Bio 9

R$ 5,00
ano II nmero 9 julho/agosto de 1999
ESPECIAL
MELANCIA SEM SEMENTES Modelos Animais

GENTICA DE CAMUNDONGOS
Algodo Colorido Extrao de DNA Doena de Chagas
NOVOS CONHECIMENTOS NA PATOGNESE DA DOENA DE CHAGAS
Biossegurana e Alimentos Transgnicos

www.biotecnologia.com.br
BIOTECNOLOGIA/KL3
BIOTECNOLOGIA/KL3
Biotecnologia e Biossegurana
ENTREVISTA
Parceria Necessria
Entrevista concedida a Fernanda Diniz Lucas Tadeu Ferreira
Julian Kinderlerer, Diretor Assistente do Instituto de Biotecnologia, Lei e tica de Sheffield, Inglaterra
A regulamentao de pesquisas biotecnolgicas comeou a ser discutida no Reino Unido no incio da dcada de 70, quando cientistas de vanguarda se depararam com determinados avanos da biologia que exigiam respostas rpidas quanto a questes de segurana. Em 1975, as tcnicas de manipulao gentica j eram vistas como instrumentos bastante rpidos e eficientes para promover maior conhecimento sobre a ao dos genes e, assim, proporcionar benefcios substanciais e, por que no dizer, imprevisveis. Por meio de dessas tcnicas, os cientistas vislumbravam um horizonte de inmeras solues para a agricultura, como, por exemplo, a extenso do ciclo de vrias culturas e a fixao natural de nitrognio nas plantas pelo ar; para a rea de sade, a possibilidade de cura de algumas doenas causadas por deficincias genticas, como o diabetes e o cncer, entre outros avanos inimaginveis. Assim, o Reino Unido foi uma das primeiras naes;compreendendo Inglaterra, Esccia, Irlanda do Norte e Pas de Gales, a desenvolver uma estratgia de regulamentao para as pesquisas de biotecnologia. Um documento escrito por Lord Ashby, em 1975, recomendava que as tcnicas de manipulao gentica deveriam ser permitidas, mas sob rigorosas condies de segurana. Naquela poca, s se conseguia modificar microrganismos em laboratrio e os riscos e medidas de conteno e precauo eram analisados sob dois aspectos: o dos cientistas e tcnicos que desenvolviam e manipulavam os organismos modificados, e o da populao em geral. O meio ambiente, incluindo plantas e animais, no foi considerado naquela ocasio. Hoje, a biotecnologia avanou muito e produtos geneticamente modificados j so comercializados em vrios pases. A biossegurana vem acompanhando essa evoluo no mesmo grau de complexidade para evitar os riscos inerentes liberao desses novos organismos. O Reino Unido um exemplo de pas que funciona dessa forma, por ser dotado de uma excelente estrutura de fiscalizao e acompanhamento das pesquisas, desenvolvimento, comercializao e importao de organismos geneticamente modificados. L, esse trabalho realizado em conjunto pelos 15 pases integrantes da Unio Europia, que seguem as mesmas diretrizes e procedimentos tcnico-cientficos de biossegurana. Para falar sobre o desenvolvimento da biotecnologia e da biossegurana no Reino Unido e na Unio Europia, a revista Biotecnologia, Cincia & Desenvolvimento entrevistou, no dia 11 de junho de 1999, na Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, localizada em Braslia, o Diretor Assistente do Instituto de Biotecnologia, Lei e tica de Sheffield, Inglaterra, Julian Kinderlerer. Ele tambm professor do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia da Universidade de Sheffield e membro de vrios comits no Reino Unido e na Europa relacionados com a biotecnologia, legislao e tica, entre eles os de Biossegurana e Proteo Ambiental da Inglaterra, e vem prestando consultoria sobre esses temas a diversos pases, como Brasil, Rssia, frica do Sul, Malsia, Tailndia e Mxico, entre outros.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
BC&D - O senhor poderia descrever, sucintamente, o estgio atual de desenvolvimento da biotecnologia agrcola no Reino Unido? Kinderlerer - A agricultura no Reino Unido um setor relativamente pequeno, mas muito eficiente. As principais atividades agropecurias esto voltadas para o cultivo do trigo e de hortalias, como batata, alface e outras, e para a criao de ovelhas e gado. O desenvolvimento da biotecnologia no Reino Unido acompanha as tendncias da Unio Europia, que, no momento, em funo principalmente da forte presso exercida pelos movimentos ambientalistas contrrios aos organismos geneticamente modificados, tem aprovado poucos produtos transgnicos. As primeiras liberaes de OGMs (organismos geneticamente modificados) no Reino Unido aconteceram em 1996 e os produtos liberados foram: hbridos de canola com tolerncia a herbicida, somente para produo de sementes; e soja tolerante ao herbicida glifosato, para importao, armazenamento e uso para nutrio animal e no para cultivo. Ainda em 1996, houve consentimento, por parte do Governo, para liberao restrita de canola geneticamente modificada com tolerncia a herbicida (glufosinate ammonium) para importao de gros, produo de rao animal e uso industrial; e de milho resistente a insetos e a herbicida, somente para importao de gros. Em 1997, o Reino Unido recebeu um pedido de importao de milho modificado geneticamente tolerante ao herbicida glifosato somente para produo de rao e no para cultivo. Esse pedido ainda no foi autorizado pelo Governo. BC&D - O senhor poderia explicar os procedimentos adotados para a comercializao de produtos transgnicos no Reino Unido? Kinderlerer - A comercializao de produtos transgnicos no Reino Unido depende de autorizao da Unio Europia. As decises tomadas pela Unio Europia quanto comercializao so automaticamente adotadas pelo Reino Unido e demais pases membros. As liberaes so analisadas caso a caso e monitoradas quanto aos efeitos diretos e indiretos ao meio ambiente, e as exigncias podem ser ampliadas ou no, de acordo com a Unio Europia. Se as anlises forem satisfatrias, os produtos transgnicos recebem licena para comercializao e podem ser colocados no
mercado sem restries. Hoje, h poucos produtos geneticamente modificados sendo comercializados na Unio Europia, entre eles destacam-se milho, cana-de-acar e canola. No Reino Unido, por enquanto, o nico produto transgnico desenvolvido, que est sendo cultivado comercialmente, sob forte monitoramento, a canola com tolerncia a herbicida e, dentro em breve, teremos tambm variedades transgnicas de batata resistentes a viroses, que esto em fase final de desenvolvimento. BC&D - Como a populao na Europa reage aos produtos transgnicos? Ou seja, o senhor acha que o povo europeu est preparado para consumir esses produtos?
por questes puramente ideolgicas, sem nenhum embasamento tcnico-cientfico. Eu acho que os jornalistas tm obrigao de apurar melhor os fatos para no divulgar notcias distorcidas, especialmente relacionadas sade e alimentao para no causar pnico e desinformao na populao. E mais ainda: os cientistas no esto agindo de maneira enftica, atravs da mdia, para mostrar opinio pblica a realidade e os avanos das pesquisas biotecnolgicas. Diante dessa situao, o Parlamento Ingls tem- se esforado no sentido de divulgar documentos tcnicos sobre os transgnicos, atravs da mdia, com o objetivo de mostrar populao os benefcios que os transgnicos podem proporcionar. BC&D - A Unio Europia tem realizado campanhas de esclarecimento da populao em relao aos transgnicos? Kinderlerer - Como eu j disse anteriormente, ns estamos tendo srios problemas na Europa, especialmente em funo do movimento das organizaes no-governamentais contrrias aos transgnicos. As campanhas de esclarecimento devem ser conduzidas por instituies de pesquisa e empresas que desenvolvem produtos transgnicos, que so, a rigor, os primeiros interessados. Os cientistas precisam ser mais enfticos ao mostrar os benefcios que podem vir a ser gerados pelos transgnicos; e mais do que isso: provar que eles so equivalentes aos produtos convencionais, s que ainda muito mais monitorados e avaliados at chegarem ao consumidor. Alm disso, no h 100% de segurana em nenhum produto alimentar, seja ele convencional ou transgnico. Se me perguntarem, por exemplo, se seguro comer bife e batatas, eu vou responder que, possivelmente, no. Porque entre 10 mil ou mais, que so seguros, pode existir pelo menos um que no seja, devido a contaminaes ou a outros fatores que a mdia aponta com freqncia, alis. BC&D - Que tipo de controle o Reino Unido exerce sobre as pesquisas e produo de organismos geneticamente modificados? Kinderlerer - Em nvel de pesquisas, ns temos um conjunto de leis e vrios comits consultivos que assessoram o Governo na regulamentao e fiscalizao dos transgnicos, de acordo com o
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Kinderlerer - A reao da populao europia aos produtos transgnicos muito negativa. Uma pesquisa realizada no incio do ms de junho deste ano mostrou que menos de 1% da populao aceita os transgnicos. A oposio aos produtos geneticamente modificados na Europa extremamente forte. Os grupos ambientalistas mais expressivos, especialmente o Greenpeace, o Friends of the Earth e a Sociedade de Proteo dos Pssaros, entre outros, alm de rgos de defesa do consumidor, enfatizam bastante, atravs dos veculos de comunicao, que os transgnicos podem vir a causar malefcios sade humana e ao meio ambiente. A populao torna-se presa fcil desses grupos pelo desconhecimento generalizado da cincia e dos seus benefcios. Isso, no fundo, uma grande irresponsabilidade da mdia por conceder espao a esses grupos que contestam os transgnicos
nvel de segurana biolgica exigido. Para os organismos geneticamente modificados de menor risco, com amplo histrico documentado de utilizao segura e sem registros de efeitos negativos para o meio ambiente, podemos trabalhar livremente, seguindo, obviamente, os procedimentos de segurana bsicos para qualquer manipulao em laboratrio. Mas, para desenvolver pesquisas com organismos de maior risco, precisamos pedir permisso antes mesmo de iniciarmos os trabalhos em laboratrios. Essa permisso solicitada ao Comit Consultivo de Modificao Gentica (Advisory Committee on Genetic Modification-ACGM ), que assessora o Departamento de Sade e Segurana na aprovao e liberao de organismos geneticamente modificados. Esse Departamento tem total autonomia e poder de polcia para impedir qualquer desobedincia legislao pertinente. Os tcnicos do Governo podem ainda auditar a qualquer momento as instituies para verificar se as pesquisas esto sendo realizadas de acordo com a lei, independente de serem transgnicos ou no. Em termos de liberao no campo, o processo muito semelhante ao do Brasil. A Embrapa, por exemplo, quando quer realizar testes de campo com produtos transgnicos, tem que ter autorizao prvia da Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) do Ministrio da Cincia e Tecnologia. No Reino Unido, o processo o mesmo: as instituies interessadas tambm tm que obter permisso do Comit Consultivo em Liberaes no Meio Ambiente (Advisory Committee on Release into the Environment - ACRE) e a fiscalizao feita por tcnicos designados pelo Departamento de Sade e Segurana. Resumindo: a regulamentao das pesquisas que envolvem organismos geneticamente modificados est dividida em trs nveis: em primeiro lugar, esto os procedimentos para as pesquisas dentro dos laboratrios; em segundo, para as liberaes no campo; e, em terceiro, para o cultivo comercial e consumo de produtos transgnicos. Essa terceira etapa depende da aprovao de um outro rgo: o Comit de Anlise de Novos Produtos e Processos Alimentares ( Advisory Committee on Novel Foods and Processes - ACNFP), que assessora o Ministrio da Agricultura, Pesca e Alimentao e a Secretaria de Estado da Sade e suas Aplicaes na avaliao dos riscos da liberao desses produtos para a alimentao humana. Em breve, dentro de poucos meses, ser
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constitudo ainda um novo comit, que vai analisar a liberao de produtos transgnicos destinados alimentao animal.
"A populao torna-se presa fcil desses grupos ambientalistas pelo desconhecimento generalizado da cincia e dos seus benefcios"
BC&D - Se um produto transgnico foi liberado para comercializao nos Estados Unidos ele automaticamente aprovado tambm na Europa ou tem que ser submetido s autoridades locais? Kinderlerer - No. Ele tem que ser submetido s autoridades de um dos 15 pases que compem a Unio Europia. Cada um desses pases tem poder para liberar ou negar a importao de um produto transgnico comercializado nos Estados Unidos e a deciso ser respeitada e acatada pelos outros 14. Ou seja, na Europa no se fala em decises locais; se um dos pases diz no introduo de um produto transgnico, diz no por toda a Europa.
fiquei surpreso com a tcnica empregada por eles: as ervas so simplesmente arrancadas com a mo, sem uso de herbicidas ou de qualquer outra tecnologia. E essa prtica muito comum na agricultura de subsistncia em vrios pases no mundo. Diante disso, apesar da introduo de plantas tolerantes a herbicidas levar ao uso desses produtos, representa, ao mesmo tempo, melhoria na qualidade de vida do trabalhador rural, alm do aumento de produo e produtividade e maiores ganhos econmicos. Contudo, em escala de cultivo comercial, eu acredito que o uso dessas plantas levar diminuio progressiva do uso desses produtos devido ao aperfeioamento constante dessa tecnologia. BC&D - A clonagem da ovelha Dolly suscitou muitas polmicas em todo o mundo por envolver aspectos legais, ticos e religiosos. O senhor acha que o avano da cincia deve ser livre ou ter algum tipo de limitao? Kinderlerer - Vamos comear pelas pesquisas com animais. H muitos anos, os cientistas vm trabalhando para aperfeioar o padro gentico dos animais atravs de tcnicas de melhoramento clssico e, assim, aumentar a produo de carne, leite e resistncia a doenas e condies adversas. Por exemplo, as ovelhas que, antigamente, s tinham uma cria por ano, em mdia, podem ter hoje 20 ou mais filhotes, em funo do desenvolvimento de tcnicas de inseminao artificial e manipulao de embries, ao longo dos anos. A clonagem nada mais do que uma evoluo desses mtodos e, mais do que isso, uma imitao de um processo da natureza; eu, por exemplo, sou um clone natural, tenho um irmo gmeo idntico. Na pecuria, h uma preocupao constante do homem em desenvolver novas tecnologias que permitam aumentar o rebanho, de modo a atender demanda crescente por carne e leite, em decorrncia principalmente do aumento populacional, alm de proporcionar ganhos de produtividade. A clonagem , sem dvida, a tecnologia mais eficiente para atingir esses objetivos. J a clonagem humana deve ser vista por dois ngulos: do ponto de vista cientfico, pode ser considerada um grande avano, por permitir, a longo prazo, o desenvolvimento de novos rgos para transplantes. Por outro lado, considero inaceitvel a clonagem de seres humanos. Como cientista, eu considero qualquer desafio
"Os cientistas precisam ser mais enfticos ao mostrar os benefcios que podem vir a ser gerados pelos transgnicos"
BC&D - Diversas instituies do agronegcio tm desenvolvido plantas transgnicas com tolerncia a herbicidas. O senhor acha que o cultivo dessas plantas pode aumentar a utilizao de defensivos agrcolas no mundo? Kinderlerer - Vou mencionar um exemplo para tentar responder a essa questo sobre o uso de herbicidas. Quando eu participei de uma reunio no Cairo, h alguns anos, me perguntaram se eu sabia como eles controlavam as plantas daninhas no Egito. Eu disse que no e
vlido para o avano do desenvolvimento cientfico sustentado, desde que respeitados os limites ticos e morais da comunidade. BC&D - Em que reas o senhor acredita que a biotecnologia pode dar respostas mais rpidas nos prximos anos? Kinderlerer - A tcnica que eu considero mais promissora hoje a de mapeamento gentico, que permite armazenar e formar bancos de dados de informaes genticas, alm de estabelecer a proximidade e o distanciamento gentico entre as espcies, o que facilita o desenvolvimento de programas de melhoramento gentico, entre outros. Na verdade, a biotecnologia j vem trazendo avanos significativos, pois tornou possvel a prospeco de genes na diversidade biolgica para aplicao imediata e seu armazenamento para uso futuro. Esses genes tm sido utilizados na agricultura para desenvolver plantas resistentes a doenas, insetos e estresses ambientais e para aumentar o valor nutricional dos alimentos, alm de diminuir as perdas de armazenamento e ps-colheita; na sade humana e animal e na indstria de alimentos, entre outros. Diante de todos os avanos que j vm sendo obtidos pelas tcnicas biotecnolgicas e do potencial que apresentam para desenvolver a agricultura do futuro, eu acho que deve haver um esforo maior, especialmente por parte das empresas governamentais, para repass-las agricultura familiar. No Brasil, por exemplo, empresas como a Embrapa devem centrar suas pesquisas na produo de espcies transgnicas importantes para a agricultura de subsistncia e produo de alimentos acessveis s camadas mais pobres, como a mandioca, que uma das principais fontes de carboidratos. As grandes empresas multinacionais, por razes bvias de mercado, no tm interesse no desenvolvimento dessas variedades transgnicas, o que, alis, no mesmo papel delas. BC&D - Como o senhor avalia o estgio atual das pesquisas de biotecnologia no Brasil? Kinderlerer - Estou muito impressionado com o alto nvel das pesquisas no Brasil, em termos de qualificao profissional dos cientistas, infra-estrutura de laboratrios e com a abrangncia
tcnica dos projetos de pesquisa. Com exceo de naes desenvolvidas como
No Reino Unido, temos um conjunto de leis e vrios comits consultivos que assessoram o Governo na regulamentao e fiscalizao dos transgnicos
EUA, Canad, Reino Unido, Frana e Japo, poucos pases no mundo tm essas qualificaes. No que se refere biossegurana, o Brasil tambm ocupa posio de vanguarda. Em uma reunio da qual participei recentemente, onde estiveram presentes representantes de 18 pases, incluindo Rssia, Nambia, Hungria, Egito e Malsia, entre outros, o Brasil foi dos que mais se destacaram. BC&D - O que motivou essa sua vinda ao Brasil?
interessante participar desses eventos, j que essa troca de experincias e conhecimentos muito importante para aumentar a percepo pblica acerca da biotecnologia, que uma rea do conhecimento que pode vir a trazer inmeros benefcios para a agricultura, sade e meio ambiente. A desinformao e a idia deturpada que a populao, por vezes, tem dos transgnicos, muito por culpa dos meios de comunicao de massa, podem prejudicar o andamento das pesquisas no pas. E a biotecnologia, definitivamente, uma cincia que no pode parar de se desenvolver. importante ainda que a populao, como um todo, saiba que existem normas, procedimentos e protocolos de biossegurana, que avaliam os riscos da introduo e desenvolvimento de produtos transgnicos e que s permitem a sua liberao se eles forem absolutamente seguros para o meio ambiente e sade da populao. Vou aproveitar ainda a minha passagem pelo Brasil para conhecer a regio amaznica. BC&D - Os produtos transgnicos comercializados no Reino Unido tm que ser rotulados? Kinderlerer - Sim. Todos os novos produtos alimentares lanados no Reino Unido tm que ser rotulados para que os consumidores saibam o seu contedo, independentemente de serem geneticamente modificados ou originrios dos seus derivados. De uma maneira geral, o europeu s consome aquilo que ele conhece. Os rtulos existem para isso. BC&D - O senhor acha que o desenvolvimento e a introduo de organismos geneticamente modificados no meio ambiente podem causar riscos biodiversidade brasileira? Kinderlerer - Sim, podem se forem introduzidos de maneira irresponsvel. Mas, para isso, que so feitas as avaliaes de riscos dos impactos no meio ambiente e os demais procedimentos de biossegurana para evitar que eles ocorram. Ao mesmo tempo, a biotecnologia uma importante ferramenta para ampliar os conhecimentos sobre os recursos biolgicos da biodiversidade, atravs, por exemplo, de tcnicas de prospeco e formao de bancos de genes. Essa situao singular no Brasil devido sua megabiodiversidade, especialmente na regio amaznica, que ainda tem muito a revelar para a cincia.
