papel de alumnio e contendo glicerina. 2.2. Limpeza de vidraria A vidraria em geral pode ser lavada simplesmente com gua, gua e sabo ou por meio de solues especiais, como o detergente Extran, soluo de cido ntrico a 10% ou ainda soluo sulfocrmica. O mtodo clssico para limpeza de alta qualidade de vidraria, particularmente lminas e lamnulas, consiste em coloc-las numa soluo sulfocrmica, cujo preparo requer muito cuidado: a uma soluo saturada de bicromato de potssio (500 ml) contida num balo de vidro refratrio (h reao exotrmica), adicionar 900 ml de cido sulfrico lentamente, agitando e resfriando sob gua corrente, at dissolver todo o precipitado de bicromato. Usar a soluo enquanto os cristais de bicromato permanecem no fundo do recipiente. Uma frmula mais simples dada por Bradbury em 1973 (apud Sanderson, 1994) Soluo de bicromato de potssio a 3% ..................90 ml cido sulfrico concentrado................... ............... 10 ml

Aps a imerso da vidraria em uma das solues, lavar vrias vezes em gua corrente, finalizando com duas lavagens em gua destilada. As lminas podem ser estocadas em lcool absoluto ou lcool absoluto acidificado (100:1). Os recipientes de vidro muito usados, podem ser mergulhados na soluo sulfocrmica forte, sem tratamento prvio e na soluo mais fraca recomenda-se ferver previamente a vidraria em gua e sabo por cerca de 30 minutos e posteriormente coloc-la na soluo sulfocrmica durante um ou dois dias Atualmente as lminas de boa qualidade so vendidas pr-lavadas e na maioria dos usos basta remover poeira e gordura, agitando-as em recipiente com lcool. Em pases tropicais as alteraes de lminas e lamnulas podem ser muito rpidas e deste modo, a superfcie de vidro torna-se opalescente. Em certos casos a camada branca que se forma solvel em cido, assim basta uma lavagem numa soluo de lcool acidificado pelo cido actico para que volte a transparncia (100:1) Em relao s lminas usadas, sobretudo com preparaes em algum meio de montagem, como blsamo do Canad, s vezes mais econmico descart-las, no entanto possvel recuper-las da seguinte forma : colocar as lminas em um recipiente de boca larga, com tampa esmerilhada contendo uma mistura em partes iguais de gua, lcool a 95 e xilol; agita-se de tempos em tempos e usa-se medida em que for precisando, tendo o cuidado de enxug-las com um tecido bem limpo. A secagem das lamnulas requer delicadeza, pois so muito frgeis, portanto indicado enxuglas segurando-as entre os dedos polegar e indicador da mo esquerda, se no for canhoto. 2.3. Preparao e observao de espcimes. O estudo de protozorios geralmente feito por meio de preparaes fresco, obtidas de infuses, de culturas mistas ou puras, quando so utilizados corantes vitais, supra-vitais e certas tcnicas sem corantes. Mais adiante forneo algumas tcnicas para este tipo de exame. No entanto vrias observaes so feitas em lminas permanentes, onde os protozorios foram eventualmente anestesiados, depois fixados, corados e finalmente montados em um meio apropriado. As preparaes de parasitos sanguneos so feitas como esfregao, sem meio de montagem ou lamnula, observados apenas com a objetiva de imerso. Numerosas tcnicas para preparaes permanentes so descritas por Langeron (1934) e Kudo (1985). Na disciplina Zoologia I, a diversidade da vida animal apreciada na zona entremars de uma praia rochosa, cujo ambiente favorvel vida das formas ssseis e sedentrias, como esponjas e cnidrios, filos objeto de nosso estudo prtico. Como a disciplina j tem organizada uma coleo de referncia dos metazorios do local de estudo, praia da Pituba, na ocasio da excurso so coletados apenas novas ocorrncias ou material de reposio, naturalmente com a orientao do professor acompanhante. Na tabela II apresento as tcnicas bsicas para anestesia, fixao e conservao dos principais grupos de animais marinhos, destinados a formar uma coleo para estudos morfolgicos e taxinmicos. Finalizo esta parte do texto, apresentando algumas tcnicas especficas para esponjas e cnidrios, a exemplo de preparaes de espculas e de esqueleto para o primeiro filo e montagens totais e de cortes histolgicos para o segundo. 2.3.1. Preparao de infuses. Um mes antes da data prevista para exame em classe, devem ser preparadas as infuses, conforme as seguintes instrues : Coloque uma boa quantidade de vegetais um vasilhame de vidro, previamente limpo, onde no tenha sido colocado nenhum fixador( formol, lcool, etc). Ponha gua, de preferncia obtida em uma fonte natural. Cubra o recipiente com gaze e prenda a mesma com cordo ou elstico. Coloque a preparao em local iluminado. 2.3.2. Meio simples para cultura de Paramecium. Voc pode fazer meio simples para cultura e deve realizar repicagem quando as infuses ou culturas esto muito ricas . Para o meio de cultura, os passos so os seguintes: Ferva por 20 minutos, 1000 mL de gua de torneira com 4 a 6 gramas de capim ou alface cortadas em fragmentos de 2 a 3 cm.

