ANEXO A CRITERIOS PARA LA ACREDITACIN DE LABORATORIOS QUE REALIZAN ANALISIS MICROBIOLGICOS Introduccin El presente anexo es una gua auxiliar,

para los laboratorios y los evaluadores, de requisitos especficos que deben garantizarse al realizar ensayos microbiolgicos y puede ser aplicable a laboratorios que obtienen resultados como parte de un servicio o de actividades de investigacin y desarrollo. Se considera que los ensayos microbiolgicos incluyen ensayos de esterilidad, lmite microbiano, deteccin, aislamiento, recuento e identificacin de microorganismos y sus metabolitos en diferentes materiales y productos o cualquier otro tipo de ensayo en el que utilicen microorganismos como parte de un sistema de deteccin. Este documento puede tambin servir de gua para los laboratorios que utilizan tcnicas en reas relacionadas con la microbiologa, como bioqumica, biologa molecular y cultivos celulares. Para una mejor aplicacin de los criterios definidos en este anexo, los mismos se han asociado a un apartado general de la norma de referencia NC-ISO/IE 17025:2006, sin que los subapartados estn en concordancia exacta con los de la referida norma. 5.3-Instalaciones y condiciones ambientales 5.3.1-Instalaciones 5.3.1.1-Es recomendable que los laboratorios dispongan de dos tipos de dependencias: a) reas auxiliares (oficinas de administracin, aseos, guardarropas, almacenes, archivos, etc.) b) reas de ensayo y otras (preparacin de material, esterilizacin, etc) donde se llevan a cabo las actividades especficas de un laboratorio de microbiologa. Los requerimientos recomendados en esta gua estn dirigidos para estas ltimas. 5.3.1.2-La ubicacin, el diseo y la distribucin de las diferentes dependencias del laboratorio debe ser tal que el peligro de contaminacin de las muestras, ya sea derivado de las condiciones ambientales, contaminacin cruzada u otras causas, sea mnimo. Se debe favorecer un diseo "sin camino de regreso", es decir que la circulacin de las muestras y el personal sea en una sola direccin, con entrada y salida diferentes. Cuando esto no sea posible, deben tomarse medidas alternativas, como las siguientes: a) realizar los procedimientos de manera secuencial, tomando las debidas precauciones para garantizar la integridad de los ensayos y de las muestras; b) separacin de actividades en el tiempo o en el espacio. 5.3.1.3-En general, es conveniente que existan reas separadas o claramente designadas para las siguientes actividades: - recepcin y almacenamiento de muestras. - preparacin de muestras. - mantenimiento de las cepas de referencias

- reas analticas diferenciadas de las reas de apoyo. - reas de apoyo (preparacin de medios de cultivo y reactivos, esterilizacin y descontaminacin, almacenamiento, lavado de material, etc.). 5.3.1.4-El rea de lavado (despus de la descontaminacin) puede compartirse con otras partes del laboratorio, siempre que se tomen las debidas precauciones para evitar la transferencia de trazas de substancias que podran afectar negativamente al crecimiento microbiano. La conveniencia de la separacin fsica debe juzgarse considerando los parmetros especficos del laboratorio (por ejemplo, nmero de ensayos realizados, tipo de ensayos, etc.). 5.3.1.5-Con el objetivo de reducir el riesgo de contaminacin y facilitar las labores de limpieza y desinfeccin, se recomiendan a continuacin y a ttulo de ejemplo, una serie de medidas. Estas no son exhaustivas y no todas ellas podrn aplicarse en todas las situaciones. a) referentes al diseo: las reas de trabajo deben ser suficientemente espaciosas como para poder mantenerse limpias y ordenadas. El espacio requerido depender del volumen de anlisis realizados y de la organizacin interna del laboratorio; - uniones cncavas entre suelo, paredes y techos; - iluminacin empotrada en los techos; - las reas de trabajo deben estar debidamente ventiladas, lo que puede conseguirse mediante ventilacin natural o forzada, o mediante el uso de unidades de aire acondicionado, equipadas con filtros para el polvo en la entrada de aire; - disponer de suficiente espacio para almacenamiento; - las tuberas que transportan lquidos no deben pasar por encima de las superficies de trabajo, a no ser que estn provistas de un revestimiento hermticamente sellado; - no se recomienda el empleo de persianas internas en las ventanas. Si esto fuera inevitable, deben estar incluidas en el programa regular de limpieza del laboratorio; - utilizacin de pantallas solares exteriores. b) referentes a materiales: las paredes, techos, suelos y superficies de trabajo deben ser lisas, de material no absorbente y fcil de limpiar y desinfectar; - las superficies de madera de instalaciones y accesorios deben estar debidamente protegidas y selladas. Evitar las maderas rugosas y sin revestir; - no se recomiendan los azulejos como material de recubrimiento de las superficies de trabajo. c) otras: minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la realizacin de los ensayos; - los armarios, estanteras, equipos y material de laboratorio deben estar colocados de forma que se evite la acumulacin de polvo y se facilite su limpieza. Se recomienda el uso de armarios hasta el techo; - para facilitar las labores de limpieza, los telfonos y ordenadores que se encuentren dentro del rea de ensayo pueden estar provistos de un protector. -

