UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA

EFECTO DE LA ESTIMULACION DE LOS LINFOCITOS T SOBRE LAS AliTERACIONES DEL SISTEMA INMUNE SECUNI)ARIAS A LA OBSTRUCCION BILIAR

Trabajo presentado por el Licenciado Peter Vorwald Kuborn para optar al Grado de Doctor en Medicina Directores: Dr Fernando Baquero Mochales Dr Angel Ceidrn Uriarte

Madrid, noviembre de 1995

O. FERNANDO BAQUERO MOCHALES, DOCTOR EN MEDICINA Y JEFE DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGA DEL HOSPITAL RAMON Y CAJAL DE MADRID, Y D. ANGEL CELDRAN URiARTE, DOCTOR FN MEDICINA Y ADJUNTO DEL DEPARTAMENTO DE CIRUGA DEL HOSPITAL LA PAZ DE MADRID.

CERTIFICAN: Que el trabajo presentado por Peter Vorwald Kuborn, titulado EFECTO DF LA ESTIMIJI.ACION DE LOS LINFOCITOS T SOBRE LAS ALTERACIONES DEL SISTEMA INMUNE SECUNDARIAS A LA OBSTRUCCION BILIAR, ha sido llevado a cabo bajo nuestra direccin en el Hospital Ramn y Cajal de Madrid. Con tal condicin podemos acreditar que esta investigacin reune las caractersticas dc originalidad y rigor cientfico que son exigibles para optar al grado de Doctor en Medicina y Ciruga.

Madrid, noviembre de mil noveciento noventa y cinco

Este proyecto de investigacin ha sido financiado por el Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (expediente nmero 90/0603) y Laboratorios Serono.

mi mujer.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Angel Celdrn, por su direccin, paciencia y continuo estmulo cientfico y personal. Al Dr. Fernando Baquero, por su direccin y valiosos consejos.

Al Dr. Javier Fernndez, por su ayuda en la determinacin de endotoxinas.

A la Dra. Susana Alernany, POf su colaboracin en el estudio de la proliferacin unfocitaria. Al Dr. Julio Maset, por su asesoramiento en el diseo experimental y el anlisis estadstico de los datos. Al Dr Angel de la Calle, por su estmulo y ayuda a la hora de iniciarme en la Cimga Experimental. Al Prof. Enrique Moreno, por su ejemplo, apoyo y confianza. Al Dr Pablo Jorge, por sus consejos en el trabajo de Ciruga Experimental. A O. Antonio Carrasco y O. Martn Garca, por su colaboracin en el diseo grfico. A las Oras. Marta de Vega y Nieves Palacios, por su paciencia y comprensin.

INDICE GENERAIL 1. INTRODUCCION

1.1. BASES MOL{EOLOGICAS Y FISIOLOGICAS DE LA SECRECION BILIAR

1.1 1. 1.1.2.

ANATOMIA FUNCIONAL DEL SISTEMA SECRETOR BIlIAR. FISIOLoGA DE LA SECRECION BILIAR.

1.1.2.1. Aspectos generales. 1.1.2.2. Secrecin de sales biliares. 1.1.2.3. Secrecin de lpidos biliares y otros solutos orgnicos. 1.1.3. ACCION
DE LA BILIS EN LOS PROCESOS DE DIGESTION Y ABSORCION

INTESTINAL. CIRCULACION ENTEROI ILPATIGA.

1.2. SISTEMA INMUNE

1.2.1. 1.2.2.

CONCEPTO DE SISTEMA INMUNE. MOLECULAS DEL SISTEMA INMUNE.

1.2.2.1. Sistema del complemento. 1.2.2.2. Inmunoglobulinas. 1.2.2.3. Linfocinas y monocinas. 1.2.2.4. Sistema ~rinctal de histocompaubilidad. 1,2.3.
CELULAS DEL SISTEMA INMUNE.

12.3.1. Sistema mononuclearfagoctico. 1.2.3.2. Lis clulas de Kupffer corno principal componente del SMNE 1.2.3.3. Linfocitos T. 1.2.3.4. Linfocitos 13. 1 .2.3.5. Clulas citotxicas espontneas. 1.2.4.
DESARROLLO DE LA RESPUESTA INMUNE.

1.2.4.1. Aspectos generales. 1.2.4.2. Activacin de los linfocitos T. 1.2.4.3. Activacin de los linfocitos B. 1.2.4.4, Activacin de las clulas citotxicas espontaneas. 1.2.4.5. Activacin del sistema del complemento.

1.3. LA BARRERA MUCOSA INTESTINAl. COMO ELEMENTO DEL SISTEMA INMUNE 1.3.1. ASPECrOs GENERALES.

1.3.2. ESTRtJGrURA HISTOLOGICA. 1.3.3. MECANISMOS DE DEFENSA ESPECFICA. 1.3.4. MECANIsMOS DE DEFENSA INESPECIFICA.
.4. ENDOTOXINAS BACTERIANAS

1.4.1. ANTECEDENTES HISTORICOS. 1.4.2. BASES MOLECULARES DE LAS ENDOTOXJNAS. 1.4.2.1. Aspectos generales. 1.4.2.2. Antgeno-O. 1.4.2.3. Antgeno core 1.4.2.4. Lpido A. 1.4.3. INTERACCION ENTRE ENDO~IO)UNA Y HUESPED. 1.4.3.1. Absorcin de endotoxinas. 1.4.3.2. Aclaramiento ce endotoxinas. 1.4.3.2.1. Aspectos generales. 1.4.3.2.2. Participacin de las clulas de Kupffer en el aclaramienro de endotoxinas. 1.4.3.3. Mediadores de la respuesta biolgica a las endotoxinas.
1.4.3.3.1. Aspectos generales.

1.4.3.3.2. Activacin del complemento. 1.4.3.3.3. Activacin de los macrfagos. 1.4.3.3.4. Activacin ce la coagulacin. 1.4.3.4. Alteraciones producidas por la accin de las endotoxinas
en los distintos rganos y sistemas.

1.4.3.4.1. Alteraciones hemodinmicas. 1.4.3.4.2. Alteraciones (le parnquima heptico. 1.4.3.4.3. Otras alteraciones producidas por la endotoxina.

1.5. FISIOPATOLOGIA DE LA OBSTRUCCION BILLAR 1 .51. ASPECTOS 1.5.2. ALIVWXCIoNES DEL SISTEMA HEPATICO.

1.5.2.1. Cantios morfolgicos en hgado y sistema excretor biliar. 1.5.2.2. Alteraciones de la hemodinmica heptica.
1.5.2.3. Alteraciones de la secrecin biliar.

1.5.2.4. Alteraciones de la funcin hepatocelular. 1.5.2.4.1. Alteraciones de la sntesis proteica. 1.5.2.4.2. Alteraciones de la circulacin enteroheptica de
los cidos biliares.

1.5.2.4.3. Alteraciones del metabolismo de la bilirrubina. 1.5.2.4.4. Otras alteraciones metablicas. 1.5.3. ALTERACIoNES DEL SISTEMA INMUNE EN LA OBSTEUCCION BILIAR. 1.5.3.1, Tran.slocacin de bacterias y endotoxinas como consecuencia de las alteraciones de la barrera mucosa intestinal. 1 .5.3.2. Alteraciones del sistema mononuclear fagoctico. 1.5.3.3. Alteraciones (le linfocitos y neutrfilos. 1.5.4. REPERCuSION DE AS ALTERACIONES DEL SISTEMA INMUNE EN EL
ACLARAMIENT() DE ENDOTOX]NAS.

1.6. COMPLICACIONES PERIOPERATORIAS DE LA CIRUGIA DE LA OBSTRUCCION BILLAR RELACIONADAS CON LA ENDOTOXINA

1.6.1. ASPECTOS GENERALES. 1.6.2. ALTERACIONES DE LA FUNCION RENAL. 1.6.3. HEMORRAGIA GASTROINTESTINAL. 1.6.4. ALTERACIONES DE LA CICATRIZACION. 1.6.5. COMPLIcACIONES INFECCIOSAS.

1.7. EFECTO DE LA TERAPIA ADVUVANTE PARA LA RECUPERACION PREOPERATORIA DEL SISTEMA INMUNE EN LA CIRUGIA DE LA OBSTRUCCION BILIAR

1.7.1. DRENAJE BILIAR PREOPERATORIO. 1.7.2, SALES BILIARES. 1.7.3. LACTLJLOSA. 1.7.4. POLIMIxINA. 1.7.5. INMUNoMODULACION. 1.7.5.1. Aspectos generales 1.7.5.2. Las hormonas tmicas como agentes inmunomoduladores. 1.7.5.3. Caractersticas de la timoestimulina. 1.7.5.3.1. Aspectos generales. 1.7.5.3.2. Mecanismos de accin y valoracin de mi actividad. 1.7. 5. 3. 3. Farmacodinamia y toxicidad. 1.7.5.3.4. La timoestimulina en experimentacin animal. 1.7. 5. 3. 5. La timoestimulina en ensayos clnicos.

2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS 3. MATERIAL Y METODOS

3d. MATERIAL

3.1,1. ANIMALES. 3.1.2. REAcrvos 3.1.2.1. Deterninaciones bioqumicas en sangre. 3.1.2.2. Fistuclio de la proliferacin linfocitaria. 3.1.2.3. Determinacin de endotoxinas. 3.1.2.4. Anestsicos. 3.1.2.5. Otros.

3.1.3. 3. 1.4.

INMUNOMODULADOR. AIAR~TOS Y MATERIAL FUNGIBLE.

3.1.4.1. Determinaciones biocumicas en sangre. 3.1.4.2. Estudio de la funcin linfociraria. 3.1.4.3. Determinacin de endotoxinas. 3.1.4.4. Instrumental quinrgico. 3.1.4.5. Otros. 3.1.5.
MATERIAL PARA ESTUDIO ESTADSTICO.

3.2. METODOS
3.2.1. MANEJO DEL ANIMAL DE EXPERIMENTACION

3.2.1.1. Cuidados generales.

3.2.1.2. Tcnica anestsica. 3.2.1.3. Tcnica quirrgica para interrumpir el flujo biliar.

3.2.1.4. Tcnica para la obtencin de muestras de sangre. 3.2.1.4.a. Sangre sistnMca. 3.2.1.4.b. Sangre portal. 3.2.1.5. Tcnica de esplenectoma para estudio de funcin linfocitaria. 3.2.1.6. l~cnica para estudio ce aclaramiento de endotoxina. 3.2.2.
DErERNIINACION DE PARAMETROS BIOQUMICOS EN SANGRE.

3.2.3. Esrtjnio DE LA RESPUESTA MITOGENICA A CONcANAVALINA A DE

LINFOCITOS

DEL BAZO.

3.2.3.1. Aislamiento de linfocitos del bazo. 3,2.3.2. Medida de la proliferacin celular. 3.2.4.
IEST DEL

LAL

(LYMULUS AMOEBOCYIE LYSATE) PARA LA DETERMINACION

DE ENDOTOXJNA.

3.2.4.1. Fundamentos del test del LAL. 3.2.4.2. Procesamiento de muestras de sangre para el ensayo LAL. 3.2.4.3. Determinacin de enclotoxna. 3.2.5. 3.2.6.
ESTUDIO DEL ACLARAMIENTO DE ENDOTOXINAS. ADNiINISTIUCION DEL INMUNOMODULADOR.

lo

3.2,7, DISEO EXPERIMENTAL..

3.2.8.

METODO ESTADSTICO.

3.2.8.1. Recepcin de casos. 3.2.8.2. Depuracion. 3.2.8.3, Estadstica descriptiva. 3.2.8.4. Estudio de distribucin. 3.2.8,5. Estadstica analtica. 3.2.8.5.a. Anlisis intragrupo. 3.2.8.5.b. Anlisis intergrupo.

IV. RESULTADOS
4.1. ALTERACIONES PONDERALES 4.2. ALTERACIONES DE LOS PARAMETROS BIOQUIMICOS HEPATICOS

4.2.1.

GRUPO CONTROL. BLANCO.

4.2.2. Gau~o 4.2.3. 4.2.4.

GRUPo ICTERICO. GRUPO TERAPEUTICO.

4.3 ALTERACIONES DE LAS CIFRAS DE CREATININA EN SANGRE

4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4,3.4,

GRUPO CONTROL. GRUPO BLANCO. GRUPO ICFERICO. GRUPO TERAPEUTICO.

4.4. RESPUESTA DE LINFOCITOS T A CONCANAVAJINA A

4.4.1. 4,4.2. 4,4.3. 4,4.4.

GRUPO CONTROL. GRUPO BLANCO. GRUPO ICTERICO. GRUPO TERAPELITICO.

11

4.5. NIVELES DE ENDOTOXEMIA PORTAL

4.5.1. 4.5.2. 4.5.3. 4.5.4.

GRUPO CONTROL. GRUPO BLANCO. (3rnPo ICTERICO. GRUPO TERAPEUTICO.

L6. NIVELES DE ENDOTOXEMIA SISTEMICA

4.6.1. 4.6.2.

GRUPO CONTROL. GRUPO BLANCO. ICTERICO.

4.6.3. GRuo

4.6.4.

GRUPO TERAPEUliCO.

4.7. ACLARAMIENTO DE ENDOTOXINA 4.7.1.

GRUPO CONTROL. ICTERICO. TERAPEUTICO.

4.7.2. GRtPo 4.7.3. GRUPo

y. DISCUSION VI. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFIA

12

1. INTRODUCCION

1.1. BASES MORFOLOGICAS Y FISIOLOGICAS DE LA SECRECION BILIAR.

1.1.1.

ANATOMA FUNCIONAL DEL SISTEMA SECRETOR BILIAR.

La secrecin biliar tiene bsicamente dos ftnciones, la excrecin de metabolitos procedentes de sustancias endgenas y exgenas (bilirrubina, drogas, etc.) y la de elementos necesarios para la digestin y absorcin de lpidos. El 90% de la bilis es agua y el 10% restante est constiti.ido por electrolitos y solutos orgnicos como cidos biliares fosfolpidos, colesterol y bilirrubina conjugada. Los hepatocitos estn dispuestos en hileras monocelulares baada por la sangre sinusoidal. Su membrana plasmtica presenta tres reas distintas desde el punto de vista morfolgico y funcional: una sinusoidal, cue abarca el 37%, separada por el espacio de Disse de las clulas endoteliales fenestradas de los sinusoides; otra lateral (50%), en contacto con los hepatocitos adyacentes; y la canalicular (13%), que con la de uno o dos hepatocitos vecinos forma el canalculo biliar La cara basolateral o sinusoidal esta activamente implicada en el transporte de sustancias que llegan al espacio de Disse atravesando el endotelio sinusoidal. En este espacio se encuentran ubicadas las clulas de Kupffer que, como se expondr

posteriormente, son macrfagos pertenecientes al sistema mononuclear-fagocitico.

En la cara lateral o intercelular, en contacto con la del hepatocito vecino> se establece la adhesin y conmnicacin entre ambas clulas y se delimita la va de

transpone paracelular. Su zona ms prxima a la cara canalicular presenta tres

reas de contacto que constituyen el complejo de unin intercelular. Las uniones estrechas o znula occluclens son las ms cercanas al canalculo biliar, al cual aislan del espacio sinusoidal. A travs de ellas es posible el paso de agua, electrolitos y algunos solutos orgnicos de mayor peso molecular Los desmosomas en cinturn o znula adherens se encuentran algo ms cerca de la pared sinusoidal y sirven de anclaje a los microfilamentos pericanaliculares, y por ello mantienen a los hepatocitos unidos. Los desmosomas en botn o mcula adherens son el lugar de anclaje ce tonofilamentos citoplasmticos.

13

El canalculo biliar posee estructuras seudodiverticulares y microvellosidades que hacen que la superficie canalicular alcance unos diez metros cuadrados en el hombre. En l comienza el sistenn colector biliar y se contina con el canal de Hering, delimitado por uno o dos hepatocitos en un lado y una o dos clulas ductales en el otro. Estas estructuras son difciles de identificar en exmenes histolgicos rutinarios a no ser que estn ocupados por tapones ce bilis corno ocurre en la ictericia obstructiva. Los canales de Hering desembocan en los dctulos que estn tapizados por clulas ce revestimiento pobremente diferenciadas y desembocan, a su vez, en los conductos biliares interlobulillares recubiertos por epitelio cuboidal o columnar bajo; estos en los conductos septales y, finalmente, en los lobulares (318).

1.1.2. FIsIOLOGA DE LA SECRECION BILIAR.

1.1.2.1. Aspectos generales. La secrecin biliar se lleva a cabo por un mecanismo denominado de ultrafiltracin osmtica, que se basa en establecer un gradiente osmtico entre la luz del canalculo y la sangre sinusoidal, Para que este gradiente se produzca es necesario que sustancias con poder osmtico, fundamentalmente sales biliares, sean transportadas desde el sinusoide, a travs de los hepatocitos, hasta el canalculo. Una vez que estas se encuentran en el canalculo biliar se produce el paso secundario de agua, debido al gradiente osmtico, a travs de la va paracelulan El flujo diario de bilis en el hombre es de 600 mi, de los cuales, 450 ml corresponden a la secrecin de los hepatociros o bilis primaria, hepatocitaria o fraccin canalicular, y 150 ml a la secrecin de las clulas ductulares o fraccin ductular. Estas ltimas slo segregan agua y electrolitos por lo que ms que producir bilis propiamente dicha, modifican su volumen y concentracin (318).