Como cientista, eu considero qualquer desafio vlido para o avano do desenvolvimento cientfico sustentado, desde que respeitados os limites ticos e morais da comunidade
Kinderlerer - Eu vim para participar, como convidado, do Seminrio sobre Clonagem e Transgnicos, realizado na primeira quinzena de junho, no Senado Federal brasileiro, no qual atuei como palestrante em um debate sobre o tema: Clonagem e transgnicos: riscos e benefcios e de uma mesa redonda sobre Biotica e biossegurana: limites e interfaces, alm de apresentar um seminrio sobre biossegurana na Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, tambm como convidado. Eu acho muito
Carta ao Leitor
Ao disponibilizarmos para os nossos leitores e comunidade cientfica esta nona edio da Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento estamos convictos de que, mais uma vez, estaremos contribuindo para promover o debate sadio e plural do avano da biotecnologia no Brasil. Muitos assuntos atuais e polmicos fazem parte desta
BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento KL3 Comunicao Fundador Henrique da Silva Castro Diretor Executivo Mrcio Brasil Diretora de Pesquisa Ana Lcia de Almeida Diretor de Arte Henrique S. Castro F Departamento Comercial, Redao e Edio: SRTV/Sul - Quadra 701 Ed. Palcio do Rdio II Sala 215 - CEP 70340-902 Braslia - DF Tel.: (061) 225-1512 (061) 225-0976 Fax: (061) 224-2830 Projeto Grfico Agncia de Comunicao IRIS (034) 217-2244 (034) 259-0386 http://www.agenciairis.com.br e-mail: iris@agenciairis.com.br E-mail kl3@biotecnologia.com.br Home-Page http://www.biotecnologia.com.br Impresso e Fotolito Grfica So Francisco Assinaturas O pedido de assinatura realizado atravs da carta resposta-comercial encartada em cada revista, por telefonema ou fax diretamente KL3 ou pela Internet atravs dos nossos endereos eletrnicos. A revista no tem vendedores autorizados. ISSN 1414-4522
edio. Com certeza espertaro interesse, troca de conhecimentos e experincias, provocando tambm debates acalorados nos leitores, como por exemplo, a entrevista com o cientista e especialista em biossegurana do Reino Unido, Dr. Julian Kinderlerer, melancia sem sementes, algodo colorido, extrao de DNA, modelos animais de doenas humanas, novos conhecimentos sobre doenas de chagas, vespas como agentes no controle biolgico e muitos outros. Importante destacar que a revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento s tem conseguido, a cada edio, aumentar o nmero e a fidelidade dos leitores graas, acima de tudo, participao sistemtica e ao nvel tcnico-cientfico dos artigos, o que tem nos proporcionado mais foras para levarmos este projeto adiante. Assim, neste momento, queremos externar nossos agradecimentos a todos aqueles que direta ou indiretamente tm contribudo com a Revista, em especial ao Conselho Cientfico, e reafirmar o compromisso pblico de manter a independncia da nossa linha editorial.
Conselho Cientfico
Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Henrique da Silva Castro - Sade; Dra. Johanna Dbereiner - Microbiologia de Solos; Maao Tadano - Agricultura; Dr. Naftale Katz - Sade; Dr. Pedro Juberg - Cincias; Srgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Gentica de Microorganismos; William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Colaboraram nesta edio: Ana Cristina Miranda Brasileiro, Ana Lcia Brunialti Godard, Benedito Antnio Lopes da Fonseca, Edcio Cunha-Neto, Eduardo Romano, Eleusio Curvlo Freire, Fboi Prezoto, Flvio de Frana Souza, Herman S. Mansur, Jean -Louis Guenet, Joo Pereira Leite, Manoel Ablio de Queirz, Rita de Cssia de Souza Dias, Rodrigo L. Orfice, Rbia F. Silva, Simone H. C. Scholze, Vera Cristina TerraBustamante, Wander L. Vasconcelos, Zlia P. Lobato.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Dr. Ivan Rud de Moraes - Toxicologia; Dr. Lus Carlos Bhering Nasser - Filopatologia Conselho Federal de Biologia Dr. Joo de Deus Medeiros Fundao Dalmo Catauli Giacometti Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Gentica; Dr. Jos Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biolgico; Dra. Marisa de Goes - Recursos Genticos Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN Dr. Jos Roberto Rogero
Novas Tecnologias Agricultura
Biomateriais para Fixao de Protenas Vespas - pg 24 Algodo Colorido - pg 36 Extrao de DNA de plantas - pg 40 Melancia sem Sementes - Encarte Especial
- pg 16
Sade
Plasticidade Cerebral e Epileptognese Doena de Chagas - pg 20
- pg 10
Entrevista Pesquisa
Biotecnologia e Biossegurana - Julian Kinderlerer, Sheffield - Inglaterra Gentica de Camundongos
- pg 04
- Encarte Especial
Biossegurana Sociedade
Biossegurana e Vacinas da Dengue
- pg 28
- pg 32
SADE
Plasticidade Cerebral e Epileptognese

Evidncias a partir de estudos neuropatolgicos humanos e experimentais
Joo Pereira Leite
Professor Doutor da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP Departamento de Neurologia, Psiquiatria e Psicologia Mdica Chefe do Laboratrio de Investigao em Epilepsia jpleite@fmrp.usp.br
Vera Cristina Terra-Bustamante

Mdica Assistente junto ao Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP vct@rnp.fmrp.usp.br
Fotos cedidas pelos autores
Introduo a tentativa de explicar a recuperao de funes aps uma injria cerebral, neurologistas levantam conceitos de reorganizao funcional ou substituio funcional do sistema nervoso central (SNC) (Ramirez et al., 1996; Sabel et al., 1997). Vrios estudos nas ltimas dcadas tm descrito que neurnios sobreviventes a um insulto no SNC passam por um processo de brotamento de sistemas axonais, formando contatos funcionais com regies deprivadas de suas aferncias originais. Dada a natureza universal dessa resposta de brotamento, existe a possibilidade de que a formao desses novos contatos seja o substrato neural responsvel pela reFigura 1: Imagem de ressonnorganizao funcional. cia nuclear magntica na seqncia Estudos lesionais em esflair do paciente JMV, 35 anos, com truturas lmbicas de anihistria de crises parciais complemais de experimentao xas que tiveram incio na adolestm demonstrado que o cncia e com histria prvia de brotamento de terminais crise febril generalizada aos dois homlogos queles desanos de idade. A investigao prnervados por uma injcirrgica evidenciou crises originadas na regio temporal esquerda. ria prvia (brotamento Observa-se a formao hipocampal homotpico) est associassimtrica, com reduo do voluado recuperao de me e da diferenciao da estrutura funes de memria (Rainterna do hipocampo esquerdo, mirez et al., 1996). No alm de acentuado aumento do entanto, estudos na forsinal (seta). mao hipocampal em
modelos experimentais de epilepsia e em pacientes com epilepsia do lobo temporal tm indicado que alguns tipos de brotamento anormais podem contribuir para a ocorrncia de crises epilpticas (Babb et al., 1991, Sutula et al., 1989). Nos ltimos anos, o avano das tcnicas de neuroimagem estrutural e funcional, alm da avaliao prolongada por Vdeo-EEG e do refinamento nas tcnicas cirrgicas tm proporcionado um aumento considervel do nmero de centros especializados no tratamento cirrgico da epilepsia do lobo temporal. Esse procedimento, embora tenha sido realizado pela primeira vez h mais de um sculo, foi temporariamente esquecido com o aparecimento das drogas antiepilpticas. No entanto, estas tm-se mostrado ineficazes no controle da maioria dos casos de epilepsia do lobo temporal, o que levou ao reaparecimento e difuso da cirurgia de epilepsia. J em 1880, Sommer observou que pacientes epilpticos apresentavam freqentemente ao exame antomo-patolgico alteraes estruturais que envolviam a regio interna do lobo temporal, particularmente o hipocampo e a amgdala (Sommer, 1880; Mathern et al., 1998), mas foi Stauder (Stauder, 1936) quem fez a associao desses achados com a ocorrncia de crises parciais complexas, dando incio descrio da sndrome que hoje conhecemos por epilepsia do lobo temporal mesial (French et al., 1993; Williamson et al., 1993). Desde ento, cada
vez mais essa sndrome vem sendo estudada na tentativa de determinar a causa do seu aparecimento e os mecanismos que levam ao desenvolvimento da epilepsia. Epilepsia do Lobo Temporal Mesial A epilepsia do lobo temporal o tipo mais comum de epilepsia intratvel do ponto de vista medicamentoso. As crises epilpticas so caracterizadas por uma aura inicial em parte dos pacientes, sendo a mais comum a aura epigstrica (sensao de mal-estar na regio abdominal caracterizada por frio, clica ou borborigmo), que pode ascender em direo ao trax ou garganta (French et al., 1993). Outras auras bastante freqentes so as caracterizadas por pensamentos forados, lembranas de fatos j vividos (do francs, dj vu) ou nunca vividos (jamais vu). Aps essa fase, a crise usualmente evolui para perda da conscincia, com o aparecimento de vrios comportamentos automticos, que envolvem particularmente a musculatura facial e da deglutio e os membros superiores. O paciente pode ainda apresentar fala e marcha automtica, ou perodos de agressividade (estes geralmente ocorrem quando o paciente contido a fora ou no perodo pscrise). Na fase ps-ictal pode ocorrer confuso mental ou recuperao imediata da conscincia. As crises podem evoluir para generalizao tnico-clnica secundria e a sua incidncia varivel de caso para caso (Fernandes e Sander, 1998). Ainda no h uma definio clara na literatura se crises epilpticas recorrentes podem ou no levar a uma piora progressiva da cognio desses pacientes ou agravar a epilepsia (Holmes et al., 1998). Os pacientes que se apresentam com essa sndrome tm freqentemente, no seu passado, histria de uma convulso, na vigncia de febre, na infncia (na maioria dos casos, at os trs anos de idade) (French et al., 1993). Essa convulso geralmente relatada como sendo duradoura (aproximadamente uma hora ou, muitas vezes, de vrias horas de durao), podendo ainda se apresentar como convulses repetidas no mesmo dia. As crises podem acometer preferencialmente um dimdio, assumindo um
Figura 2: Representao esquemtica em corte coronal do hemisfrio cerebral direito passando pelo lobo temporal. Na poro mesial est o hipocampo, seguido pelo giro parahipocampal, que ligado ao lobo temporal, na sua poro mais inferior. Para a retirada do hipocampo, faz-se uma seco da superfcie lateral do lobo temporal, entre o giro temporal mdio e superior, em direo ao corno temporal do ventrculo lateral, como indicam as setas. Faz-se a retirada da superfcie cortical para, em seguida, retirar-se o hipocampo em bloco, juntamente com o giro parahipocampal.
carter assimtrico. Aps essa crise, que pode se caracterizar por um episdio nico ou por crises repetidas no decorrer de meses ou anos, surge um perodo em que o paciente permanece assintomtico. Esse perodo segue at o final da infncia ou incio da adolescncia, quando, ento, as crises epilpticas reaparecem, sendo dos tipos parcial simples e/ou complexa, geralmente ocorrendo controle insatisfatrio com as drogas anticonvulsivantes disponveis. Estes pacientes tm como achado radiolgico a esclerose hipocampal (Williamson et al., 1993). Exames de Investigao Assim como nos outros casos de epilepsia, esses pacientes devem ser submetidos a exames de investigao de rotina, que incluem o eletrencefalo-
grama, e a um exame de neuroimagem, preferencialmente a ressonncia nuclear magntica. O primeiro pode evidenciar anormalidades focais, principalmente nas regies temporais, que podem ser unilaterais ou bilaterais. O achado tpico da ressonncia nuclear magntica a atrofia da regio mesial do lobo temporal, sendo esse achado conhecido por esclerose mesial temporal. Essa alterao envolve principalmente o hipocampo, o giro parahipocampal e a amgdala, sendo identificada pela ressonncia nuclear magntica como uma rea de reduo de volume na seqncia T1 e aumento de sinal na seqncia flair (Figura 1). Em alguns pacientes, a ressonncia nuclear magntica pode ser normal ou limtrofe com a normalidade. Esse achado ocorre com maior freqncia nos pacientes em que no se observa histria de crise febril na infncia antecedendo a epilepsia do lobo temporal, ou seja, nos pacientes que no apresentam a histria tpica da sndrome da esclerose mesial temporal. Nos casos definidos como clinicamente intratveis, realizada uma investigao pormenorizada, que inclui a monitorizao prolongada por Vdeo-EEG, onde so registrados os achados interictais e ictais. Os achados ictais so tipicamente manifestos pela presena de atividade rtmica na faixa teta, correspondendo ao ritmo hipocampal, que, na grande maioria dos casos, unilateral. Ainda fazendo parte da avaliao pr-cirrgica so ainda realizados testes neuropsicolgicos que evidenciam dficits de memria verbal (quando as crises so originadas no hemisfrio dominante) ou de contedo vsuo-espacial (quando as crises so originadas no hemisfrio no dominante) e a uma avaliao psiquitrica e social que podem identificar distrbios psiquitricos e familiares relacionados ou no epilepsia. Tratamento cirrgico O tratamento cirrgico visa cura da epilepsia ou reduo significativa do nmero das crises epilpticas. O intuito da cirurgia a resseco da rea epileptognica, que, na epilepsia do lobo temporal, envolve as estruturas mesiais (hipocampo, giro parahipocampal e amgdala). Para que seja feita a resseco feita uma inciso na
Figura 3: A: Representao esquemtica de um hipocampo normal. As clulas principais do hipocampo compreendem os neurnios piramidais (representados por tringulos) distribudos nos diversos subcampos (CA1, CA2 e CA3) do Corno de Ammon e clulas granulares (com citoplasma arredondado) localizadas na fascia dentata (FD). A regio do hilo envolta pela FD e contm, no seu interior, interneurnios dispersos (representado por clulas em forma de losango). Os axnios das clulas granulares (fibras musgosas) se projetam para a regio CA3, constituindo o stratum lucidum (cabea de seta). Na superfcie externa da fascia dentata, encontra-se a camada molecular com as pores interna (mais clara, indicada por um asterisco) e externa (mais escura, indicada por uma estrela). B: Representao esquemtica de um hipocampo com esclerose hipocampal. Observa-se uma perda celular importante (representada por figuras em branco), particularmente neurnios piramidais e hilares. J na camada granular no h perda significativa de neurnios, ocorrendo no entanto, uma proliferao de colaterais axnicas (reorganizao sinptica) provenientes de neurnios granulares que se projetam principalmente para a camada molecular interna (indicadas pelas setas azuis).
poro lateral do crnio, prximo ao pavilho auricular, por onde se tem, acesso ao encfalo. As tcnicas de resseco da regio epileptognica variam nos diversos centros de cirurgia de epilepsia, podendo incluir apenas as estruturas mesiais do lobo temporal ou estender-se com a resseco da poro lateral do lobo temporal (Figura 2), sendo esta a tcnica mais comumente utilizada. Prognstico O prognstico cirrgico bastante favorvel, particularmente nos pacientes com diagnstico da sndrome da esclerose hipocampal. Nesse grupo de pacientes, chega a ser observado um ndice de cura da epilepsia em torno de 80% a 90% dos casos, embora alguns pacientes continuem a apresentar as auras. Nos pacientes em que essa histria no encontrada, mas, em exames de neuroimagem, observa-se achado tpico de esclerose hipocampal, o ndice de cura ligeiramente menor, mas ainda em torno de 80%. Por outro lado, para os pacientes que apresentam ressonncia nuclear magntica normal, apresentam um prognstico
bem menos favorvel, podendo ser obtido apenas 50% a 60% de casos em que ocorre a cura da epilepsia. Modelos animais e mecanismos de epileptognese Para que haja um completo entendimento dos mecanismos que levam ao desenvolvimento das epilepsias, includa a epilepsia do lobo temporal, vrios modelos animais vm sendo desenvolvidos. Tenta-se, dessa forma, determinar quais so os eventos que podem induzir o aparecimento das crises epilpticas, as estruturas envolvidas e o melhor tratamento a ser utilizado. Determinar o substrato anatmico, patolgico e funcional, inclusive os neurotransmissores envolvidos e as suas vias nas diversas formas de epilepsia de grande importncia para o desenvolvimento de novas teraputicas clnicas ou cirrgicas e na criao de mecanismos de preveno das mesmas. Assim, o modelo animal ideal seria aquele que mais se aproximasse histria natural que ocorre em pacientes. O ideal que se pudesse desenvolver em primatas, devido maior semelhana filogentica com o ho-
mem, um modelo em que ocorressem crises espontneas, no sendo necessria a induo das crises por drogas ou leses cerebrais. Infelizmente so poucas as espcies animais que apresentam epilepsia idioptica e menos ainda com crises parciais complexas como as encontradas na epilepsia do lobo temporal. As preparaes experimentais mais antigas, particularmente as utilizadas para teste de drogas antiepilpticas, no reproduziam de forma fidedigna a fenomenologia encontrada em humanos (Purpura et al., 1972). As crises epilpticas eram induzidas principalmente de forma aguda, no sendo observada a ocorrncia de crises espontneas tardiamente. Nas duas ltimas dcadas, novos modelos foram desenvolvidos tendo como caracterstica comum a ocorrncia de crises espontneas, em geral, como consequncia de um insulto cerebral decorrente de status epilepticus. Os principais modelos utilizados para estudar a epilepsia do lobo temporal com ocorrncia de crises espontneas so obtidos com injees na cavidade peritoneal ou intra-hipocampal em ratos ou camundongos ou ain-
da atravs da estimulao eltrica mantida de estruturas lmbicas (McNamara, 1994). Entre as drogas mais utilizadas esto a pilocarpina e o cido kainco (Cavalheiro et al., 1982, Leite et al, 1990). A pilocarpina um agente colinrgico que, quando injetado em ratos, leva ocorrncia de crises epilpticas semelhantes s crises parciais complexas observadas em humanos. Essas crises se manifestam agudamente como um episdio de estado de mal epilptico, que pode durar vrias horas (assim como o encontrado na infncia de crianas que desenvolvem a sndrome da epilepsia do lobo temporal mesial). Aps um perodo em torno de 15 dias, os animais passam a apresentar crises parciais com automatismos nas patas e com as vibrissas, assemelhando-se s parciais complexas da epilepsia do lobo temporal. Essas crises apresentam ento um carter recorrente de forma crnica e espontnea (Leite et al., 1990, Cavalheiro et al, 1991). O cido kanico uma aminocido excitatrio com ao glutamatrgica. Quando injetado na regio hipocampal ou sistemicamente leva a um quadro de status epilepticus lmbico. Posteriormente a essa fase, so observadas crises recorrentes espontneas (Cavalheiro et al., 1982). Estudos realizados nesses modelos animais mostram que, se o estado de mal epilptico no ocorre ou abortado com drogas antiepilpticas, essas alteraes neuropatolgicas no hipocampo no ocorrem nem se desenvolvem as crises espontneas, mostrando que pode existir uma relao direta entre esse tipo de epilepsia e as anormalidades anatmicas e funcionais do hipocampo (Lemos e Cavalheiro, 1995). Um achado neuropatolgico encontrado em vrios modelos de status epilepticus a perda acentuada de neurnios hilares e clulas piramidais nos subcampos CA1 e CA3, com relativa preservao das clulas granulares e neurnios piramidais de CA2. Alm desse padro desigual de vulnerabilidade celular, existe tambm a ocorrncia de brotamentos axonais no hipocampo esclertico (Figura 3). Uma ateno maior tem sido dada a perda de neurnios hilares, particularmente as clulas musgosas e aos fenmenos plsticos de brotamentos axonais. Essas alteraes tm-se apre-
sentado como substrato anatmico para duas hipteses propostas na literatura, na tentativa de explicar os mecanismos subjacentes ao processo de epileptognese na epilepsia do lobo temporal mesial (McNamara, 1994). 1-Hiptese das clulas em cesto dormentes: Essa hiptese foi estabelecida por Sloviter (1991), utilizando o modelo da estimulao eltrica mantida da via perfurante, a principal aferncia que se projeta do crtex entorrinal (camadas II e III) para a formao hipocampal. A estimulao eltrica dessa via determina a perda da inibio mediada pelo GABA nas clulas granulares in vivo, sendo, portanto, consistente com a idia de que a desinibio sinptica contribui para a hiperexcitabilidade das clulas granulares. No entanto, essa observao paradoxal em vista da preservao preferencial dos neurnios GABArgicos, isto , os neurnios GABArgicos se apresentam proporcionalmente menos lesados do que
as clulas principais. A hiptese afirma que uma crise prolongada levaria, por um mecanismo excitotxico, morte de neurnios no hilo (clulas musgosas), removendo a aferncia excitatria desses neurnios para as clulas em cesto (GABArgicas), que ficariam ento dormentes, sem a ativao normal determinada pelas clulas musgosas. Uma vez iniciada a perda parcial da inibio, combinada a aferncia excitatria a estmulos normais, descargas excessivas das clulas granulares seriam geradas, levando `a morte celular progressiva no hilo e ao aparecimento de uma condio epilptica com o passar dos anos aps o insulto inicial (McNamara, 1994). 2-Reorganizao sinptica das fibras musgosas: Essa hiptese defende a idia de que a hiperexcitabilidade das clulas granulares uma consequncia de um rearranjo patolgico de uma circuitaria neuronal, na qual as clulas granulares emitiriam colaterais axnicas para o
Figura 4: Cortes histolgicos ilustrando um hipocampo normal (A e C) e um hipocampo de um paciente com esclerose hipocampal (B e D). A e B representam colorao pelo mtodo de Nissl. C e D mtodo de colorao pelo neoTimm, que evidencia fibras ricas em zinco. Em A nota-se a distribuio normal das clulas granulares e piramidais. Comparando com a figura B observa-se uma reduo significativa de todas as clulas nas camadas piramidais (entre as setas curvas) e do hilo (cabea de seta), com preservao do subiculum inferiormente (asterisco). Na figura C observa-se a representao normal da marcao pelo mtodo do neo-Timm, sendo a regio do hilo mais intensamente corada, se extendendo at a transio entre a regio CA3 e CA2. Em D, esta marcao no hilo um pouco menos intensa, estendendo-se at a regio do subiculum. Na regio da fascia dentata observa-se uma densa marcao anormal na camada molecular interna (seta).