 Aps 24 horas, distribua apenas o lquido em tubos de ensaio, e adicione um gro de arroz em cada. Ponha uma gota de infuso em lmina escavada, previamente limpa e desengordurada e examine-a para verificar a riqueza do (s) protozorio (s) desejado(s) para cultivo. Com uma ala de platina retire alguns protozorios e coloque-os nos tubos de ensaio, cobrindo-os com rolha de algodo. A repicagem deve ser semanal; no entanto as culturas podem ser mantidas por meses, bastando adicionar, uma vez por mes, pequenos fragmentos de folhas previamente fervidas juntamente com um pouco do lquido. 2.3.3. Tcnicas de observao Para imobilizao : soluo Agar-agar 1 ou 1,5%, em estado lquido 40C (usar temperatura ambiente). Para diminuio dos movimentos : goma arbica a 0,5%; alginato de sdio a 0,5%. Para anestesiar: fosfato monopotssico a 1,4%; lcool metlico a 10%; sulfato de magnsio a 33%; soluo de Corri: lcool metlico a 96%(10 cc); gua destilada (90cc); clorofrmio(3 gotas ); sulfato de nquel a 0,1%(1 a 2 min. em saleira contendo 20 gotas de meio de cultura + 2 gotas do anestsico). Para evitar a dessecao: bordear a lamnula com vaselina. 2.3.4. Solues corantes para protozorios. Coloraes vitais so feitas por determinados corantes em altas diluies, os quais so acumulados em tecidos ou pores especiais da clula viva sem exercerem ao nociva sobre a mesma, enquanto uma colorao ps-vital obtida por meio de um corante vital sobre clulas ou tecido extrados de um animal vivo. A diferena bsica consiste na reao ser em meio oxidante (ps-vital ) ou ao abrigo do ar ( vital), o que naturalmente d resultados diferentes. Por exemplo, o verde janus s evidencia o condrioma aps aerao. As coloraes vitais no so coloraes propriamente ditas, pois o que existe uma acumulao do corante em pores especiais da clula, que parece depender da carga eltrica da molcula corante. Os corantes eletro-positivos so bsicos e os eletro-negativos so cidos; o primeiros evidenciam estruturas eletro- negativas e os segundos, estruturas eletro-positivas. A colorao propriamente dita s ocorre aps a morte da clula. No estudo de protozorios, so usadas portanto, colorao vital, colorao propriamente dita, ou ps-mortem, assim como aplicao de um mordente, isto , substncia que age como intermediria entre corpos sem nenhuma afinidade qumica, propiciando uma combinao tripla entre tecido, mordente e corante. Colorao vital : a maioria dos corantes aplicada em concentraes muito baixas (0,01% ) a fim de diminuir a toxicidade sobre as clulas; so muito utilizados os seguintes corantes bsicos, os mais adequados ao estudo de protozorios: azul de metileno (1: 10 000 = 0,01g em 100cm de gua destilada) evidencia ncleo e grnulos citoplasmticos eventualmente vacolos. carmim em p em diminutas quantidades para observao de tomada de alimento, vacolos digestivos e movimento de ciclose dos mesmos em protozorios ciliados. vermelho neutro (1: 1 000= 100cm de gua destilada + 0,01g de corante ou 1: 3 000 = 0,03g de corante em 100cm de gua destilada) indicador de pH e se acumula em vacolos digestivos; quando pH inferior a 7, a colorao apresenta-se vermelho forte quando o pH est nas zonas neutra e bsica a colorao amarelada. verde janus B (1: 10 000) evidencia o condrioma aps um certo perodo de exposio ao ar; precedido pelo vermelho neutro o resultado ainda melhor. Colorao propriamente dita : os mesmos corantes vitais em concentraes elevadas ou em solues alcolicas ou acticas, matam e coram protozorios; alm disto outros corantes no vitais so usados, a exemplo de: verde de metila a 1% em cido actico a 1%, cuja mistura deve ser preparada no momento de usar, na proporo 1:1, cora ncleos; soluo cianopcrica, uma mistura de soluo saturada de cido pcrico (fixador) com traos de azul de anilina (corante), indicada para a observao da expulso de tricocistos em ciliados. A soluo de Noland atua, ao mesmo tempo, como fixador e corante:

Fenol saturado em soluo aquosa - 80cm formol a 40% - 20cm glicerina - 4cm violeta de genciana - 20 mg Soluo mordente : usa-se a soluo de lugol para evidenciar flagelos, clios, grnulos de glicognio e cistos de parasitos intestinais; na preparao da frmula abaixo, os sais so triturados e a gua adicionada lentamente, at a dissoluo total: iodeto de potssio 2 g iodo metlico sublimado 1 g gua destilada 200 ml 2.3.5. Preparao de metazorios. A escolha da tcnica fica condicionada ao propsito do estudo. Para estudos de taxinomia os animais so anestesiados, fixados e conservados e a partir da a maioria dos grupos zoolgicos requer preparaes microscpicas. Basicamente so de dois tipos: montagens totais ou cortes, estes ltimos destinados ao estudo de clulas e tecidos. 2.3.5.1. Preparao de solues fixadoras e conservantes. Para o estudo taxinmico da maioria dos grupos zoolgicos, formol e lcool etlico so utilizados como fixadores e conservantes. A soluo aquosa conhecida como formol ou formalina contm um gaz, aldedo frmico (CHO), que dissolve na gua no mximo at 40% e comercializado a 37%. Tem penetrao rpida nos tecidos e poder coagulante sobre as protenas, sendo portanto um bom fixador, mas cuja fixao lenta. Tambm bom conservante, pois sabe-se que tecidos podem nele permanecer por mais de 10 anos sem grandes modificaes de suas estruturas. A fixao pelo lcool etlico empregada sobretudo em anatomia vegetal e em histoqumica, sendo pouco recomendada na maioria de preparaes de tecido animais. Porm, muitos metazorios destinados s colees de museu so conservados em lcool. Em qualquer dos casos, o lquido fixador deve sempre ser substitudo. Formol ou formalina - O termo formalina refere-se soluo diluida e formaldedo soluo estoque. Por exemplo, formol ou formalina a 10%, que a diluio usual para fixao ( 90 ml de gua e 10 ml da soluo estoque), na realidade contm 4% de formaldedo. A soluo concentrada quando exposta luz decompe cido frmico e gua, e a diluda usualmente estocada com carbonato de clcio, de magnsio para neutralizao ou emprega-se o fixador tamponado com sais. Nunca adicione a soluo estoque (formaldedo) a carbonatos, pois a evoluo rpida de CO pode explodir. Uma frmula muito usada o formol salino: adiciona-se x volumes de formol neutralizado a y volumes de soro fisiolgico ou gua do mar; O soro para invertebrados em geral na concentrao de 0,6% de cloreto de sdio(NaCl) e para vertebrados 0,9%, enquanto que para organismos marinhos suficiente a gua do mar. A formalina deve ser neutralizada prxima ao perodo de uso, pois este estado no duradouro. Uma maneira prtica e barata muito utilizada consiste em: colocar na soluo de formol uma gota de vermelho neutro a 1% ; misturar com um basto de vidro e notar a colorao vermelha, que indica pH cido; a seguir gotejar lentamente uma soluo bsica, por exemplo, hidrxido de potssio (KOH) a 10%, ao mesmo tempo em que se mistura as solues; continuar misturando at que a colorao mude para a faixa do amarelo, que indica um pH prximo da neutralidade. Toda turbidez indcio da formao de paraformaldedo, o qual deve ser removido por filtrao antes do uso. O formol do comrcio um lquido incolor cujos vapores podem provocar comicho nos olhos, dermatite, diminuio da olfao e em certas pessoas, bronquite e febre, bem como endurecimento da epiderme. Portanto, a rigor a fixao deveria ser feita sob capela e evitar qualquer contato com a pele. Para o manuseio das peas conservadas em formol necessrio lav-las em gua corrente e em seguida enxagu-las em gua levemente amoniacal, a fim de suprimir o odor.

