Catlisis enzimtica

O H2N NH2 ureasa

+

3H 2O

2 NH4

HO

HCO 3

Objetivos:

Estudiar el mecanismo de reaccin para una catlisis enzimtica (enzima ureasa de frijol de soja) Determinar la temperatura de mxima actividad cataltica Obtener la constante da Michaelis (km) y rapidez mxima mediante la ecuacin de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofte

Introduccin:

Los enzimas son catalizadores extraordinarios. Estos incrementos de velocidad se basan en el reordenamiento de los enlaces covalentes en una reaccin catalizada por enzima. Reacciones qumicas de muchos tipos tienen lugar entre sustratos y grupos funcionales de los enzimas (cadenas laterales de aminocidos especficos, iones metlicos y coenzimas). Los grupos funcionales catalticos de los enzimas pueden formar de manera transitoria un enlace covalente con un sustrato activndolo para la reaccin o puede transferirse transitoriamente un grupo del sustrato a un grupo del enzima. Estos grupos disminuyen la energa de activacin (acelerando la reaccin) al crear una ruta de reaccin alternativa de menor energa. Otra explicacin se basa en las interacciones no covalentes entre el enzima y el sustrato. Gran parte de la energa requerida para disminuir la energa de activacin proviene generalmente de interacciones dbiles no covalentes entre el sustrato y el enzima. El factor que diferencia realmente las enzimas de la mayora de los catalizadores no enzimticos es la formacin de un complejo ES especfico. La interaccin entre enzima y sustrato en este complejo esta canalizada por las mismas fuerzas que estabilizan la energa protenica. La formacin de cada interaccin dbil en el complejo ES viene acompaada de una pequea liberacin de energa libre que proporciona un cierto grado de estabilidad a la interaccin. La energa procedente de enzima-sustrato se denomina energa de fijacin la cual es una fuente principal de energa libre utilizada por las enzimas para disminuir la energa de activacin de las enzimas. Una vez unido el sustrato al enzima, grupos funcionales catalticos situados adecuadamente ayudan a la rotura o formacin de un enlace mediante diversos mecanismos, entre los que se encuentran la catlisis acido-base, la catlisis

covalente y la catlisis por ion metlico.

El esquema ms sencillo para explicar la cintica de reaccin de un solo sustrato es el mecanismo de Michaelis y Menten Este tratado asume la formacin reversible de un intermediario enzima-sustrato, que es seguido de una descomposicin del complejo al producto.
[ ] [ ]

Es muy til transformar la ecuacin de Michaelis Menten en una forma lineal para analizar grficamente los datos. Uno de los mejores mtodos es el de LineweaverBurk. En este caso se sacan inversos de (11): [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Graficando contra

[ ]

[ ]

el valor de la pendiente de la lnea es

Metodologa: Parte A
Preparacin de la solucin de ureasa

Se suspendieron 100 mg de ureasa en 50 ml de agua, se agit fuertemente

Extraccin de ureasa de frijol de soja

Se tritur en un mortero 0.5g de soja y se agregaron 10 ml de etanol al 30% Se centrifug a 2500 rpm durante 15 minutos. Se mezcl todos los sobrenadantes en un recipiente y se homogeniz

Parte B
Temperatura de actividad mxima del catalizador

En un tubo de ensaye perfectamente limpio y seco, se coloc 20 ml de la solucin de urea 0.02M y se fij el tubo al soporte universal. Se coloc el bao sobre la parrilla de calentamiento.

Se equilibro el bao a 30C, se agregaron 4 gotas del extracto de ureasa al tubo de ensaye y se puso en marcha el cronometro en el momento de mezclar. Inmediatamente se introdujo la celda al tubo.

Se hicieron mediciones de conductividad para la reaccin cada10 segundos (12 lecturas en total). Otros equipos realizaron el experimento a 24, 40, 50 y 60C.