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seu prprio campo dendrtico, resultando num circuito excitatrio recorrente (Tauck e Nadler, 1985). Esse rearranjo resultante da eliminao sinptica em decorrncia da morte de neurnios (clulas musgosas) que, normalmente, projetam axnios para o tero proximal da camada molecular do giro denteado (McNamara, 1994). As sinapses eliminadas so ento substitudas pelos axnios das clulas granulares, as fibras musgosas. Os axnios das fibras musgosas contm altas concentraes de zinco e podem ser facilmente identificados pelo mtodo de Timm. Uma marcao anormal de terminais Timm positivos na camada molecular interna tem sido observada em hipocampos de pacientes com esclerose hipocampal e modelos animais de epilepsia temporal (Figura 4). Acredita-se que, para ocorrer esse processo plstico, haveria a necessidade de sntese de fatores trficos que seriam responsveis pelo brotamento e manuteno desses novos circuitos (Gall e Isackson, 1989). Concluso Embora partindo de um achado neuropatolgico comum (perda de neurnios hilares), duas hipotses se apresentam com mecanismos fisiopatolgicos aparentemente antagnicos. Somente com futuros experimentos no tecido cerebral epileptognico humano e em modelos animais, conseguiremos validar essas hipteses. No entanto, o conhecimento dos eventos moleculares que ocorrem aps a leso neuronal poder, no futuro, oferecer novas estratgias teraputicas no combate epilepsia farmacorresistente. O desenvolvimento de drogas que antagonizem a ao excitotxica sobre os receptores do tipo NMDA poder obviamente evitar os processos degenerativos quando empregados na fase aguda da agresso ao tecido cerebral. Uma vez estabelecida a leso, talvez a reorganizao sinptica das fibras musgosas possa ser impedida com a modulao especfica de fatores trficos neuronais, como foi recentemente descrita para o sistema colinrgico (Holtzman e Lowenstein, 1995). Ou ainda, no caso das clulas em cesto dormentes, poderiam ser desenvolvidas drogas que,
seletivamente, ativassem as clulas GABArgicas inativas, podendo ento restabelecer a inibio recorrente nas clulas granulares do giro denteado. Referncias bibliogrficas Babb, TL; Kupfer, WR; Pretorious, JK; Crandall, PH and Levesque, MF. Synaptic reorganization by mossy fibers in human epileptic fascia dentata. Neuroscience, 42 (2): 351-363, 1991. Cavalheiro EA, Riche D, Le Gal La Salle G - Long-term effects of intrahippocampal kainic acid in rats: a method for inducing spontaneous recurrent seizures. Electroenceph. clin. Neurophysiol., 53:581-589, 1982. Cavalheiro EA, Leite JP, Bortolotto ZA, Turski WA, Ikonomidou C and Turski L - Long-term effects of pilocarpine in rats: Structural damage of the brain triggers kindling and spontaneously recurrent seizures. Epilepsia, 32(6): 778-782, 1991. Fernandes, JG e Sander, JWAS. Epidemiologia e histria natural das epilepsias. Em: Fundamentos Neurobiolgicos das Epilepsias. Costa da Costa J, Palmini A, Yacubian EMT e Cavalheiro EA (eds.), Lemos Editorial, Vol. 1: 3-20, 1998. French, JA; Willianson, PD; Thadani, VM et al - Characteristics of medial temporal lobe epilepsy : I. Results of history and physical examination. Annals of Neurology, 34: 774-780, 1993 Holmes, MD; Dodrill, CB; Wilkus, RJ; Ojemann, LM and Ojeman, GA. Is partial epilepsy progressive? Tenyear follow-up of EEG and neuropsychological changes in adults with partial seizures. Epilepsia, 39(11): 1189-1193, 1998. Holtzman DM and Lowenstein DH - Selective inhibitoin of axon outgrowth by antibodies to NGF in a model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience, 15:7062-7070, 1995. Gall CM and Isackson PJ - Limbic seizures increase neuronal production of messenger RNA for nerve growth factor. Science, 245:758-761, 1989. Leite J. P.; Bortolotto Z.A., Cavalheiro E.A - Spontaneous recurrent seizure in rats: AnExperimental model of partial epilepsy. Neuroscience
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Herman S. Mansur - mestre e doutor em fsico-qumica Rodrigo L. Orfice - mestre e doutor em engenharia de materiais Wander L. Vasconcelos - mestre e doutor em engenharia de materiais Rbia F. Silva mestre e doutora em engenharia de materiais
Universidade Federal de Minas Gerais Escola de Engenharia Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais hmansur@demet.ufmg.br Zlia P. Lobato mestre em virologia e doutora em biologia molecular Universidade Federal de Minas Gerais - Escola de Veterinria Departamento de Medicina Veterinria Preventiva
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO DE FABRICAO DE VIDROS POROSOS VIA SOL-GEL PARA FIXAO DE PROTENAS
Resumo Realizou-se um estudo para desenvolvimento de um processo de fabricao de vidro poroso de slica via solgel para fixao de protenas. Utilizou-se tetrametilortossilicato (TMOS) como precursor em meio de etanlico e um tampo fosfato salino PBS, mantendo o pH=7,40 0,05. O processo de polimerizao foi monitorado por meio de anlise FTIR, sendo observado um perodo superior a 10 dias para obteno de uma polimerizao completa temperatura ambiente. As anlises dos substratos de vidros porosos incluiram medidas de porosidade e rea superficial (B.E.T). Em seguida foram realizados testes preliminares para avaliao da eficincia de fixao da protena albumina nos substratos de vidro poroso. Palavras Chaves: Biomateriais, Protenas, Sol-gel.
1. INTRODUO A elevada eficincia apresentada pelas macromolculas biolgicas na seleo de reagentes e na especificidade da interao com stios de reao tem promovido o crescente interesse de pesquisa envolvendo filmes finos de macromolculas associadas a materiais avanados [1-2]. As protenas, em especial, so macromolculas biolgicas de elevada importncia e o estudo de suas interaes com os diversos materiais e meios qumicos fundamental para o aprofundamento do conhecimento orgnico e funcional dos seres vivos. Os estudos envolvem geralmente a fixao ou imobilizao de uma ou mais protenas em substratos, por meio de diversos mecanismos, tais como, ligao covalente, adsoro fsica, ligaes cruzadas, polarizao e estereoqumica, etc. Um ou mais desses mecanismos citados devem estar envolvidos no processo de fixao da protena com o substrato. Os vrios parmetros do
Abstract In this work we report the development of a process for silica porous glass production with protein fixation based on sol-gel method. The glass was obtained using TMOS in ethanol and phosphate buffered saline (PBS) solution with pH= 7.40 0.05. The polymerisation of the material during the gelation process was monitored through FTIR and no significant change of the spectra after 10 days was observed. Porosity and surface area were analysed by B.E.T and the results have shown an increase of the average pore size when albumin protein macromolecules were added to gelation solution. Keywords: Biomaterials, Proteins, Sol-Gel Glass.
(tetrametilortossilicato, TMOS), conduz reao de polimerizao sob condies apropriadas e a viscosidade da soluo aumenta at o gel ser obtido. O gel subseqentemente secado e aquecido para produzir os produtos desejados. Durante a polimerizao, a evoluo da forma e do tamanho dos polmeros, que determinam a interao reolgica entre eles so os fatores chaves que afetam a dependncia tempo-viscosidade da soluo. Uma etapa fundamental no processo sol-gel a produo do gel poroso, preparado geralmente atravs da hidrlise e condensao de alcxidos. Tal evoluo conduz eventualmente formao de um gel poroso, que posteriormente pode ser convertido em vidro poroso pela desidratao do material. As caractersticas de controle de porosidade, a elevada superfcie de interao e estrutura amorfa dos vidros obtidos por processamento sol-gel os qualificam como substrato ideal para a construo de sistemas biolgicos heterogneos envolvendo
processo, tais como pH, temperatura, rea superficial, ons e agentes quelantes, agentes complexantes etc. certamente determinam os nveis de eficincia e o grau de seletividade das interaes protena-substrato. Pesquisas recentes tm demonstrado que vidros silicatos obtidos por meio da tecnologia de processamento sol-gel podem oferecer um substrato para fixao de macromolculas de protenas sem a perda de caractersticas funcionais biolgicas das mesmas [3-6]. Ao contrrio dos mtodos convencionais de fuso de slica vtrea que requerem elevadas temperaturas, o processamento sol-gel envolve baixas temperaturas nas reaes de hidrlise e condensao, ideal para a grande variedade de molculas orgnicas sensveis a altas temperaturas, como a classe das protenas que podem desnaturar e perder sua atividade biolgica [7]. Tipicamente, uma soluo contendo um alcxido lquido, tal como Si(OCH3)4
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materiais inorgnicos e macromolculas de protenas. O controle da distribuio e do tamanho mdio de poros fundamental para a propriedade de fixao de protenas do substrato, oferendo um maior ou menor nmero de stios de interao, dependendo do volume de poros e da rea superficial slido-poros da matriz vtrea obtida [8]. A porosidade e a elevada superfcie especfica intrnseca dos vidros porosos obtidos via sol-gel permitem a captura de macromolculas sem a necessidade de uma ligao com os stios biologicamente ativos, o que portanto, no compromete a eficincia da propriedade de seletividade do sistema construdo. Neste trabalho foi realizado um estudo de anlise de FTIR da formao de uma matriz de slica-gel porosa com incorporao de protena BSA. Foram feitas anlises da variao da porosidade mdia da matriz obtida com a adio de macromolculas de protena durante o processamento solgel e tambm aps a gelao. 2. MATERIAIS E MTODOS Os reagentes Na2CO3 (> 99,5%), fornecidos pela VETEC foram utilizados sem purificao posterior. Na2HPO4 (> 99,0%), NaH2PO4 (> 99,0%) e NaCl (> 99,0%), fornecidos pela VETEC, foram utilizados como reagentes para preparao do tampo fosfato PBS (phosphate buffered saline). Foi preparada uma soluo 1,0 N de NaOH (> 99,0%), fornecido pela MERK, para correo do pH da soluo utilizada no processo sol-gel. A albumina bovina (BSA - frao V > 99,5%), C2H5OH (absoluto >99,8%) e Si(OCH3)4 (TMOS > 98%) foram adquiridos da SIGMA- ALDRICH e utilizados sem purificao posterior. 2.1. Preparao do Substrato Sol-Gel a) Mtodo-1 - Sem adio de albumina Preparou-se uma soluo de TMOS (1,0 ml ), etanol (1,2 ml) e um tampo fosfato salina (PBS, pH=7,4, 0,6 ml), promovendo agitao moderada, temperatura ambiente at ocorrncia de gelao. A soluo foi mantida em temperatura ambiente por 14 dias para polimerizao completa. Foram realizados espectros de FTIR ao longo desse perodo de tempo para monitoramento da polimerizao. Aps uma semana, foi feita a adio de 250 l da soluo de 1,0 % de albumina em tampo PBS, em cada amostra de gel de slica.
acompanhamento da evoluo durante a preparao do substrato de gel de slica com a incorporao e adsoro de protenas. Foram obtidos espectros de reflexo, utilizando-se o acessrio Perkin-Elmer para reflexo difusa. Amostras monolticas e na forma particulada foram analisadas. 2.3. Tnica de anlise de porosidade por B.E.T.
Figura 1. Representao esquemtica das etapas de processamento solgel, com a incorporao de protenas em matrizes dos vidros porosos obtidos
Utilizou-se o equipamento de anlise AUTOSORB-1 da Quantachrome. Os ensaios foram realizados com susbtratos de gel de silica com diferentes concentraes de protenas para avaliao da sua influncia na rea superficial e no tamanho mdio dos poros obtidos. 3. RESULTADOS 3.1. B.E.T. Os resultados iniciais indicam uma influncia significativa no tamanho mdio de poros obtidos e na rea superficial com a adio de macromolculas da protena albumina bovina (BSA) no processo de sntese de vidro de slica porosa via sol-gel. Utilizando-se o Mtodo-1, onde a protena foi adicionada no oitavo dia de envelhecimento do gel, observou-se um valor mdio de 75 para as amostras com concentrao de albumina de 3% a 5 % e 50 para o gel de slica sem adio de protena . De modo anlogo, as amostras fabricadas pelo Mtodo-2, onde a protena foi adicionada durante o processo de gelao, observouse um tamanho mdio de poro inferior ao obtido no Mtodo-1, mas uma tendncia similar de aumento do tamanho mdio de poro (50-100%) com adio de 1% de BSA. Essa observao est de acordo com a literatura [3] que discute o aumento do tamanho do poro com a adio de macromolculas orgnicas associado, principalmente, ao encapsulamento dessas macromolculas nos poros, que impedem a contrao durante o processo de envelhecimento do gel de slica. 3.2. Espectroscopia de Infravermelho A espectroscopia de infravermelho foi utilizada nesse trabalho para comprovar a eficincia do mtodo de preparao no que se refere incorporao de protenas nos gis de slica. Alm disso, essa tcnica foi ainda usada para monitorar os processos envolvidos na formao do reticulado inorgnico do gel de slica. Como salientado anteriormente, a formao do gel de slica via sol-gel inclui o processamento de uma srie de reaes
b) Mtodo-2 - Com adio de albumina durante a gelao Preparou-se uma soluo de 1,0 % de albumina em tampo PBS e adicionou-se mistura de TMOS-Etanol, agitando-se moderadamente em banho de gelo at que a gelao ocorresse. Manteve-se temperatura ambiente por 14 dias para polimerizao completa. A Fig.1 mostra um diagrama representativo do processo de incorporao de macromolculas de protenas durante o processamento sol-gel para obteno de uma matriz vtrea de slica. 2.2. Tnica de anlise por Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) Utilizou-se o equipamento de anlise FTIR Paragon-1000 da Perkin-Elmer, com o software Spectrum for Windows 1.0. Os espectros foram obtidos na faixa de nmero de onda de 400 a 4000 cm-1 para
Figura 2. Espectros de infravermelho de amostras de gis de slica em diferentes estgios de consolidao
qumicas que envolvem os alcxidos metlicos e seus derivados, frutos de reaes de hidrlise e condensao. O processamento de tais reaes leva ao surgimento e crescimento de cadeias polimricas inorgnicas, as quais interagem entre si, culminando com a eventual formao de um reticulado tridimensional (gel). A espectroscopia de infravermelho permite o acompanhamento da evoluo estrutural que ocorre durante a transformao sol para gel e aps a formao do gel, a partir da avaliao do ambiente qumico associado s ligaes da slica. A Fig.2 mostra os espectros de infravermelho de gis de slica em diferentes etapas de consolidao. Nesse caso, gis coletados aps 11, 12 e 14 dias aps gelao foram submetidos anlise. Os espectros exibidos na Fig.2 mostram o pico caractersticos das ligaes Si-O-Si (modo de estiramento) entre 1100-1000 cm-1, o pico relacionado com as ligaes rompidas Si-O- entre 950-900 cm-1 e, entre 450-400 cm-1, o pico associado com as ligaes Si-O-Si no modo de dobramento. A anlise desses espectros prov informaes relacionadas com a estrutura dos gis de slica no que diz respeito formao do reticulado tridimensional. Percebe-se, atravs dos espectros, uma mudana progressiva da freqncia dos picos relativos s ligaes Si-O-Si (estiramento) para maiores nmeros de onda em gis envelhecidos por tempos mais longos. Alm disso, observa-se uma reduo gradual da intensidade do pico relacionado com as ligaes rompidas para maiores tempos de envelhecimento. Tais resultados esto explicitados na Fig.3. Os resultados da Fig.3 fornecem informaes importantes relacionadas com o processo de consolidao da estrutura dos gis de slica. A mudana do pico localizado aproximadamente em 1080 cm-1 para freqncias maiores uma indicao de que o reticulado da slica se torna mais rgido medida que o tempo de envelhecimento aumenta. Quanto maior o nmero de ligaes cruzadas entre as cadeias polimricas inorgnicas, maior a rigidez da rede e maior a energia necessria para a ocorrncia das transies vibracionais das molculas. Ao mesmo tempo, a reduo do nmero de ligaes quebradas (Fig.3) uma indicao do prosseguimento das reaes de condensao entre grupos silanol (-SiOH) mesmo aps a gelao. Tais reaes aumentam a densidade de ligaes cruzadas no gel, levando a um enrijecimento da rede inorgnica. Informaes obtidas via espectroscopia de infravermelho, como as discutidas nas Fig.2 e Fig.3, so teis na definio do estgio timo de consolidao dos gis para impregnao de macromolculas (processamento Mtodo 1). Tal estgio timo deve incluir uma srie de caractersticas estruturais que possibilite a penetrao e fixao
tram tambm presentes no espectro do gel preparado com albumina, revelando, assim, a capacidade do mtodo usado em incorporar macromolculas em matrizes de slica. 4. CONCLUSO Neste trabalho foi desenvolvido um processo de obteno de uma matriz de vidro poroso via sol-gel para incorporao de protenas. Observou-se um aumento do tamanho mdio poro da matriz com o aumento da concentrao de protena BSA. Verificou-se ainda a incorporao da protena BSA adicionada por meio da tcnica espectroscpica de FTIR. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq/CAPES/FINEP/FAPEMIG pelos recursos concedidos para utilizao nesse projeto. Os autores agradecem tambm a Wesller G. Schmidt pelas anlises de porosidade realizadas pelo mtodo B.E.T. 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS [1] MCLEAN, M.A.;STAYTON, P. S.; SLIGAR, S. G.,Engineering Protein Orientation at Surfaces to Control Macromolecular Recognition Events, Anal. Chem., v.65, p.2676-2678, 1993. [2] MURAMATSU, H.; DICKS,J.; TAMIYA,E.; KARUBE,I., Piezoelectric Crystal Biosensor Modified with Protein-A for Determination of Immunoglobulins, Anal. Chem., 1987, v.59, pp.2760-2763. [3] DAVE,B.C.; DUNN,B.; VALENTINE, J. S.; ZINK, J. I., Sol-Gel Encapsulation Methods for Biosensors, Analytical Chemistry, v.66, n.22, 1994. [4] BRAUN,S.; RAPPOPORT,S.; ZUSMAN,R.; AVNIR,D.; OTTOLENGHI, M. Mater. Lett., 1990, v.10, pp.1. [5] ELLERBY, L. M.; NISHIDA, C. R.; NISHIDA, F.; YAMANAKA,S.A.; DUNN,B.; VALENTINE, J. S.; ZINK,J.I., Science, 1992, v.255, pp.1113. [6] WU,S.; ELLERBY,L.M.; COHAN,J.S.; DUNN,B.;VALENTINE,J.S.;ZINK,J.I, Chem. Mater., 1993, v.5, pp.115. [7] HENCH,L.L.;WEST,J.K., Chem. Rev., 1990, v.90, pp.33. [8] HENCH, L.L.; VASCONCELOS, W.L. Sol-Gel Silica Science, Annual Review of Materials Science, v.20, 1990, 269-298. [9] CHITTUR, K. K., FTIR and Protein Structure at Interfaces, Chemical and Materials Engineering Department, University of Alabama in Huntsville, AL 35899; http://eb-p5.eb.uah.edu/~kchittur/ bmreview, 11-ago-1998. [10] MOSS, D., NABEDRYK, E., BRETON, J.; MANTELE, W., Eur. J. Biochem., v.187, pp.1990, 565-572.