1.1.2.2. Secrecin ce sales biliares y electrolitos. Las sales biliares son responsables del flujo biliar dependiente. Para que este se lleve a cabo es necesario que aquellas sean captadas por el hepatocito, transportadas a travs ce su citoplasma y segregadas en el canalculo biliar. Estos procesos

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requieren un transpone activo que consume energa, ya que la concentracin sinusoidal de sales biliares es de 5 a 20 gM y la canalicular de 2 a 3 mM. Una vez en el canalculo, las sales biliares atraen agua gracias a su capacidad colertica, que oscila entre 7 y 10 gl/gM, aunque las sales biliares divalentes conjugadas con sulfato pueden alcanzar 25 ~.tl/gM(116).

1.1.2.3. Secrecin de lpidos biliares y otros solutos orgnicos. La bilis contiene colesterol y fosfolpidos, sobre todo lecitina. A diferencia de los fosfolpidos biliares, slo el 30% del colesterol biliar procede de la sntesis heptica; el resto de la ingesta. El colesterol es solubilizado en forma de micelas por los cidos biliares y fosfolpidos. Adems de los anteriores, a travs de la bilis se excretan bilirnbina conjugada, drogas, colorantes y hormonas. Cualquiera de estas sustancias que tenga poder onctico contribuye a formar el flujo biliar independiente de sales biliares (318).

1.1.3.

ACCION DE LA BILIS EN LOS PROCESOS DE DIGESTION Y ABSORCION INTESTINAL. CIRCULACION ENTEROHEPATICA.

Los cidos biliares desempean un papel esencial en la digestin y absorcin intestinal de lpidos de la dieta. Emlsionan las grasas aumentando as la superficie de accin de la lipasa pancretica. Despus de la digestin se forman micelas mixtas de colesterol, fosfolpidos, cido grasos, cidos biliares y monoglcridos. De esta forma, es posible que molculas lipdicas poco solubles puedan atravesar la capa acuosa adyacente de la membrana plasmtica del enterocito y ser absorbidas. Los cidos biliares prinurios, clico y quenodesoxclico, son sintetizados en el hgado a partir de colesterol y los secundarios, desoxiclico y litoclico, derivan de los primarios por la accin ce las bacterias, principalmente del colon. Casi todos los cidos biliares son segregados por el hgado conjugados a glicina o taurina; esto hace descender su pK, POE lo que en la luz intestinal suelen estar ionizados y son hidrosolubles. Las bacterias intestinales hidrolizan la unin amida de la glicina 15

o taurina con el cido biliar, desconjugndolo y hacindolo liposoluble, por lo que pueden atravesar mentranas y establecerse la circulacin enteroheptica. La mayor parte (70-80%) de la reabsorcin de cidos biliares tiene lugar mediante transporte activo dependiente de Na+ en los 100 150 cm distales de leon; el resto, que corresponde a cidos no conjugados, suele absorberse de forma pasiva. La bilirrubina no es absorbida y pasa prcticamente intacta del intestino delgado al colon, es desconjugada por IA-glucuronidasas bacterianas y da lugar a los urobilingenos que, tras ser oxidados, colorean las heces (318).

16

1.2. SISTEMA INMUNE

1.2.1.

CONCEPTO DE SISTEMA INMUNE.

Se puede definir como aquel sistema encargado de diferenciar lo propio de lo extrao. Est constituido por un conjunto de clulas y molculas cuya caracterstica principal es la capacidad para el reconocimiento de fragmentos moleculares de elementos extraos que pueden penetrar en el organismo. Existe una respuesta inmu4

ne no especfica o natural, desarrollada a nivel de diversas barreras defensivas, y una especfica o adquirida que se caracteriza por la interaccin entre el elemento antignico reconocido como extrao y el sistema inmune, generndose una memoria inmunolgica especfica para el antgeno. Entre ambas existe una estrecha interrelacin (14) (54) (221) (255). El componente celular del sistema inmune lo constituyen linfocitos T y B, clulas natural killer o clulas citotxicas naturales y el sistema mononuclear-fagoctiCo. La base molecular esta formada por el sistema del complemento, las inmunoglobulinas y las citocinas (182).

1.2.2.

MOLECULAS DEL SISTEMA INMUNE.

1.2.2.1. Sistema del complemento. Es un conjunto de protenas sricas sintetizadas, fundamentalmente en el hgado, que se activan de forma secuencial, por lo que tambin reciben el nombre de cascada del complemento. Como se ver posteriormente, los productos resultantes de su activacin ejercen diversos efectos biolgicos como la lisis de membranas celulares, el estmulo cte la quimiotaxis y fagocitosis, y otros fenmenos de la reaccin inflamatoria (255).

12.2.2. Inmunoglobulinas. Son molculas segregadas por las clulas plasmticas procedentes de la diferenciacin y maduracin del clon de linfocitos B activado por un antgeno determinado y con capacidad cte unirse especficamente a dicho antgeno. Estn constituidas por dos cadenas pesadas y dos ligeras, unidas entre s por puentes de sul17

furo, con regiones constantes y regiones variabjes que determinan la especificidad de unin al antgeno. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: Ig G, Ig A, lg M, Ig D e lg E. (1) (14).

1.2.2.3. Linfocinas y monocinas. Se trata de molculas cuya caracterstica ftndamental es la de no ser antgenoespecficas. Reciben el nombre genrico
dic

citocinas, y se denomina linfocinas a

las segregadas por los linfocitos y monocinas a las producidas por monocitos. Cuando las citocinas transmiten mensajes de un leucocito a otro, o sobre la misma clula que las produce, reciben el nombre de interleucinas. Como se expondr a continuacin, intervienen en los procesos de activacin del sistema inmune, pero ni su sntesis ni sus efectos son exclusivos de este ya que pueden regular la funcin de otros rganos y tejidos (1) (53).

1.2.2.4. Sistema principal de histocompatibilidad. Son molculas de carcter antignico que diferencian a los miembros de una misma especie. El gen que las determina se localiza en el cromosoma 6. Tienen una estructura glicoproteica y se expresan en la membrana citoplsmica de clulas con ncleo. Participan en los procesos de reconocimiento antignico y activacin de los componentes celulares del sistema inmune. 1-lay dos tipos de molculas de [sto compatibilidad, clase 1 y clase II, segn la regin gnica que las codifique (12).

1.2.3.

CELULAS DEL SISTEMA INMUNE.

1.2.3.1. Sistema mononuclear-fagoctico (SMNF). Tambin conocido como sistema retculo-endotelial, agrupa a las clulas accesorias del sistema inimne, diferentes morfolgicamente, pero que en su membrana expresan molculas de clase 1 y clase II del sistema principal de histocompatibilidad y receptores para lg G y componentes activados del complemento. Su funcin bsica es captar el antgeno, procesarlo y presentarlo a los linfocitos para su activacin (Figura 1). Fn l se incluyen los monocitos circulantes y una serie

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de macrfagos distribuidos por distintos rganos y sistemas como las clulas de Kupffer del hgado, las clulas dendrticas del tejido conectivo y ganglionar, las clulas de Langerhans de la piel, etc. (1) (31) (316).

1.2.3.2. Las clulas de Kupffer como principal componente del SMNF. Estas clulas desarrollan el 80-90 % de la capacidad fagocitaria del SMNF y representan el 50 % de las clulas parenquimatosas hepticas. Se localizan en los espacios de Disse, entre el endotelio del sinusoide y los hepatocitos, constituyendo el complejo perisinusoidal. Por su localizacin, son una de las primeras barreras con las que se encuentran los antgenos absorbidos en el tubo digestivo. Se pueden considerar un filtro o barrendero (seavenger) de todo lo que llega al hgado por va portal. En condiciones normales, el aclaramiento de los antgenos portales se completa con un solo paso. Este aclaramiento depende de que el flujo sanguneo sea el adecuado. La vida media de las clulas de Kupffer en el hgado es de 12 das. Cuando en circunstancias anmalas son destruidas, otras clulas del complejo perisinusoidal, corno las endoteliales y los hepatocitos, pueden incrementar su capacidad fagocitaria (30) (44) (46) (65) (71) (87) (124) (357) (366).

1.2.3.3. Linfocitos T. Representan el 70-80% de los linfocitos circulantes y reciben su denominacin por la maduracin intratrnica durante la vida fetal y postnatal precoz. Expresan en su membrana diversas molculas que, por su estructura y funcin sirven, para identificarlos y clasificarlos; se denominan con las siglas CD (cluster of differentiation). Estas molculas actan fundamentalmente en el reconocimiento antignico as como en la activacin y adherencia celular. Parte de ellas tienen carcter polimrfico, con una regin variable que corresponde al clon de linfocitos que se activar con un determinado antgeno; son receptores antignicos que estn constituidos por el heterodmero alfa beta (a-It) o gamma delta (y-8). Estos recepto-

res se unen por enlaces no covalentes al complejo molecular monomrfico o

19

FIGURA

1. Activacn de los componentes

celulares del sistema inmune <11).

20

constante CD 3, el cual participa en la transduccin de la seal de activacin celular una vez que se ha producido el reconocimiento y unin especfica al antgeno (Figura 1). Otras molculas, igual que el CD 3, son monomrficas y por tanto idnticas en los distintos clones de linfocitos. Entre ellas est el CD 2 receptor de los hemates de carnero que, al ser complementaria con LFA-3 (Lymphocyte function-associated antigen) de la clula presentadora de antgeno, acta como anclaje para estabilizar la unin entre esta y el linfocito T. Las molculas CD 4 y CD 8 se expresan de forma excluyente y definen dos poblaciones de linfocitos fenotpicamente diferentes. En general, los linfocitos que expresan el CD 4 tienen una funcin cooperadora o helper y los que expresan el CD 8, citotxica o supresora. El CD 4 se une a determinantes no polimrficos de la molcula HLA II de la clula presentadora de antgeno, y el CD 8 a los de la molcula FILA 1 presente en la clula diana. la molcula LFA-I es complementaria de ICAM-1 (intercellular adhesion molecule) en la clula presentadora de antgeno o en la clula diana (Figura 1) (II) (12) (181) (182).

1.2.3.4. Linfocitos B. Reciben esta denominacin por su maduracin en la bolsa de Fabricio de las aves o en su equivalente ce la mdula sea en los mamferos. Morfolgicamente son similares a los linfocitos T, pero se diferencian por expresar en su membrana inmunoglobulinas de superficie que actan como receptor antignico. Las inmunoglobulinas presentan dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras idnticas entre s; cada una de ellas tiene una porcin constante y una porcin variable. Esta ltima es diferente para los distintos clones de linfocitos 13. Cuando se produce el proceso de activacin y nuduracin de los linfocitos B, estos se diferencian hacia clulas plasmticas capaces de segregar inmunoglobulinas (Figura 1) (11) (12) (182).

1.2.35. Clulas citotxicas espontneas. Constituyen una subpoblacin de linfocitos que morfolgicamente se caracteriza por su ncleo arrionado y los grnulos azurfilos de su citoplasma. En su rnem-

21

brana expresan molculas monomrficas como CD 16, receptor del fragmento Fc de la Ig G, CD 56 y, de forma variable, CD 2 y CD 8. Pueden tener actividad ltica sobre clulas tumorales e infectadas por virus sin que se requiera una fase de sensibilizacin previa y sin estar restringidas por las molculas del sistema principal de histocompatibilidad. Tambin pueden ejercer funciones reguladoras sobre otras subpoblaciones de linfocitos y clulas hematopoyticas (Figura 1) (11).

1.2.4.

DESARROLLO DE LA RESPUESTA INMUNE.

1.2.4.1. Aspectos generales. la respuesta inmune es un proceso por el cual, tras la exposicin al antgeno, se activan aquellos clones de linfocitos, T 13, que tienen en su superficie el receptor clonotpico o la inmunoglobulina capaz de reconocerlo. Inicialmente, la respuesta innune es especfica, pero los procesos posteriores que regulan la progresin de la activacin linfocitaria son inespecficos y compartidos por distintos antgenos. Despus de ser expuestos al antgeno, el clon de linfocitos activado pasa de la fase de reposo del ciclo celular, o fase Go, a otra ms activa. La activacin de los linfocitos T y 13 tiene aspectos comunes y otros diferentes (Figura 1) (11).

1.2.4.2. Activacin de los linfocitos T. La activacin de las clulas T se produce de forma secuencial (Figura 1). En la primera fase o de induccin, despus de ser procesado el antgeno por la clula accesoria, es expuesto en su membrana en presencia de las molculas del sistema principal de histocompatibilidad. De esta fornn se puede producir el contacto con el receptor antignico del linfocito T cooperador. La clula accesoria segrega interleucina-1 (IL-1), que acta sobre su receptor en la membrana del linfocito. Al mismo tiempo, el acoplamiento entre las distintas molculas de la superficie de ambas clulas pone en marcha una serie de procesos intracelulares en el linfocito T, que terminan con la activacin de diferentes genes y la sntesis proteica propia de la fase GI precoz del ciclo celular (11) (66).

22

Despus de la fase de induccin, el clon de linfocitos T activado pasa a la fase de expansin, aumentando masivamente la expresin de receptores para IL-2 (IL2r). Simultneamente, la IL-2 segregada al medio acta sobre la poblacin de linfocitos que expresan IL-2r; el complejo formado se internaliza en la clula y se pasa a la fase GI tarda dei ciclo celular. En este proceso pueden intervenir otras linfocinas como el interfern y, la IL-4 y las hormonas tmicas. De esta forma termina producindose la proliferacin del clon de linfocitos correspondiente al antgeno. Esta liroliferacin de linfocitos T conleva la sntesis de diversas linfocinas que van a regular la proliferacin y diferenciacin de los linfocitos 13, las clulas citotxicas espontneas y las clulas T citotxicas (II).

1.2.4.3. Activacin de los linfocitos 13. La activacin de los linfocitos B se produce despus de entrar en contacto con el antgeno y con la colaboracin de los linfocitos T cooperadores. En determinadas condiciones biolgicas o en el caso de algunas subpoblaciones, el linfocito B se puede activar sin que se requiera la presencia de los linfocitos T. De la misma forma que el linfocito T, esta activacin es secuencia] (Figura O. La unin del linfocito 13 y el antgeno se lleva a cabo por medio de las inmunoglobulinas que aquel expresa en su superficie. Cabe la posibilidad de que despus de la unin se produzca un proceso de endocitosis del complejo antgeno-inmunoglobulina y el linfocito 13 acte como clula presentadora de antgenos. Para que el clon de linfocitos 13 progrese en el ciclo celular y prolifere, se necesita el estmulo de citocinas, parte de ellas procedentes del linfocito T Cooperador, como IL-l, IL-2, IL-4, interfern y y el factor de necrosis tumoral. Alguna, como el factor transformante del crecimiento beta, tiene un efecto inhibidor. En ciertas condiciones ce activacin, hay subpoblaciones de linfocitos 13 que pueden llegar a segregar linfocinas para regular de forma autocrina su proliferacin. Los linfocitos 13 activados maduran hacia clulas plasmticas con capacidad de 23

segregar inmunoglobulinas a travs de un proceso poco conocido. Entre las citocinas que parecen regular esta maduracin de los linfocitos B se encuentran la L1, IL2, IL-4, factor de necrosis tumoral y la linfotoxina (12).

1.2.4.4. Activacin de las clulas citotxicas espontneas. la activacin del linfocito T citotxico se inicia por la interaccin de su receptor clonotpico con el antgeno en presencia de molculas de clase 1 del sistema principal de histocompatibilidad. Cualquier clula que presente esta molcula en su membrana puede presentar el antgeno. El proceso de activacin, una vez iniciado, es sinlar al del linfocito T cooperador. En la activacin de estas clulas parece que participan citocinas como la IL-2, IL-l y el factor de necrosis tumoral. Las hormonas tmicas podran aumentar la actividad citotxica de las mismas. Los linfocitos T citotxicos activados pueden unirse a las clulas que expresan en su membrana el antgeno y provocar su muerte (Figura 1) (11).

1.2.4.5. Activacin del sistenn del complemento. Se ha comentado que el complemento engloba una serie de protenas sricas, ligadas a membranas celulares, que se activan secuencialmente por procesos proteolticos (Figura 2). Est constituido, a su vez, por dos sistemas que convergen en su proceso de activacin: la va clsica, activada por complejos antgeno-anticuerpo (lg G lg M), y la va alternativa, activada directamente por molculas presentes en la superficie bacteriana, La convergencia de las dos se produce a nivel del factor C3, y terminan formando el complejo de ataque a la membrana que produce la lisis celulan Otras funciones del complemento son la opsonizacin, producida por fragmentos u opsoninas procedentes de la lisis del factor C3, y el estmulo de otros fenmenos inflamatorios por los fragmentos C3a y C5a, procedentes de los factores (2 y CS o anafilotoxinas (12).

24

Compleja AgAc (IgG o IgM)

VIA CLASICA

Convertasa de C3 va clsica

Convertasa de

CS va clsica

su
Convertasa de C3 va alterna

Convertasa de C5 va altema

VIA ALTERNA
FIGURA

2. Proceso de activacin del complemento (12>.

25

1.3. LA BARBERA MUCOSA INTESTINAL COMO ELEMENTO DEL SISTEMA INMUNE

1.3.1.

ASPECTOS GENERALES.

La presencia de bacterias en el tubo digestivo, imprescindible para los procesos de digestin y absorcin de nutrientes, es posible gracias a un perfecto equilibrio con el husped. Este equilibrio es mantenido por la accin de la barrera mucosa intestinal, en torno a la cual se desarrollan una serie de mecanismos de defensa especficos e inespecficos, gran parte de los cuales constituyen lo que Alverdy et al (16) han denominado funcin inmune intestinal.

13.2.

ESTRUCTURA HISTOLOGICA.