lcool etlicoGeralmente emprega-se o alcometro para determinar a porcentagem de lcool absoluto numa mistura aquosa, pois diferentes concentraes de lcool tem diferentes densidades e especficas gravidades. Por isto o instrumento flutua mais para cima ou mais para baixo e a concentrao aparece na escala . No entanto, nem sempre esse instrumento est disponvel, por isto transcrevo de Langeron (1934) a tabela de diluio de Gay-Lussac (Tabela I) 2.3.5.2. Anestesia, fixao e conservao de animais marinhos. As indicaes contidas na tabela II referem-se preparao de animais marinhos para formar uma coleo destinada ao estudo taxinmico. Isto porque os txons contidos no programa de Zoologia I so predominantemente marinhos e a aula de campo sobre diversidade feita num costo rochoso.

importante assinalar que para cada grupo de metazorio h uma maneira adequada de usar o (s) anestsico (s). Por exemplo, no caso dos cnidrios, animais estudados em Zoologia I, esta etapa crucial. Assim, a melhor forma de anestesiar hidrozorios coloniais despejando sobre a colnia com plipos distendidos em um recipinte (com reduzida quantidade de gua) uma soluo 1:1 de gua do mar e cloreto de magnsio a 7,5% (preparado em gua destilada) (MIGOTTO, com.pess.). Quanto aos membros da classe Anthozoa, tem dado bons resultados a posterior aplicao do mesmo anestsico (cloreto de magnsio) em zoantdeos transportados ao laboratrio, mantidos em aqurio iluminado por lmpada Gro-Lux (cujo espectro semelhante luz solar) e uma vez distendidos, transferidos para pequenas cubas de vidro ou plstico com volume conhecido de gua do mar e expostos luz (Gro-lux), a fim de garantir que os plipos fiquem abertos. Quando isto ocorre despeja-se o mesmo volume do anestsico a 7,5%, lentamente, mas todo de uma vez, com cuidado para no agitar demais a gua do mar com a colnia ( ROHLFS DE MACEDO, 1986). Na ausncia da lmpada mantenha as colnias sob arejamento (existem pequenas bombas pilha) expostas luz do sol e proceda como descrito acima. Para os demais membros dos antozorios, a proporo 1:1 (soluo de MgCl2: gua do mar ) deve ser mantida, assim como o modo de aplicao do anestsico descrito para os zoantdeos. No caso de preparaes histolgicas , alm dos agentes fixadores citados, podem ser usados outros aldedos, como paraformaldedo, glutaraldedo, acroleina, bem como o lcool metanol, acetona, cidos acticos e pcrico, freqentemente em misturas. Por exemplo, o fixador microanatmico conhecido como Bouin, muito usado no estudo de invertebrados marinhos, contm cido pcrico, formaldedo e cido actico. No Brasil necessria uma autorizao do exrcito para a compra de cido pcrico, provavelmente pelo risco de exploso se aquecido bruscamente. Alm do Bouin, so usados vrios outros fixadores anatmicos, bem como citolgicos. Aps a aplicao de qualquer um desses fixadores, vrias etapas se sucedem: desidratao e clarificao; banhos de parafina, em estufa; incluso em parafina, resina ou similar; realizao de cortes ao micrtomo; montagem sobre lmina; remoo do meio de incluso; colorao e montagem em resina sinttica O estudo da morfologia interna de Anthozoa requer preparaes histolgicas e freqentemente estas preparaes so fundamentais na prtica de identificao taxinmica dos mesmos. Neste caso recomenda-se a utilizao de uma soluo fixadora nomeada Susa de Heidenhain ou Bouin aquoso ( este ltimo apenas quando no requerida a preservao de estruturas calcrias), e colorao pelo mtodo tricrmico de Mallory ou Gomori. Frmulas e procedimentos so encontrados em manuais de tcnicas histolgicas. Se voc tem interesse em saber mais sobre tcnicas histolgicas, clique no site da FAFIS- Faculdade Adventista de Fisioterapia (Cachoeira, Bahia); l h um bom texto sobre o assunto.