Figura 3. Mudanas observadas na freqncia e intensidade de bandas de absoro em gis de slica analisados em diferentes estgios de consolidao.
das macromolculas. Entre essas caractersticas citam-se: textura de poros, rigidez da rede, concentrao de grupos silanol (ligaes quebradas), entre outras. 3.3. Avaliao da presena de protenas nos gis de slica A espectroscopia de infravermelha foi usada na determinao da eficincia dos mtodos de incorporao de protenas nos gis. Na Figura 4, so mostrados espectros de albumina pura (Fig.4a), de gis de slica puros (Fig.4c) e de gis de slica com albumina (Fig.4), obtidos pelo processo tipo (a). Os picos caractersticos da albumina, que envolvem os grupamentos amida primria (1620 a 1680 cm-1) e amida secundria (1480 a 1580 cm-1), esto claramente exibidos na Fig.4a. Os picos observados nos espectros de FTIR de amida-I e amida-II esto de acordo com as bandas descritas para protenas na literatura [9-10]. Esses picos se encon-
Figura 4. Espectros de infravermelho de albumina, gel de slica e gel de slica incorporado com albumina
AGREVO
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DOENA DE CHAGAS
SADE
Pesquisador do Instituto do Corao (InCor) Faculdade de Medicina da USP Ganhador do Prmio Roche (1994) e Prmio Santista Juventude (1998) por seu trabalho na Imunologia da Doena de Chagas edecunha@usp.br
Edcio Cunha Neto
Novos conhecimentos na patognese da Doena de Chagas
doena de Chagas, causada pelo protozorio Trypanosoma cruzi, afeta de 16 a 18 milhes de pessoas no continente americano. Dados da Organizao Mundial de Sade revelam que cerca de 90 milhes de pessoas esto expostas ao risco de infeco. Em decorrncia de migraes populacionais, a doena de Chagas, classicamente considerada uma enfermidade rural, passou a atingir centros urbanos, estimando-se que, aproximadamente, 300.000 indivduos infectados residam hoje em So Paulo e mais de 200.000, no Rio de Janeiro. A despeito de a doena de Chagas ter sido descoberta e seu ciclo elucidado h mais de oito dcadas, vrios aspectos relacionados com o seu controle ainda se apresentam desafiadores. Os quimioterpicos anti-T. cruzi atualmente disponveis apresentam baixa eficcia e alta toxicidade, especialmente na fase crnica da doena de Chagas. O conhecimento dos aspectos imunolgicos e inflamatrios que levam ao desenvolvimento das diferentes formas clnicas e dos mecanismos responsveis pelas formas graves, como a cardiopatia chagsica crnica, poderia permitir um tratamento eficaz por meio da modulao desses mecanismos. A via mais importante de transmisso de T. cruzi para humanos a vetorial, pelas fezes de insetos triatomneos (barbeiros) infectados. Graas a programas de Sade Pblica, a transmisso vetorial est sendo controlada em diversos pases da Amrica Latina, como o caso do Brasil. Em funo das grandes correntes migratrias citadas acima, a transfuso sangnea passou a
representar, especialmente nas grandes cidades, a via mais importante no surgimento de novos casos da doena de Chagas. Acometimento cardaco na Doena de Chagas A causa principal de morbidade e mortalidade na doena de Chagas o acometimento cardaco, que ocorre de 5 a 30 anos aps a infeco primria em cerca de 30% dos indivduos infectados pelo T. cruzi. Na cardiopatia chagsica crnica (CCC), ocorre uma inflamao e destruio progressiva do tecido cardaco, levando a alteraes da conduo dos impulsos eltricos no corao e arritmias. Paralelamente, ocorre um progressivo afinamento do msculo cardaco, levando dilatao das cavidades do corao, tendo como conseqncia a incapacidade de bombear adequadamente o sangue para o organismo, um quadro chamado de insuficincia cardaca congestiva. Dessa forma, a CCC freqentemente tem um curso fatal, uma vez que o tratamento apenas sintomtico e a possibilidade de realizao de transplantes cardacos bem menor que a demanda. Existem cerca de 2 milhes de pacientes acometidos de CCC em nosso pas. A CCC responsvel por, aproximadamente, 15% dos casos de pacientes atendidos por insuficincia cardaca congestiva, em hospitais do Estado de So Paulo. Um grupo menor dos pacientes infectados por T. cruzi (cerca de 5% a 8%) desenvolve alteraes no tubo digestivo (os chamados megaesfago e megaclon), aparentemente por destruio dos neurnios que controlam sua motilidade; esses
problemas digestivos dificilmente levam ao bito. J no acometimento cardaco, que tratado apenas sintomaticamente com sucesso varivel, o paciente em geral vem a falecer em decorrncia de complicaes irreversveis da doena. A CCC a indicao mais comum para o implante de marca-passos cardacos artificiais em nosso pas. Nos pacientes com insuficincia cardaca refratria, o nico caminho o transplante cardaco, um procedimento dispendioso e inaccessvel para a grande maioria dos pacientes. Estudos com animais experimentalmente infectados indicaram que o tratamento com drogas anti-T. cruzi no parece evitar a progresso da cardiopatia 1. Mecanismos de destruio do corao Os mecanismos que levam ao desenvolvimento da CCC ainda so assunto de intenso debate. So ainda desconhecidos os fatores de suscetibilidade que levam apenas 30% dos indivduos a desenvolverem a CCC aps a infeco por T. cruzi, enquanto que os restantes 70% no apresentam problemas cardacos. A principal caracterstica do tecido cardaco na CCC uma miocardite difusa, incluindo a destruio das fibras cardacas e substituio por fibrose cicatricial, associada a um considervel infiltrado inflamatrio difuso, composto por linfcitos T e macrfagos. Essas clulas inflamatrias tm sido consideradas como as efetivas destruidoras do tecido cardaco, na aparente ausncia do T. cruzi. J no corao de pacientes da forma indeterminada (IND), sem sintomas cardacos, identifica-se uma inflamao bem menos intensa, chamada miocardite focal 2, que pode estar associada com restos parcialmente destrudos do parasita 3(Higuchi et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997; 56: 485). Utilizando-se tcnicas ultra-sensveis, como o PCR 4 e a imuno-histoqumica 5, encontram-se indcios da presena do T. cruzi no corao de pacientes com CCC; entretanto, tais indcios tambm so encontrados no corao de chagsicos da forma indeterminada, sem alteraes cardacas 6. Alm disso, outros rgos, como os rins, so parasitados
pelo T. cruzi de forma anloga ao corao 7, sem apresentarem sinais de destruio ou dano funcional. Em conjunto, esses dados sugerem que a simples presena do T. cruzi no suficiente para a induo da miocardite difusa e da destruio do tecido cardaco. H algumas dcadas, foi postulada a hiptese auto-imune da patognese da CCC, que procurava explicar a agresso ao tecido cardaco na CCC na ausncia do T. cruzi in situ como um fenmeno secundrio a uma resposta imunolgica contra algum antgeno do T. cruzi, que apresentasse semelhanas antignicas, ou mimetismo molecular, com um componente cardaco. A
esse mecanismo - reagir com um antgeno semelhante, porm distinto daquele que gerou a resposta imune - chama-se reao cruzada imunolgica. Tanto as respostas imunes ao T. cruzi quanto a auto-imunidade a componentes cardacos j foram responsabilizadas como desencadeadores do infiltrado inflamatrio e da destruio tecidual na CCC 8. Informaes obtidas com modelos animais freqentemente apontam para uma direo que pode ser confirmada por estudos com doentes. Linfcitos T CD4+, ou auxiliadores, de camundongos cronicamente infectados com T. cruzi podem transferir a inflamao cardaca para camundongos no-infectados. Tambm foi observado que tanto anticorpos do soro quanto linfcitos T CD4+ de camundongos
infectados reconhecem a miosina cardaca, a protena mais abundante do corao (Resultados revisados na ref. 8). Para verificar a validade dos resultados na doena humana, nosso grupo estudou anticorpos anti-miosina cardaca no soro de pacientes CCC e IND. Anticorpos anti-miosina cardaca purificados por afinidade a partir de soros de pacientes CCC reconheceram especificamente um antgeno de T. cruzi em um imunoblot com protenas dos parasitas, apresentando-se como duas bandas de 140 e 116 kDa 9. Identificouse esse antgeno como a protena recombinante B13 de T. cruzi 10. Anticorpos de reao cruzada estavam presentes em 100% dos soros de CCC, mas somente 14% dos soros IND os apresentavam 9. Uma vez que so os linfcitos T e no os anticorpos os principais envolvidos na destruio ao corao, testamos clones de linfcitos T obtidos por clonagem in vitro e expandidos a partir de um fragmento de bipsia do corao de um paciente portador de CCC. Foram identificados clones de linfcitos T CD4+ obtidos de bipsia endomiocrdica de portador de CCC que reconheciam de forma cruzada a miosina cardaca (a principal protena do corao) e a protena B13 de T. cruzi 11. Curiosamente, nenhum clone de clula T reagiu a qualquer outro antgeno de T. cruzi, o que poderia indicar que, pelo menos nas reas estudadas, o desencadeador do infiltrado inflamatrio era o reconhecimento cruzado da miosina cardaca e no a presena do T. cruzi 11. Estudamos tambm a produo de citocinas (mediadores solveis secretados por linfcitos modular inflamao) por linfcitos T presentes no corao de pacientes CCC. Quando submetidos a estmulo com a fitohemaglutinina, potente ativador de linfcitos, essas clulas produzem quantidades significativas de IFN- e TNF-, (citocinas inflamatrias, do tipo T1) mas no IL-4 (citocina anti-inflamatria, do tipo T2) 12 . Em conjunto, esses dados indicam a presena, no infiltrado inflamtorio do corao de cardiopatas chagsicos, de linfcitos T reagindo cruzadamente com componentes do corao e capazes de produzir citocinas inflamatrias, capazes de estabelecer uma inflamao do
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tipo hipersensibilidade tardia, justamente a observada na CCC. Aps a definio das caractersticas principais dos linfcitos T presentes no corao de cardiopatas chagsicos, possvel comparar tais caractersticas em linfcitos do sangue perifrico de pacientes CCC e IND, um material mais facilmente disponvel que bipsias cardacas. Embora os linfcitos perifricos no tenham apresentado resposta contra a miosina cardaca, a imunizao in vitro de linfcitos com a protena B13 leva gerao de clones de linfcitos T com reao cruzada com a miosina 13 .Isso sugere que, ao longo da infeco por T. cruzi, a sensibilizao pela protena B13 in vivo possa levar quebra da tolerncia para a miosina cardaca. A resposta de linfcitos T do sangue perifrico protena B13 foi muito semelhante entre pacientes CCC e IND. Os linfcitos T reconhecem B13 de forma restrita ao HLA, isto , apenas indivduos com certas caractersticas genticas (portadores de determinados alelos dos genes da regio HLA) podem apresentar resposta, embora estas caractersticas estejam presentes em at 85% da populao. Entre os chagsicos, a resposta de citocinas a B13 caracterizada por grande produo de Interferongama, uma citocina pr-inflamatria, do tipo T1, e produo quase nula de Interleucina 4, uma citocina anti-inflamatria, do tipo T2. A resposta de citocinas a estmulo com fitoemaglutinina foi semelhante ao da B13 e oposta encontrada em controles normais. Esses resultados indicaram a existncia, nos pacientes chagsicos, de um desvio sistmico e generalizado para a produo de citocinas do tipo T1 (IFN- e proinflamatrias), com supresso de produo das citocinas do perfil T2 (IL-4) 14. Esse desvio do perfil das citocinas provavelmente est relacionado com a capacidade do T. cruzi de induzir a produo da Interleucina 12 (IL-12) por moncitos e macrfagos, que, reconhecidamente, estimula a produo de citocinas do tipo T1 e suprime o perfil T2. Em suma, nossos resultados, ilustrados esquematicamente na Figura 1, reforam a possibilidade de que a infeco pelo T. cruzi estimule a formao de linfcitos T potencialmente patognicos, como postulado para outros agentes infecciosos em doenas autoimunes. A infeco gera linfcitos T maturos, que reconhecem a protena B13 e produzem IFN-, que so potencialmente
capazes de migrar para o corao. Entretanto, a identificao de linfcitos T anti-B13 capazes de produzir citocinas tipo T1 tanto em pacientes CCC como em IND, que no apresentam destruio do tecido cardaco, indica que a sua presena no suficiente para causar inflamao e destruio no corao. Assim, deve haver um ponto-chave, um fenmeno imunolgico adicional, ocorrendo apenas em pacientes CCC, que leve ao acmulo e ativao de tais clulas no miocrdio levando leso. Estamos investigando a hiptese de que a gerao de um infiltrado inflamatrio destrutivo no miocrdio pode somente ocorrer no subgrupo de indivduos infectados por T. cruzi, cujos linfcitos T anti-B13 apresentem reao cruzada com a miosina cardaca. Novos tratamentos: drogas inteligentes e imunomodulao Aparentemente, no existe imunidade estril ao T. cruzi, isto , o parasita persiste no organismo do paciente em baixos nmeros, ao longo da fase crnica da doena, quer entre cardiopatas quer entre indeterminados. Isso apoiado pelo fato de que estados de imunossupresso (por exemplo, drogas imunossupressoras para transplante de rgos, imunodeficincias) em chagsicos crnicos invariavelmente provocam reativao do parasitismo. O tratamento com as drogas disponveis contra o T. cruzi no leva eliminao completa do parasita de pacientes adultos cronicamente infectados; assim, a cura parasitolgica completa difcil. Aparentemente, o parasita persiste no hospedeiro na forma intracelular, j que estudos mostraram que clulas intensamente parasitadas por T. cruzi no so danificadas pelo infiltrado inflamatrio durante a infeco 3,15. Os dados parecem indicar que as formas intracelulares do parasita desenvolveram mecanismos de escape, ou pelo menos de retardo, da destruio das clulas infectadas pelo sistema imune, como acontece com alguns tipos de virus 15,16. A identificao desses possveis mecanismos de escape poderia fornecer importantes alvos para o desenvolvimento de drogas anti-T. cruzi efetivas, capazes
de curar a infeco crnica pelo parasita. Por outro lado, a definio do auto-antgeno cardaco relevante para a patognese auto-imune da cardiopatia chagsica crnica o primeiro passo para, no futuro, conceber um tratamento por supresso antgenoespecfica da resposta imune dirigida contra esse auto-antgeno, como j descrito na uvete auto-imune, diabetes mellitus insulino-depedente, esclerose mltipla e na artrite reumatide 16. Nessas doenas, observou-se que a administrao oral do auto-antgeno relevante gerou diminuio dos nveis de citocinas inflamatrias do tipo T1 no rgo afetado, com conseqente reduo de inflamao e destruio tecidual. Seria possvel, ento, eliminar seletivamente a resposta auto-imune prejudicial sem interferir na resposta de defesa contra o parasita. Referncias bibliogrficas 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Teixeira, A.R.L. et al. J. Infect. Dis. 162:1420, 1990 Higuchi, M.L. et al. Clin. Cardiol. 1987; 10:665 Higuchi, M.L. et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997; 56: 485 Jones, E. et al. Am J. Trop. Med. Hyg. 1993; 48:348 Higuchi, M.L. et al. Cardiovasc. Pathol. 1993; 2:101 Olivares-Villagomez, D. et al. Parasite Immunol 1998; 20:447 Chocair, P. et al. Rev Soc Bras Med Tropical 1985;18:43 Kalil, J. & Cunha-Neto, E. Parasitol. Today 1996; 12:396 Cunha-Neto, E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:3541 Gruber A. & Zingales B. Exp Parasitol 1993;76:1 Cunha-Neto, E. et al. J. Clin. Invest. 1996; 98:1709 Cunha-Neto, E. et al. Braz. J. Med. Biol. Res. 1998; 31:133-137 Abel, L.C.J. et al. Braz. J. Med. Biol. Res. 1997; 30: 1305 Cunha-Neto, E. et al. .Mem Inst. Oswaldo Cruz 1997; 92 (Suppl I): 40-41 Vianna, G. Mem. Instituto Oswaldo Cruz 1911; 3:276 Fruh, K et al. Nature 1995; 375:415 Meinl, E et al. Immunol. Today 1998; 19:474 Weiner, HL. Annu.Rev.Med. 1997; 48:341
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NOVARTIS
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AGRICULTURA
VESPAS
A importncia das vespas como agentes no controle biolgico de pragas
Prof Fbio Prezoto
Departamento de Zoologia. Universidade Federal de Juiz de Fora fprezoto@icb.ufjf.br
s insetos so o mais numeroso grupo de animais sobre a face da Terra e, devido a sua influncia nas mais diferentes atividades humanas, tm sido objeto de estudo h muitos anos. Com o passar do tempo, a relao dos insetos com o homem levou-os a serem classificados, do ponto de vista econmico, em insetos teis ou nocivos. Entre os insetos, a ordem Hymenoptera uma das que mais chama a ateno, com cerca de 103 mil espcies conhecidas, compreendendo insetos como formigas (15 mil espcies), abelhas (20 mil espcies) e vespas (cerca de 68 mil espcies) (GILLOTT, 1995). As vespas ou marimbondos so insetos abundantes, que apresentam um alto grau de sinantropismo, ou seja, de associao com o homem. muito comum encontrar ninhos de vespas construdos ao redor de edificaes humanas. Embora todo o conhecimento popular sobre as vespas gire em torno de suas dolorosas ferroadas e do seu grande nmero de indivduos, que saem do ninho para atacar, cabe dizer que a ao nociva desses insetos extremamente irrelevante quando levamos em conta a contribuio deles tanto no aspecto ecolgico quanto no econmico. A grande maioria das vespas
predadora de inmeras pragas agrcolas e, consequentemente, agentes valiosos no controle biolgico destas. Mesmo em baixos nveis populacionais, os predadores contribuem na diminuio da quantidade de pragas, reduzindo os picos de infestao quando muitos inimigos naturais de hospedeiros especficos so ineficientes (DeBACH, 1951). Dentre as vespas sociais, o gnero Polistes se destaca como um importante agente de controle biolgico, devido principalmente facilidade de manipulao e translocao de suas colnias para abrigos artificiais. Na Carolina do Norte, RABB & LAWSON (1957), verificaram que a introduo de colnias de vespas desse gnero na cultura do fumo reduziu em 68% o dano causado pela lagarta Protoparce sexta (Johan). Segundo MORIMOTO (1961), uma nica colnia de Polistes pode predar 2.000 lagartas de Pieris rapae L., praga da couve, durante seu ciclo de desenvolvimento. No Brasil, estudos recentes feitos por PREZOTO et al. (1994) e GIANNOTTI et al. (1995) trazem um levantamento detalhado de presas capturadas pelas vespas Polistes simillimus e P. lanio lanio, respectivamente, sugerindo a utilizao das mesmas no controle biolgico de pragas agrcolas, uma vez que, em ambas as espcies, a maioria das presas capturadas
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correspondeu a lagartas de Lepidoptera que estavam presentes nas plantaes prximas aos ninhos estudados. O Japo e os E.U.A. possuem programas de manejo de colnias de vespas desse gnero para abrigos artificiais instalados ao redor de plantaes, com a finalidade de controle das pragas dessas culturas. A primeira pesquisa brasileira envolvendo a utilizao de uma espcie de vespa social do gnero Polistes no controle biolgico de pragas agrcolas, foi realizado por PREZOTO (1997), no Municpio de Piracicaba, SP. Nesta pesquisa, o autor procurou avaliar a ao predatria da vespa social Polistes simillimus sobre as pragas do milho (Zea mays L.) em campo, verificando os efeitos dessa associao na produtividade da lavoura e na incidncia de pragas. O trabalho de PREZOTO (1997) foi realizado em duas etapas: a primeira durante o perodo de novembro de 1994 a maro de 1995 e a segunda de novembro de 1995 a marco de 1996. A primeira etapa do trabalho avaliou o efeito da ao predatria da vespa P. simillimus na produtividade de uma lavoura de milho infestada com a lagarta-docartucho (Spodoptera frugiperda). Para tanto, infestou-se uma lavoura experimental de milho de 500 m2 (5 quadras de 10 x 10 metros, distantes 8 metros entre si) na sua fase inicial com lagartas de primeiro nstar da referida lagarta. Aps a completa infestao da lavoura, foram translocadas 20 colnias de P. simillimus, em estgio inicial, de localidades prximas para abrigos artificiais de madeira, distribudos um em cada lado das 5 quadras -experimento. Tambm foram mantidas duas quadras-controles (sem infestao e sem vespas), distantes cerca de 750 metros da rea experimental. Ao final do ciclo da cultura, em maro de 1995, a comparao da produo mdia das quadras-experimento e quadras-controle revelou que, devido ao das vespas, a produtividade das quadrasexperimento foi 15,94% maior do que a produo das quadras controle para o peso bruto de espigas e 13,07% maior em relao ao peso de gros. A segunda etapa do trabalho quantificou a ao predatria das vespas P. simillimus sobre as pragas da cul-
tura do milho (5 quadras experimento) em relao ocorrncia natural das mesmas em uma cultura em condies normais (2 quadras-controle). O experimento seguiu a mesma metodologia da primeira etapa, com exceo da infestao com lagartas de S. frugiperda. Pela amostragem semanal de 5 plantas em cada uma das quadras experimento e controle, estimou-se a incidncia de pragas nas duas reas e, por meio da coleta semanal de presas capturadas pelas vespas (5 horas por semana), identificou-se quais as pragas da cultura do milho estavam sendo predadas (Tabela I). Os resultados obtidos nas 12 coletas realizadas durante o ciclo da cultura do milho (novembro de 1995 a maro de 1996) revelaram que a predao de pragas exercida pelas 20 colnias de P. simillimus na rea experimental, contribuiu para uma reduo de 77,16% na incidncia de S. frugiperda e 80% na populao de Helicoperva zea (lagarta-da-espiga) em relao rea de controle. Esses resultados confirmam a excelente atuao dessa espcie de vespa no controle biolgico das pragas e significam uma economia para o agricultor, uma vez que acabam predando com sucesso as pragas mais abunFigura 2: Distribuio dos abrigos artificiais de madeira com colnias de Polistes simillimus ao redor de uma quadra de milho experimental.