El sistema de ventilacin de los equipos informticos debe estar orientado de manera que se evite la contaminacin. Por ejemplo, el flujo de aire no debe dirigirse hacia las superficies de trabajo; utilizar lavamanos de accionamiento no manual; ausencia de mobiliario, documentos y objetos que no sean los estrictamente necesarios para la realizacin de los ensayos. No debe haber plantas y objetos personales innecesarios en las reas de trabajo.

5.3.1.6-Cuando el trabajo en condiciones estriles sea limitado o tenga lugar slo ocasionalmente, puede ser suficiente con utilizar una superficie de trabajo limpia, siempre que se apliquen tcnicas aspticas rigurosas. 5.3.1.7-Deber establecerse un programa documentado de limpieza y desinfeccin del laboratorio, los equipos y las superficies, que tenga en cuenta los resultados de la vigilancia de las condiciones ambientales y la posibilidad de contaminacin cruzada. 5.3.1.8-Dependiendo del tipo de ensayos que se realicen, el acceso al laboratorio de microbiologa debe restringirse al personal autorizado. Cuando existan este tipo de restricciones, el personal deber conocer: a) el uso restringido de una determinada rea; b) las restricciones impuestas al trabajo que puede realizarse en dichas reas; c) las razones para imponer esas restricciones. 5.3.1.9-En el laboratorio de microbiologa, debe utilizarse la indumentaria apropiada para el tipo de ensayos que se realicen. El personal debe despojarse de esta indumentaria antes de abandonar el rea. 5.3.1.10-El personal debe estar capacitado para trabajar en este tipo de reas evitando la contaminacin hacia el interior y hacia el exterior. 5.3.1.11-El laboratorio para realizar sus ensayos microbiolgicos, debe poseer el correspondiente autorizo del Centro Nacional de Seguridad Biolgica. 5.3.2-Condiciones ambientales 5.3.2.1-Si el laboratorio detecta una posible contaminacin debe definir los recuentos mximos de microorganismos que considere aceptables y establecer medidas a tomar para corregir las situaciones en que se sobrepasen estos lmites. Estas medidas incluyen, por ejemplo: - limpieza y desinfeccin a fondo del laboratorio (incluyendo superficies de trabajo y filtros del aire acondicionado); - incremento de la frecuencia de las operaciones de limpieza y desinfeccin; - modificaciones en los procedimientos de limpieza y desinfeccin; - la instalacin de unidades de aire acondicionado. 5.3.2.2-Debe considerarse la posibilidad de contaminacin cruzada causada por los equipos. Por ejemplo: - el material desechable debe estar limpio o estril, en funcin de su uso;

- el material de vidrio reutilizable debe estar debidamente limpio o estril, en funcin de su uso; - lo ideal es que los laboratorios dispongan de ms de un autoclave. Sin embargo, siempre que se tomen las debidas precauciones para separar las cargas de descontaminacin y esterilizacin, y siempre que exista un programa documentado de limpieza para controlar las condiciones ambientales tanto externas como internas del autoclave, el laboratorio puede utilizar un nico autoclave. -es conveniente que los procesos de esterilizacin sean controlados peridicamente. 5.4- Mtodos de ensayo y validacin de mtodos. 5.4.1-validacin de mtodos 5.4.1.1-Los ensayos microbiolgicos cualitativos que exprese el resultado en trmino de deteccin / no deteccin, y los mtodos de confirmacin e identificacin se validarn siempre que sea necesario determinando la especificidad, la desviacin positiva y negativa, el lmite de deteccin, el efecto matriz y los otros indicadores requeridos. Se considerar las recomendaciones dadas por la AOAC en 1999 y otros documentos similares. 5.4.1.2-Para la validacin de los mtodos cuantitativos se asumir todo lo recomendados para los mismos en normas como la de EURACHEM, FDA, ISO y AOAC. Siempre se considerar las diferentes matrices en que se emplear el ensayo. 5.4.1.3-A los sistemas de ensayo que se venden en el mercado (kits) siempre se le deben comprobar su utilidad en las condiciones propias que trabaja el laboratorios, verificando los datos sobre validacin procedentes de fuentes alternativas y del fabricante. El laboratorio debe solicitar a los fabricantes datos sobre validacin y evidencias de que cumplen un sistema reconocido de aseguramiento de la calidad. Cuando no se disponga de datos completos sobre la validacin, el laboratorio debera completar la validacin del mtodo antes de utilizarlo con carcter rutinario. Cuando se haya realizado una validacin, el laboratorio tendr que verificar peridicamente que se cumplen los parmetros documentados, por ejemplo, utilizando muestras inoculadas, etc. 5.4.1.4-Las validaciones pueden utilizar muestras contaminadas naturalmente y contaminadas artificialmente tratando que simulen lo mejor posible las condiciones naturales. Se considerarn diferentes niveles de contaminacin. 5.4.2-Incertidumbre de la medicin 5.4.2.1-El clculo de la incertidumbre en esta materia est siendo abordado en la actualidad por la comunidad de laboratorios y se espera que en un futuro se disponga de unas directrices ms claras en el campo de la microbiologa. 5.5- Equipos 5.5.1- Reactivos y medios de cultivos