En la pared del intestino, especialmente del delgado, existen elementos que contribuyen, de fornu especfica o inespecfica, a la funcin inmune intestinal, manteniendo el equilibrio de la flora intraluminal y controlando su translocacin. Las vellosidades intestinales estn cubiertas por una capa de moco que evita la adherencia directa de las bacterias a los enterocitos. Los complejos de unin entre estos ltimos impiden el paso de bacterias y de otras partculas, y entre ellos aparecen clulas secretoras de moco, leucocitos y clulas del sistema APUD. En las criptas de Lieberkthn se encuentran las clulas de Paneth, que contienen lisozima y pueden fagocitar y digerir microorganismos de la flora intestinal. El epitelio intestinal se renueva constantemente; las clulas se originan en el fondo de las criptas y emigran hacia el vrtice de las vellosidades donde se desprenden dejando una zona de extrusin, a travs de la cual cabe la posibilidad de me penetren las bacterias. Las clulas epiteliales descansan sobre una membrana basal que tambin contribuye a impedir el paso de bacterias. Por debajo de esta se encuentran la lmina propia constituida por un tejido conjuntivo laxo ricamente vascularizado en el que existen fibrocitos, clulas plasmaticas, macrfagos, eosinfilos, clulas cebadas, linfocitos y clulas indiferenciadas. Algunas de estas clulas, como se ver posteriormente, contribuyen al desarrollo de la inmunidad especfica intestinal. El

26

tejido linfoide intestinal se denomina GALT (gut associated lymphoid tissue) y representa el 50% del tejido linfoide del organismo (128) (376) (377).

1.3.3.

MECANISMOS DE DEFENSA ESPECIHCA.

Estn representados fundamentalmente por la Ig-A secretora (Ig A-S) que es la inmunoglobulina ms abundante en secreciones externas. La estructura de la Ig A-S puede ser considerada nica entre las inmunoglobulinas, pues se presenta como una glicoproteina constituida por dos molculas de Ig A, unidas por una cadena en J, y un componente secretor (Figura 3). Esta estructura le confiere resistencia a los enzimas digestivos y a cambios de temperatura y pH. Parece que su mecanismo de accin se basa en inhibir la adherencia de bacterias a las clulas de la mucosa intestinal> que es el primer paso para la translocacin. El proceso de produccin de la Ig A-S comienza a nivel de las placas de Peyen situadas en la lmina propia del leon y constituidas por agregados de linfocitos B, linfocitos T y macrfagos (Figura 4). En la cpula de las placas de Peyer existen clulas epiteliales especializadas o clulas M que procesan el antgeno hacia el nucrfago, inicindose as la activacin y proliferacin de los linfocitos 13 con la colaboracin de linfocitos T. Una vez activados, son conducidos por va linftica a la circulacin sistmica, que los distribuye de nuevo por la lmina propia del intestino y de otras mucosas. Aqu maduran a clulas plasmticas que producen la lg A-S, que es transportada a la luz intestinal por endocitosis inversa (Figura 5) (17). La produccin diaria de lg A-S vara segn los distintos tejidos y especies. En el hombre, la mayor parte de la lg A-S procede de la secrecin intestinal, y en roedores, de la secrecin biliar (225).

1.3.4.

MECANISMOS DE DEFENSA INESIECIFICA.

El tubo digestivo proximal contiene pocos microorganismos debido a la-accin de las secreciones gstrica y biliar Estudios experimentales, in vitro e in vivo, han demostrado un efecto inhibidor de las sales biliares sobre bacterias anaero27

COOH

Cadena ligera

Cadena J Dmero de IgA

FIGURA

3. Estructura de la IgA secretora (17)

Lmina propia Secrecin extraintestinai

Luz intestinal

Mlg eno
-

Sangre Conducto toracuco 7 nfatico esenterico

j~

1jan9IIo

Vaso sanguneo ~-d

~, Antgeno

FIGURA

4. Proceso de sntesis y secrecin de lgA-S (17).

4>

5. El transporte de lgA-S desde la membrana basal al borde secretor de las clulas secretoras se realiza, tras su unin a receptores del componente secretor, por un proceso de pinocitosis inversa (17). 28
FIGURA

bias. Se ha observado que las secreciones biliar y pancretica tienen un efecto trfico sobre la mucosa intestinal, lo cual puede contribuir a mantener la barrera. Otros factores limitantes del crecimiento bacteriano en el intestino delgado son la propia motilidad intestinal y la vlvula leo-cecal. Finalmente, las bacterias anaerobias pueden formar una pasta en la superficie mucosa que bloquea los receptores epiteliales para adhesinas de bacterias gram negativas (13) (43) (57) (126) (215) (279) (280) (333) (376) (380).

29

1.4. ENDOTOXINAS BACTERJANAS

1.4.1.

ANTECEDENTES I-IISTORICOS.

El descubrimiento de las endotoxinas se produjo a finales del siglo XIX cuando Richard Pfeiffer (citado en 238 y 299), discpulo de Robert Koch, observ que Iisados de Vibrio cholcrae inactivados por calor contenan un principio txico que era capaz de causar la muerte en animales ce experimentacin. A esta toxina, termoestable, se le dio el nombre de endotoxina para distinguirla de la exotoxina, termolbil, segregada activamente por bacterias vivas. Ms tarde, Centanni (citado en 238 y 299) vio que la endotoxina se poda aislar a partir de bacterias gram negativas pero no de bacterias gram positivas, y adems tena propiedades pirgenas. Buchner (citado en 238 y 299) fue el primero en asociar endotoxinas con leucocitosis y otras alteraciones de la inmunidad del husped. En 1935
fbi-

vin y Messrobeanu (citados en 238 y 299) demostraron que la actividad endotxica de bacterias grarn negativas reside en un complejo macromolecular de la membrana externa. Veinte aos despus, Westphal y Lderitz (citados en 28) describieron la estrnctura bioqumica de las endotoxinas.

1.4.2.

BASEs MOLECULARES DE LAS ENDOTOXINAS.

1.4.2,1. Aspectos generales. La pared de las bacterias gram negativas est constituida por una membrana citoplsmica interna, el pptidoglicano, una membrana externa y, en muchos casos, por estructuras adicionales como cpsulas, polisacridos extracelulares, fimbrias y flagelos. Las endotoxinas son lipopolisacridos (LPS) de la membrana externa que forman una barrera hidrfoba e impiden la entrada de sales biliares, enzimas y ciertos antibiticos; de esta forma la bacteria tambin puede eludir los mecanismos defensivos del husped. Las endotoxinas son liberadas por bacterias gram negativas vivas, en fase de multiplicacin, y muertas. La endotoxina libre es una fraccin ce la total o celular, pero es la que tiene importancia patognica para el hombre y los animales. Est formada por un componente lipdico o lpido A unido a un polisacrido que, a su vez, se divide

30

en dos zonas, el polisacrido central o core y el polisacrido antgeno O (Figura 6).(28) (239) (301)

1.4.2.2, Antgeno O. Es la porcin ms externa de la endotoxina y est formada por un nmero variable de unidades monomricas de oligosacrido, compuestas por 2 a 6 monosadridos (Figura 7). Los monmeros son especficos para cada cepa bacteriana, variando en cada una de ellas la longitud resultante de la concatenacin de los mismos (28) (300) (301).

1.4.2.3. Antgeno core. Esta porcin es mucho ms corta que el antgeno O y une este con el lpido A (Figura 7). Dentro del core se pueden distinguir dos regiones: la ms distal al lpido A, que contiene azcares como glucosa, galactosa y n-aeetilglucosamina, y la ms proximal, con heptosa y cido 3-desoxi-D-mano-2-octulosnico (lcDO), que frecuentemente llevan radicales fsforo y fosforiletanolamina. A pesar de tener cierta diversidad estructural, esta es mucho menor que la del antgeno O, ya que slo existen 6 7 variaciones dentro de las enterobacterias ms comunes (28) (300) (301).

1.4.2.4. Lpido A. La estructura bsica del lpido A difiere poco entre los distintos grmenes gram negativos. Muchas de las acciones biolgicas de las endotoxinas dependen de la estructura qumica nica del lpido A, Est constituido por un armazn

de disa-

crido-glucosamina fosforilado al que se unen cidos grasos de cadena larga. El lpido A se une al core a travs del lcDO (Figura 7). La hidrlisis cida rompe la unin al KDO sin detoxificar la endotoxina. La hidrlisis alcalina la detoxifica al romper la unin ce los cidos grasos al lpido A, sin que por ello pierda su antigenicidad (237) (257) (300) (301).

31

Pared

celular

FIGURA 6. Representacin esquemtica de la membrana bacteriana (28).

P p
Fa Gb Fa

EtNH
Fa P

Fa-GIc (NH4KDOhept

(NH,> KDO
Fa P

heptglc-gal-glc galgb NA~) hept glc NAc~ col

EtNH
n

lpido A

Core

Polisacddo

Antgeno O Polis ac rido

FIGURA 7. Estructura del lipopolisacrido E. coIiOlll:

84(238).

32

1.4.3.

INTERACCION ENTRE ENDOTOXINA Y HUESPED.

1.4.3.1.

Absorcin de endotoxinas.

No se ha identificado el mecanismo exacto de absorcin intestinal de endotoxrus. Hace aos que se observ endotoxemia porta en individuos sanos y enfermos hepticos, mientras que la endotoxemia sistmica slo se encontr en enfermos hepticos (41) (101) (141) (143) (180) (186) (203) (247) (248) (272) (286) (349) (350) (358) (359). Otros trabajos no han visto niveles de endotoxemia portal significativos en humanos ni en aninules (264) (271) (363). Estas diferencias en cuanto a la incidencia de endotoxemia portal en sujetos sanos son debidas, probabiemente, a la distinta sensibilidad de los test. Es posible que la absorcin intestinal de endotoxirus se produzca en condiciones normales y estas sean posteriormente aclaradas por el hgado. La cantidad de enclotoxinas puede aumentar en la luz intestinal sin que ello produzca alteraciones morfolgicas o funcionales sobre la mucosa ni ocasione endotoxemia significativa (363). Pero cuando existen situaciones patolgicas como la isquemia, la obstruccin> la enfermedad inflamatoria intestinal, o la accin de aminas vasoactivas en el transcurso del shock, las bacterias y endotoxinas son absorbidas en grandes cantidades y pasan a la circulacin sistmica por va portal o linftica. En estudios experimentales se ha comprobado que se utiliza con ms frecuencia esta ltima, pero cuando existen alteraciones importantes de la mucosa intestinal, tambin es importante la va portal (22) (28) (144) (215) (251) (264) (266) (267) (275) (303) (362) (363).

1.4.3.2. Aclaraniento ce endotoxinas 1.4.3.2.1. Aspectos generales. Mathison et al. (218) estudiaron el aclaramiento sanguneo y el acmulo tisular de LPS marcados con 125 en conejos, observando que era bifsico. En una primera fase rpida, ce aproximadamente 15 uinutos, se aclaraba la mayor parte del LPS y en otra ms lenta, de varias horas, la fraccin restante, probablemente, el LPS se aclara en la fase rpida sin estar ligado a ninguna protena plasmtica,

33

mientras en la fase lenta se une, en gran parte> a lipoproteinas de alta densidad, a las de baja densidad, a anticuerpos especficos anti-LPS y a la protena ligadora de LPS. La velocidad de aclaramiento tambin depende del tipo de LPS. Estudios autorradiogrficos o de inmunofluorescencia demuestran que la mayor parte de la endotoxina administrada es captada por las clulas de Kupffer hepticas y, en mucha menor proporcin, por monocitos hemticos y macrfagos esplnicos, renales> pulmonares suprarrenales y musculares (132) (138) (167) (170) (218) (235) (258).

1.4.3.2.2. Participacin de las clulas de Kupffer en el aclaramiento de endotoxina. Los estudios sobre aclaramiento de endotoxinas realizados durante e] transplante heptico demuestran la importancia que tienen las clulas de Kupffer en esta funcin. Se aprecia un gran incremento de la endotoxemia sistmica durante la fase anheptica, que disminuye en un tiempo variable tras la reperfusin del hgado transplantado. El estasis de la circulacin portal puede contribuir a la absorcin de endotoxinas. Los pacientes con fallo primario del injerto presentan niveles de endotoxemia sistmica muy elevados (140) (150) (233) (306) (342) (385). Para disminuir los efectos nocivos de la endotoxemia en el transplante heptico se ha llevado a cabo la descontaminacin selectiva del tubo digestivo antes del mismo, con resultados variables (23) (364) (381). Como se ha comentado, los enfermos con hepatopatas presentan endotoxemia sistmica, lo que no ocurre en suetos sanos, muy probablemente por la disminucin del aclaramiento heptico. La administracin de endotoxinas por va sistmica venosa demuestra que el filtro pulmonar es ineficaz para su aclaramiento, permitiendo el spillover o diseminacin de estas a la circulacin sistmica hasta que se aclaran en el hgado (51). Estudios in vitre muestran que la captacin de LPS por clulas de Kupffer se produce por pinocitosis, y es un proceso no saturable a concentraciones de endotoxina muy superiores a las fisiolgicas. El procesamiento de las endotoxinas en las clulas (le Kupffer es, sin embargo, poco conocido (429) (130) (131) (132) (153) (218),
34

1.4.3.3. Mediadores de la respuesta biolgica a las endotoxinas. 1.4.3.3.1. Aspectos generales. Clsicamente se ha considerado la endotoxina como un mediador entre bacterias y husped para el desarrollo de enfermedades. Pero sus efectos biolgicos no se suelen deber a una accin directa de la misma, sino a mediadores producidos tras la activacin de componentes del sistema inmune, como el complemento y los macrfagos, y la coagulacin. La secrecin prolongada e inadecuada de estos mediadores lleva a la aparicin de los efectos nocivos de las reacciones orgnicas que ellos desencadenan (169) (229) (299).

1.4.3.3.2. Activacin del complemento. El lpido A activa la va clsica del complemento y el polisacrido, la va alternaUva (Figura 2). Como consecuencia se producen las anafilotoxinas (C3 y CS), cuyos principales efectos son la vasodilatacin, la contraccin del msculo liso y la quimiotaxis de mononucleares y polimorfonucleares (56) (175) (238) (340) (367).

1.4.3.3.3. Activacin de los macrfagos. Las endotoxinas (LPS) se unen a la protena ligadora del lipopolisacrido (PLL) y este complejo LPS-PLL se anda en el receptor CD-14 del macrfago y de otras clulas, inicindose la activacin celular (45) (84) (164) (299) (322) (371). El macrfago activo libera tres grupos de mediadores: proteicos como el factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucinas QL-1, iL-6, 11-8); lipdicos como prostaglandinas (PGE9, tromboxanos (TxA2) y factor de activacin plaquetaria (PAAF); y radicales libres de oxgeno (28) (236) (297) (343).
U activacin del metabolismo del cido araquidnico por la va de la ciclooxi-

genasa da origen a las prostaglandinas PGE2 y PGF2a, y por la de la lipooxigenasa produce leucotrienos (EEC4). Estos productos son necesarios para la sntesis de interleucinas y para modular la propia accin efectora de los macrfagos. Adems, son vasoactivos y estimulan la quimiotaxis (127) (178) (212) (261) (340) (367). El factor activador plaquetario es producido por los macrfagos tras activacin di-

35

recta o mediada por leucotrienos y prostaglandinas. Es tambin producido por neutrfilos, plaquetas y clulas endoteliales. Estimula la agregacin plaquetaria, la degranulacin de los neutrfilos y el aumento de la permeabilidad vascular (169) (388). La interleucina 1 es producida directamente por los macrfagos. Desempea un papel importante en la activacin del sistema inmune, actuando sobre los linfocitos. Adems> aumenta la adhesividad de las clulas endoteliales y estimula la coagulacin intravascular, la produccin de protenas de fase aguda e incluso de prostaglandinas, leucotrienos y factor activador de las plaquetas (169) (387). El factor de necrosis tumoral es un polipptido sintetizado en diversas clulas, fagocticas o no fagocticas, activadas por endotoxinas, CSa, antgenos parasitarios o fngicos, IL-1 y, de forma autocrina, por el mismo INE Las clulas de Kupffer hepticas constituyen la miyor poblacin de macrfagos tisulares en el hombre, por lo que el hgado tiene un enorme potencial de secrecin de TNE La vida media aproximada es de 15 minutos. Estimula la produccin de protenas de fase aguda y linfocinas, activa clulas fagocitarias y endoteliales, y es capaz de destruir clulas tumorales. Puede mediar respuestas beneficiosas o deletreas dependiendo de la cantidad producida, la duracin de la liberacin y el ambiente bioqumico circundante determinado por la presencia de otros mediadores (25) (39) (40) (81) (139) (160) (161) (169) (171) (202) (226) (227) (355). El factor estimulante de colonias es producido por macrfagos y linfocitos 13 estimulados, a su vez, por la IL-1 procedente de los propios macrfagos. Regula la proliferacin y diferenciacin de clulas de la mdula sea, estimula la actividad fagocitaria, la sntesis ce prostaglandinas y la secrecin de proteasas, y contribuye a inducir tolerancia a endotoxinas (169). El interfern no es producido directamente por los macrfagos, sino por los linfocitos T activados por la accin conunta de IL-1 e IL-2. Estimula el metabolismo oxiclativo ce aquellos y, por tantc, su actividad fagocitaria (47). Las enclorfinas, relacionadas con la etiopatogenia de la hipotensin y el shock sptico, parecen ser sintetizadas tras la estinRlacin directa de los macrfagos por la endotoxina (340) (367).