Figura 1: Vespa forrageadora de Polistes simillimus trazendo pedao de presa para a colnia (na Seta).
dantes da cultura e diminuindo o gasto com inseticidas, que, muitas vezes, no controlam com eficincia a espcie danosa, alm de contribuir para a preservao do meio ambiente pela produo de produtos sem agrotxicos. As vespas de P.simillimus encontraram e predaram de maneira eficiente as lagartas de S frugiperda, mesmo as escondidas dentro de partes da planta, onde os produtos qumicos no atuam. A lagarta-do-cartucho a praga mais importante e disseminada
na cultura de milho no pas, no somente pelos danos que causa, mas tambm pela dificuldade de control-la (CRUZ, 1986). Dessa forma, pode-se concluir que o manejo de colnias de vespas sociais para controle de pragas de culturas agrcolas muito vivel, no apenas pelos bons resultados obtidos, mas tambm pela facilidade e boa aceitao dessas vespas ao manejo e translocao de suas colnias. As vespas sociais so relativamente abundantes no ambiente e, uma vez introduzidas, as colnias crescem, multiplicam-se e disseminam-se pela regio, favorecendo sua manuteno e continuada eficincia no controle biolgico das pragas do local. Apesar da grande importncia ecolgica das vespas no ambiente, muitas espcies esto ameaadas de extino devido, principalmente, falta de conscincia da maior parte da populao que, ao encontrar um ninho de vespa, o destri mesmo sem motivo, alm do uso indiscriminado de inseticidas, que levam morte vrias colnias no ambiente. Ao contrrio da abelha, as tcnicas para o manejo e a criao das vespas ainda esto no incio, por isso, quando um vespeiro destrudo, nada pode reconstru-lo. Por se tratar de um animal silvestre, protegido por lei, quem for pego capturando ou destruindo ninhos de vespas est sujeito s penas da lei. Agradecimentos O autor agradece a ateno da Prof Lgia Vieira Lage, pela colaborao na reviso do artigo. Referncias CRUZ, I. Manejo de pragas do milho no Brasil. In: EMBRAPA. Curso internacional de manejo de pragas. Sete Lagoas: EMBRAPA/CNPMS, 1986. 22p. DeBACH, P. The necessity for na ecological approach to pest control on citrus in California. J. Econ. Entomol., 44: 443-7, 1951.
Figura 3: Vista de uma colnia da vespa social Polistes simillimus em um abrigo artificial de madeira.
GIANNOTTI, E.; PREZOTO, F.; MACHADO, V.L.L. Foraging activity of Polistes lanio lanio (Fabr.) (Hymenoptera, Vespidae). An. Soc. Entomol. Brasil, 24: 455-63, 1995. GILLOTT, C. Entomology. New York, Plenium Press, 1995. 798p. MORIMOTO, R. Polistes wasps as natural enemies of agricultural and forest pests. III. (Studies on the social Hymenoptera of Japan. XII). Sci. Bull. Fac. Agric. Kyushu Univ., 18: 243-52, 1961. PREZOTO, F. Ao de Polistes (Aphanilopterus) simillimus Zikn, 1951 (Hymenoptera, Vespidae) no combate s pragas de Zea mays L. Dissertao de Mestrado apresentada ao Instituto de Cincias Biolgicas/ UNESP. Rio Claro, 1997, 67p. PREZOTO, F.; GIANNOTTI, E.; MACHADO, V.L.L. Atividade forrageadora e material coletado pela vespa social Polistes simillimus Zikn, 1951 (Hymenoptera, Vespidae). Insecta, 3(1): 11-19, 1994. RABB, R.L. & LAWSON, F.R. Some factors influencing the predation of Polistes wasps on tobacco hornworm. J. Econ. Ent., 50: 778-84, 1957.
TABELA I. Quantidade de presas capturadas por 5 colnias de Polistes simillimus durante 5 horas semanais (60 horas) na rea experimental de uma cultura de milho.
PRESAS CAPTURADAS LEPIDOPTERA Spodoptera frugiperda Spodoptera sp. Heliothis virescens Helicoverpa zea Mocis latipes Trichoplusia ni Anticarsia gemmatalis Nymphalidae Pieridae LEPIDOPTERA No identificados Ninfa de HEMIPTERA INSETOS ADULTOS No identificados Material no identificado TOTAL 1 4 1 1 6 2 3 1 4 3 1 2 1 2 1 7
NMERO DE SEMANAS 4 5 6 7 8 9 1 2 3 1 1 8 2 3 1 6 1 1 2 2 6 3 2 1 2 8 2 1 1 3 3 1 1 1 2 2 -
TOTAL % 10 11 12 1 1 2 2 2 1 9 2 1 2 1 3 3 3 2 1 23,07 1,09 15,38 10,98 1,09 8,79 14,28 2,19 1,09 12,08 1,09 3,29 5,58 100,0
- 1 11 7
- 1 13 6
SOJA ROUNDUP
Biossegurana e
BIOSSEGURANA
Vacinas da Dengue
Critrios de Biossegurana na anlise de um candidato Vacinal
dengue, hoje a mais importante doena viral transmitida por artropdos, resulta da infeco por um dos sorotipos do vrus do dengue. Esses vrus, denominados dengue tipos 1, 2, 3 e 4, so transmitidos a um hospedeiro susceptvel atravs da picada da fmea do mosquito Aedes aegypti previamente infectada. O quadro clnico dessa doena varia desde apresentaes assintomticas at quadros graves caracterizados por hemorragia e choque circulatrio e associados a alta letalidade, denominados febre hemorrgica do dengue (FHD) e sndrome do choque do dengue (SCD). Essas formas da doena esto, na maior parte das vezes, relacionadas com a infeco secundria causada por um sorotipo do vrus da dengue diferente daquele que causou a infeco primria. FHD e SCD so prevalentes em mais de 100 pases e so uma ameaa sade de mais de 2,5 bilhes de pessoas, habitantes das regies tropicais e subtropicais do globo terrestre. A incidncia anual da dengue estimada em torno de dezenas de milhes, com um nmero aproximado de 500.000 hospitalizaes de casos de FHD/SCD. Em mdia, o ndice de mortalidade desses casos de 5%, com, aproximadamente, 24.000 bitos por ano. No Brasil, somente neste ano, j foram notificados 213.932 casos de dengue, sendo que, at a 18a semana epidemiolgica, 50 casos foram caracterizados como FHD/SCD e resultaram em 8 bitos. A Organizao Mundial da Sade (OMS) considera o controle e a preveno da dengue uma das suas prioridades e, para atingir esse objetivo, adotou, em 1995, um programa estratgico mundial. Atualmente, o controle dessa doena baseia-se primariamente no controle do vetor, j que no existe ainda uma vacina licenciada para uso humano, apesar de intensa pesquisa nesse campo nos ltimos 30 anos. Vacinas para a dengue As primeiras tentativas de produo de vacinas para os vrus da dengue iniciaram-se alguns anos aps esses vrus terem sido isolados. Inicialmente, candidatos vacinais foram atenuados pela passagem seriada em crebros de camundongos e se mostraram protetores contra os seus prottipos selvagens. Entretanto, proteo apenas contra um tipo de sorotipo no suficiente devido hiptese de que a infeco sequencial por um sorotipo diferente leve a uma doena mais grave. Desse modo, a vacina para o dengue deve ser tetravalente, isto , proteger contra os 4 sorotipos. Assim, pesquisadores comearam a tentar produzir vacinas atenuadas para o dengue, em particular grupos de vrias instituies americanas e da Mahidol University, na Tailndia. As cepas 45AZ5 PDK-27 (dengue-1), DEN-2 PR-159-S1 (dengue-2), CH53489 clone 24/28 (dengue-3) e 341750 Carib (dengue-4) foram desenvolvidas pelos grupos americanos enquanto que as cepas DEN-1 PDK13, DEN-2 PDK-53, DEN-3 PGMK-30/ F2 e DEN-4 PDK-48 foram desenvol-
Departamento de Clnica Mdica da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto - Universidade de So Paulo. Mdico formado pela Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo e Mestrado e Doutorado pela Yale University (USA).
Benedito Antnio Lopes da Fonseca
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vidas na Tailndia, sob superviso da OMS. Vrios ensaios clnicos foram feitos com esses candidatos vacinais, quando foram conseguidos alguns resultados que garantiam a possibilidade dessas vacinas serem usadas, desde que os problemas de potncia e imunogenicidade fossem resolvidos. Em 1993, foi firmado um acordo comercial entre a Mahidol University e a Pasteur Merieux Serums and Vaccines Company para optimizar a produo dessas vacinas para o dengue. No incio deste ano, foi apresentado, no First Annual Conference on Vaccine Research em Washington, D.C., o resultado dos testes em voluntrios humanos com esta vacina. A concluso do trabalho foi que, apesar da maioria dos individuos testados terem apresentado soroconverso, interaes entre os sorotipos virais resultando em viremia seletiva pelo dengue-3, podem afetar a infectividade e imunogenicidade da vacina tetravalente. A produo de vacinas de vrus inativados tem sido pouco explorada na produo de vacinas para o dengue devido caracterstica de no apresentar grande imunogenicidade. Recentemente, Putnak e colaboradores tem investido nesse mtodo de produo de candidatos vacinais atravs da passagem desses vrus em clulas Vero (rim de macaco verde africano) e FRhL-2 (pulmo fetal de macaco Rhesus) seguido por inativao em formalina a 0.05% e formalina seguida de radiao (7 mRads de fonte de cobalto). Entretanto, somente proteo parcial foi obtida com esta tcnica o que a coloca em segundo plano em relao s demais, principalmente pelo fato de ser muito caro produzir esse tipo de vacina e pela pouca imunogenicidade. Outra estratgia usada na produo de candidatos vacinais refere-se purificao de protenas nativas dos vrus da dengue por cromatogra-
fia lquida (HPLC). Os resultados a tambm foram desapontadores e, associada ao custo de produo, essa estratgia tem sido abandonada. Nos ltimos anos, algum progresso no desenvolvimento de vacinas tem sido alcanado por meio do uso da tecnologia do DNA recombinante. As estratgias usadas foram as de produo de peptdeos sintticos, vacinas de subunidades, vacinas de vrus recombinantes, vacinas derivadas de clones infecciosos de cDNA derivados de candidatos vacinais e vacinas de DNA. Deposita-se muita esperana nos dois ltimos mtodos. Um clone infeccioso de cDNA preparado a partir do candi-
mundongos. Outros candidatos vacinais preparados por engenharia gentica so as vacinas de subunidades e vrus recombinantes que expressem protenas dos vrus da dengue. A produo de vacinas de subunidades em baculovrus tem tido resultados conflitantes pois alguns grupos tm encontrado proteo total em camundongos, enquanto outros encontram apenas proteo parcial. Com vrus recombinantes, principalmente com o vrus da vaccnia, esses resultados no tm sido diferentes, apesar desses vrus recombinantes possurem a reputao de induzirem melhor resposta imune do que os outros vetores recombinantes, tais como bactrias, por exemplo, a Salmonella typhimurium. Biossegurana e vacinas Desde que a vacina para a dengue seja a nica chance de realmente controlar essa doena, intensas pesquisas nessa rea podero resultar na produo de candidatos vacinais. As normas para liberao de uma vacina deve cobrir todas as fases de produo de uma vacina, isto , a fase de desenvolvimento, de ensaios clnicos, registro nos orgos competentes e vigilncia ps-liberao. Antes da fase de investigao clnica, deve-se investir na segurana do laboratrio em que a pesquisa est sendo desenvolvida a fim de se proteger as pessoas que esto envolvidas na pesquisa e que o meio ambiente no seja afetado pelos produtos secundrios resultantes dessa pesquisa. Para tanto, as condies de segurana dos laboratrios devem ser otimizadas, em especial com a manipulao dos vrus e o descarte do material. A infraestrutura de biotrio de extrema importncia, pois se a pesquisa for realizada em reas endmicas para a dengue, existe a possibilidade de contaminao dos animais usados em pesquisa por mosquitos infectados ou da contaminao de mosquitos pelo candidato vacinal. Alm disso, necessrio certificar-se de que os materiais usados na produo das vaciBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 29
dato vacinal DEN-2, PDK-53 est sendo usado para construir vrus quimricos por meio da insero dos genes da cpside viral, da pr-membrana e do envelope dos vrus dengue-1, 3, e 4 na estrutura genmica do DEN-2 PDK-53. Essas vacinas vm sendo desenvolvidas com sucesso por um grupo do National Intitutes of Heallth (NIH) e tm-se mostrado imunognicas no modelo animal. Alm disso, clone infeccioso de cDNA do vrus da febre amarela pode ser usado para os mesmos fins. As vacinas de DNA podem representar uma soluo, pois elas podem ser usadas para imunizao contra um sorotipo especfico de dengue, sem o inconveniente de induzir a resposta imune exacerbada responsvel pelas infeces graves do dengue. Kochel e colaboradores produziram um candidato vacinal para o dengue-2 e demonstraram a presena de anticorpos neutralizantes para esse vrus em ca-
nas sejam puros e seguros, e que, ao mesmo tempo, no comprometam a potncia da vacina. Testes em animais, inclusive em primatas no-humanos, devem ser exaustivamente realizados para garantir que a mesma no txica, portanto segura, potente e eficaz para uso em humanos. Aps a avaliao da eficcia dessa vacina no laboratrio, os critrios de biossegurana devem ser aplicados na investigao clnica. A investigao clnica para validao da vacina como imunobiolgico geralmente se faz em trs fases: os ensaios clnicos de fase I, II e III. Na fase I, o produto administrado para um pequeno nmero de voluntrios e visa a determinar a atividade biolgica do produto, sua potncia e a sua segurana. Nesse caso, um candidato vacinal para a dengue dever induzir a formao de anticorpos neutralizantes e, para alcanar esse objetivo, o candidato vacinal deve ser administrado em pequenas doses e ser isento ou com poucos efeitos colaterais. Ainda nessa fase, pode-se certificar de que o candidato vacinal no persiste no organismo (latncia) e que pode ser administrado com segurana a imunossuprimidos e imunocomprometidos. Ensaios de fase II destinamse a confirmar os achados dos ensaios de fase I, em particular a eficcia do produto em produzir a sua atividade farmacolgica e fisiolgica. No caso das vacinas da dengue, essas devero induzir resposta imune que confira proteo contra os quatro sorotipos de vrus da dengue semelhante resposta induzida pelos prprios agentes. Nessa fase, o vrus selvagem pode ser administrado aos voluntrios que foram vacinados ou podem ser usados voluntrios de rea endmica e verifica-se a capacidade protetora da vacina. Alguns efeitos colaterais mais raros podem ficar aparentes nessa fase. Devido ao maior nmero de voluntrios usados, pode-se determinar, nessa fase, se a infeco pela vacinao ocorre somente na populao alvo, se o candidato vacinal contagioso e se induz fenmenos imunolgicos que possam ser associados ao desenvolvimento de doena autoimune. Se o candidato vacinal um vrus recombinante, deve-se avaliar se no ocorreu mudana de especificidade celular ou aumento da virulncia. Na fase III, os ensaios clnicos so
realizados no campo, com um grande nmero de pessoas e devem incluir populaes com caractersticas epidemiolgicas bem estudadas. A vigilncia ps-liberao deve ser implementada e documentada. Somente assim, eficcia e segurana a longo prazo podem ser determinadas. Apenas com estudos a longo prazo que se poder concluir que o candidato vacinal no tumorognico ou no ocorre integrao no genoma do hospedeiro. Nessa fase, por meio de estudos controlados, outros aspectos importantes na discusso de critrios de biossegurana podero ser avaliados. Entre eles esto a capacidade do candidato vacinal infectar outras espcies, incluindo os vetores da dengue, de sobreviver na natureza, de ser disseminado no meio-ambiente e, finalmente, do grau de segurana desse candidato vacinal a longo prazo. Dessa fase sairo os resultados que sero analisados em relao ao risco da liberao de uma vacina para uso humano e o benefcio a ser alcanado. Como exemplo, os efeitos colaterais do vrus da vaccnia no foram desprezveis durante a campanha de erradicao da varola, porm a erradicao dessa doena livrou a humanidade de um dos seus maiores flagelos. Do mesmo modo, as vacinas contra a poliomielite e o sarampo no so incuas, mas prestam um benefcio imensurvel s pessoas vacinadas. Quanto persistncia na natureza, impossvel predizer o resultado da liberao de um candidato vacinal no meio-ambiente. O vrus da vaccnia , at hoje, excretado por bfalos, na ndia. Isso s ocorre porque o vrus da vaccnia tem a capacidade de infectar outras espcies que no aquela visada para a vacinao. Desse modo, ser difcil ocorrer a liberao de um vrus recombinante preparado a partir de um vrus da vaccnia para uso vacinal. Por outro lado, se a especificidade do candidato vacinal para a espcie humana for alta e os efeitos da infeco aguda pouco importantes, a persistncia na natureza pode auxiliar na imunizao de susceptveis Assim, a avaliao de critrios de biossegurana na liberao de um candidato vacinal complicada pela necessidade de estudos a longo prazo, porm um dos critrios mais importantes a avaliao de risco e
benefcio. As vacinas de vrus atenuados multivalentes, como o caso da vacina para a dengue, podem apresentar a replicao preferencial de um sorotipo viral em detrimento dos outros. Alm disso, por serem atenuadas, e portanto, vacinas de vrus vivos, existe a possibilidade da reverso de um deles cepa virulenta, aumentando a possibilidade de causar doena clnica aps a inoculao da vacina. As vacinas de vrus quimricos funcionariam como vacinas de vrus atenuados e, portanto, com os mesmos problemas mencionados anteriormente para essas vacinas. Adicionalmente, como ocorre a produo de um vrus previamente inexistente, no se pode prever o impacto desste novo vrus na natureza e o resultado das suas infeces em seres humanos. Desde que vacinas de DNA esto sendo consideradas uma alternativa promissora para o desenvolvimento de vacinas, a maior preocupao a possibilidade de integrao desstes DNAs no genoma celular. Estudos sobre esse tema tm mostrado que a injeo de 200 mL de DNA, o que corresponde a 3 x 1013 molculas de DNA, representa uma freqncia de integrao 10.000 vezes inferior a evento oncognico, o que um evento extremamente raro. Assim, se um candidato vacinal apresentasse um efeito adverso indesejado a cada 100.000 vacinaes, este seria considerado um alto ndice de efeitos adversos. Porm, se analisarmos o fato de que j foram notificados mais de 200.000 casos de dengue este ano no Brasil e que houve 50 casos de dengue hemorrgico nesse perodo, resultando em 8 bitos, o benefcio da vacinao bvio. Desse modo, importante determinar os critrios de biossegurana para que se possa avaliar um candidato vacinal na sua totalidade, mas, claro, que os estudos a longo prazo so aqueles que nos daro as maiores informaes sobre a segurana e o benefcio do uso desses imunobiolgicos. Desse modo, na eventualidade de se produzir uma vacina para dengue, esta dever passar por uma bateria imensa de testes para que seja cogitada a sua aprovao para uso humano. Infelizmente, apesar dos esforos e da necessidade para controle dessa doena, vacinas para a dengue no estaro disponveis para uso humano em um futuro prximo.