5.5.1.1-Se debe garantizar que la calidad de los reactivos y medios de cultivos sea la apropiada para los ensayos. Se verificar la calidad de cada lote de reactivo crtico a su entrada al laboratorio usando controles positivos y negativos de microorganismos que sean reconocidos. 5.5.1.2-Se recomienda realizar controles adicionales con carcter aleatorio, para asegurarse de que los productos siguen cumpliendo las especificaciones requeridas. Estos controles pueden incluirse en el programa interno de control de calidad. 5.5.1.3-Los medios de cultivo, productos en polvo deshidratados y reactivos comerciales deben consumirse antes de la fecha de caducidad. El laboratorio debe registrar la fecha de recepcin, la fecha de caducidad y la fecha de apertura del envase. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Todos los envases, especialmente los que contengan medios deshidratados, deben estar hermticamente cerrados. No deben utilizarse medios deshidratados que presenten compactacin o un cambio de color. 5.5.1.4-Para la preparacin de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada, desionizada o de smosis inversa, y que haya sido sometida a controles peridicos que aseguren su calidad (conductividad, pH y carga microbiana) y llevar un registro actualizado de los mismos. 5.5.1.5-Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, controlarse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. En los documentos ISO 7218 e ISO/TR 11133-1 se incluyen una serie de directrices para la preparacin y esterilizacin de medios, as como los tiempos de almacenamiento recomendados. 5.5.1.6-Los lotes de medios preparados segn frmula en el laboratorio deben verificarse a travs de promociones de crecimientos con el cultivo de microbianos procedentes de una coleccin reconocida y debe verificarse que los medios selectivos inhiben el crecimiento de microorganismos no deseados. 5.5.1.7-Debe verificarse la esterilidad de los medios y diluyentes preparados en el laboratorio. 5.5.1.8-El laboratorio debe asegurarse de que los medios y reactivos (incluidas las soluciones madre) estn debidamente etiquetados para garantizar su identificacin, concentracin, condiciones de almacenamiento, caducidad y/o perodos recomendados de almacenamiento. Asimismo, debe poder identificarse a la persona que ha preparado el medio o reactivo, la fecha de preparacin y la fecha de caducidad, ya sea por medio de una etiqueta o de un registro apropiado. 5.5.2- Equipos e instrumental 5.5.2.1-Normalmente los equipos, sus componentes e instrumental de laboratorio deben mantenerse limpios. Se esterilizaran o desinfectarn segn un programa establecido, tales como: - aparatos de filtracin, homogenizadores peristltico, batidoras, contenedores de cristal o plsticos, asas de siembras

baos de agua, incubadoras, gabinetes microbiolgicos, autoclaves, freezer y refrigeradores termmetros, balanzas, medidores de pH, contadores de colonias

5.5.2.2-Los laboratorios contarn con procedimientos que garanticen la limpieza y esterilizacin de los materiales hasta el momento en que van a ser usado. La preparacin de los materiales debe ser de tal forman que no interfiera con los crecimientos microbianos. 5.5.2.3-La medicin de temperatura es crtica en casi todos los ensayos microbiolgicos y en el mantenimiento de muestras y materiales. Por ello especial cuidado se debe tener en la calibracin y control de todos los instrumentos dedicados a la medicin de temperatura 5.5.2.4-La estabilidad, uniformidad y distribucin de la temperatura, as como el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio de ella en los equipos y locales donde es fundamental este indicador (baos de agua, incubadora, autoclaves, hornos) deben estar establecidas y registrados sus comportamientos y los cambios o reparaciones que se ejecuten en los equipos e instrumentos relacionados con este indicador. 5.5.2.5-Se mantendrn registros que demuestren el correcto ciclo de las esterilizaciones y sus controles. 5.6 Trazabilidad de las mediciones 5.6.1-Cepas de referencia 5.6.1.1-Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referencia de microorganismos suministrados por una coleccin nacional o internacional reconocida. . Se debe mantener procedimientos que demuestren la identificacin y autenticidad de las cepas, su manejo para mantener pureza y viabilidad, demostracin de la estabilidad y el control de ellas. 5.6.1.2-Debe demostrarse que las cepas de referencias mantienen sus caractersticas originales. Se recomienda realizar bancos de subcultivos que faciliten una reserva con las condiciones iniciales y con un nmero de pases bien definido. Se puede seguir las indicaciones del Anexo B de la ISO/TR 11133-1 para la creacin y manejo de estos bancos, incluyendo las preparaciones de trabajo. 5.6.1.3-En caso de emplear clulas estas deben ser suministradas por una coleccin nacional o internacional reconocida. Se debe demostrar su autenticidad, viabilidad y pureza. Tener procedimientos de manejo que eviten la contaminacin cruzada y con micoplasmas, reproducirlas con los medios y reactivos ptimos para mantener sus condiciones iniciales y garantizar su trazabilidad. 5.6.2-Materiales de referencia y materiales de referencia certificados. 5.6.2.1-Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados proporcionan la trazabilidad esencial en las mediciones y son utilizados, por ejemplo, para demostrar la exactitud de los resultados, calibrar equipos y