36

1.4.3.3.4. Activacin de la coagulacin.

Las alteraciones producidas en este sistema por la endotoxina se basan en la actuacin sobre las plaquetas, los factores de la coagulacin y las clulas endoteliales, desencadenndose como consecuencia una coagulacin intravascular diseminada. La endotoxina es capaz de provocar una agregacin plaquetaria y, secundariamente, una degranulacin de las mismas con liberacin de sustancias vasoactivas. A esta agregacin plaquetaria pueden contribuir el aumento de los niveles de tromboxano A2, metabolito del cido araquidnico. Las plaquetas, despus de entrar en contacto con la endotoxina, expresan en su membrana el factor plaquetario 3 (Ff3). El factor tisular es producido tras la activacin directa de los macrfagos por la endotoxina. Esta glicoproteina sirve de receptor al factor VII, que> despus de unirse a ella, se convierte en la forma enzimticamente activa capaz de iniciar la va extrnseca. La endotoxina tambin activa la va intrnseca a travs de la activacin del factor XII (Figura 8) (110) (147) (238) (326) (360). Los macrfagos estimulados por la endotoxina segregan TNF-a, el cual> a su vez, es capaz de inducir la expresin de factor tisular en la membrana de las clulas endoteliales. De esta manera el endotelio se convierte en una potente superficie trombognica. Tantin disntnuye la produccin de prostaciclina, que, al contrario del TxA2, es un vasodilatador e inhibidor de la agregacin plaquetaria. Al mismo tiempo, el desprendimiento de las clulas endoteliales lesionadas de la pared del vaso pone al descubierto las fibras colilgenas, promovindose la agregacin plaquetaria y el depsito de fibrina (105) (110) (123) (147).

1.4.3.4. Alteraciones producidas por accin de las endotoxinas en los distintos rganos y sistemas. 1.4.3.4.1. Alteraciones hemodinmicas. Muchos ole los mediadores liberados por la accin de las endotoxinas son capaces de producir importantes alteraciones hemodinmicas. Tras la inyeccin de endotoxinas, es caracterstica la aparicin de un estado hiperdinmico sistmico ca-

37

racterizado por la disminucin de las resistencias vasculares y el aumento del consumo de oxgeno y de la temperatura corporal. A nivel pulmonar se producen cambios propios de un distrs respiratorio agudo como hipertensin pulmonar, aumento de la pernwabilidad vascular e hipoxia. La administracin repetida de endotoxina en ovejas produce un estado hiperdinmico que incluso persiste despus de suspender la inyeccin de la misma (52) (63) (74) (99) (112) (198) (277).

1 .4.3.4.2.Alteraciones del parnquinn heptico. Desde hace aos se conoce la capacidad de la endotoxina de origen intestinal para producir dao heptico; son varios los mecanismos descritos para provocarlo. Pueden alterar la integridad de las clulas endoteliales y activar la coagulacin, como se ha expuesto anteriormente, desencadenando la aparicin de lesiones hepticas por isquemia. Cuando se administra la endotoxina a ratas hepatectomizadas, se produce una necrosis heptica masiva que se acompaa de destruccin de clulas endoteliales y depsitos de fibrina en los sinusoides (165) (234) (248) (249) (364) (388). La liberacin de mediadores y encimas citolticos secundaria a la interaccin entre endotoxina y clulas de Kupffer altera los hepatocitos. Existe la posibilidad de que las endotoxinas acten directamente sobre ellos. Se ha visto que aumentan la fragilidad de los lisosomas hepatocitarios, estimulan la degradacin del citocromo P-450, alteran morfolgicamente y funcionalmente las mitocondrias y disminuye la captacin y excrecin de sustancias (20) (42) (64) (110) (219) (252).

1.4.3.4.3. Otras alteraciones producidas por las endotoxinas. La fiebre fue el primer efecto descrito de los producidos por la endotoxina; se debe a una accin directa, o a travs de mediadores, sobre los centros termorreguladores cerebrales. Otro de los efectos clsicos es la neutropenia inicial, por secuestro perifrico, seguida de importante neutrofilia. Paralelamente se produce un estmulo ce la eritropoyesis. Tras la administracin intravenosa de enolotoxina o TNF> aumentan los niveles

38

fr

Macrfagos

ir
Factor Tisular (TF)

Xl

-~

Xla IXa+VIIIa+FF3+Ca

4
4

VII
-b-

VIla+TF+FP3+Ca VEA EXTRNSECA

VEA INTRNSECA X*

Xa+Va+FPS+Ca TROMBINA FiBRINA

FIGURA 8. Proceso de activacin de la coagulacin desencadenado por la endotoxina (351).

39

plasmticos de cortisol y ACTH. No se han podido demostrar cambios significativos en los niveles de glucosa, insulina y glucagn sistmico. En cuanto al metabolismo lipdico, se han observado elevaciones de los niveles sricos de cidos grasos libres, colesterol, fosfolpidos y triglicridos. Tambin estimulan la sntesis heptica de protenas y la proteolisis muscular, aumentando la liberacin de glutamina (112) (228) (241) (294).

40

1.5. FISIOPATOLOGIA DE LA OBSTRUCCION BILLAR

1.5.1.

ASPECTOS GENERALES.

La interrupcin del flujo biliar es debida en el 90% de los casos a litiasis, estenosis benignas y tumores que afectan a la va biliar. Las dos primeras suelen producir una obstruccin incompleta que da lugar a ictericia intermitente y crisis de colangitis por colonizacin de grmenes en la bilis estancada. Los tumores causan> generalmente, una obstruccin completa con ictericia progresiva sin colangitis. La obstruccin biliar lleva consigo una retencin de componentes biliares, tanto a nivel heptico como sistmico, y un dficit de los mismos en el tubo digestivo. Como consecuencia, se producen alteraciones en la luz intestinal, en el sistema hepatocelular y en el sistema inmune, que, entre otros efectos, provocan la aparicin de una endotoxemia responsable de muchas de las complicaciones postoperatorias de estos pacientes (278).

1.5.2.

ALTERACIONES DEL SISTEMA HEPATICO.

1.5.2.1. Cambios morfolgicos en hgado y sistema excretor biliar. La obstruccin biliar produce alteraciones histolgicas en el sistema excretor y en las clulas parenquimatosas. En los canalculos se depositan trombos de pigmento biliar y se desestructuran las microvellosidades; progresivamente se vuelven ms largos y tortuosos. La extravasacin de componentes biliares en los espacio porta ocasiona un colangiolitis aguda con importante infrtrado de polimorfonucleares. Los hepatocitos que ms precozmente sufren los efectos txicos derivados del depsito de blilrrubina, sales biliares y otros componentes de la secrecin biliar, son los que estn ms prximos a dichos espacios. Las sales biliares inhiben el citocromo P-450, se producen alteraciones del retculo endoplsmico liso y rugoso, desestructuracin de la membrana celular y, finalmente, destruccin de los hepatocitos; aparece entonces lo que se ha denominado necrosis en sacabocados o peace meal necrosis. Si la obstruccin biliar se prolonga, los fenmenos inflanutorios agudos dan paso al depsito de fibras de reticulina y posteriormente de colgeno; se establece as una fibrosis, que, con el tiempo, se hace irreversible y contribuye a la colestasis y a la aparicin de

41

cirrosis e hipertensin portal. Es difcil determinar cundo se producen en el hombre estos cambios durante el transcurso de la obstruccin biliar; en la rata, a partir de las dos semanas, existe una fibrosis irreversible con signos de hipertensin portal (134) (278) (284) (317).

1.5.2.2. Alteraciones de la hemodinnica heptica. La obstruccin biliar> en su fase aguda, suele acompaarse de un aumento reactivo del flujo sanguneo heptico, quizs para mantener una adecuada funcin heptica ante la dificultad para segregar la bilis. En la fase crnica de la obstinecin biliar, el flujo sanguneo tiende a disminuir (2) (32) (134) (177) (217).

1.5.2.3. Alteraciones de la secrecin biliar. La produccin de bilis se ve alterada por el aumento de la presin en la va biliar cuando se interrumpe total o parcialmente el flujo. En experiencias llevadas a cabo en ratas se ha observado que cuando esta presin es de 16 a 17 cm de H20, la secrecin biliar es un 65% de la normal y cesa completamente cuando la presin es de 20 cm de H20. Esta disminucin en la produccin de bilis est ms determinada por la inhibicin de la secrecin que por un aumento de la absorcin de componentes biliares en los propios canalculos (4) (278).

1.5.2.4. Alteraciones de la funcin hepatocelular. 1.5.2.4.1. Alteraciones de la sntesis proteica. La sntesis proteica, fundamentalmente ce albmina, es normal en las primeras fases de la ictericia, pero a la larga puede aparecer hipoproteinemia secundaria al proceso neoplsico que la causa, a la malnutricin y a la cirrosis biliar de las formas crnicas. Existe una menor captacin perifrica de aminocidos, aunque los niveles sricos son normales o ligeramente aumentados (259) (341). La sntesis de enzimas canaliculares est aumentada; tanto la fosfatasa alcalina como la gamunglutamiltranspeptdasa se elevan en sangre hasta alcanzar una meseta. Esta mayor produccin es la responsable de que ambas aumenten en obstrucciones

42

totales y segmentarias. El estmulo para la produccin de fosfatasa alcalina se debe a una mayor concentracin de sales biliares intrahepatocitarias, pero se desconoce el de la sntesis de gammaglutamiltranspeptidasa (55) (288) (344). La capacidad para producir factores de coagulacin tambin se mantiene en las primeras fases, aunque existe un alargamiento del tiempo de protrombina por la menor absorcin de vitamina K (32).

1.5.2.4.2. Alteraciones de la circulacin enteroheptica de los cidos biliares. La obstruccin biliar conleva una interrupcin de la circulacin enteroheptca y desencadena un aumento de sales biliares en los hepatocitos y sangre. Como mecanismos compensatorios se producen, una mayor conjugacin, sobre todo con sulfato que facilita la eliminacin urinaria, una disminucin de la sntesis de ciertos cidos biliares> y un aumento de otros anormales que son ms hidrosolubles y por tanto ms fciles de eliminar por el rin. La accin detergente de los cidos biliares acumulados en el hepatocito altera de forma importante su membrana (32).

1.5.2.4.3. Alteraciones del metabolismo de la bilirrubina. La produccin diaria de bilirrubina en humanos es de 250 a 300 mg, de la que cerca del 70 % procede del catabolismo de la hemoglobina en el SMNF, fundamentalmente del bazo y mdula sea. El 30% restante corresponde a hemoprotenas no hernoglobnicas hepticas como el citocromo P-450. La bilirrubina no conjugada va firmemente ligada a la albmina plasmtica. Su entrada en el hepatocito es muy probable que sea mediada por carrier y, una vez en su interior, parece unirse a protenas citoslicas ligandinas que impiden la redifusin al plasma y favorecen su entrada en el retculo endoplsmico, donde es conjugada con cido glucurnico, hacindose hidrosoluble. Cuando las protenas ligadoras ole bilirrubina se saturan, se produce un aumento de la bilirrubina no conjugada. En la obstruccin biliar completa, la bilirrubina, una vez conjugada, pasa a sangre, y sus niveles> despus de un ascenso de das o semanas, suelen llegar a

43

una meseta a partir de la cual la produccin diaria es eliminada por el rin; valores superiores a los de la meseta sugieren hemlisis o disfuncin renal. Esta meseta se alcanza antes en perros y ratas> ya que en ellos existe una mayor fraccin de bilirrubina conjugada que es filtrable y presentan, adems, una mayor tasa de filtracin glomerular respecto al peso. El acmulo intrahepatocitario de bilirrubina provoca una menor captacin de oxigeno por las mitocondrias del hepatocito> disminuye la actividad del citocromo y altera la fosforilacin oxidativa. El paso de componentes biliares a la sangre se debe a un reflujo biliolinftico, biliovenoso y transhepatoctico (10) (32) (114) (196) (278) (290) (319) (368).

1.5.2.4.4. Otras alteraciones metablicas. La sntesis hepatocitaria de colesterol est disminuida, pero sus niveles sricos aumentan significativamente debido a una disminucin de su conversin en sales biliares y a la falta de excrecin por la bilis. Tambin es mayor la sntesis de lipoprotenas anormales que pueden interferir con las lipoproteinas de alta densidad (32) (184) (195) (325). Se ha descrito tina intolerancia a la glucosa en animales de experimentacin con obstruccin biliar que puede ser debida a una alteracin de la fosforilacin mitocondrial del hepatocito (259) (375).

1.5.3.

ALTERACIONES DEL SISTEMA INMUNE EN LA OBSTRUCCION BILIAR.

1.5.3.1. Translocacin de bacterias y endotoxinas como consecuencia de las alteraciones en la barrera mucosa intestinal. Como se ha comentado anteriormente, en el tubo digestivo existen una serie de mecanismos de defensa especfica e inespecfica que contribuyen de forma importante a la actividad del sistema inmune> manteniendo el equilibrio de la flora intestinal y evitando su translocacin. Los factores que la provocan son, fundamentalmente, las alteraciones de la flora intestinal, la desestrucruracin de la mucosa y la depresin de las defensas del husped (7) (33) (94) (98) (111) (162) (189) (205) (376) (377) (380). Se ha observado translocacin bacteriana en diver-

44

sas situaciones como el shock hemorrgico (291) (334) (384), la isquemia intestinal (275) (292)> las quenuduras (8) (96) (246), el tratamiento con frnucos citotxicos y antibiticos (15) (33) (34), la nutricin parenteral total (16) (128) (176) (287) y la malnutricin severa (89) (92) (98) (336). Deitch et al (97) han visto un predominio de bacterias gram negativas en el tubo digestivo de ratas despus de ligar el coldoco. Al mismo tiempo, hay una mayor translocacin de estos grmenes en los ganglios linfticos mesentricos y un edema importante a nivel de la lmina propia. El fenmeno de translocacin se ha visto asociado al dficit funcional de linfocitos T, circunstancia que aparece en la obstruccin biliar (309).

1.5.3.2. Alteraciones del sistenyia mononuclear-fagoctico. Desde hace aos se sabe que la obstruccin biliar produce una disminucin de la capacidad fagocitaria del sistema mononuclear-fagoctico. Este hecho es independiente de la situacin nutricional del animal de experimentacin y se hace evidente a partir de la
1a

~ 2~ semana de haber ligado la va biliar. El cultivo de

clulas de Kupffer en medios con cantidades elevadas de sales biliares y endotoxina provoca alteraciones morfolgicas en el citoplasma de las mismas (18) (80) (108) (172) (173) (348).

1.5.3.3. Alteraciones de linfocitos y neutrfilos. Diversos animales, despus ce ligar la va biliar> presentan una depresin de la respuesta a mitgenos por parte de los linfocitos T (122) (135) (281) (365). Owens et al (268) observaron que los ratones atmicos presentaban un dficit de Lg A> placas de Peyer subdesarrolladas y una mayor incidencia de translocacin bacteriana. Posteriormente, Maddaus et al. (206) vieron que la funcin inmune Tdependiente tena escasa importancia en el hecho de la translocacin, pero> una vez que esta se produca, pocha influir en la viabilidad del microorganismo translocado dentro del ganglio linftico. La funcin de los neutrfilos tambin est deprimida en la obstruccin biliar 45

como lo demuestra el hecho de que ratas a las que se les liga el coldoco y se les induce una peritonitis presentan un aclaramiento bacteriano peritoneal mucho ms lento que los controles. Se ha observado, in vitro, una menor funcin guimiotctica, microbicida y ltica de los polimorfonucleares procedentes de individuos con ictericia obstructiva (86) (307) (308).

1.5.4.

REPERCUSION DE LAS ALTERACIONES DEL SISTEMA INMUNE EN EL ACLARAMIENTO DE ENDOTOXINAS.

Las alteraciones de la funcin del sistema inmune descritas en apartados anteriores provocan un aumento en la absorcin de endotoxinas y una disminucin de su aclaramiento. Ya se ha comentado que, si bien la endotoxemia portal se ha observado en individuos sanos, la endotoxemia sistmica es una circunstancia que aparece en pacientes con algn grado de insuficiencia heptica, entre ellos los que presentan ictericia obstructiva. Se ha demostrado un aumento de compleos inmunes de lg A coincidiendo con la presencia de endotoxemia sistmica en pacientes con obstruccin biliar. El depsito de estos inmunocomplejos en diversos rganos puede producir dao tisular (24) (132) (204) (247) (263) (271) (286). La endotoxina contribuye a la depresin de diversos componentes del sistema inmune, perpetuando una situacin de crculo vicioso. Niveles elevados de endotoxina dificultan la incorporacin de nutrientes a la nwcosa intestinal y provocan alteraciones isqumicas de la misma a travs de sus mediadores (15) (157) (238) (242) (245) (260) (276) (335) (345) (369).

46

1.6. COMPLICACIONES PERJOPERATOlUAS DE LA CIRUGIA DE LA OBSThUCCION BILLAR RELACIONADAS CON LA ENDOTOXINA

1.6.1.

AsPECTOS GENERALES.

Los pacientes con obstruccin biliar estn expuestos a una alta morbimortalidad perioperatoria. En ello influyen los efectos txicos de los componentes biliares, la malnutricin y la patologa neoplasica. Una revisin llevada a cabo por Dixon et al (106) de 373 pacientes ictricos mostr que la existencia en un mismo enfermo de un hematocrito inferior al 30 %, una biirrubina mayor de 11.7 mg/dl y enfermedad neoplsica, elevaba el riesgo de mortalidad al 60%. Algunas de las complicaciones ms importantes y frecuentes de la ciruga en enfermos ictricos van a estar determinadas por la depresin del sistema inmune y la endotoxemia procedente del tubo digestivo, De ellas destacan el fracaso renal, las hemorragias gastrointestinales, las aiteraciones de la cicatrizacin y las complicaciones spticas (19) (49) (101) (155) (209) (259) (282) (352).