2.3.5.3. Esponjas: preparao de lminas a) Espculas calcrias isoladas Colocar um fragmento da esponja sobre lmina e cobrir com lamnula. Com uma pipeta de Pasteur gotejar, junto borda da lamnula, hipoclorito do sdio (Q- Boa) e deixar dissolver totalmente a pea. Lavar em gua 2 a 3 vezes, depois com lcool a 95 e retirar os lquidos com tiras de papel de filtro, dispostas na borda oposta. Deixar secar sobre placa aquecedora, retirar cuidadosamente a lamnula e montar em resina sinttica. b) Espculas silicosas isoladas Substituir o hipoclorito de sdio por cido ntrico concentrado e passar a preparao por uma chama de lamparina a lcool, sem lamnula e sob exausto. Repetir o procedimento, evitando colocar o cido na lmina quente, at que a parte orgnica seja dissolvida. Lavar , cuidadosamente, 2 a 3 vezes com gua de pisseta, seguida de jato de lcool a 95% Secar e montar.. Tabela I. Diluio de lcool etlico (Gay Lussac) lcool desejado mL de gua/100 mLde lcool a 100% mL de gua/100 mLde lcool a 95% 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 6,5 13,25 20,54 28,59 37,58 47,75 50,37 72,82 88,6 107,44 130,26 158,56 194,63 242,38 308,9 408,5 574,75 907,09 6,41 13,33 20,95 29,52 39,18 50,22 63,00 77,99 99,89 117,57 144,46 178,71 224,08 287,28 381,90 539,66 855,55

Fonte: Langeron, 1934. c) Espongina Colocar pequenas fatias de esponja em amonaco e deixar na estufa at o aparecimento das fibras. Lavar vrias vezes e desidratar na srie de lcool at o 95% Colocar 2 vezes em lcool butlico normal por cerca de 30 minutos em cada. Montar em resina sinttica. d) Cortes espessos : Demospongiae Fazer cortes com lmina de barbear, perpendiculares e tangenciais superfcie da esponja conservada em via mida ou seca. Desidratar e diafanizar em lcool butlico normal por cerca de 30 minutos

Montar em resina sinttica. e) Cortes espessos : Calcarea Cortar longitudinalmente um exemplar conservado em lcool. Corar em fuccina cida, soluo alcolica (80%) a 1% Desidratar em lcool a 95% (20 min) e butanol normal (2 vezes, 30 min) Colocar em 2 banhos de parafina 58 - 60 C (2 horas cada) Incluir em parafina e fazer cortes transversais com lmina de barbear Retirar a parafina com xilol Montar em resina sinttica. 2.3.5.4. Cnidaria : preparao de lminas a) Montagem total de hidrides Cortar uma poro da colnia conservada em lcool a 70% e/ou retirar uma hidromedusa do lquido conservante. Corar em carmim borcico* por cerca de 10 minutos Diferenciar em lcool-cido** Desidratar em lcool a 90% por cerca de 10 minutos Completar a desidratao e fazer a diafanizao em lcool butlico normal (2 vezes, 30 minutos cada) Montar em resina sinttica * Carmim borcico : soluo de brax a 4% (100ml) + carmim (1g) ; ferver at que o carmim se dissolva, adicionar 100ml de lcool a 70% e filtrar aps 24 horas. **lcool -cido : 4 gotas de cido concentrado para 100 mL de lcool. b) Preparao de lminas de escleritos, esqueleto calcrio. Colocar um pequeno pedao de tecido em tubo de ensaio ou sobre lmina e dispor gotas de hipoclorito de sdio para em poucos minutos dissolver o tecido. Lavar repetidas vezs com gua, depois com lcool a 95% Deixar secar ou pipetar e colocar sobre lmina, tambm permitindo a secagem completa. Montar em resina sinttica. c) Preparao de nematocistos de antozorios Obter fragmentos dos tentculos, acncios, filamentos gstricos ( preferencialmente de animal vivo) e dispor sobre lminas com uma gota de gua. Dissociar as estruturas com estiletes finos e contrastar com lugol, no caso de no haver microscpio contraste de fase. Cobrir com lamnula. TABELA II : ANESTESIA, FIXAO E CONSERVAO DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE METAZORIOS MARINHOS - Subsdio construo de colees. TXON ANESTESIA FIXAO CONSERVAO

Porifera Demospongiae Formol salino N a lcool a 80% 10% ou lcool a 80% lcool a 80% lcool a 80%