mtodos, validar mtodos y permitir la comparacin de mtodos al ser utilizados como patrones de referencia. Se recomienda su utilizacin siempre que sea posible. 5.6.2.2-Los materiales y substancias de referencia, as como los materiales de referencia certificados, deben almacenarse y manipularse en unas condiciones que no alteren su integridad, de acuerdo con un procedimiento documentado y el mtodo de ensayo correspondiente. 5.8- Manipulacin de los objetos de ensayo 5.8.1-El transporte y conservacin de la muestra debe ser en condiciones que garanticen su integridad. Estas condiciones deben ser controladas y registradas. La flora microbiana puede ser sensible a factores tales como temperatura o duracin del almacenamiento y transporte, por lo que es importante verificar y registrar el estado de la muestra cuando se recibe en el laboratorio. 5.8.2-En el traslado debe asegurarse que no se contamine la muestra y en casos que sea necesario que no existan escapes que puedan afectar a las personas o el ambiente. 5.8.3-Los ensayos deben realizarse tan rpido como sea posible. Las muestras que se encuentran a la espera de ser analizadas deben almacenarse en condiciones adecuadas para reducir al mnimo cualquier modificacin en la poblacin microbiana presente. 5.8.4-El laboratorio debe disponer de un procedimiento que incluya la entrega de muestras. Si la muestra es insuficiente o si se encuentra en mal estado debido a deterioro fsico, temperatura incorrecta, envase roto o etiquetado defectuoso, el laboratorio debe rechazarla o describir su estado en el informe del ensayo, si es posible realizar el trabajo. 5.8.5-El envase y etiquetado de las muestras puede estar, en potencia, altamente contaminado y las muestras deben manipularse y almacenarse con precaucin para evitar que se propague la contaminacin. 5.8.6-Debe existir un procedimiento documentado para la conservacin y eliminacin de muestras. Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de ensayo estn altamente contaminadas, deben descontaminarse antes de su eliminacin. Si es necesario, las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido los resultados del ensayo, o ms tiempo. 5.8.7-Los laboratorios deben contar con procedimientos para la correcta disposicin de los materiales contaminados de manera que no afecten a los ensayos en ejecucin, las muestras para prximos ensayos, ni a las personas, ni al ambiente. 5.9-Aseguramiento de la calidad de los resultados 5.9.1.-El laboratorio contar con procedimientos diseados para la realizacin del control interno de manera que pueda realizar la evaluacin contina del trabajo. El mayor

objetivo es asegurar la consistencia de los resultados da a da y su conformidad con los criterios establecidos. 5.9.2-El control interno considerar la evaluacin de reactivos, medios de cultivos, calidad de materiales y cultivos de referencias, mtodos de ensayos, y otros. La frecuencia de los controles se establecer en proporcin a la frecuencia de los fallos. Bibliografa 1. ONARC, 2007-Criterios de acreditacin para laboratorios de ensayo y calibracin, Rev.05. 2. NC-ISO/IEC 17025:2006-Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibracin. 3. G-ENAC-04 Rev. 3 Nov. 2002. Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan anlisis microbiolgicos. 4. EURACHEM Guidance Document No.1. WELAC Guidance Document No. WGD 2. Accreditation for Chemical Laboratories. Abril 1993. 5. AOAC, 1999. AOAC International Qualitative and Quantitative. Microbiology Guidelines for Methods Validation. Microbiology guidelines: Journal of AOAC International vol. 82, no. 2. 6. 6. ISO 16140:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods. 7. ISO/TR 11133-1:2000. Microbiologa de los alimentos para consume humano y animal. Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para el Aseguramiento de la Calidad para la preparacin de medios de cultivo en el laboratorio