1.6.2.

ALTERACIONES DE LA FUNCION RENAL.

El fallo renal tras la ciruga por obstruccin biliar fue descrito a principios de siglo por Clairmont y Von Haherer (citado en 369). Los pacientes ictricos presentan una disminucin de la tasa de filtracin glomerular tras la intervencin en ms del 60% de casos, y el
9 6/o

desarrolla un fracaso renal con una mortalidad asociada superior

al 500/o (24) (62) (78) (100) (106) (125) (149) (274) (278) (282) (332) (368) (383).

1.6.3.

HEMORRAGIA GASTROINTESTINAL.

Esta complicacin se ha descrito entre un 6% y un 14% de los pacientes con obstruccin biliar sometidos a ciruga; es la causa del 20% de los fallecimientos en el postoperatorio y, generalmente, se deben a gastritis erosivas. Aunque en ellas puede influir el reflujo duodenogstrico alcalino, es probable que la endotoxina, al igual que en el fracaso renal> sea el factor etiolgico ms importante. Las alteraciones de la coagulacin existentes antes de la intervencin no parecen influir en el desencadenamiento de la hemorragia. La aparicin de erosiones en estmago
41

de pacientes cirrticos se asocia> con frecuencia, a endotoxemia sistmica. La endotoxina estimula la secrecin gstrica, y en las gastritis erosivas producidas en animales de experimentacin tras su inyeccin se han observado niicrotrombos de fibrina en los vasos de la mucosa (78) (106) (107) (213) (282) (304).

1.6.4.

ALTERACIoNEs DE LA CICATRIZACION.

Los pacientes intervenidos por obstruccin biliar sufren dehiscencias de la herida operatoria entre el 2% y el 4% de casos, y un 10% a 12.5% desarrollan eventraciones (282). Lee (200) y otros autores (307) demostraron un retraso en la emigracin de macrfagos, proliferacin de fibroblastos, formacin de colgeno y angiognesis en heridas de animales con ictericia obstructiva. Tambin se ha observado una disminucin de los niveles de prolina-hidroxilasa (49). En estas alteraciones puede jugar un papel importante la malignidad de los procesos causantes de la obstruccin biliar y la nulnutricin, pero el papel de la endotoxina queda demostrado en trabajos experimentales en los que se observ una mejora de la cicatrizacin en ratas ictricas tratadas con sales biliares, capaces de controlar la absorcin de endotoxina (21).

1.6.5.

CoMPLICACIONEs INFECCIOSAS.

la depresin del sistema inmune existente en los pacientes con obstruccin biliar aumenta las posibilidades de colonizacin bacteriana en distintos rganos y sistemas. Entre ellas hay que tener en cuenta la que se puede pinducir en la propia va biliar obstruida cuando esta se manipula preoperatoriamente con fines diagnsticos y temputicos 30-50% ce casos (48). Adems, la endotoxemia derivada de estas colonizaciones tiene efectos ms contraproducentes en dichos enfermos que en personas sanas. Wells et al (378) observaron una incidencia de infeccin postoperatoria en ciruga biliar igual o mayor que en la ciruga coloproctolgica, aunque esta es, en teora> mucho ms contaminante. Pitt et al (282) y Dixon et al (106) han visto que las complicaciones spticas aparecen en ms del 20% de casos> siendo las ms frecuentes la infeccin de la herida ce laparotoma y la presencia de bacteriemia.

48

1,7. ACCION DE LA TERAPIA ADYUVANTE PARA lA RECLIPERACION PREOPERATORJIA DEL SISTEMA INMUNE EN LA CIRUGIA DE LA OBSTRUCCION BILIAR

1.7.1.

DRENAJE BILIAR PREOPERATORIO.

Desde el punto de vista terico, la maniobra ms eficaz para recuperar las funciones del sistema inmune sera la descompresin del rbol biliar y la reposicin de la bilis en el tubo digestivo. Whipple (citado en 356), en 1935, describi la duodenopancreatectoma para extirpar tumores de cabeza de pncreas que causaban ictericia obstructiva; para ello realizaba un drenaje de la va biliar en una primera intervencin y la reseccin en un segundo tiempo. Hoy en da, el drenaje

biliar se lleva a cabo mediante la colocacin de catteres transparietohepticos

o por procedimientos endoscpicos (79). En la revisin de Clements et al (79) se observa que los casos en los que se utiliz el drenaje externo para descomprimir el rbol biliar sin reponer la bilis en el intestino, presentaron resultados contradictorios en cuanto al posible efecto beneficioso de cara a la intervencin. Despus, con el uso de tcnicas de drenaje biliar interno que derivan la bilis al tubo digestivo, se ha conseguido que aquellos sean ms unifornyiemente positivos. Varios estudios experimentales y ensayos clnicos han permitido explicar los mecanismos por los cuales acta el drenaje biliar. Algunos autores (102) (152) observaron que el drenaje interno disminua significativamente la incidencia de endotoxemia portal y sistmica en ratas, mientras que los niveles se mantenan elevados cuando se realizaba un drenaje externo, lo que demuestra la importancia de restituir la bilis en el tubo digestivo. La recuperacin de la funcin renal, metabolismo heptico y sistema inmune despus del drenaje biliar se produce ms lentamente que la normalizacin de los niveles de bilirnbina. Koyama et al (197) han observado que tanto la cetognesis como la funcin respiratoria mitocondrial de los hepatocitos tardan unas seis semanas en normalizarse tras la liberacin de la obstruccin biliar. Pacientes sometidos a drenaje biliar preoperatorio recuperan muy lentamente la capacidad de

49

sntesis heptica de cidos biliares (136). La respuesta linfocitaria a mitgenos, que se encuentra deprimida a los 21 das de ligar la va biliar en ratas> no comienza a recuperarse hasta la segunda semana de haber realizado un drenaje biliar interno (309) (312). La capacidad de aclaramiento de] SMNF se restablece a partir de la
12

22

semana (103). Vane et al (365), en estudios llevados a cabo en

coneos, han observado que tanto la respuesta linfocitaria a mitgenos como la actividad del SMNF se recuperan mucho ms lentamente.

1.7.2.

SALES BILIARES.

La administracin de sales biliares a enfermos ictricos, fundamentalmente de deoxicolato, disminuye los niveles de endotoxemia portal y sistmica y evita el deterioro de la funcin renal durante el postoperatorio (60) (61) (62) (117) (273) (352) (353). Existe cierta controversia acerca del mecanismo de accin de las sales biliares. En un estudio realizado por Cahil et al (60) no se observ que las sales biliares controlaran la flora bacteriana gram negativa del tubo digestivo. Los cidos biliares, in viti-o actan sobre las bacterias y tienen una accin detergente sobre la endotoxina que es capaz de inactivara (37) (38) (126) (272) (279) (296) (314) (320) (327). Kocsar et al (194) y> ms tarde> Bailey et al (24) vieron que los cidos biliares impedan la absorcin de endotoxina. En un estudio experimental (152)> el drenaje biliar interno disminuy los niveles de endotoxernia, pero esto no ocurri con el drenaje externo. Parece, por tanto, que las sales biliares pueden ejercer una accin directa sobre la endotoxina o sobre su proceso de absorcin. Greve et al (154) han propuesto que ms que un efecto directo sobre la endotoxina, los cidos biliares inhiben la secrecin de TNF por los macrfagos. Sin embargo, estos mismos autores (29) no han observado que el control de los niveles de TNF mediante anticuerpos monoclonales disminuya la mortalidad de ratones ictricos.

50

1.7.3. LACTULOSA.

La lactulosa es un disacrido sinttico derivado de la lactosa, cuya estructura qumica corresponde a 4-0-IA-D-galactopiranosil-D-fructo-fiiranosa.Clsicamente se ha utilizado para tratar la encefalopata porto-sistmica. Se ha observado que la administracin preoperatoria de lactulosa a enfermos con ictericia obstructiva reduce los niveles de endotoxemia, portal perioperatoria y sistmica postoperatoria, y mejora la funcin renal (269) (270). Tambin evita la necrosis heptica inducida en ratas con galactosamina, que es mediada por la endotoxina de origen intestinal (142). Son varios los mecanismos por los cuales la lactulosa podra ejercer su accin teraputica en la obstruccin biliar. Gracias a su poder osmtico y su capacidad para acidificar, estimula el movimiento del colon y produce un efecto laxante que puede disminuir la absorcin de endotoxinas. Tambin puede alterar la flora bacteriana del colon y, por tanto, la produccin de aquellas (105). Greve et al (156) han visto que la lactulosa, in vitro, apenas tiene efecto antiendotoxina, pero inhibe la produccin de TNF por los nucrfagos estimulados por la esta; aunque es cierto que para ello necesita ser absorbida, circunstancia que no se produce en condiciones normales, s sera posible en situaciones patolgicas en las que se alterara la barrera intestinal.

1.7.4.

POLIMIXINA.

Es un antibitico polipeptdico con capacidad para inactivar la endotoxina in vitro. Es efectiva en ratas ictricas pero no ha sido capaz de controlar la endotoxemia en hunyianos (75) (166) (179).

1.7.5.

INMUNOMODULACION.

1.7.5.1. Aspectos generales En las ltimas dcadas se ha desarrollado una terapia inmunolgica especfica
para

la endotoxina en distintas patologas, basada en la administracin de anti-

cuerpos o en el estmulo de su produccin con derivados no activos de la misma (202). Menos frecuentemente se han empleado sustancias capaces de llevar a ca51

bo una estinnlacin inespecfica de elementos del sistema inmune. Eapat et al (27) (86) observaron que un derivado de la Tinospora Cordifolia revierte la depresin de la capacidad fagocitaria y microbicida producida en los macrfagos y neutrfilos pci- la obstruccin biliar

1.7.5.2. Las hormonas tmicas como agentes inmunomoduladores. La funcin inmune del timo qued establecida cuando Miller (citado en 9), en 1962, observ que la timectoma en ratones recin nacidos originaba la muerte prematura despus de la involucin del sistenyia timo-dependiente. Las hormonas tmicas son un grupo de pptidos sintetizados por las clulas epiteliales del timo que actan sobre los procesos de proliferacin, maduracin y activacin de los linfocitos T. Sus niveles sricos descienden rpidamente al extirpar el timo o lentamente por la involucin con la edad. De los extractos tmicos se obtienen diferentes pptidos capaces de actuar sobre las distintas funciones del linfocito T; entre ellos se encuentran la timopoyetina, la timosina a-1, la timulina y el factor tmico humoral. La timopentina (TP-5) es un pentapptido sinttico correspondiente a la secuencia de aminocidos 32 al 36 de la timopoyetina. Otros pptidos sintticos son la esplenina y la esplenopentina (SP-5). Las hormonas tmicas se han empleado en infecciones vricas> lepra> tuberculosis> enfermedades autoinmunes, neoplasias e inmunodeficiencias primarias y secundarias (3) (163) (339) (347) (379).

1.7.5.3. Caractersticas ole la timoestimulina, 1.7.5.3.1. Aspectos generales. La timoestimulina fre aislada y purificada en 1977 por Falchetti y Bergesi (118). Es un complejo polipeptdico que se obtiene de la glndula tmica bovina y tiene un peso molecular menor de 10.000 Daltons. En la identificacin del principio activo> el perfil electrofortico presenta una sola banda caracterstica correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 4.500 Daltons.
52

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54

1.7.5.32. Mecanismos de accin y valoracin de su actividad. La timoestimulina induce la aparicin de marcadores de superficie de las clulas T y, como otras hormonas tniicas, estimula sus procesos de proliferacin, diferenciacin

y activacin, tanto en animales como en humanos inmunodeprimi-

dos. En sujetos sanos, el efecto de la timoestimulina no es tan manifiesto como el que ejerce sobre individuos en los que la inmunocompetencia no est desarrollada o se ha deprimido (67) (330). Los ensayos llevados a cabo para el estudio de la accin de la timoestimulina son de dos tipos: los primeros sirven para determinar la accin sobre los nurcadores de superficie ce clulas T y 13 (tabla 1); el segundo tipo de ensayos evala la funcin linfocitaria, para lo cual se incuban los linfocitos con timoestimulina y diversos mitgenos (tabla II).

1.7.5.3.3. Farmacodinamia y toxicidad. La timoestimulina administrada por va intravenosa o intramuscular, a dosis de 1 2 mg/kg de peso/da, en animales no modifica la presin arterial sistmica, la
frecuencia cardaca

y respiratoria, los registros electrocardiogrficos ni el tono o

motilidad de la musculatura lisa y estriada. Tampoco altera las respuestas presoras, electrocardiogrficas y neumogrficas a epinefrina, norepinefrina, acetilcolina e histamina. La administracin prolongada de dosis elevadas, hasta 100 mg/kg/da, no tiene efecto letal ni modifica el peso corporal ni el aspecto macroscpico o microscpico de los rganos inmunolgicos ms relevantes> como el bazo o el timo (118).

1.7.5.3.4. La timoestimulina en experimentacin animal. Son escasos los estudios realizados en animales en los que se ha empleado la
timoestimulina como tratamiento

de infecciones bacterianas (85) (224). Ha sido

utilizada ms frecuentemente como agente antiviral, disminuyendo la mortalidad, o antitumoral, consiguindose mayor supervivencia, tanto en tumores primarios como metastsicos (191) (192) (210).

55

1.7.5.3.5. La timoestimulina en ensayos clnicos. La timoestimulina se ha mostrado eficaz en el tratamiento de inmunodeficiencias prixmrias como el Sndrome de Di George> la aplasia tmica, la ataxia telangiectasia

y, en general, las enfermedades relacionadas con la depresin de linfoci-

tos T (6). Tambin se ha utilizado con xito en diversas inmunodeficiencias secundarias que se suelen asociar a pacientes infantiles, seniles, neoplsicos, quemados o sometidos a radio-quimioterapia. En enfermos quirrgicos reduce la tasa de complicaciones infecciosas postoperatorias (59) (145) (214) (354).

56

2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS
La ciruga de los enfermos con ictericia obstructiva se ha asociado a unas altas tasas de morbilidad y mortalidad. Muchas de las complicaciones descritas en estos
enfermos son

consecuencia de las alteraciones existentes en los distintos compo-

nentes del sistema inmune, que motivan un aumento de la absorcin de endotoxinas a nivel del tubo digestivo y la aparicin de una endotoxemia sistmica por un dficit de aclaramiento. Como se ha expuesto anteriormente, tanto los fenmenos de translocacin como la depresin del SMNF estn relacionados con un dficit funcional de linfocitos T, que es la poblacin linfocitaria que fundamentalmente se altera en la obstruccin biliar Las hormonas tmicas poseen una accin moduladora basada en la estimulacin de estos linfocitos en individuos inrnunodeprimidos. En base a estos hechos, se plante la hiptesis de que el tratamiento con timoestimulina

de ratas con ictericia obstructiva podra recuperar la funcin linfocitaria

T y controlar la translocacin de enclotoxinas desde la luz intestinal hacia la circulacin portal, as como la aparicin de endotoxemia en la circulacin sistmica motivada por la disminucin de su aclaramiento. Para ello se establecieron los siguientes objetivos:

1) Desarrollar un modelo de ictericia obstructiva en ratas, simple y eficaz para interrumpir

el flujo biliar.

2) Estudio de las diferencias ponderales en ratas con ictericia obstructiva, siete das despus de haber ligado la va biliar, tratadas o no con timoestimulina. 3) Estudio de las variaciones en los niveles de creatinina en sangre de ratas con ictericia obstructiva, siete chas despus de haber ligado la va biliar, tratadas o no con timoestimulina. 4) Determinacin de la respuesta linfocitaria a Concanavalina A en ratas con ictericia obstrnctiva, siete das despus de haber ligado la va biliar, tratadas o no con timoestimu lina. 5) Determinacin de los niveles de endotoxemia porta en ratas con ictericia obstructiva, siete das despus de haber ligado la va biliar, tratadas o no con timoestimulina.

51

6) Estudio de las variaciones de los niveles de endotoxemia sistntica en ratas con ictericia obstructiva, siete das despus de haber ligado la va biliar, tratadas o no con timoestirnulina. 7) Estudio del aclaramiento de endotoxina exgena en ratas con ictericia obstructiva, siete das despus de haber ligado la va biliar, tratadas o no con timoestimulina.

58

3. MATERIAL Y METODOS
3.1. MATERIAl.
3.1.1. ANIMALES.

Se utilizaron 94 ratas Wistar, machos (n= 69) y hembras (n 25), de un peso de 347 10,3g (media error estndar). Los animales procedan de la colonia del
Servicio

de Ciruga Experimental del Hospital Ramn y Cajal de Madrid.

3.1.2. REAcTivos. 3.1.2.1. Determinaciones bioqumicas en sangre.

-

Boehringer Mannheim. Barcelona. Espaa:

-

Tiras reactivas para Reflotron:

-

Glucosa (ref. nti

744948).

Triglicridos (ref. n~ 745049). Creatinina (ref. n~ 745154). Amilasa (ref n~ 1200658). Bilirrubina (ref. n~ 905321). GPT (ref. nti 745138). GOl (ref. n~ 745120). GGT GeL n2 744964). Suero control Precinorm U (ref. nti 745154).

3.1.2.2. Estudio de la funcin linfocitaria.

-

Gibco. Madrid, Espaa:

-

Medio RIMI (ref. n~ 074-01800N). Suero de carnero fetal al 2% y 5% GeL n2 011- 06290).

Sigma. Madrid. Espaa:

-

Fungizona (ref. n9 F9528). Azul de tripano.

Llorente. Madrid. Espaa:

-

Gentamicina (ref. n2 763094).