Parte C
Parmetros de la ecuacin cintica

Se realiz nuevamente la hidrlisis de 20 ml de urea con ureasa a la temperatura ptima que se obtuvo en la parte A, a las concentraciones 0.015, 0.004 y 0.007M

Resultados:
Temperatura de trabajo: 24C

Parte B
Tiempo (s) Tamb 24C 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 30.1 30.1 30.3 30.3 30.5 30.5 30.7 30.7 30.7 30.9 31.0 Conductividad (S/cm) 34C 40C 50C 20.8 33.9 35.2 36.3 36.7 37.4 37.8 38.4 38.6 38.8 39 39 39.3 80 81.4 83.5 84.5 86.9 91.2 92.3 94.6 96.3 97.5 98.7 99.8 10.6 19.3 19.83 20.4 20.9 21.4 22.0 22.2 22.9 23.2 23.6 24.3 60C 9.7 25.2 25.4 25.8 26.2 26.4 26.8 27.0 27.3 27.6 27.7 28.1 28.1

Parte C
Tiempo (s) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Conductividad (S/cm) .015M .004M .007M 17.8 35.8 36.7 37.6 37.9 38.2 38.2 38.4 38.4 38.4 38.6 7.53 22.1 22.6 23.7 24.3 24.6 25.0 25.0 25.2 25.2 25.3 8.04 29.0 29.5 29.6 29.6 29.6 29.8 29.8 29.8 29.8 29.8

110 120

38.6 38.6

25.5 25.5

29.8 29.8

Anlisis de Resultados:

Para determinar la rapidez inicial r0 para cada temperatura de realiz un grfico de conductividad (S/cm) en funcin del tiempo sabiendo que esta reaccin

T 24C
31 30.9 30.8 Conductividad (S/cm) 30.7 30.6 30.5 30.4 30.3 30.2 30.1 30 0 20 40 60 t (s) 80 100 120 y = 0.008848485x + 29.90484848 R = 0.955531648

T 34C
41 40 39 Conductividad (S/cm) 38 37 36 35 34 33 0 20 40 60 t(s) 80 100 120 140

y = 0.044475524x + 34.64242424 R = 0.887649589

T 40C
104

99

y = 0.193951049x + 77.95151515 R = 0.981810313

Conductividad (S/cm)

94

89

84

79 0 20 40 60 80 100 120 140

t (s)

T 50C
25 24

y = 0.048436364x + 18.43036364 R = 0.995786542

Conductividad (S/cm)

23 22 21 20 19 18 0 20 40 60 80 100 120 140

t (s)

T 60C
28.5 28

Conductividad (S/cm)

y = 0.027762238x + 24.99545455 R = 0.987599318

27.5 27 26.5 26 25.5 25 0 20 40 60 80 100 120 140

t (s)

De acuerdo a las ecuaciones obtenidas en los grficos anteriores la rapidez inicial para cada temperatura est reportada en la siguiente

T(C) 20 34 40 50 60

r0 0.008848485 0.044475524 0.193951049 0.048436364 0.027762238

tabla:

En esta reaccin el fenmeno de aumento de la rapidez de la reaccin cuando aumenta la temperatura se sobrepone a la desnaturalizacin de la enzima debido a su origen protenico. El resultado de estas interacciones da como resultado un mximo de velocidad a una temperatura dada, conocida como temperatura optima. En el siguiente grfico se puede observar que la temperatura ptima experimental para esta catlisis enzimtica es la de 40C

Rapidez inicial en funcion de T

0.25

r0
0.2 0.15 0.1 0.05 0 15 20 25 30 35 40 T (C) 45 50 55 60 65

Una vez conociendo la temperatura ptima se determin la rapidez inicial a la concentracin 0.015, 0.004 y 0.007M. En esta parte experimental se trabajo con 60C como temperatura optima debido a que los datos experimentales no los proporcion otra seccin de laboratorio La rapidez inicial se determin realizando un grfico de conductividad en funcin de tiempo

Rapidez inicial para la solucion .015M

39.5 39 38.5 Conductividad (S/cm) 38 37.5 37 36.5 36 35.5 0 20 40 60 Tiempo (s) 80 100 120 140 y = 0.02034965x + 36.62727273 R = 0.712605084

Rapidez inicial para la solucion .004M

26.5 26 25.5 Conductividad (S/cm) 25 24.5 24 23.5 23 22.5 22 21.5 0 20 40 60 80 100 120 140 Tiempo (s) y = 0.028321678x + 22.65909091 R = 0.808905481