CARGILL
SOCIEDADE

O papel da CTNBio
Nacional, foi sancionada, em 1995, a Lei de Biossegurana e foi criada a Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio), instituio norteadora do desenvolvimento da moderna biotecnologia no Brasil. Operacionalmente vinculada ao Ministrio da Cincia e Tecnologia, a CTNBio comeou suas atividades em junho de 1996. composta por 36 membros, titulares e suplentes, especialistas de notrio saber cientfico, das reas humana, animal, vegetal e ambiental, representantes dos Ministrios da Cincia e Tecnologia, da Sade, da Agricultura, do Meio Ambiente, da Educao e das Relaes Exteriores, alm de representantes de rgo de defesa do consumidor, de proteo sade do trabalhador e do setor empresarial de biotecnologia. Compete CTNBio estabelecer normas e regulamentos relativos s atividades e projetos que envolvam construo, cultivo, manipulao, uso, transporte, armazenamento, comercializao, consumo, liberao e descarte relacionados a organismos geneticamente modificados, visando a proteger a vida e a sade do homem, dos animais e das plantas, bem como o meio ambiente. A Comisso vem-se reunindo regularmente desde a sua criao para certificar a segurana de laboratrios e experimentos relativos liberao de organismos geneticamente modificados no meio ambiente e para julgar pedidos de comercializao de produtos que contenham OGMs. Ao longo de seus trs anos de funcionamento, foram emitidas 18 Instrues Normativas que regulamentam diversos aspectos da biotecnologia moderna no Pas. Atualmente, existem 120 instituies pblicas e privadas credenciadas pela CTNBio, por meio da concesso de Certificado de Qualidade em Biossegurana (CQB), para desenvolver atividades com organismos transgnicos, das quais 20 efetivamente conduzem liberaes planejadas no meio ambiente. A Comisso j autorizou e vem acompanhando cerca de 700 processos de liberaes planejadas no meio ambiente, em plantios agrcolas em escala experimental e apenas um em esca-
A autora analista de C&T do Ministrio da Cincia e Tecnologia, tem mestrado em Direito pela UnB e membro da CTNBio.
Simone H. C. Scholze
intenso avano da pesquisa biotecnolgica provoca hoje uma crescente mobilizao da sociedade e dos Poderes Pblicos quanto absoro dos seus resultados reaes positivas com relao aos benefcios aportados pela biotecnologia e reaes negativas quanto aos riscos tecnolgicos. Quando se trata de riscos tecnolgicos, no se est lidando apenas com a incerteza econmica ou cientfica e tecnolgica, mas tambm com a incerteza tica e moral. primeira ordem de incertezas, a sociedade responde com o estabelecimento de regulao tcnica mais estrita, por exemplo, no campo da biossegurana, do uso de animais para pesquisa e da propriedade e comrcio de bens de alto contedo tecnolgico. Relativamente segunda categoria de incertezas, alm do debate no campo da biossegurana, verifica-se a legtima intensificao do debate tico. O Brasil chega hoje exatamente a essa era de transformaes cientficas e de debates ticos e legais. A aprovao de um plantio em escala comercial de uma linhagem transgnica comea com muitos anos de trabalho de laboratrio. Uma vez que uma planta potencialmente til tenha sido desenvolvida e testada em laboratrio, um programa de testes de campo essencial para avaliar seu desempenho, antes da comercializao. A biossegurana visa precisamente ao estabelecimento dos mecanismos de proteo para o uso da biotecnologia moderna, tanto no que tange a experimentos laboratoriais, como a testes de campo que possam implicar risco biolgico, provocando impactos ambientais favorveis ou indesejveis ou conseqncias para a sade humana. Desde a dcada de 1970, fatores associados ao desenvolvimento cientfico e tecnolgico dos pases, a interesses econmicos e a presses dos prprios cientistas e de grupos ambientalistas vm delineando as normas do que se convencionou denominar biossegurana. A Lei de Biossegurana Como conseqncia de projeto de lei de iniciativa do ento Senador Marco Maciel, aps 5 anos de tramitao no Congresso
la comercial, a soja roudup ready. Embora se verifique um processo cada vez maior de conscientizao, muitas instituies ainda atuam com organismos transgnicos sem autorizao legal da CTNBio. A fiscalizao dessas atividades incumbncia dos rgos fiscalizadores do Ministrio da Agricultura, do Ministrio da Sade e do Ministrio do Meio Ambiente, em suas respectivas reas de competncia. Procedimentos da CTNBio A Comisso analisa, caso a caso, as solicitaes que lhe so encaminhadas, jamais emitindo pareceres genricos sobre, por exemplo, soja transgnica ou milho transgnico em geral, mas, unicamente, sobre determinada linhagem de soja modificada para expressar determinadas caractersticas. Cabe ao solicitante o nus de demonstrar a biossegurana do OGM, fornecendo todos os dados necessrios para a avaliao da CTNBio, podendo a Comisso exigir informaes e testes adicionais. exigncia legal para realizao de experimentos com OGMs que a instituio interessada disponha da autorizao especfica da CTNBio para a realizao do experimento, de Certificado de Qualidade em Biossegurana, ambos publicados no Dirio Oficial da Unio, e que constitua Comisso Interna de Biossegurana de acordo com os critrios das Instrues Normativas. A elaborao de parecer tcnico prvio conclusivo pela CTNBio regulada pela Lei 8.974/95, Decreto 1.752/95, Regimento Interno da CTNBio, alm dos procedimentos estabelecidos nas Instrues Normativas. De acordo com esses procedimentos, o pedido de liberao de OGMs no meio ambiente distribudo s Comisses Setoriais Especficas da reas da Sade, Vegetal, Animal e Ambiental, que emitem pareceres tcnicos nas reas de sua competncia, determinando os critrios e recomendaes para a sua liberao ou a indeferindo. O Parecer Tcnico Conclusivo emitido pela CTNBio contempla necessariamente os seguintes aspectos da segurana do OGM: a) riscos ao meio ambiente, examinados com especial ateno pela Comisso Setorial Es-
pecfica da rea Ambiental, presidida pelo representante do Ministrio do Meio Ambiente; b) riscos do ponto de vista agrcola e animal, examinados atentamente pelas Comisses Setoriais Especficas das reas Vegetal e Animal, presididas pelo representante do Ministrio da Agricultura; c) riscos para a sade humana, para produo de alimentos com vistas ao consumo humano, examinados com especial ateno pela Comisso Setorial Especfica da rea de Sade, presidida pelo representante do Ministrio da Sade. Esse parecer vinculado a todos os atos administrativos posteriores dos Ministrios, seja quanto ao registro e fiscalizao de sementes e gros, na Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura, seja quanto ao registro e fiscalizao de produtos alimentcios, na Agncia de Vigilncia Sanitria do Ministrio da Sade. Endossa, por fim, o carter vinculativo do Parecer Tcnico Conclusivo quanto segurana ambiental e alimentar dos organismos transgnicos, o disposto no inciso II do art. 2 do Decreto 1.752/95, que atribui competncia ampla CTNBio para acompanhar o desenvolvimento e o progresso tcnico e cientfico na biossegurana e em reas afins, objetivando a segurana dos consumidores e da populao em geral, com permanente cuidado proteo do meio ambiente. Competncias Especficas dos Ministrios da Sade, da Agricultura e do Meio Ambiente Emitido o parecer tcnico prvio conclusivo da CTNBio, cabe aos Ministrios da Agricultura, da Sade e do Meio Ambiente, no limite de sua competncia especfica, a atribuio de monitorar e fiscalizar as atividades relacionadas aos OGMs - e no se trata aqui de conceder aprovao prvia, que responsabilidade da CTNBio, onde esses Ministrios tm assento. Por ocasio do registro e da fiscalizao de sementes e gros, pela Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura, e do registro e da fiscalizao de produtos alimentcios pela Agncia de Vigilncia Sanitria do Ministrio da Sade, observar-se-, para efeitos de biossegurana, o Parecer Tcnico Conclusivo da CTNBio. O registro e outras autorizaes desses Ministrios so medidas administrativas para fins de fiscalizao e monitoramento do uso, transporte, armazenamento, comercializao, consumo, liberao e descarte de produtos que contenham OGMs. Aplicam-se, ainda, as legislaes gerais de competncia de cada Ministrio. Em particular, nos termos da Lei 6.507/77 e do Decreto 81.771/78, cabe ao Ministrio da Agricultura promover a fiscalizao da produo e do comrcio de sementes e mudas, e proceder ao registro de sementes e gros, com o objetivo de garantir a qualidade do material produzido e comercializado. Acresce competncia desse Ministrio o registro de novas cultivares para fins de comercializa-
o e de proteo dos direitos de propriedade intelectual, nos termos da Lei 9.456/ 97 e do Decreto 2.366/98. Apesar de o ato da CTNBio constituir parecer conclusivo de carter tcnico do ponto de vista da biossegurana, no , entretanto, autorizvel para determinar o plantio de um vegetal transgnico, cuja responsabilidade fundamentalmente da competncia do Ministrio da Agricultura. Vale ainda ressaltar que, segundo as normas gerais contidas na Lei de Biossegurana (art. 16), compete exclusivamente CTNBio determinar a paralisao de quaisquer atividades envolvendo OGMs, uma vez constatada a existncia de riscos graves para a sade do homem e dos animais, para as plantas e para o meio ambiente. Assim, a interdio de experimentos e de plantios de vegetais geneticamente modificados, mediante determinao da CTNBio publicada em comunicado no Dirio Oficial da Unio prerrogativa dos rgos de fiscalizao do Ministrio da Sade, do Ministrio da Agricultura e do Ministrio do Meio Ambiente. Alm da interdio e tambm mediante determinao da CTNBio, infraes Lei 8.974/95 podero ser passveis de multas em valores superiores a 16.110,80 UFIR, que sero aplicadas pelos rgos de fiscalizao dos Ministrio citados. Soja Transgnica Roundup Ready Com relao ao caso especfico da utilizao em escala comercial da cultivar da soja geneticamente modificada round up ready resistente ao herbicida glifosato, requerida pela empresa Monsanto, a CTNBio regulamentou, por meio da Instruo Normativa n 18, de 15/12/98, os procedimentos a serem observados para sua liberao planejada no meio ambiente e seu plantio comercial, por ter entendido que, do ponto de vista da biossegurana, no h risco ambiental ou para a sade humana e animal na utilizao da soja em questo. Aps trs anos de estudos experimentais realizados pela empresa interessada, com o acompanhamento da CTNBio, e um ano de exaustiva avaliao pela CTNBio, a concluso favorvel acerca da ausncia de risco para a segurana ambiental decorrente do uso dessa soja pautou-se nos seguintes elementos: a) A soja uma espcie predominantemente autopolinizvel, cuja taxa de polinizao cruzada da ordem de 1%. Por tratarse de espcie extica, sem parentes silvestres no Brasil, no se verifica a possibilidade de ocorrncia de polinizao cruzada da soja transgnica com espcies silvestres no meio ambiente. b) Existem no Brasil pelo menos trs espcies conhecidas de ervas daninhas naturalmente resistentes ao herbicida glifosato. A utilizao do glifosato no Pas, ao longo das ltimas duas dcadas, no ensejou o aparecimento de outras espcies de
ervas daninhas a ele resistentes. A introduo, para plantio, do cultivar soja transgnica round up ready no aumentar a presso de seleo sobre as espcies daninhas em termos de concentrao de produto/ rea. c) A soja uma espcie domesticada, cuja sobrevivncia depende em alto grau do ser humano. No h razes cientficas para se prever a sobrevivncia de plantas derivadas da linhagem em questo fora de ambientes agrcolas. Alm disso, na ausncia de presso seletiva - no caso, o uso do herbicida glifosato - a expresso do gene inserido no confere planta vantagem adaptativa. d) A utilizao do herbicida glifosato, de uso rotineiro nas lavouras de soja no Brasil, no teve efeito negativo no processo de fixao biolgica de nitrognio, seja quanto ao comportamento dos cultivares de soja expostos ao herbicida, seja com respeito ao comportamento dos microrganismos fixadores de nitrognio. Alm disso, o gene marcador nptii, de resistncia a antibitico, no foi transferido para a espcie transgnica. e) Finalmente, ainda quanto questo ambiental, no h nenhum efeito documentado de variaes de comportamento populacional de insetos benficos ou de insetos pragas decorrente do uso do herbicida citado. Alm do exame da segurana ambiental, a CTNBio concluiu que, fora os riscos inerentes ao consumo da soja para a parcela da populao que apresenta reaes adversas ingesto da soja em geral, o consumo da soja transgnica no consiste risco para a segurana alimentar, tanto na dieta de humanos, quanto na dieta de animais. Monitoramento A par de todas as consideraes tcnicas e com o objetivo de assegurar contnuo acompanhamento do produto, a CTNBio, nos termos da melhor conduta de gerenciamento de risco do ponto de vista da biossegurana, decidiu que o uso comercial da soja transgnica em questo ser realizado mediante monitoramento cientfico pelo perodo de cinco anos, procedendo-se a anlises e estudos em plantios comerciais a serem disponibilizados pela empresa Monsanto. O monitoramento compreender os seguintes aspectos: a) avaliao da variao da composio especfica da comunidade de plantas daninhas da rea. b) avaliao de eventual incidncia de plantas daninhas escape, determinando se a resistncia ao herbicida glifosato resultaria da transferncia do transgene. c) avaliao peridica da dinmica populacional de organismos indicadores: insetos, patgenos e microorganismos fixadores de nitrognio e solubilizadores de fosfato. d) a empresa enviar relatrio anual CTNBio, at o dia 15 de junho seguinte ao ano agrcola especfico.
e) as reas de monitoramento sero franqueadas auditoria cientfica pela sociedade civil organizada interessada, mediante autorizao prvia da CTNBio e com a presena de fiscais do Ministrio da Agricultura. f) a empresa informar na embalagem do produto que, eventualmente, os usurios da tecnologia podero receber visitas tcnicas da CTNBio. O monitoramento, que, na prtica, verificar qualquer possvel efeito adverso de carter ambiental decorrente do uso do produto transgnico, consiste, de fato, em gerenciamento de risco e visa a permitir que, a qualquer momento, a CTNBio possa retirar o produto do Sistema Nacional de Registro de Cultivares e, por conseguinte, do mercado de sementes e da indstria de alimentos, por meio da ao dos rgos de fiscalizao e controle do Ministrio da Agricultura. Anlise de Risco do OGM para o Meio Ambiente e Licenciamento Ambiental Paralelamente discusso sobre o mrito tcnico-cientfico da deciso tomada pela CTNBio de dispensar a EIA/RIMA para a soja transgnica roundup ready, devidamente consubstanciada na Instruo Normativa n 18, de 15/12/98, e no Comunicado n 54, publicado no D.O.U. de 1/10/98, Seo 3, pg. 56, tem sido questionada alguns aspectos da constitucionalidade da aplicao da Lei de Biossegurana e de seu decreto regulamentador, especificamente quanto dispensa de EIA/RIMA pela CTNBio, que passamos a examinar. O art. 225, inciso V, da Constituio determina que incumbe ao Poder Pblico exigir, na forma da lei, estudo prvio de impacto ambiental para instalao de obra ou atividade potencialmente causadora de significativa degradao do meio ambiente. Por outro lado, quanto anlise de risco ambiental, facultado CTNBio, nos termos do inciso XIV, do art. 2 do Decreto 1.752/95, exigir como documento adicional, se entender necessrio, a realizao de Estudo de Impacto Ambiental(EIA) e o respectivo Relatrio de Impacto no Meio Ambiente (RIMA) de projetos e aplicao que envolvam a liberao de OGM no meio ambiente. O confronto dessas duas disposies da legislao brasileira permite avaliar a questo da biossegurana dos OGMs para o meio ambiente sob a tica de algumas consideraes legais. A primeira reflexo diz respeito ao fato de que a Lei de Biossegurana insere-se no Captulo VI da Constituio Federal de 1988 - Do Meio Ambiente, regulando os incisos II e V do 1, segundo os quais incumbe ao Poder Pblico preservar a diversidade e a integridade do patrimnio gentico do Pas e fiscalizar as entidades dedicadas pesquisa e manipulao de
material gentico; e controlar a produo, a comercializao e o emprego de tcnicas, mtodos e substncias que comportem riscos para a vida, a qualidade de vida e o meio ambiente. Uma vez que essa lei cria a Comisso Tcnica de Biossegurana, na qual tm assento diversos ministrios e organizaes, e lhe confere competncia especial no campo ambiental, torna-se claro que a questo ambiental na legislao brasileira no se circunscreve exclusivamente esfera de atribuies do Ministrio do Meio Ambiente, ou aos rgos do Sistema Nacional do Meio Ambiente ou ao CONAMA. Outra considerao diz respeito deciso da CTNBio de dispensar a exigncia de EIA/RIMA - e no de estudos e avaliaes de risco ambiental - para a soja roundup ready. Do ponto de vista cientfico e dos estudos de risco ambiental examinados e acompanhados ao longo de trs anos pela CTNBio, no apenas luz das condies especficas brasileiras, mas ao longo dos anos em que esse produto j vem sendo avaliado, testado, produzido e utilizado, no apenas no Brasil, mas tambm nos Estados Unidos, na Unio Europia, na Argentina, no Canad e no Japo, no se constatou qualquer indcio de que haja potencial de significativa degradao do meio ambiente. S isso j afastaria a exigncia de estudo prvio de impacto ambiental contida no mencionado art. 225, inciso IV, da Constituio Federal. Ademais, vale ressaltar que os estudos prvios de impacto ambiental a que se refere o texto constitucional no se limitam unicamente ao EIA/RIMA regulado pela Resoluo 237/97 do CONAMA. Uma ltima considerao quanto ao aspecto ambiental deve ser finalmente examinada. O processo de avaliao e controle de risco ambiental do ponto de vista da biossegurana de OGMs, que deve ser rigorosamente seguido pelo solicitante de autorizao para experimentos com organismos transgnicos, minuciosamente definido nas Instrues Normativas n3/96 e n10/98 da CTNBio. Essa regulamentao contm normas detalhadas para avaliao e controle de risco ambiental, bem como de riscos para a sade humana e animal pelo uso de organismos transgnicos, cujo contedo e critrios so substancialmente equivalentes a um estudo de impacto ambiental, embora no tenham essa denominao. Esses procedimentos de verificao prvia de riscos dos transgnicos para a sade e o meio ambiente, tradicionalmente denominados avaliao de risco e controle de risco - e no Estudo de Impacto Ambiental e Relatrio de Impacto no Meio Ambiente (EIA/RIMA) - contm elementos e procedimentos similares e a mesma finalidade de proteo e preservao ambiental. Alm disso, a Instruo Normativa n3/ 96 determina que, no caso de a CTNBio
considerar que a liberao proposta provocar efeito negativo no meio ambiente, a encaminhar ao Ministrio do Meio Ambiente, que poder exigir impacto ambiental (EIA/RIMA). Mais uma vez evidencia-se o poder discricionrio do Poder Pblico representado pela CTNBio - que, com base em evidncias e estudos cientficos, avaliar se cabe ou no exigir do interessado a realizao de EIA/RIMA. Logo, se, na avaliao cientfica de risco da CTNBio, o rgo pblico sobre o qual recai esse poder discricionrio ,e se no constatar que no h risco de dano significativo ao meio ambiente que justifique a elaborao de um EIA/RIMA, este no ser exigido do interessado. Cabe ainda observar que, luz do 4, do art. 24 da Constituio Federal, segundo o qual a supervenincia de lei federal suspende a eficcia da lei estadual no que lhe for contrrio, uma vez que esse estudo seja dispensado pela instncia federal competente, a CTNBio, no poder uma lei estadual requer-lo. Consideraes finais A CTNBio foi criada em 1995 por uma lei democraticamente aprovada pelo Congresso Nacional e, desde sua instalao, em junho de 1996, pauta sua ao pelo estrito cumprimento da Lei de Biossegurana. Toda a ao que a CTNBio se prope a realizar est calcada no entendimento de que o Estado moderno no pode prescindir da transferncia do conhecimento e do seu uso em benefcio do homem e da sociedade, mediante processos adequados de biossegurana. Esse princpio da precauo - concretizado entre ns pela prpria existncia da Lei de Biossegurana e da CTNBio - reflete-se hoje na postura que a sociedade brasileira adotar doravante em face da tecnologia transgnica. Nesse contexto, quando a biotecnologia vem-se tornando, cada vez mais, instrumento para soluo de problemas relacionados, sobretudo, com sade e alimentao humana, fundamental que a legislao brasileira de biossegurana seja adequadamente implementada e que a CTNBio continue a orientar instituies de pesquisa e empresas quanto aos critrios e procedimentos de biossegurana, como tambm a a esclarecer a preocupao da populao brasileira acerca de eventuais riscos associados a OGMs. Ao presenciarmos o debate acirrado acerca da convenincia ou no de permitirmos a entrada de produtos transgnicos no Brasil, preciso ter-se discernimento quanto s questes econmicas, as questes legais, as questes polticas e as questes cientficas, de modo que no se permita que os aspectos polticos e econmicos venham a obscurecer ou deturpar a legalidade e a legitimidade da Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana, refletida na transparncia de seus procedimentos, na competncia de seus cientistas, na correo e seriedade com que as questes de segurana cientficas so por ela abordadas.