59

Aldrich. Madrid. Espana:

-

Concanavalina

A (re? n~ 86, 142-1).

Merk. Madrid. Espaa: 5 x lo-5 M (re? Flow Laboratories. Madrid. Espaa:

-

2-mercaptoetanol

n~

805740).

Glutaniina 2mM (re? n~ 16-801-49).

Amersham. Madrid. Espaa:

-

Timidina [metil-H31.(ref. n2 TRK4I8).

3.1.2.3. Determinacin de endotoxinas.

-

Associates of Cape Cod, Woods Hole. Massachusetts. E.E.U.U.:

-

Reactivo LAL Pyrotell, lote 42-102-544 (ref. n2 AE-061). Endotoxina CSE (100 ng/mI), lote 49 de E.coli, potencia 12,5 UE/ng (re?
nti

AE-075).

Atlas Bioscan Ltd. West Sussex. Gran Bretaa:

-

Agua apirgena (< 0,001 UE/ml), lote 21-01-92 (re? nti AE-081).

3.1.2.4. Anestsicos.
-

Ibys SA. Madrid. Espaa:

-

Sulfato de atropina a concentracin de Img/ml.

Roche SA. Madrid. Espaa:

-

Diazepam a concentracin de Smg/mi.

Parke Davis SA. Madrid. Espaa:

-

Clorhidrato de Ketamina a concentracin de Smg/ml.

3.1.2.5. Otros
-

Laboratorios Difco. Michigan.E.E.U.U.:

-

Lipopolisacrido

E.coli 0127:B8.

Laboratorios Rovi SA. Madrid. Espaa:

-

Heparina sdica al 1%.

60

Sarget. Madrid. Espaa:

-

Povidona Yodada al 10%

Laboratorios Prez Gimnez. Crdoba. Espaa.

-

Alcohol sanitario al 700 y 960.

3.1.3. INMUNOMODULADOR.
-

Laboratorios de Investigacin del Instituto Farmacolgico Serono. Roma. Italia:

-

Extracto tmico: Timoestimulina (TP-l).

3.14. ApAIt4Tos Y MATERIAL FUNGIBLE. 3.1.41. Determinaciones bioqumicas en sangre.

-

Boehringer Mannheim. Mannheim. Alemania:

-

Espectrofotmetro de reflexin modelo Reflotrn.

Kubota. Tokyo. Japn:

-

Centrfuga Kubota 5100.

Eppendor? 1-lamburg. Alemania: Pipetas automticas de 1-1000k1

-

Tubos de polipropileno de 1 cc3.

H. ICO SA. Madrid. Espaa:

Jeringas ce insulina estriles de polipropileno 25 G.

3.14.2. Estudio de la funcin linfocitaria.

Dwyer Instr. Inc. Indiana. EE.UU.:

-

Cmara de flujo laminar Magnehelic.

Beckman. Glenrothes. Gran Bretaa:

-

Contador ~g Beckman LS 1701.

Scatron lnstrnments. Lier. Noruega:

-

Recuperador de clulas o Cel harvester. Papel ce filtro para el recuperador de clulas. Skatron Filterntats.

Nikon. Tokyo. Japn: 61

Microscopio binocular invertido modelo Nikon Diaphot.

Lab-Line Instruments Inc. Illinois. E.E.U.U.:

-

Agitador rotatorio modelo Mistral Mixer.

NAPCO.Iliinois. E,EUU.:
-

Estufa de incubacin modelo NAPCO-5415 IR CO2 System. precisin modelo Precisterm.

P-Selecta. Heidelberg. Alentania:

-

Termostato de inmersin electrnico de

Cultek. Madrid. Espaa:

-

Mechero automtico modelo Pireboy.

Tecnomara. Zirich. Suiza:

-

Pipeta automtica modelo Pipet Boy.

Bibby Sterilin Ltd. Staffs. Gran Bretaa:

-

Placas de Petri estriles modelo Sterilin.

Sarstedt. Hamburg. Alemania:

-

Tubos de polipropileno estriles de 15 nI Casas estriles.

3. Tubos de polipropileno de 1 cc Nunclon T.M. Kopenhagen. Dinamarca:

-

Placas microtiter estriles de 96 pozillos.

Brand. Heidelberg. Alentania:

-

Pipetas Pasteur estriles de 5 ml. Cmara de recuento celular Neubauer.

3.1.4.3. Determinacin de endotoxinas.

-

Associates of Cape Cod. Woods Hole.Massachusetts. EE.UU.:

-

Nefelmetro LAL-5000-II.

Heidolph Elektro. Kelheim. Alemania:

-

Agitador modelo Vortex REA-2000.

Atlas Bioscan Ltd. West Sussex. Cran Bretaa:

-

Tubos apirgenos de reaccin de 10 x 75 mm (ref. n~ AE-1 10).

62

Tubos apirgenos de dilucin de 13 x 100 mm (re?nti AE-112). Pipetas apirgenas de 1 y 2 ml (re?n~ AE-136 y AE-137).

Nichiryo. Tokyo. Japn:

-

Micropipeta ajustable

de 10

100 II.

American National Can. Greenwich. EE.UU.:

-

Parafilm. Puntas de pipeta apirgenas.

Siemens. Mtinchen. Alemania:

-

Frigorfico con dispositivo de seguridad. Ordenador personal modelo PCD-2P. Impresora matricial modelo Highprint 3100.

Viggo-Spectramed. Helsingborg. Suecia:

-

Catteres intravenosos de polipropileno de 18 G.

3.1.4.4. Instrumental quirrgico.

-

Aesculap. Miinchen. Alemania:

-

Caja de instrumental microquirrgico: 2 pinzas anatmicas, 2 pinzas quirrgicas, 2 tijeras de diseccin, una tijera de hilos, 4 pinzas de mosquito, un disector fino> un portaaguas fino y un portaagujas grueso.

Lorca Marn. Murcia. Espaa:

-

Ligaduras de seda de 4/0 y 5/0.

3.1.4.5. Otros
-

Carl Zeiss. Jena. Alemania:

Lupa microquirrgica binocular.

Sauter. Hambu rg. Alemania:

-

Balanza de precisin de Sg-lOOOg modelo Sauter SM 1000.

Xahl Clipper Corporation. Illinois.EE.U. U.:

Esquilador elctrico modelo Wahl 89 Taper.

Asik. Kopenhagen. Dinamarca:

63

Jeringas de polipropileno desechables de 2, 5 y 10 ml.

Becton Oickinson. Fraga. Espana:

-

Agujas desechables de 20 G.

3.1.5. MATERIAL PARA ESTUDIO ESTADISTICO. Se emple un ordenador JEPSSEN 486/ 66 Mhz y el programa BMOP 386 DYNAMIC
y.

7.0 y BMOP NEW SYSTEM versin beta (BMOP Statistical Software).

Los mdulos empleados para la estadstica descriptiva y homogeneidad fueron: DM, 10, 20, 3D, 40, 70, 4F, 2V, 5V, 3S, IR.

3.2. METODOS 3.2.1.

MANEJO DEL ANIMAL DE EXPERIMENTACION.

3.2.1.1. Cuidados generales. Los animales se mantuvieron en jaulas estndares con capacidad para tres ratas cada una y con libre acceso a comida y bebida, no inferior a 20-45 ml de agua y 12-15 g de pienso por animal y da. Fueron expuestos al ritmo circadiano ambiental con una temperatura que oscil entre 18 y 22 0C y una humedad relativa del 70%. El serrn del fondo, que contena las excretas, se cambi a diario.

3.2.1.2. Tcnica anestsica. Se llev a cabo mediante inyeccin intraperitoneal de una mezcla de sulfato de atropina (0.2 ml a concentracin de 1 mg/mi), diazepam (0.8 ml a concentracin de 5 mg/nt y clorhidrato de ketamina (1 ml a concentracin de 5 mg/mI). Se ajust la dosis de la mezcla anestsica al peso del animal (1 ml por kilogramo de peso) (115).

3.2.1.3. Tcnica quirrgica para interrumpir el flujo biliar. Los animales slo recibieron agua durante las 24 horas previas a la intervencin. Todas las operaciones se hicieron en condiciones aspticas. Despus de anestesiar la rata y colocarla en decbito, fijando sus extremidades, se rasur el abdomen y se lav con una solucin antisptica de povidona yodada. Se realiz 64

una laparotoma media de unos 3 cm de longitud iniciada pocos milmetros por debajo del apndice xifoides. La localizacin del antro gstrico facilit la identificacin del duodeno, del que es necesario traccionar para tensar la va biliar principal (VBP) en el ligamento hepatoduodenal (73) (167). Una vez identificada y disecada esta, se utiliz la tcnica de Koch-Weser et al, (193) para interrumpir el flujo biliar. Oicha tcnica consiste en realizar una doble ligadura con seda (5/0) de la VBP, una por debajo de la confluencia de los conductos hepticos lobares y otra justo por encima de la unin con los conductos pancreticos, extirpando un segmento de la misma entre ambas. El cierre de la laparotomia se llev a cabo con sutura continua de seda (4/0). Finalmente, se marc a los animales pata su correcta identificacin.

3.2.1.4. Tcnica para la obtencin de muestras de sangre. 3.2.1.4.a. Sangre sistmica. Se obtuvo por puncin directa de la vena yugular interna, tomando como referencia el latido de la arteria cartida comn. Se utilizaron agujas y jeringas de insulina lavadas con heparina sdica.

3.2.1.4.b. Sangre portal. A travs de una laparotoma como la descrita previamente, se localiz el confluente venoso mesentrico-portal traccionando del paquete intestinal. Oespus, se obtuvo una muestra de sangre portal mediante puncin directa con aguja y jeringa de insulina lavada con heparina sclica.

3.2.1.5. Tcnica de esplenectoma Para estudio de la funcin linfocitaria. En la misma intervencin descrita en el prrafo anterior se llev a cabo la esplenectoma. Para ello se exterioriz el bazo traccionando del estmago y se extirp despus de ligar con seda (4/0) y seccionar el pedculo esplnico.

65

3.2.1.6. Tcnica para estudio del aclaramiento de endotoxina. Se canularon las dos venas yugulares internas a travs de una incisin supraclavicular utilizando sendos catteres Abbocath de 18 G lavados con heparina sdica (283). En uno de ellos se inyect lipopolisacrido E. coli 0127: B8 a dosis de 1 mg/1 OOmg de peso. Por el otro se obtuvieron muestras hemticas seriadas para estudio del aclaramiento.

3.2.2. DUrERMINACION DE PARAMVrRos BIOQUIMICOS EN SANGRE Las muestras hemticas fueron centrifugadas inmediatamente despus de su extraccin, a 4000 rpm, durante 10 minutos. Los sueros resultantes se congelaron a 20 oc hasta su procesamiento con el espectrofotmetro de reflexin.

3.2.3. ESTUDIO DE LA RESPUESTA MITOGENICA A CONCANAVALINA A DE LINFOCITOs T DEL BAZO. 3.2.3.1. Aislamiento de linfocitos del bazo. Despus de extraer los bazos en condiciones de esterilidad, se mantuvieron en medio RPMI con 60 ~ig/ml de gentamicina y 0.25 pg/ml de fungizona. Posteriormente, fueron triturados sobre gasas estriles, que actuaron como filtro, con el mbolo de una jeringa; las clulas filtradas se centrifugaron a 1800 rpm durante 4 minutos, desechando el sobrenadante. Se lavaron tres veces con medio RPMI suplementado con gentamicina, fungizona y suero fetal de ternera (FCS) al 2% inactivado a 56 oc durante 30 minutos; finalmente, las clulas fueron resuspendidas en medio basal completo (RPMI, gentamicina, ftrngizona, Glutamina 2 mM y (~mercaptoetanol 5 x 10~ M y FCS al 5%). Para el contaje de clulas se utiliz una cmara de Neubauer y la viabilidad de las mismas se determin con un colorante (le exclusin, tripan blue preparado al 10% en solucin isotnica, que perimtic distinguir las clulas vivas de las clulas no viables por la coloracin azul que adquieren estas ltimas al penetrar el colorante a travs ce su membrana alterada (146) (148).

66

3.2.3.2. Medida de la proliferacin celular. La proliferacin celular se determin en funcin de la sntesis de DNA despus de estimular los linfocitos con la Concanavalina A (Con A) (146). Para medir la sntesis de DNA, los linfocitos resuspendidos en medio basal, a una densidad de IO~ clulas/lOO pi, se incubaron a 372C con 5% de CO2 y 95% de humedad en placas de 96 pocillos con distintas concentraciones de Con A. A las 48 3) en cada pocillo y se manhoras se aadi 0.5 ~xCide timidina tritiada (metil-H tuvieron las clulas 24 horas ms en las condiciones de incubacin ya sealadas. Despus de este tiempo, la timidina tritiada no incorporada se separ con ayuda de un cel harvester, de tal forma que los ncleos quedaran retenidos en filtros de fibra de vidrio. La timidina tritiada incorporada al DNA se determin cuantificando, en cuentas por minuto (CPM), la radiactividad de los filtros en un contador de radiacin JA. Los resultados se expresaron como ndice de estimulacin (lE) y respuesta relativa (RR) calculados segn las frmulas:

CPM (de cada muestra estimulada) LE

=
______________________________

CPM (control) cpm (animal problema+Con A)-cpm (animal problema basal) RR

=

cpm (animal control+Con A)-cpm (animal control basal)

3.2,4. TESr

DEL

LXI. PARA

LA DIrrERMINACION DE ENDOTOXINA.

3.2.4.1. Fundamentos del test del LAL. El fundamento del test del IAL (Lymulus Amoebocyte Lysate) se basa en la capacidad que tiene el lpido A de desencadenar una reaccin de coagulacin con el extracto de las clulas sanguneas (amebocitos) del Lymuluspohphemus (horseshoc crab). La endotoxina activa una cascada de proteasas, en presencia de iones de calcio y de magnesio, que hidrolizan el sustrato coagulgeno, dando lugar a la protena coagulina con capacidad de formar polmeros que generan un estado de gelificacin con aumento de la turbidez.

67

Existen tres tipos principales de ensayos que comparten este mismo frmndamento: mtodo de gelificacin (180) (256) (286); mtodo turbidimtrico (256); y mtodo cromognico (35) (168) (186) (203) (256).

3.2.4.2. Procesamiento de muestras de sangre para el ensayo LAL. Se llev a cabo con material apirgeno, recogindose muestras de sangre (0.5 mi) y anticoagulndolas con heparina sdica (15
-

30 UI/ml). Se centrifugaron du-

rante 5 minutos, a 3000 rpm, para separar el suero, que fue congelado a -20 0C hasta su procesamiento. Para su anlisis, las muestras de suero se diluyeron al 1/100 con agua apirgena, mantenindose a temperatura de 65 oc durante 1 hora para eliminar gran parte del efecto inhibidor del plasma en la reaccin del LAL Despus de enfriarse a temperatura ambiente, se mezclaron en un tubo de reaccin 400g1 de la muestra con 100pi de reactivo LXI.. Las muestras se procesaron por duplicado, realizndose diluciones seriadas al 1/10 cuando contenan ms de 100 UE/ml.

3.2.4.3. Determinacin de endotoxina. Para medir ~os niveles de endotoxina se emple el mtodo cintico turbidimtrico LAL-5000. Se trata ce un mtodo automtico cuantitativo, con un rango lineal de 0.001 a 100 unidades de endotoxina (UE)/ml, que mide la turbidez del ensayo IAL en funcin de la densidad ptica cada 10 segundos. El tiempo de reaccin (TR) se dene como el tiempo que tarda la mezcla de la muestra y el reactivo LAL en conseguir una determinada turbidez (0.2 unidades de densidad ptica); es menor cuanto mayor sea la concentracin de endotoxina, existiendo una correlacin lineal entre el logaritmo del TR y el logaritmo de la concentracin de endotoxina. La concentracin de endotoxina de una muestra problema se obtiene al interpolar el log TR en la recta de calibracin obtenida con diluciones de un patrn valorado de concentracin estndar de endotoxina (OSE.). En todos los ensayos se emple como control negativo agua apirgena, y corno

68

controles positivos, una dilucin del patrn CSE de 0.01 ng/ini ( 0.125 UF/mi) y una muestra de suero al que se le aada una concentracin conocida de CSE, recuperando siempre el valor diana expresado 25% (agua) 50% (suero).

3.2.5.

EsTUDIO DEL ACLARAMIENTO DE ENDOTOXINA.

El aclaramiento de endotoxina se expres como ndice fagoctico (IF), determinado segn la frmula: log C1- log C2
-

IF=

*C1 y C2 representan las concentraciones de endotoxina en los tiempos T1 yT2.

3.2.6. ADMINISTRACION

DEL INMUNOMODULADOR.

La timoestimulina se administr por va intramuscular, en el msculo qudriceps posterior, a dosis de 6 mg/kg/da durante 7 das.