Calcarea Cnidaria Hidrides Sifonforos

MgCl2 a 7,5% MgCl2 a 7,5%

Formol N a 5% lcool a 70% Formol fluido Zenker* N + Formol N a 5% de

Hidromedusas Scyphozoa

MgCl2 a 7,5% MgCl2 a 7,5%

Formol salino/N, Formol 5% salino/N,5% Formol salino e Formol N a 10% N a 10%

Anthozoa

MgCl2 a 7,5%

Formol salino N Formol N a 5% a 10% (zoantdeos) ou lcool a 70% Cloreto de Lavagem; lcool a mercrio(100g), 30%; lcool a cido 50%; at lcool a actico(3ml) e 70%. gua do mar (300ml)

Ctenophora

MgCl2 a 7,5%

Platyhelminthes Distender entre duas Formol N a 10% lcool a 70% lminas levemente amarradas com fio e colocar no refrigerador. Nemertini Sipuncula Echiura Annelida Polychaeta MgCl2 a 7,5% ou Formol N a 10% Lavagem em gua leo de cravo em de torneira; lcool 500 ml de gua do a 70% mar. MgCl2 a 7,5% Formol salino e Formol a 5% ou N a 10% lcool a 85% Mentol MgCl2 a 7,5% MgCl2 a 7,5% Formol N a 10% lcool a 70% Formol N a 10% Formol N a 10% Formol (24h) a 5% lcool a 70%

Oligochaeta Hirudinea Arthropoda Pycnogonida Crustacea

Gotejar lcool etlico Formol salino e lcool a 70% na gua c/ o animal N a 10% Gotejar lcool etlico Formol N a 10% lcool a 70% na gua c/ o animal Gotas de lcool em Formol salino N Formol N a 10% gua ou MgCl2 a a 10%; injetar ou lcool a 70% 7,5% em espcimes com 3% de grandes. glicerina Distender entre 2 Formol N a 10% lcool a 70% lminas e aplicar MgCl2 a 7,5% MgCl2 a 7,5% Formol N a 10% lcool a 70% MgCl2 a 7,5% ou Formol N a 10% lcool a 70% gotas de lcool etlico na superfcie da gua do mar. MgCl2 ou gotas de Formol salino e lcool a 70% lcool etlico a 0,5- N a 10% 1%. (poucos dias), tambm injetar na superfcie ventral.

Mollusca Polyplacophora

Gastropoda Bivalvia

Cephalopoda

Ectoprocta

Mentol na superfcie Formol N a 10% lcool a 70% da gua c/ o animal Mentol;gua Formol N a 10% Formol N a 10% destilada ou de ou lcool a ou lcool a torneira:Ophiuroidea 75%;injetar no 70%,podendo perstoma de depois ser Echinoidea. guardado seco. MgCl2 a 7,5% lcool a 25% lcool a 70% MgCl2 a 7,5 % em Formol N a 5% lcool a 70% gua do mar Anestesiar Formol N a 10% Formol N a 10% Ascidiacea com MgCl2 na superfcie da gua

Echinodermata

Holothuroidea Hemichordata Chordata Urochordata

Cephalochordata MgCl2 na superfcie Formol N a 10% Formol N a 10% da gua ou lcool a 70% Piscis Formol a Lavagem em 10%(10-20 gua;lcool a 80% dias); injetar em exemplares maiores de 5cm. * Zenker : Bicloreto de mercrio (5g) + bicromato de potssio (2,5g)+ sulfato de sdio (1g) + gua destilada ( 100 ml) + cido actico, adicionado no momento do uso (4ml). Nota: os txons grifados so os filos e formol N significa neutralizado. Referncias KUDO, Richard R. Protozoologia. traducido por Aristeo Acosta Carreon. Mexico: Continental, 1985. 905p. il. LANGERON, M. Prcis de Microscopie. 5a. edio, Paris: Masson et Cie, 1934. 1205p. ROHLFS DE MACEDO, C.M. Microanatomia e sistemtica das espcies de Zoanthus Lamarck, 1801 (Cnidaria, Anthozoa, Zoanthidea) do litoral e ilhas ocenicas do Brasil. 1986.141p. il. Mestre em Cincias Biolgicas, rea Zoologia, Museu Nacional/Universidade Federal do Rio de Janeiro.1986. SANDERSON, J.B. Biological microtechnique. Preston: BIOS Scientific Publishers Limited, 1994. 224p. Fonte: http://www.zoo1.ufba.br/teclab2.html --