AGROCERES
ALGODO COLORIDO
Pesquisador da Embrapa Algodo-Campina Grande, PB
Elusio Curvelo Freire
AGRICULTURA
Fotos: Eleusio Curvlo Freire
O ALGODO COLORIDO NO BRASIL
ORIGEM O algodo colorido foi desenvolvido pelos incas e astecas h 4.500 anos, bem como por outros povos antigos das Amricas, sia, frica e Austrlia. J foram identificadas 39 espcies silvestres de algodo com fibras coloridas. Na maioria dessas espcies primitivas, o algodo possui fibras coloridas, principalmente na tonalidade marrom. Porm, j foram descritos algodes coloridos em tonalidades verde, amarela, azul e cinza. Esss algodes, por longos perodos, foram descartados pela indstria txtil mundial e at mesmo foi proibida sua explorao em vrios pases por serem considerados como contaminao indesejvel dos algodes de tonalidade branca normal. Esses tipos coloridos foram preservados pelos povos nativos e nas colees de algodo em vrios pases. No Brasil, foram coletadas plantas de algodoeiros asselvajados, nas tonalidades creme e marrom, em misturas com algodoeiros brancos cultivados, das espcies G. barbadense L. e G. hirsutum L. Miscelnia de cores do algodo trabalhado na Embrapa
Tabela 1 - Herana de cor da fibra do algodo. Smbolo do gene Colorao da fibra Espcie de Gossypium Ld1k Lc2B Lc2k Lc2M Lc2v Lc3B Lc4k Dw Lg1 Lc2 Lc Caqui Marrom claro caqui Marrom mdio Marrom muito claro Marrom claro Caqui Branco sujo Verde Marrom Marrom Arboreum e herbaceum Arboreum e herbaceum Arboreum e herbaceum Arboreum e herbaceum Arboreum e herbaceum Arboreum e herbaceum Arboreum Raimondii Hirsutum Hirsutum Barbadense, Darwinii e Tomentosum
Regio frica e Afrosia frica e Afrosia frica e Afrosia frica e Afrosia frica e Afrosia frica e Afrosia Afrosia Amrica Amrica Amrica Amrica
FONTE: Endrizzi et al (1984)

raa, marie galante Hutch, conhecidos como algodes arbreos. Esses algodes coloridos tinham uso apenas artesanal ou ornamental, principalmente nos Estados da Bahia e Minas Gerais. Inicialmente passaram a ser preservados em bancos de germoplasma da Embrapa Algodo, em Patos-PB, desde 1984. A partir de 1989, foi iniciado o trabalho de melhoramento gentico, aps uma visita de empresrios txteis japoneses, que demonstraram interesse em adquirir aquele tipo de fibra. A HERANA DA COR DA FIBRA A herana da colorao da fibra normalmente controlada por um gene dominante, mas com alelos em locus diferentes. O gene verde controlado pelos alelos de um nico locus Lg, encontrado no cromossomo 15 do genoma D do algodo americano (G. hirsutum). O gene que controla a colorao marrom em suas vrias tonalidades encontrado nos algodes do velho e do novo mundo, com vrios alelos identificados. (Tabela 1). Sendo a cor do algodo controlada por genes maiores, o melhoramento dessa caracterstica simples, porm no prescinde de autofecundao controlada pelo melhorista, para evitar segregaes ou contaminaes indesejveis. Por outro lado, algumas tonalidades de cores so fortemente influenciadas pelo ambiente (luz solar, tipo de solo, ano). Entre as tonalidades de cores, a verde a mais influenciada pelo ambiente, enquanto a creme e a marrom so as mais estveis. O PROCESSO DE MELHORAMENTO Inicialmente foi efetuada uma avaliao da produtividade e das caractersticas das fibras dos 11 acessos de algodo arbreo colorido existentes no Banco de Germoplasma. Constatou-se que o compri-
Tabela 2 - Caractersticas mdias das novas linhagens de algodo colorido. Touros, RN - 1998. 1 Linhagem Rendimento 1 P. 100 P. 1 Comprimento Uniformidade % Flor Capulho Sementes de kg/ha Capulho S.L. 2,5 % (%) (dias) (dias) (g) (g) Fribra 1.982 ab 60 ab 111 b 9,2 abc 38,4 CNPA 95-3B 3,7 25,8 ab 45,8 ab CNPA 96-713 2.510 a 61 ab 116 ab 9,0 abc 38,6 3,4 25,7 ab 45,6 ab 61 a 114 ab 8,0 c CNPA 96-871 1.268 b 3,4 24,8 b 46,5 ab 38,0 CNPA 96-426 1.841 ab 59 b 112 ab 10,0 a 4,2 27,6 ab 48,3 a 38,2 CNPA 96-703 1.715 ab 61 a 113 ab 8,5 bc 3,3 25,9 ab 46,8 a 39,9 CNPA 96-729 1.425 b 60 ab 115 ab 9,9 a 42,3 b 3,7 28,3 a 37,9 CNPA 96-802 1.755 ab 59 ab 113 ab 9,5 ab 46,4 ab 4,0 26,4 ab 39,8 CNPA 96-816 1.377 b 60 ab 118 a 8,7 abc 39,5 46,6 ab 3,4 26,1 ab CNPA 96-974 1.488 b 60 ab 115 ab 9,1 abc 38,6 46,7 ab 3,2 25,1 ab CNPA 96-1016 1.754 ab 61 ab 112 ab 9,3 abc 38,6 46,7 a 3,6 24,9 b CNPA 96-1029 1.470 b 60 ab 112 ab 8,1 c 46,4 ab 3,5 26,6 ab 39,3 1.689 60 114 Mdia 46,2 9,0 3,6 26,1 38,8 3,0* 2,4* 1,9ns F. 2,7** 5,6** 1,3ns 2,6* 0,7ns 24,1 1,7 CV% 3,8 2,3 6,1 14,1 5,1 4,5
mento das fibras dos acessos coloridos variou de 25,9 a 31,6mm; a resistncia era muito fraca, com 60% dos materiais variando de 19,5 a 21,7 gf/tex, o que impossibilitaria sua industrializao em fiaes modernas, que exigem algodes de alta resistncia. As fibras eram tambm excessivamente finas e de baixa uniformidade. A produtividade, no campo variou de 294 a 1.246 kg/ha. Foi determinado como objetivo do programa de melhoramento elevar a resistncia das fibras, a finura, o comprimento e a uniformidade, bem como estabilizar a colorao das fibras nas tonalidades creme e marrom e elevar a sua produtividade no campo. Utilizou-se primeiramente, o mtodo de seleo individual com teste de prognies, e, posteriormente, o mtodo de hibridao seguido de seleo genealgica, para se obter variaes nas tonalidades de cores. A partir de 1996, foram includos nas pesquisas algodes de colorao verde e procuradas novas combinaes de cores, por meio de cruzamentos dos algodes marrom, creme e verde. O mtodo de seleo individual com teste de prognies consistiu em separar plantas coloridas nas 11 entradas originais que constituiam o Banco de Germoplasma, de modo que propiciasse a anlise das caractersticas agronmicas e das fibras de cada uma das plantas eleitas. Por meio desse mtodo foram obtidas e estudadas 1.085 plantas, que resultaram em 217 linhas de prognies de tonalidades creme a marrom. O mtodo de hibridao foi utilizado para obter nova variedade e combinao de cores diferentes, pelo do cruzamento dos algodoeiros nativos do Brasil, de colorao creme e marrom, com as cultivares americanas Arkansas Green (verde) e Texas (marrom
Elongao Resistncia Finura (%) gf/tex (Micronaire) 22,1 abc 21,5 abc 21,5 abc 24,2 a 23,0 abc 18,0 bc 23,9 ab 22,0 abc 21,8 abc 17,7 c 19,3 abc 21,4 3,1** 11,6 4,0 ab 4,3 a 4,3 a 4,1 ab 3,9 ab 3,5 b 3,9 ab 4,1 ab 4,3 ab 4,2 ab 3,9 ab 4,1 2,5* 7,8 5,3 5,1 5,4 5,5 5,3 4,8 5,7 5,2 5,1 5,1 5,2 5,3 1,5ns 7,6
intenso). Esses cruzamentos esto nas geraes F2 e F3 e iro resultar cultivares com tonalidades de cores mais variadas em futuro prximo. Outra opo que foi utilizada pela Embrapa para a obteno de cultivares de algodo colorido foi a introduo dos genes que controlam a colorao verde, na cultivar comercial mais plantada no Nordeste (CNPA 7H), por meio da tcnica de retrocruzamentos. Para isso, foram efetuados trs ciclos de retrocruzamentos utilizando-se a cultivar Arkansas Green como progenitor doador e a CNPA 7H como progenitor recorrente. Nos ltimos trs anos, foram estudadas 217 prognies, 35 novas linhagens e 22 linhagens avanadas de algodo colorido, nos municpios de Patos e Monteiro, na Paraba e Touros, no Rio Grande do Norte.
Tabela 3 - Caractersticas mdias das linhagens avanadas de algodo colorido. Touros, RN - 1998. Rendimento 1 1 P. 100 % kg/ha Flor Capulho Sementes de (dias) (dias) (g) Fribra Bulk CNPA 95-3B 2.912 ab 59 112 ab 10,1 ab 35,1 CNPA 95-130 3.534 a 59 110 b 10,4 a 33,5 CNPA 95-653 2.398 bc 59 113 ab 8,8 b 37,2 CNPA 95-709 2.142 bc 58 113 ab 9,2 ab 35,8 CNPA 95-813 1.904 c 58 112 ab 10,0 ab 33,8 CNPA 95-816 34,0 2.191 bc 58 113 ab 9,4 ab Bulk Creme ENL 789 2.629 bc 34,8 59 111 b 9,7 ab CNPA 771/92-1139M 2.688 bc 57 33,6 111 ab 8,9 b CNPA 95-4B 58 37,4 2.302 bc 111 b 8,9 b CNPA 92-127 58 37,6 2.396 bc 114 a 9,2 ab Mdia 58 35,6 2.509 112 9,4 F. 7,0ns 3,2** 3,9** 2,5* 7,2** CV% 5,5 13,7 7,8 1,3 6,0 Linhagem P. 1 Comprimento Uniformidade Resistncia Finura Elongao Capulho S.L. 2,5 % (%) gf/tex (Micronaire) (%) (g) 7,0 3,8 25,6 4,0 ab 48,1 ab 19,3 7,2 3,6 4,2 ab 28,6 48,3 ab 21,5 7,7 3,5 3,6 ab 26,5 50,9 a 20,3 7,1 4,1 3,9 ab 27,9 49,8 ab 19,5 6,2 4,0 4,5 a 28,8 48,7 ab 20,2 6,5 3,5 4,0 ab 28,1 45,0 b 20,0 7,5 4,2 3,7 ab 26,9 47,9 ab 18,7 7,4 3,9 3,7 ab 25,5 49,6 ab 21,8 7,2 3,7 3,4 b 26,3 48,8 ab 18,0 7,1 3,8 4,3 ab 26,9 47,1 ab 19,1 7,1 3,8 3,9 27,1 48,4 19,8 16ns 1,9ns 3,0** 1,6ns 1,8ns 2,0ns 9,9 8,9 9,8 7,1 4,9 8,5
37
Tabela 4 - Caractersticas tecnolgicas de fibras das linhagens de algodo colorido eleitas para multiplicao. Touros-RN. 1998. Fio Singelo - 27 Tex Linhagem Comprimento Uniformidade Resistncia Alongamento Finura Fiabilidade Resistncia Alongamento Coeficiente CSP gf/tex % Toro % gf/tex (%) S.L. 2,5 % Variedades Coloridas: 1806 14,1 4,8 3,31 5,3 20,5 44,1 3,9 CNPA 95-653 1 27,6 1881 14,04 5,0 3,51 5,8 22,6 46,6 4,0 CNPA 92-1139 2 28,7 Variedades Comerciais brancas: 2307 14,92 6,5 3,47 5,8 27,0 51,3 3,8 ITA 90 29,9 3,49 2212 14,32 5,3 5,7 26,0 47,1 3,6 CNPA 8H 29,1
1 2
- Produtividade de 2.400 kg/ha e rendimento de fibra de 37,2%, sob condies irrigadas. - Produtividade de 2.690 kg/ha e rendimento de fibra de 36,6%, sob condies irrigadas.
RESULTADOS OBTIDOS COM A PESQUISA DE ALGODO COLORIDO AVALIAO AGRCOLA Com o processo de melhoramento contnuo, as linhagens avaliadas em 1997,em Patos e Monteiro, PB, apresentaram produtividade em torno de 1.500 kg/ ha, resistncia de fibras na faixa de 23 a 25 gf/tex, finura fina (I.M.) de 3,4 , comprimento de fibra (S.L. 2,5%) de 29,5mm e uniformidade de 48,0%. A produtividade mdia no campo supera a de cultivares de algodoeiro moc precoce em mais de 50%. Por outro lado, com essas caractersticas de fibras, os algodes coloridos melhorados podem ser processados por indstrias txteis modernas. Nas avaliaes de fios do algodo colorido de ttulos 16Ne e 20Ne, obteve-se resistncia do fio de 13,5 e 12,3 gf/tex, respectivamente; alongamento de 6,9; e 56 pontos finos/km e 112 pontos grossos/km; ndices que confirmam a boa qualidade do fio. Em 1998, para fugir da seca que afetou todo o Nordeste, a pesquisa foi conduzida sob condies irrigadas, utilizando-se piv central, no municpio de Touros-RN. Nessas condies, foram avaliadas 46 prognies, 11 novas linhagens e 10 linhagens avanadas de algodes coloridos. As ca-
ractersticas mdias das novas linhagens estudadas esto apresentadas na Tabela 2, onde podem ser observadas as caractersticas mdias das 4 linhagens eleitas (CNPA 96-713, CNPA 96-426, CNPA 96-703 e CNPA 96-802) para continuidade das pesquisas. Essas linhagens apresentaram resistncia que variam de 21,5 a 24,2 gf/tex, finura de 3,9 a 4,3, comprimento comercial na faixa 28-30mm a 30-32mm, alta produtividade (1.715 a 2.510 kg/ha) e alto rendimento de fibras (38,2 a 39,8%). Os resultados do ensaio de linhagens avanadas, onde esto sendo avaliados os materiais em fase pr-comercial, esto apresentados na Tabela 3. Nesse ensaio, foram escolhidas as linhagens CNPA 95653 e CNPA 92-1139 M para aumento de sementes, com vistas a um possvel lanamento delas como novas cultivares, devido ao equilbrio das caractersticas agronmicas e tecnolgicas das fibras dessas linhagens. Esses dados confirmaram resultados semelhantes obtidos nos anos de 1996 e 1997 com essas linhagens e so indicadores de que elas podem ser plantadas comercialmente. AVALIAO INDUSTRIAL Com as fibras coloridas obtidas em 1997 foram produzidos fios de ttulo 20Ne
e confeccionados tecido de malha e 50 camisetas para avaliao da qualidade do tecido produzido a partir do algodo colorido nordestino. A malha e os testes industriais foram processadas no CERTTEX/ SENAI em Paulista, Pernambuco. Foram efetuados ensaios de solidez de cor; estabilidade dimensional da malha (encolhimento) e resistncia do tecido ao Pilling. Os resultados obtidos comprovaram que a malha colorida apresentou boa solidez de cor nos nveis de cloro de 0,01% e 0,1%, com grau 4; boa solidez de cor a frico, com graus 4 a 5; boa solidez de cor ao suor, grau 4-5; boa solidez da cor a lavagem, grau 3-4; e alta resistncia do tecido ao Pilling, grau 5. Esses dados so uma evidncia de que o tecido obtido com esse algodo possui qualidade e estabilidade de colorao, semelhante aos tecidos coloridos artificialmente. Neste ano de 1999, esto sendo efetuados testes de desempenho industrial do algodo colorido na indstria EMBRATEX; do Grupo Coteminas, sediada em Campina Grande, na Paraba. Para isso, foram fornecidos dois fardos de pluma, os quais esto sendo processados em equipamentos industriais de srie para produo de fio de ttulo Nec 25,25; confeco de malha e de camisetas. A produo industrial do fio colorido na fiao da EMBRATEX apresen-
tou resultados considerados satisfatrios pelos engenheiros txteis da empresa. O fio de algodo colorido apresentou tenacidade de 11,4 CN/Tex, elongao de 3,9% e fora mxima de 2,66 N, 10 pontos finos/ km e 18 pontos grossos/km. PERSPECTIVAS DO ALGODO COLORIDO A pesquisa encontra-se na fase de escolha final de uma das linhagens para aumento de sementes e lanamento de uma cultivar de fibras coloridas, o que dever ocorrer em um ou dois anos. As sementes foram aumentadas em reas irrigadas no municpio de Touros e Ipanguau, no Rio Grande do Norte, com colheita em novembro de 1998. Entre as dez linhagens avanadas coloridas estudadas, foram escolhidas uma de colorao marrom para plantio no Campo Experimental de Patos,-PB, com vistas a apresent-la aos produtores em julho, e uma de colorao creme para plantio sob condies irrigadas, em Touros-RN, para apresent-la aos produtores em novembro/99. As caractersticas tecnolgicas das duas linhagens escolhidas esto apresentadas na Tabela 4. Pretende-se concluir os testes de avaliao do desempenho industrial at o final de 1999, com divulgao dos resultados em conferncia txtil programada para o ano 2000. A regio indicada para plantio de algodo arbreo colorido inicialmente ser aquela zoneada para cultivo do algodoeiro arbreo no Nordeste, podendo, no futuro, a produo desse algodoeiro se expandir para outras regies. O mercado para o algodo colorido ainda restrito, sendo o produto consumido por pessoas alrgicas a corantes sintticos, grupos ambientalistas e ONGs que desenvolvem trabalhos com agricultura orgnica. Os preos obtidos com o algodo colorido no mercado internacional variam de US$ 3,79 a US$ 5,00 / kg de fibra verde e de US$ 1,84 a US$ 3,35/kg de fibra marrom, o que propicia alta margem de lucro aos produtores, quando comparado com o algodo de fibra branca, que alcana preos mdios de US$ 1,65/kg de fibra. Por outro lado, o desenvolvimento gentico de outras tonalidades de cores e os testes industriais processados com os algodes coloridos podem abrir novos mercados, inclusive para o algodo colorido orgnico (algodo produzido sem utilizao de fertilizantes, inseticidas ou outros
insumos qumicos artificiais), bem como industrializao sem o uso de corantes sintticos, para resultar num produto ecologicamente limpo, sem agresses ao homem e ao ambiente. ALGODO COLORIDO VERDE Simultaneamente ao desenvolvimento do algodo colorido marrom, foram produzidos retrocruzamentos para incorporao da colorao verde na cultivar de algodo anual mais cultivada no Nordeste (CNPA 7H). Aps a srie de trs retrocruzamentos, foram retiradas prognies que esto em fase de seleo e avaliao tecnolgica de fibras e fios. Pretende-se at o final do ano 2000, colocar disposio dos produtores sementes de uma cultivar de algodoeiro anual de fibra verde, derivada da CNPA 7H.
R$ 100.000,00 da Embrapa, num montante total de R$ 160.000,00, referentes ao custeio de pesquisa. A esses recursos devem ser acrescentadas as despesas referentes aos salrios do pessoal envolvido, o que eleva o custo total da pesquisa para R$ 355.000,00, no perodo de 10 anos da pesquisa. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ENDRIZZI, J.E.; TURCOTTE, E.L. e KOHEL, R.J. Quantitative genetics, cytology and cytogenetics. In: Cotton. Ed. R.J. KOHEL e C.F. LEWIS. Madison: American Society of Agronomy, 1984. p.82-131. EMBRAPA. O algodo colorido no Brasil. Campina Grande: EMBRAPA-CNPA, 1998 (folder). FREIRE, E.C.; SANTANA, J.C.F. de; GUSMO, J.L. de e SILVA, J.A. da. Caractersticas e potencialidades do algodo colorido do Nordeste do Brasil. In: Conferncia internacional Txtil/ Confeco, I, 1995. Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro, SENAI/CETIQT, 1995. p. 16-22.. FREIRE, E.C.; ANDRADE, F.P. de; FARIAS, F.J.C.; COSTA, J.N. de; MOREIRA, J. de A.N.; VIEIRA, R. de M.; FARIAS, R.H. de. Melhoramento do algodo colorido no Nordeste do Brasil. Campina Grande: EMBRAPACNPA, 1997. 6p. (EMBRAPA-CNPA, Pesquisa em Andamento, 49). FREIRE, E.C. Brasil j produz algodo orgnico. Textilia, v. 5, n 18, 1995. p. 68. ICAC RECORDER. Washington: International Cotton Advisory Committee. v.10, n 4, 1992. ICAC RECORDER. Washington: International Cotton Advisory Committee, v.11, n 4, 1993. INTERNATIONAL COTTON ADVISORY COMMITEE. Cultivo del algodon organico: ICAC Recorder, Washington, v.14, n 4, p. 55-81, 1996. WANDERLEY, M.J.R.; SANTANA, J.C.F. de; LIMA, M. do S.N.; FREIRE, A. de F. Fiabilidade das novas linhagens do algodoeiro arbreo de fibra colorida em funo de suas caractersticas fsicas. In: Congresso Brasileiro de Algodo, I. 1997. Fortaleza. Anais.. Fortaleza: MA/SDR/EMBRAPA, 1997. p.608-612. KATZ, D.; BOONE, N.; UREELAND, J.M. Jr. Organically grown and naturally colored cotton: A global overview. In: Beltwide cotton conferences, 1997. New orleans. Proceeddings... New Orleans: National Cotton Council, 1997. p. 293-297.