3.2.7. DISEO EXPERIMENTAL. Se establecieron cuatro grupos experimentales: 1) Grupo control (n=22): fue sometido a una laparotoma con el fin de obtener sangre portal para determinar la concentracin de endotoxina y realizar una esplenectoma para estudio de la funcin linfocitaria. Al mismo tiempo, se obtuvo una muestra de sangre sistmica para determinar la concentracin de los distintos parmetros bioqumicos, as como de endotoxina. La funcin linfocitaria se estudi en nueve animales y el aclaramiento (le endotoxina en cuatro. 2) Grupo blanco (n16): se someti a una primera laparotoma blanca en la que se disec la VI3P sin ligarla ni resecara. Adems, se tom una muestra de sangre sistmica para determinacin de endotoxina y parmetros bioqumicos. Siete das despus, se realiz una segunda laparotoma dumnte la cual se obtuvo sangre portal para determinar la endotoxina. Tantin se obtuvo sangre sistmica para determinacin de parmetros bioqumicos y endotoxina. La funcin linfocitaria se estudi en siete animales. 69

3) Grupo ictrico (n42): los animales fueron sometidos a una primera laparotoma en la que se lig y resec la va biliar principal. A continuacin, se llevaron a cabo los mismos pasos descritos en el grupo blanco. Se estudi la funcin linfocitana en 12 animales y el aclaramiento de endotoxina en seis. 4) Grupo teraputico (n= 14): se realizaron los mismos procedimientos que en el grupo anterior. Entre la primera y la segunda laparotoma, los animales fueron tratados con timoestinRlina (TP-1). Se estudi la funcin linfocitaria en siete animales y el aclaraniiento en cuatro.

3.2.8. MifroDo

ESTADSTICO.

3.2.8.1. Recepcin de casos. Se prepar un fichero con 53 variables por cada animal de experimentacin, empleando el programa dBASE 111+ (Borland). El fichero creado se export con el programa DBMSCOPY
+

(Conceptual Software) a formato BMDP.

3.2.8.2. Depuracin. Se emple el mdulo 4D del programa BMDP

y

7.0 para realizar la depuracin

inicial de los datos. Posteriormente, se obtuvo descriptiva ampliada mediante el mdulo 2D para la depuracin estadstica.

3.2.8.3. Estadstica descriptiva. De las variables cualitativas se obtuvieron frecuencias absolutas, relativas y acumuladas. De las variables cuantitativas se obtuvieron, globalmente y por grupos, la media, desviacin tpica, error estndar de la media, coeficiente de variacin, mximo y mnimo, mediana y cuartiles, intervalo intercuartlico medio, coeficientes de asimetra y curtosis, y estimaciones robustas de la media.

3.2.8.4. Estudio de distribucin. Se estudi la distribucin a fin de obtener una distribucin terica ajustable para el anlisis de los cIatos. El ajuste de las variables a la distribucin gaussiana se 70

verific por medio del test de Shapiro-Wilks. La distribucin de la varianza (homoscedasticidad) se estudi mediante el test de Levene. En caso de detectarse diferencias estadsticamente significativas con la distribucin gaussiana, se utilizaron mtodos no paramtricos. En los casos en que la variable no se ajust a una distribucin gaussiana, se emplearon los grficos diagnsticos de Box-Cox a fin de encontrar una transformacin que normalizara y estabilizara las varianzas. Se encontr que en las CPM, lE y RR, la transformacin mediante logaritmos en base 10 produca un buen ajuste. Una vez repetida la prueba de Shapiro-Wilks, se decidi emplear esta transformacin en dichas variables. Para aquellos casos en los que no se encontr ajuste vlido, se decidi el empleo de pruebas no para mtricas.

3.2.8.5. Estadstica analtica. 3.2.8.5.a. Anlisis intragrupo. Se utiliz el test de Kruskal-Wallis, con correccin segn tamao de muestra, como alternativa no paramtrica para el estudio de las variables que no se ajustaron a la curva de Gauss. En los casos en que fue positivo, se obtuvo la comparacin mltiple de medias mediante el test de Wilcoxon con correccin de Bonferroni para evitar el aumento del error alfa debido a comparacin mltiple de hiptesis. Para las comparaciones 2 a 2 pareadas, que fueron planeadas a priori, se emple la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney. En los casos en que se verific ajuste a la curva de Gauss, se aplic el anlisis de la varianza. Al deshacer la transformacin logartmica, se obtuvo media geomtrica y no aritmtica.

3.2.8.5,b. Anlisis intergrupo.

Para las variables no gaussianas, se emple el test de Knskal-Wallis y comparacin mltiple de medias por medio del test de Wilcoxon-Mann-Whitney con correccin de Bonferron. Para las variables con ajuste a la distribucin gaussiana se 71

emple el modelo mixto de anlisis de la varianza para datos repetidos, con una covariante cuando se estudiaron CPM, lE y RR (covariante
=

concentracin de

Con A) y tamaos de xmestra desiguales y el anlisis de la varianza con la correccin de Welch y Brown-Forsythe. La comparacin mltiple de medias se realiz empleando el test de Tukey y Bonferroni.

72

LV. RESULTADOS
4.1. ALTERACIONES PONDERALES.

En la tabla figuran los datos referentes a edad, sexo y peso de los animales en los distintos grupos ce experimentacin. La diferencia ponderal entre el peso inicial, antes de la primera laparotoma, y el peso final, una semana despus, no fue estadsticamenre significativa (es.) en el grupo blanco ni en el grupo teraputico, pero s en el grupo ictrico.

4.2. ALTERACIONES DE PARAMETROS I3IOQUIMICOS ITEPATICOS 4.2.1. GRtwo

CONTROL.

Los resultados aparecen en la tabla II. No se observaron diferencias es. entre este grupo y el resto de los grupos de experimentacin antes de la primera laparotoma para actuar sobre la va biliar

4.2.2. Gnu~o

BLANCO.

No existieron diferencias es. en los valores de los parmetros hepticos antes y despus de manipular la va biliar.

4.2.3. GRupo

ICTERICO.

En este grupo, los parmetros hepticos se elevaron, de forma e.s., despus de ligar la va biliar (v0.OI). Las diferencias, en ese momento, fueron tambin e.s. con respecto al grupo control (p<O.OI) y al grupo blanco (p<O.ol).

4.2.4. GRUFO

TIZRAPEUTICO.

Como en el grupo ictrico, el valor de los parmetros hepticos se elev, de forma es., con respecto al obtenido antes de ligar la va biliar (p<0.Ol). No hubo diferencias es. entre ambos grupos despus de provocar la obstruccin biliar

73

4.3. ALTERACIONES DE LAS CIFRAS DE CREATININA EN SANGRE 4.3.1.

GRUPO CONTROL.

Los resultados aparecen en la tabla II. No existieron diferencias e.s. en las cifras de creatiina en sangre, entre este grupo y el resto, antes de actuar sobre la va biliat

4.3.2. GRUPO

BLANCO.

Se produjo una elevacin es. de la cifra de creatinina en sangre despus de la intervencin en la que se nunipul, sin ligar, la va biliar (p<O.Ol).

4.3.3. Gnu~o

ICTERJCO.

Despus de ligar la va biliar aument, de forma es., la cifra de creatinina en sangre (p<C.0l).

4.3.4.

GRUPO TERAPEUTICO.

En este grupo se elev la cifra de creatinina, de forma es., despus de ligar la va biliar (p<O.OI). La cifra obtenida tras la internpcin del flujo biliar fue inferior, aunque no de forma es., con respecto a la del grupo ictrico.

4.4. RESPUESTA DE LINFOCITOS T A CONCANAVALINA A

4.4.1.
GRUPO CONTROL.

En este grupo, el lE aument progresivamente con la dosis de Concanavalina A, obtenindose un valor mximo a la concentracin de 1 ~ig/m1y disminuyendo con concentraciones superiores (Figura 1) (Tabla III).

4.4.2.

GRUPO BLANCO.

La evolucin del lE en el grupo blanco para las distintas dosis del mitgeno fue similar a la del grupo control, no existiendo en ningn momento diferencias e.s. (Figura 1) (tabla III). Los valores de la liR en este grupo aparecen en la tabla IV y estn representados en la figura 2.
74

4.4.3. Gpupo

ICrERICO.

Los valores de E fueron siempre inferiores, de forma es., a los del grupo control (Figura 1) (Tabla III). La RR fue siempre inferior a la del grupo blanco para todas las concentraciones de mitgeno, siendo las diferencias e.s. para concentraciones de lggr/ml y 2igr/mi, respectivamente (Figura 2) (Tabla IV).

4.4.4.

GRLIPO TERAPEUTICO.

Como ocurri en el grupo blanco, no existieron diferencias e.s. con respecto al grupo control en los valores del E. Estos, a su vez, fueron siempre superiores, de forma e.s. (p<O.05 para 0.5 vgr/ml de Con A y p<0.0l para el resto), a los del grupo ictrico (Figura 1) (Tabla III). La RR fue siempre superior a la del grupo blanco, siendo las diferencias es. hasta concentraciones del ngeno de 1~gr/ml. Con respecto al grupo ictrico, la RR fue superior, de forma es., en todos sus valores (p<O.05 para 1.5 vgr/ml de Con A y p<0.Ol para el resto) (Figura 2) (Tabla IV).

4.5. NIVELES DE ENDOTOXEMIA PORTAL

4.5.1.

GRUPO CONTROL.

Los resultados aparecen en grupo fue

la tabla V.

La cifra

de endotoxemia portal en este

de 0.130.02 UF/ml.

4.5.2.

GRUPO BLANCO.

La endotoxemia portal, una semana despus de manipular la va biliar, fue inferior a los lmites de deteccin del ensayo.
control. No existieron diferencias es. con

el grupo

4.5.3. GRUPO ICTERICO.

La endotoxemia portal, una semana despus de ligar la va biliar, fue superior, de

forma es., a

la de los gnpos blanco y Control (p< 0.05).

15

4.5.4. GRUPO TERAPEUTICO.

No existieron diferencias es. en la endotoxemia portal, con respecto a los gru-

pos blanco y control, despus de ligar la va biliar. Fue, adems, inferior a la del
grupo ictrico, acercndose esta diferencia a la significacin estadstica.

4.6. NIVELES DE ENDOTOXEMIA SISTEMICA

4.6.1. GRUPO CONTROL. Los resultados aparecen en la tabla VI. Los niveles de endotoxemia sistmica en este grupo fueron cercanos al lmite de deteccin del ensayo empleado. No existieron diferencias es. con el resto de los grupos antes de que en ellos se manipulara o tigara la va biliar.

4.6.2. GRUPO BLANCO.

No se observaron diferencias e.s. entre los niveles de endotoxemia sistmica existentes antes y despus de manipular la va biliar Tampoco existieron diferencias es. entre la endotoxemia portal y sistmica despus de la manipulacin.

4.6.3. GRUPO ICrERJCo.

Se produjo un aumento es. (p<O.OS) de los niveles de endotoxemia sistmica despus de ligar la va biliar; los obtenidos despus de provocar la obstruccin

biliar fueron inferiores, de forma e.s. (p<0.0l), a los de endotoxemia portal.

4.6.4. GRUPo TERAPEUTICO.

No existieron diferencias es. entre los niveles de endotoxemia sistmica antes y despus de ligar la va biliar. Los niveles obtenidos despus de ligar la va biliar fueron inferiores, aunque no de forma es., a los de los grupos blanco e ictrico. No hubo diferencias es. entre los niveles de endotoxemia portal y sistmica despus de la obstruccin biliar.

76

4.7. ACLAiRAMIENTO DE ENDOTOXINA

4.7.1. GRuPo CONTROL. El ndice fagoctico medio (IP) en este grupo fue de 0.056. Los aclaramiento de
los cuatro animales estudiados aparecen representados en la figura 3.

4.7.2. GRUPO ICIERKo,

Este grupo present un IP de 0.032, valor inferior al grupo control. Los aclaramientos aparecen representados en la figura 4..

4.7.3. GRUPO TERAPEUTICO. El IP, de 0.092, fue superior al grupo ictrico y al grupo control. Los aclaramientos estn representados en la figura 5.

77

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a,
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*

79

p<0.05 con respecto a grupo contro.

LOG (10) lE
[ConA]pg/m 0,2 0,5 1.530.18 1.87 0.10 0.530.17 1.230,14 1 1.680.15 2.04 0.06 0.560.16 1.580.11 1,5 1.500.24 1.360.08 0.320.15 1.580.07 2 1.47 0.25 1.68 0.14 0.130.10 1.16 0.12 GRUPO CONTROL 1.120.25* (n 91 GRUPO BLANCO 1.630.16 (n=7) GRUPO KTERICO 0.580.14 (n= 12) GRUPO TERAPEIJTICO 0.750.24 (nr 7) * Media error estndar.

80

pc0.05 con respecto al grupo blanco ** p<0.Ol con respecto al grupo blanco
*

LOG (10) RR [Con Al j.ig/mI 0 0,2 0,5

1 1,5 2

GRUPO BLANCO ~0.30 (0.101* .0.93(0.32) -0.68 (0.17) -0.52(0.15> -0.65(0.12> .0.31 (0.22) (nr 7) GRUPO ICTERICO .e.m~ <0.13) 4,02 (0.31) 4.24 (0.21) 1.32 (0.27) -1.45 (0.36) -1.54 (0.30) (n 12) GRUPO TERAPEUTICO -0.18 (0.10) 0.46<0.10) -0.11(0.11> -0.10(0.11) .0.14(0.12) -0.54(0.21> (n r 7) * Media error estndar.

81

Endotoxemia portal (UE/ml) GRUPO CONTROL (a = 22) GRUPO BLANCO (n = 16) GRUPO ICTERICO (n = 42) GRUPO TERAPEUTICO (n = 14)
*

Significacin estadstica***

0.13 0.02* o.os** 2.32 0.56 0.24 0.07 ti S. pcO.01 N. S.

Media error estndar. ~ Niveles interiores al limite de deteccin del ensayo. *4* Significacin estadstica de las diferencias con respecto al grupo control.

Endotoxemia sistmica (1) GRUPO CONTROL (a = 22) GRUPO BLANCO (n = 16) GRUPO ICTERICO (n = 42) GRUPO TERAPEUTICO (a = 14) 0.15 0.03* 0.087 0.037 0.097 0.016 0.11 0.02

Endotoxemia sistmica (II)

Significacin estadstica444

0.05** 0.63 0.24 0.24 0.05

N. S. p<0.05 N. 3.

(1) Niveles de endotoxemia sistmica antes de ligar o manipular la va biliar. (II) Niveles de endotoxemia sistmica siete das despus de ligar o manipular la va biliar. * Media error estndar. ~ Niveles inferiores al lmite de deteccin del ensayo. *~* Significacin estadstica de las variaciones de los niveles de endotoxemia sistmica en los distintos grupos antes y despus de ligar o manipular la va biliar.

82

12

14

16

Tiempo (minutos) FIGURA

3. Aclaram lentos de endotoxna en el grupo control.

1000Endotoxlna logia (UE/n~ x 1000)

10

12

14

16

Tiempo (minutos) FIGURA

4. Aclaramientos de endotoxina en el grupo ictrico.

FIGURA

5. Aclaramientos de endotoxina en el grupa teraputico. 83

y. DISCUSION
El objetivo del estudio realizado se centr en determinar el efecto teraputico que la estimulacin de los linfocitos T pudiera ejercer sobre la depresin del sistema inmune secundara a la obstruccin biliar y sus consecuencias. Esto requera un modelo experimental fcilmente reproducible. Por ello se escogi corno animal de experimentacin la rata, que es estandarizable en cuanto a sexo, gentica y alimentacin (88). La tcnica empleada para interrumpir el flujo biliar, mediante ligadura y exresis de una parte de la va biliar (193), fue efectiva en todos los animales en los que se realiz, como lo demostr la ictericia conjuntival y los niveles de bilirrubina alcanzados a la semana de la intervencin, similares a Jos de otros trabajos (80). Este modelo ha sido utilizado ampliamente en la investigacin de las alteraciones fisiopatolgicas de la ictericia obstructiva (79). El intervalo de tiempo escogido para llevar a cabo las distintas determinaciones, despus de haber ligado la va biliar, fue de una semana. Se ha comprobado que es suficiente para que la bilirrubina alcance, en ratas, su meseta y se alteren el resto de los parmetros estudiados (10) (80) (201) (243), sin que a la vez se produzcan cambios histolgicos irreversibles y en la circulacin portal (134). La determinacin de los niveles de endotoxina, al tratarse de un estudio comparativo, exiga la utilizacin de un mtodo cuantitativo; por ello se descart la posibilidad de emplear el ensayo de gelificacin, que es cualitativo. Tanto el ensayo turbidimtrico como el cromognico son cuantitativos, puesto que las lecturas se realizan mediante un lector ptico. Se emple el ensayo turbidimtrico por tener varias ventajas sobre el cromogenico: presenta un mayor rango de lineali dad en la cuantificacin de enclotoxina; tiene mayor sensibilidad para manejar diluciones altas de las muestras, con lo que se atena el efecto interferente de diversos componentes del plasma; emplea los reactivos naturales sin la adicin de otros sustratos sintticos; el margen de pH en el que se desencadena la reaccin es ms amplio (pH 6-8); es ms econmico; la reaccin tiene lugar en ambos de vidrio, mientras que el cromognico utiliza microplacas de plstico, no pudiendo asegurar la apirogenicidad ce los 96 pocillos; por ltimo, el turbidimtrico permi-

84

te cuantificar individualmente cada tubo, mientras que en el cromognico Ja reaccin se activa para todos los pocillos simultneamente, existiendo un error de tiempo desde que se aade el reactivo al rimer pocillo y al ltimo (256). La funcin linfocitaria se determin mediante el estmulo de poblaciones de linfocitos T con el mitgeno Concanavalina A. Este mtodo ha sido utilizado anteriormente, detectndose una depresin de la reactividad linfocitaria en los primeros das tras la obstruccin biliar (122) (135). La estimulacin se llev a cabo con distintas dosis del mitgeno, ya que la respuesta de los linfocitos puede ser diferente en funcin de esta variable. El estudio del aclaramiento de endotoxina, no previsto en el protocolo inicial, se realiz en un nmero relativamente escaso de animales. Por este motivo no se pudo hacer anlisis estadstico, pero los ndices fagocticos obtenidos muestran diferencias entre los mismos que nos parece interesante exponer La capacidad fagocitaria del sistema mononuclear-fagoctico ha sido estudiada, tanto en ensayos clnicos como en experimentacin animal, con sustancias como albmina (108), carbn coloidal (172) (173), bacterias (26) (31) (68) (103) (185) (222) (323), partculas de ltex (80) y otros (348). La mayora de estas partculas son captadas por clulas del SMNF, as como por clulas endoteliales y parenquimatosas, mientras la endotoxina lo es, casi exclusivamente, por las primeras. La dosis administrada debe ser lo suficientemente alta como para no estimar el flujo sanguneo heptico ms que la funcin del SMNF (218) (258) (285). La timoestimulina, inmunomodulador utilizado en el grupo teraputico, tiene una accin estimulante sobre las poblaciones de linfocitos T en enfermos inmunodeprimidos (119) (120) (121). En un modelo experimental de peritonitis, utilizado por nuestro grupo, se observ un aumento de la quiniiotaxis de los macrfagos, y probablemente de su capacidad fagocitada, en ratas tratadas con este frmaco (224). La dosis administrada se determin en base a la empleada en este ultimo estudio y a la farmacocintica del principio activo (36) (118), ya que no se haba usado previamente este inmunomodulador en un modelo de obs truccin biliar.