Rapidez inicial para la solucion .007M

29.9 29.8 29.7 Conductividad (S/cm) 29.6 29.5 29.4 29.3 29.2 29.1 29 28.9 0 10 20 30 Tiempo (s) 40 50 60 70 y = 0.012285714x + 29.08666667 R = 0.717129929

La rapidez inicial a las diferentes concentraciones de acuerdo a las ecuaciones de los grficos anteriores son las siguientes:
[Urea] .02M 0.015M 0.004M 0.007M r0 0.027762238 0.02034965 0.02832168 0.01228571

Para determinar la constante de Michaelis (Km) [la cual indica el nmero de molculas de sustrato convertidas a productos por sitio activo en la unidad de tiempo] Se utiliz la ecuacin de Lineweaver-Burk ya que sta al estar en una forma lineal se pueden analizar grficamente los datos [ ] Al graficar en el eje de las abscisas y la pendiente de la lnea es contra
[ ]

, da un intercepto

en el eje de las ordenadas, de [

[Urea] .02M 0.015M 0.004M 0.007M

r0 0.027762238 0.02034965 0.02832168 0.01228571

1/r0 36.02015083 49.1408943 81.3953507 35.3086424

1/[Urea] 50 66.6666667 142.857143 250

Grafica de Lineweaver-Burk
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 45 65

1/r0

y = 0.468512203x + 14.98877472 R = 0.986683529

85

105 1/ [Urea]

125

145

165

Nota: Se despreci el valor de la concentracin .004M ya que al saber que la rapidez de reaccin disminuye conforme disminuye la concentracin del sustrato y en este caso hubo un aumento se puede suponer que los datos experimentales son errneos. De esta forma

Sabiendo que

0.031257
Otra forma de determinar la constante de Michaelis es mediante la grafica de Eadie-Hofstee que muestra la velocidad en funcin de la relacin velocidad/concentracin de sustrato
[Urea] r0 r0 /[Urea]

.02M 0.015M 0.004M 0.007M

0.027762238 0.02034965 0.02832168 0.01228571

1.3881119 I.35764333 1.75510143 7.08042

Los datos de la concentracin 0.004M se despreciaron por los motivos antes mencionados

Grfica de Eadie-Hofstee
0.03 r0 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 1.3 1.4 1.5 r0 /[Urea] 1.6 1.7 1.8 y = -0.029410318x + 0.064246612 R = 0.708441099

De esta forma de acuerdo a la ecuacin de Eadie-Hofstee: [ ] y = b - mx Por lo tanto el valor de:

Y el valor de

Es importante conocer el valor de Km debido a que este refleja la afinidad de la enzima por el sustrato, como se puede observar mediante los dos grficos se obtuvo un valor de Km pequeo (.0312 y .0294) el valor de una Km pequea

refleja una alta afinidad de la enzima por el sustrato porque a una baja concentracin del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de la velocidad mxima. Se obtuvieron casi el mismo valor de Km y R max mediante los dos mtodos grficos y se puede observar la efectividad de estos mtodos.

Conclusiones De acuerdo a los datos reportados en la literatura la temperatura ptima para la enzima de ureasa es de 60C lo cual nos indica que los datos proporcionados a la T de 40C son incorrectos. La Km reportada de la ureasa es de .025, experimentalmente obtuvimos un valor aproximado a .03 con lo cual se puede concluir que la enzima utilizada (ureasa) reflej una alta afinidad por el sustrato (urea). Se cumplieron satisfactoriamente los objetivos ya que se logr determinar la temperatura de mxima actividad cataltica para esta reaccin y de igual manera se comprendi el mecanismo de reaccin para una catlisis enzimtica y se lograron determinar y de esta manera se comprob la efectividad del mtodo de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee.

Bibliografa
Lehninger/ Principios de Bioqumica / Ediciones OMEGA /Tercera Edicin 2001 J. L. Latham /Elementos de cintica de reacciones / Editorial el manual moderno 1980 Yolanda Marina/Calculo de parmetros de rapidez en cintica qumica y enzimtica/UNAM Cuautitln