UTILIZAO DA BIOTECNOLOGIA PARA A PRODUO DO ALGODO COLORIDO Os avanos obtidos at ento com o algodo colorido decorreram da explorao do germoplasma natural do algodo, por meio de mtodos tradicionais de melhoramento gentico. O uso da biotecnologia de transferncia de genes que controlam a expresso de vrias tonalidades de cores, das espcies selvagens de algodo para as cultivares modernas, j constitui um dos objetivos das empresas de biotecnologia que trabalham com algodo, no mundo, o que pode resultar em avanos tecnolgicos e em economia de tempo e recursos na obteno das futuras cultivares de algodo colorido. RECURSOS APLICADOS NA PESQUISA No perodo de desenvolvimento desta pesquisa, foram aplicados, aproximadamente, R$ 60.000,00 oriundos do CNPq e
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Extrao de DNA de plantas

AGRICULTURA
Eduardo Romano, Bilogo Molecular, M.Sc. Ana Cristina Miranda Brasileiro, Biloga Molecular, Ph.D.
CENARGEN/Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia. romano@cenargen.embrapa.br
SOLUES PARA PROBLEMAS COMUMENTE ENCONTRADOS
isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos uma etapa importante na anlise da estrutura e organizao do genoma de plantas. Essas anlises necessitam, freqentemente,usar enzimas de restrio, que cortam o DNA em fragmentos, para ser que utilizado em Southern blot ou em construo de bibliotecas genmicas. Preparaes de DNA vegetal tambm so, comumente, utilizadas como substratos em reaes de PCR para estudos filogenticos ou no desenvolvimento de marcadores moleculares como os microsatlites e os gerados por RAPD. Independente do tipo de estudo molecular, as preparaes de DNA devem produzir amostras puras suficientes para no inibir os tratamentos enzimticos ou causar interferncias nos padres de migrao em gel de eletroforese. Algumas consideraes so importantes na obteno de DNA de boa qualidade e devem ser atendidas independente do mtodo utilizado. 1) As paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares. Essa etapa realizada geralmente pelo congelamento do tecido vegetal em nitrognio lquido e posterior quebra mecnica, com o auxlio de um pilo e de um almofariz, no caso de extrao em larga escala. Para extrao em pequena escala, utiliza-se um pequeno basto de vidro e um tubo
Figura 1: Esquema representativo das etapas de extrao de DNA pelo mtodo CTAB.
de microcentrfuga. Nesse caso, as preparaes freqentemente se destinam a reaes de PCR e podem ser realizadas somente na presena de tampo de extrao, sem a adio de nitrognio lquido. 2) As membranas celulares devem ser rompidas para liberao do DNA. Essa etapa realizada pela ao de um detergente como SDS (dodecil sulfato de sdio) ou CTAB (brometo de cetiltrimetilamnio). 3) Deve-se evitar a ao de DNAses, que podem degradar o DNA. Com esse propsito, os tampes de extrao possuem pH por volta de 8,0, enquanto o pH timo para ao de DNAses endgenas fica por volta de 7,0. Outro expediente empregado a adio de EDTA (cido etileno diamono tetractico) no tampo de extrao. O EDTA uma substncia quelante de ctions divalentes, como Mg+2 e Ca+2 e, portanto, inibe a ao
de DNAses, que usam esses metais como cofatores (Sambrook et al., 1989). 4) cidos nuclicos devem ser separados das protenas. Para tanto, realiza-se de uma a vrias extraes com fenol e/ou clorofrmio, que desnaturam as protenas tornando-as insolveis fase aquosa, onde se encontram os cidos nuclicos. 5) O DNA deve ser protegido da ao de compostos fenlicos, que oxidam o DNA irreversivelmente, tornando este inacessvel s enzimas de restrio. A contaminao por compostos fenlicos pode ser evidenciada pela colorao do DNA que tende a ficar marrom. Para evitar o efeito oxidativo dos polifenis, deve ser adicionado ao tampo de extrao agentes anti-oxidantes, como PVP (polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro bovino) ou -mercaptoetanol.
6) Os cidos nuclicos devem ser separados de polissacardeos. Esses inibem a ao de enzimas de restrio (Shioda & Marakami-Muofushi, 1987) e tornam a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migrao do DNA em corridas eletroforticas. O detergente CTAB utilizado com essa finalidade, j que polissacardeos e cidos nuclicos possuem solubilidade diferenciada na presena desse detergente. Polissacardeos tambm podem ser removidos pelo emprego de gradiente de cloreto de csio (CsCl).
Vrios autores descrevem problemas no isolamento e purificao de DNA vegetal de boa qualidade (para uma reviso ver: Rogers & Bendich, 1994). Esses problemas so resultantes principalmente do co-isolamento de polissacardeos, substncias fenlicas e compostos secundrios. O mtodo mais utilizado com sucesso para diferentes espcies o baseado no uso do detergente CTAB. Esse detergente solubiliza as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitao (Weising et al., 1995). A maioria dos
Tabela 1: Problemas comumente encontrados durante o isolamento de DNA de plantas; possveis causas e solues.
Problema encontrado Amostra de DNA marrom ou muito escura. Amostra de DNA com aspecto gelatinoso e excessivamente viscoso. O DNA, antes da digesto com enzimas de restrio, apresenta arraste vertical no gel. Causa Contaminao por polifenis. Soluo Adio de PVP-40 e/ou BSA no tampo de extrao, a concentrao de 1 a 2%. Aumento da concentrao de mercaptoetanol para at 5%. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio. Extrato de DNA via ncleos celulares.
Contaminao por polissacardeos.
DNA degradado por contaminao por DNAses ou por quebra Verificar o pH do tampo de extrao. mecnica durante a extrao com Este deve estar por volta de 8,0. Se o clorofrmio. pH estiver por volta de 7,0 facilitar a ao de DNAses durante a extrao Mistura das fases aquosa e de clorofrmio menos vigorosamente. Aplicar menos DNA no gel. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio; Extrao de DNA via ncleos celulares. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio; Extrao de DNA via ncleos celulares. Purificao da amostra em gradiente de CsCI ou por precipitao com acetato de amnio; Extrao de DNA via ncleos celulares; Aplicao de menos DNA no gel. Adicionar RNAse A, a uma concentrao final de 100g/mL e incubar a 37C por 20 minutos.
O DNA apresenta forma cnica no Excesso de DNA aplicado no gel. gel, em direo ao plo positivo. Contaminao por polissacardeos.
Aps a corrida, muito DNA retido Contaminao por no poo do gel. polissacardeos.
Aps digesto com enzima de Contaminao por restrio, a amostra apresenta polissacardeos. uma corrida com muito DNA nas Excesso de DNA aplicado no gel. laterais e pouco DNA no centro. O DNA no gel apresenta contaminao com RNA. Contaminao por RNA.
protocolos descritos na literatura utilizam o protocolo CTAB padro, com algumas modificaes, com vistas a resolver problemas especficos da espcie em estudo. Outros protocolos freqentemente empregados so variaes do descrito por Dellaporta e colaboradores (Dellaporta et al, 1983). Esses mtodos se fundamentam na precipitao simultnea de protenas e polissacardeos na presena de SDS e altas concentraes de acetato de potssio. Outro mtodo utilizado a extrao de DNA por meio de ncleos celulares. Essa estratgia baseada em uma prvia separao dos ncleos dos outros constituintes celulares. Esse procedimento pode resolver o problema de co-isolamento de constituintes indesejveis, como os polissacardeos e polifenis citoplasmticos. A principal desvantagem deste mtodo que a extrao de ncleos a partir de material congelado muito ineficiente. Outra desvantagem que esse mtodo mais laborioso do que os previamente mencionados. As preparaes de DNA obtidas por qualquer um desses mtodos podem sofrer uma posterior purificao por centrifugao em gradiente de densidade de CsCl. Essa purificao, apesar de laboriosa, eficiente na remoo de RNA, polissacardeos, protenas e outros contaminantes da amostra de DNA. Outra estratgia para purificao do DNA isolado a precipitao com acetato de amnio. Essa estratgia mais rpida, porm o DNA purificado de menor qualidade. Nesse artigo descrevemos um protocolo CTAB padro utilizado com sucesso em nosso laboratrio, em diferentes espcies, e dois protocolos de purificao (gradiente de CsCl e acetato de amnio). Apresentamos tambm uma tabela (tabela 1), onde so identificados os problemas comumente encontrados na extrao de DNA por meio do protocolo CTAB. Dessa forma, o leitor poder identificar o problema e tentar fazer as modificaes necessrias para melhorar a qualidade do DNA. Na tabela 2, esto listadas algumas espcies vegetais para as quais foram necessrias adaptaes de protocolos bsicos, visando resoluo de problemas especficos.
Tabela 2 - Principais espcies vegetais para as quais foram necessrias adaptaes de protocolos bsicos, visando resoluo de problemas especficos (adaptado de Weising et al. 1995).
Espcie vegetal Protocolos Protocolos baseados na Protocolos Protocolos utilizando precipitao de envolvendo o mistos tampes CTAB protenas e isolamento de polissacardeos com ncleo aceato de potssio/SDS (Dellaporta) X X X X X
Abies alba (abeto) Betula alba (btula) Glycine max (soja) Gossypium hirsutum (algodo) Fragaria x ananassa (morango) Helianthus annus (girassol) Hordeum vulgare (cevada) Ipomoea batatas (batata-doce) Linum usitatissimum (linho) Lycopersicon esculentum (tomate) Musa acuminata (bananeira) Nelumbo spp. (ltus) Nicotiana tabacum (fumo) Oryza sativa (arroz) Picea abies (aberto) Pisium sativum (ervilha) Prunus persica (pessegueiro) Saccharum spp. (cana-de-acar) Solanum tuberosum (batata) Theobroma cacao (cacaueiro) Vicia faba (fava) Vitis vinifera (videira) Zea mays (milho)
Protocolos
X X X X X X X X
X X
X X X X X X X X X X X X X
X X X X
Isolamento de DNA total de plantas utilizando-se o mtodo CTAB (Figura 1) 1. Pese 3 g do material vegetal a ser analisado (calos, folhas, plntulas etc.), de preferncia fresco, e transfira para um almofariz contendo com nitrognio lquido. Com o auxlio de um pilo,
Para maiores informaes sobre tcnicas de isolamento e anlise de DNA de plantas, consulte o "Manual de Transformao Gentica de Plantas" (Brasileiro & Carneiro, 1998). Nele so apresentadas diferentes tcnicas utilizadas na transformao de plantas, assim como experimentos para a deteco de genes reprteres e anlise moleculares da integrao de genes em plantas. Para adquirir o manual, acessar via Internet a home page da Embrapa no endereo: http://www.spi.embrapa.br
pulverize o material at se obter um p fino. 2. Transfira rapidamente o p obtido para um tubo de polipropileno de 50 ml que contenha 15 ml de tampo CTAB [CTAB 2% (p/v); NaCl 1,4 M; Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; -mercaptoetanol 0,2% (v/v)] pr-aquecido a 65oC. Feche o tubo e misture gentilmente at o p ficar homogeneamente distribudo. 3. Incube as amostras em banhomaria a 60oC por 30 minutos, agitando ocasionalmente o tubo para manter o extrato ressuspendido. 4. Retire o tubo do banho-maria e espere que a mistura atinja a temperatura ambiente. Adicione 15 ml de clorofrmio:lcool isoamlico (24:1; v/v). Feche o tubo e misture manualmente por 10 minutos. 5. Centrifugue a 5.000 g por 10 minutos a temperatura ambiente, para separar a fase orgnica da aquosa. 6. Remova a fase aquosa (fase superior) para um tubo novo de 50
ml. Evite pegar qualquer protena desnaturada presente na interface. 7. Repita a extrao com clorofrmio:lcool isoamlico mais uma ou duas vezes (etapas de 4 a 6), levando em considerao que mais extraes podem tornar a amostra mais pura, porm com maiores perdas de DNA. 8. Adicione RNAse A a uma concentrao final de 100 g/ml e incube a 37oC por 30 minutos. Essa etapa opcional e contribui para aumentar a pureza da sua amostra. 9. Adicione 0,6 volume de isopropanol ou 2,5 volumes de etanol absoluto, ambos a -20oC. Misture suavemente at formar um precipitado. 10. Se o complexo DNA-CTAB obtido formar uma rede de filamentos visveis, recupere o DNA com o auxlio de uma pipeta. Caso o DNA no forme uma rede visvel, centrifugue a amostra a 10.000 g por 20 minutos. Em uma boa preparao, o DNA no deve estar escuro. Sempre que possvel, evite a etapa da centrifugao para no co-precipitar o DNA e polissacardeos. 11. Descarte o sobrenadante e lave o precipitado com 5 ml de etanol 70% (v/v). Caso o precipitado se solte durante a lavagem, repita a etapa da centrifugao por 3 minutos(etapa 10). 12. Descarte o sobrenadante e seque o precipitado invertendo o tubo em um papel-toalha. 13. Dissolva o precipitado em 500 l de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e incube a 4oC por meia hora ou mais. A amostra pode ser ento armazenada a -20oC. 14. Uma purificao posterior pode ser realizada por tratamento com acetato de amnio ou por gradiente de cloreto de csio . Purificao de DNA total de plantas por tratamento com acetato de amnio 1. Dissolva o DNA isolado em 1,0 ml de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e adicione 500 l de acetato de amnio a 7,5 M. 2. Feche o tubo e misture suavemente por inverso para homogeneizar a soluo. Incube no gelo por 15 minutos. 3. Centrifugue por 30 minutos a 10.000 g a 4oC. Transfira o sobrena-
dante para um novo tubo. 4. Adicione 2 volumes de etanol absoluto ao sobrenadante e misture suavemente por inverso. Incube por 1 hora a -20oC. 5. Centrifugue por 10 minutos a 5.000 g a 4oC. 6. Lave o precipitado com etanol 70% (v/v) e centrifugue novamente nas mesmas condies por 3 minutos. 7. Seque o precipitado e dissolva em 500 l de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Conserve a soluo a -20oC. 8. Caso seja necessrio, proceda a uma repurificao por gradiente de cloreto de csio. Purificao de DNA total de plantas por gradiente de cloreto de csio (CsCl) (Figura 2) 1. Dissolva o DNA isolado em 6,5 ml de tampo TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e transfira a soluo para um tubo de ultracentrfuga de 10 ml. 2. Adicione 7 g de CsCl, feche o tubo e misture a soluo por inverso. Caso necessrio, aquea a soluo em um banho-maria a 30oC para facilitar a dissoluo. 3. Adicione 700 l de brometo de etdio a 0,1% (p/v). Feche o tubo e misture gentilmente por inverso para homogeneizar a soluo. A partir dessa etapa, proteja seu tubo com um papel-alumnio para evitar exposio luz ambiente, que po-
der danificar o DNA na presena do brometo de etdio. 4. Centrifugue a 45.000 rpm (rotor Vti65) por 16 horas, em uma ultracentrfuga, a 20oC. 5. Aps a formao do gradiente, visualize a banda correspondente ao DNA sob luz ultravioleta (320 nm). Colete cuidadosamente a banda com o auxlio de uma pipeta Pasteur e transfira para um novo tubo de vidro de 15 ml. 6. Remova o brometo de etdio adicionando soluo que contm DNA 1 volume de 1-butanol ou lcool isoamlico, ambos saturados em gua. Feche o tubo e misture gentilmente por inverso at que uma nica fase se forme. 7. Centrifugue por 3 minutos a 1.500 rpm (rotor SS34) a temperatura ambiente, para separar a fase orgnica da aquosa. Descarte a fase orgnica (fase superior), que contm o brometo de etdio, com o auxlio de uma pipeta Pasteur. 8. Repita a extrao por quantas vezes forem necessrias para eliminar qualquer vestgio de brometo de etdio (a cor rosa deve desaparecer completamente das fases orgnica e aquosa). 9. Remova o cloreto de csio precipitando o DNA pela adio de 2 volumes de gua destilada e 6 volumes de etanol absoluto. Incube por 30 minutos a 4oC. 10. Centrifugue a 12.000 rpm (rotor SS34) durante 30 minutos, a 4oC. Descarte o sobrenadante e dissolva o precipitado em 500 l de tampo TE (TrisHCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Conserve a soluo a -20oC.
11. Quantifique a amostra de DNA atravs de leitura espectrofotomtrica, medindo a absorbncia da soluo no comprimento de onda de 260 nm. A concentrao de DNA da amostra ser dada pela seguinte frmula: [DNA] = 50 g/ml x D x A260; onde: D o fator de diluio usado para fazer a leitura espectrofotomtrica e A260 a leitura obtida no comprimento de onda de 260 nm. Referncias Brasileiro ACM, Carneiro VTC (eds) (1998) Manual de Transformao Gentica de Plantas. Braslia, Embrapa-SPI/ Embrapa-Cenargen. 309 p. Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983) A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep 1: 19-21. Rogers SO, Bendich AJ (1994) Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant molecular biology manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a labaratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Shioda M, Marakami-Muofushi K (1987) Selective inhibition of DNA polymerase by a polysaccharide purified from slime of Phisarum polycephalum. Biocem Biophys Res Commum 146:61-66. Weising K, Nybom H, Wolff K, Meyer W (1995) DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton.
B
Figura 2: Purificao de DNA total de plantas por meio de gradiente de cloreto de csio. (A) Separao dos diferentes componentes presentes na soluo aps o isolamento do DNA total e ultracentrifugao em rotor de ngulo fixo. (B) Eliminao do brometo de etdio da soluo de DNA.
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Sou estudante de biologia pela Universidade Federal do Par e lendo a reportagem Clones Tecnolgicos, a Salvao da Lavoura do Cacau, da edio nmero 3, de Biotecnologia, Cincia & Desenvolvimento, interessei-me muito pelas variedades resistentes Vassourade-bruxa. Gostaria de entrar em contato com quem est trabalhando com esse material, e como devo proceder para conseguir sementes e mudas estando em Belm. Gunther Barbosa, e-mail gunther@ufpa.br. Prezado Sr. Gunther, Temos os telefones da Ceplac onde o Senhor poder conseguir informao. CEPLAC: Geraldo Lessa (assessor de comunicao) 021.73.214-3015; Raul Rene Valle (diretor de pesquisa) 021.73.214-3003 e 226-7585, 2258041. Endereo: Caixa Postal 07 Itabuna (BA), CEP 45600-000. A reportagem foi feita por Lucas Tadeu Ferreira e o e-mail : deluca@tba.com.br
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Meu nome Isabel Cristina, sou estudante do curso de biologia. Adorei a matria sobre vacinas polivalentes antihelmintos. Gostaria de obter mais informaes a respeito. Seria possvel conseguir mais alguma coisa sobre o assunto? Isabel Cristina, e-mail: isabel@sunnet.com.br
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Publicamos os e-mails acima para que os leitores entrem em contato com os interessados.
Parabns pelo projeto. Estamos divulgando seu e mail para que algum interessado entre em contato.
Comunicamos o lanamento do livro Manual de transformao gentica de plantas organizado pelas pesquisadoras da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia Vera Tavares Campos Carneiro e Ana Cristina Miranda Brasileiro, publicado pela prpria Embrapa. Interessados podem adquiri-lo pela livraria virtual da Embrapa, no site www.spi.embrapa.br, ou pelos telefones (021) 61.348-4236 e 348-4708. As autoras do artigo Probiticos Uso de probiticos na alimentao de frangos de corte, publicado na Revista nmero 3 (maio/junho 1999), solicitam a incluso de uma referncia bibliogrfica, fazendo uma retificao. Trata-se de um manual tcnico publicado em 1997 pela extinta empresa Biotecnal denominado O Fantstico Mundo dos Probiticos.
Gostaria de saber se vocs podem me dar uma dica: onde posso encontrar
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ano II nmero 9 julho/agosto de 1999

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NOVOS CONHECIMENTOS NA PATOGNESE DA DOENA DE CHAGAS

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