85

En todos los grupos laparotomizados hubo un aumento significativo en los niveles de creatinina. Este aumento fue mayor en el grupo ictrico que en los grupos blanco y teraputico Son varios los factores que pueden contribuir a las alteraciones de la funcin renal en el curso de la ictericia obstructiva. Se ha descrito una respuesta hipotensiva anormalmente alta a la deplecin de volumen en humanos y animales con obstruccin biliar. Existe mayor reactividad vascular en el rin a la accin de las catecolaminas, lo que contribuye a un menor flujo renal total y a una redistribucin en detrimento del flujo cortical. El sistema renina-angiotensina no parece estar implicado en estos cambios. El aumento de la produccin de prostaglandinas podra compensar inicialmente estas alteraciones. La bilirrubina inhibe la fosforilacin oxidativa mitocondrial. La bilis parece tambin alterar la funcin tubular del rin. Estos cambios pueden potenciar los efectos de la isquenMa en el rin (72) (259) (332). Pero aparte de lo expuesto en el prrafo anterior, quizs sea la endotoxina la que ms influencia tenga en el desencadenamiento de un fracaso renal durante el postoperatorio de enfermos intervenidos por obstruccin biliar. Wardle y Wright (374) observaron que la administracin de una dosis alta de endotoxina provocaba la muerte de ratas ictricas, con importantes depsitos de fibrina en los vasos renales. Trabajos ms recientes de los mismos autores (372) (373) y otros investigadores (383) demuestran la relacin ce la endotoxemia con la aparicin del fallo re-

nal, fundamentalmente a travs de alteraciones de la coagulacin similares a las

que se producen en el fenmeno de Sanarelli-Shwartzman (77). El mecanismo por el cual la enclotoxina deseneadena una coagulacin intravas cular en individuos ictricos, sobre todo a nivel renal, se basa en un desequilibrio entre la produccin de tromboxano A2, que es vasoconstrictor y agregador paquetario, y la de prostaciclina, con accin vasodilatadora e inhibidora de la agregacin plaquetaria. Al mismo tiempo, se activa la va intrnseca ce la coagulacin y se inhibe la fibrinolisis debido al dao causado en las clulas endoreliales por la bilirrubina, sales biliares y la propia enclotoxina (125). A estas~ ~q1teracionestambin puede contribuir la accin vasoconstrictora de catecolaminas producidas por 86

estmulo de la endotoxina (74) (368), y la elevacin de a-1-antitripsina observada en individuos ictricos (125). Aunque las diferencias en los niveles de creatinina no eran significativas entre los distintos grupos, es posible que si lo fueran para el grupo ictrico ante una situacin de stress. Los resultados obtenidos muestran que, a la semana de haber interrumpido el flujo biliar, en el grupo ictrico sin tratamiento con tirnoestimulina existe una depresin de la respuesta (le linfocitos T a mitgenos con diferencias estadsticamente significativas respecto a los grupos blanco y control. Feduccia et al (122) observaron, en un modelo similar al empleado en este trabajo, que la respuesta a Concanavalina A y otros mitgenos apareca, ya, deprimida a los tres das de haber ligado la va biliar. Otros autores han obtenido resultados similares en ratas (309) y en conejos (365). No se ha visto que la obstruccin biliar produzca alteraciones en la funcin de los linfocitos 13(305) (306) (309) (310). Fraser et al (135), en un estudio llevado a cabo en perros, no pudieron demostrar alteraciones en la funcin de ambas poblaciones linfocitarias dos o tres semanas despus de haber ligado la va biliar. Aunque la depresin de los linfocitos T es, como se ha expuesto, un hecho constatado por la mayor parte de los autores, no se conoce claramente cul o cules pueden ser los factores etiopatognicos que la determinan. Los resultados de alguno ce los estudios citados (309) y
dic

otros trabajos (4) (83) (151) (157)

(172) no demuestran que el deterioro del estadIo nutricional, observado en individuos ictricos, contribuya a la misma. En nuestro estudio, la diferencia ponderal entre el peso inicial, antes (le ligar o manipuJar la va biliar, y peso final, una semana despus, era es. en el gRipo ictrico pero no en Los grupos blanco ni teraputico. Estos hallazgos ~odlri~ti~ indicar que la depresin inmunolgica, ms que una consecuencia de la desnutricion sea, junto a otros factores, la causa de la prdida significativa dle peso en los animales ictricos. Algunas de los mediadores liberados por los macrfagos tras el estimulo de la endotoxina, corno el TNF, estn implicadlos en procesos catablicos que )odlria justificarla (355). Newberry et al (244) observaron que el suero de enfermos con ictericia obstructiva inhiba la respuesta a mitgenos de los linfocitos humanos. Sin embargo, 87

esta inhibicin no se produca si aquel proceda de enfermos a los que se haba practicado un drenaje biliar siete das antes. Parece, por tanto, probable la existencia de un factor o factores plasmticos que pudieran ser los responsables de la depresin inmunolgica. Aquellos con los que se especula, pueden sintetizarse en dos que determinan planteamientos fisiopatolgicos distintos. Por un lado, estara el posible efecto txico de los componentes biliares. Los linfocitos humanos preincubados con bilirrubina no conjugada tienen una menor repuesta a mitgenos (302) (313) (338). Giani et al (148) vieron las mismas alteraciones cuando los linfocitos se incubaban con cidos biliares, aunque las concentraciones que se requeran eran mucho mayores que las que existen in vivo Ms recientemente, Greve et al (157) han observado que la supresin de la inmunidad celular no se produce cuando se liga la va biliar en ratas libres de grmenes. Sin embargo, la administracin crnica de endotoxina a estos animales y a ratas normales da lugar a la misma depresin inmunolgica que en las ictricas. Estos autores proponen que la causa podra ser la secrecin de TNF por macrfagos activados por la endotoxina (154) (156) (158). Este efecto depresor de la inmunidad, mediado por los macrfagos ha sido descrito en otras circunstancias por Eliner et al (113) y Marshall et al (216). Es posible que ninguna de las dos vas etiopatognicas propuestas acte de forma excluyente, aunque una de las dos sea la que produzca las alteraciones ms precozmente. En el grupo de ratas con obstruccin biliar a las que se trat con timoestimulina, la respuesta de los linfocitos T a la Concanavalina A no presentaba diferencias es, con respecto a los controles. Con cualquiera de los procesos etiopatognicos anteriormente diescritos puedle jIlstificar el efecto teraputico de la timoestimulina, ya que es, por un lacIo, capaz ce evitar la translocacin de endotoxinas y, en el caso de que la depresin del sistema inmune comenzara por la accin de los componentes biliares, la timoestimulina es especialmente activa en inmunoclefi ciencias primarias y secundarias (119) (120), por lo que podra recuperar la funcin de linfocitos deprimidos por sales biliares o bilirrubina. En el estucho realizado, los niveles ce enclotoxemia poitil en el grupo control

88

fueron muy bajos, aproximndose a los lmites de deteccin del ensayo. No se determin la endotoxemia portal en el resto de los grupos antes de manipular o ligar la va biliar, ya que la manipulacin de la vena porta, dado su pequeo calibre, poda producir alteraciones que interfirieran las determinaciones en la segunda laparotoma. La manipulacin de la va biliar, realizada en el grupo blanco, no produjo diferencias es. de los niveles de endotoxemia portal con respecto al grupo control. El grupo ictrico, una semana despus de ligar la va biliar, presentaba nrveles de endotoxemia portal superiores, de forma e.s., a los del grupo control. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Clements et al (80). De la revisin de la literatura, puede deducirse la importancia que los componentes biliares tienen en el control de la proliferacin y translocacin de bacterias y endotoxinas. Deitch et al (97) han visto, en estudios llevados a cabo en ratas, que una semana despus de ligar la va biliar se produce un aumento significativo de la flora gram negativa en la luz del ciego. Adems, la concentracin de bacterias en los ganglios linfticos mesentricos es superior a la de los controles. Rudbach et al (314) observaron que el desoxicolato sdico desintegraba, in vitro,la endotoxina y abola algunos de sus efectos biolgicos y, Kocsar et al (194), que esta sal biliar era capaz de inhibir la absorcin ce endotoxinas en ratas. De otros estudios, tambin se puede deducir el papel de las sales biliares en el equilibrio de la flora intestinal (126) (279). La Ig A-S es segregada en roedores, fundamentalmente, a travs de la bilis, por lo que la obstruccin biliar puede disminuir, de forma importante, su presencia en la luz del tubo digestivo (225). En ratas normales, la administracin ce grandes cantidades de endotoxina oral no produce efectos patolgicos (363). Estudios morfolgicos del proceso de translocacin en la mucosa intestinal, demuestran que la mayor parte de bacterias y endotoxinas pasan a travs del citoplasma de los enterocitos (7). Una vez en la lmina propia, pueden diftindirse libremente entre Las clulas cte la pared intestinal hasta alcanzar la serosa o ser captadas por los macrfagos distribuidlos entre los enterocitd)s, la lmina propia y las placas de Pcyer; despus son transportadas a los ganglios linfticos o pasan a los vasos sanguine-

89

os portales (28) (70) (267) (363) (377). Los fenmenos inflamatorios que Deitch et al (97) observaron en la lmina propia de la mucosa intestinal de ratas ictricas pueden ser debidos a la activacin de los macrfagos por la presencia de endotoxinas. Aunque, como se ha expuesto, el factor de mayor trascendencia para el inicio de la transiocacin, en el curso de la obstruccin biliar, puede ser el aumento de bacterias y endotoxinas motivado por la ausencia de componentes biliares, la desaparicin de los efectos trficos que la secrecin biliar tiene sobre la mucosa intestinal tambin podra favorecer la translocacin (13) (380). Owens y l3erg (268) vieron la relacin que exista entre los linfocitos 1 y la translocacin, al observar que esta aumentaba en ratones atmicos; esta alteracin era corregida con injertos de timo. Otros autores (17) observaron que estos animales tenan menor cantidad de clulas productoras de Ig A-S en el tubo digestivo. El tratamiento de ratones con agentes quimioterpicos, como el 5-Fluoruracilo, o inmunosupresores, como la ciclofosfamida, provoca la translocacin (33). Sin embargo, no siempre se ha podido demostrar que la supresin de la -actividad de las clulas T la aumente de forma significativa (206). En este mismo estudio, la inyeccin intraperitoneal dic IL-2 la redujo significativamente en ratas a las que se administraban grandes cantidades
dic

E. coil C25. Esto llev a concluir que, aunque los

linfocitos T tuvieran un escaso papel para evitar el movimiento bacteriano desde la luz intestinal hasta los ganglios linfticos mesentricos, si podan contribuir al control de las bacterias una vez transiocadas. El grupo (le ratas ictricas tratadas con timoestimulina no present diferencias significativas en los niveles de endotoxemia pon-al con respecto a los grupos blanco y control, pero fueron inferiores a las del grupo ictrico, estando esta diferencia en el lmite ce la significacin estadstica. Estos resultados coinciden con los de otros estudios (206) en los que se observ que la inmunoestirnulacin mespecfica sobre los linfocitos T puede controlar la translocacin. Son varios los mecanismos (te accin descritos para la timoestimulina, que pueden justificar el control que la misma ejerce sobre la translocacin de endotoxinas en ratas ictricas. Se sabe que aumenta la actividad de las clulas citotxicas o NK

90

(36) (223) (329) e incrementa, in vitro, la produccin de IL-2 e interferon gamma en linfocitos (223). El aumento de la secrecin de IL-2 podra activar la produccin de lg A-S (206). Se ha visto que la IL-2 produce una importante proliferacin de clulas NK en los ganglios linfticos mesentricos, aunque no es seguro que estas clulas puedan desarrollar actividad fagocitaria frente a bacterias y endotoxinas. El incremento de la produccin de interferon gamma puede aumentar la capacidad microbicida de los macrfagos mediante la induccin ce receptores a IL-2 en la membrana (47). Para llevar a cabo un anlisis de los resultados obtenidos en las determinaciones de endotoxemia sistmica y las pruebas de aclaramiento de endotoxina, es importante establecer, de acuerdo con los datos de la literatura, cules pueden ser las alteraciones del SMNF en el curso de una obstruccin biliar. Como se expuso en la introduccin, este sistema est constituido por macrfagos, que forman el grupo de clulas accesorias o presentadoras de antgenos dentro del sistema inmune (181). Las clulas de Kupffer representan el 85% de las mismas y desempean un papel importante en el aclaramiento de partculas y grmenes procedentes del tubo digestivo a travs de la circulacin portal (44). Drivas et al (108) observaron, en 1976, que la capacidad fagocitaria del SMNF, medida por el aclaramiento dIc microagregados de albmina, se encontraba disminuida en pacientes con ictericia obstructiva. Posteriormente, Ilolman et al (172) y Ding et al (103) han visto, en ratas, que esta alteracin se produce a partir de las dos semanas ce haber provocado la obstruccin biliar. Las bacterias que pasan el filtro heptico llegan al pulmn que, a pesar de tener capacidad para captarlas, tiene menor actividad bactericida (185). La incubacin de clulas de Kupffer en medlios con cidos biliares, bilirrubina y enclotoxina las altera morfolgica y fun cionalmente (5) (82) (331). De trabajos ms recientes, se desprendle que la actividad de las clulas de Kupffer, durante el curso de una obstruccin biliar, pasa por dlistintas fases que podran influir de forma importante en las alteraciones fisiopatolgicas de los enfermos ictricos. En condliciones normales, estos macrfagos se hallan en un microambiente

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caracterizado por bajos niveles de arginina, debido a que la enzima arginasa, responsable de la hidrlisis de arginina en ornitina y urea, presenta en hgado concentraciones 25 veces superiores al resto ce rganos. Esto permite la produccin, por las propias clujas de Kupffer, de PGE2 que inhibe la secrecin de TNF y, por tanto, sus efectos sistmicos contraproducentes (64). De esta forma, determinadas cantidades de endotoxina y otras partculas presentes en el flujo portal seran eliminadas, sin que ello produjera alteraciones sistmicas. Cuando a aquellas se las somete a un estmulo mantenido, pueden producir inmunosupresin mediada por TNF (211) (216), aumentar su capacidad procoagulante (326) y liberar intermediarios reactivos de oxgeno capaces de producir dao heptico (20). En la obstruccin biliar concurren, inicialmente, dos circunstancias que podran desencadenar lo descrito en el prrafo anterior. Por un lado, un mayor nivel de endotoxemia portal, como demuestran los resultados de este trabajo. Por otro, la posible disminucin de actividad de la arginasa como consecuencia de las alteraciones metablicas hepticas. As aumentara significativamente la secrecin de TNF capaz de producir la depresin del sistema inmune propuesta por Greve et al. (157). Se ha comentado que la capacidad de aclaramiento del SMNF aparece disminuida a partir de la segunda semana de ligar la va biliar en ratas (103) (172). Cements et al (80), utilizando un modelo con el que se estudi de forma selectiva la de las clulas de Kupffer, a distintos tiempos despus de interrumpir el flujo biliar, observaron que, aunque la hiperbilirrubinemia alcanzaba su meseta ya en la primera semana, el aclaramiento no slo no disminua sino que era ligeramente superior al de los controles. A pesar de ello, la endotoxemia sistmica apareci aumentada de forma significativa a los siete das, y se elev ms a partir de la segunda semana, momento en el que la depresin de las cluLas de Kupffer se hizo evidente, debida, quizs, a la accin negativa de sus propios mediadores y al efecto txico cte los componentes biliares. En el grupo ictrico, no tratadlo con timoestimulina, la enclotoxemia sistmica aument significativamente despus de ligar la va biliar y la endotoxemia portal fue,

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en ese momento, superior, de forma es., a la sistmica. La tendencia que se aprecia en el aclaramiento parece indicar que en este grupo est disminuido con respecto al grupo blanco. Estos ltimos resultados no coinciden con los del trabajo anteriormente citado (80), si bien en nuestro caso, el aclaramiento se mide en funcin del tiempo de desaparicin de una determinada dosis de endotoxina y no de la cantidad de partculas captadas por el SMNF heptico despus de ser inyectadas por va portal. Independientemente del estado de la capacidad de aclaramiento a la semana de ligar la va biliar, esta podra no ser la adecuada para eliminar toda la sobrecarga de endotoxinas que afluyen al hgado por va portal; ello explicara que, a pesar de existir una cierta eliminacin de enclotoxinas en el hgado, no se pueda evitar que la endotoxemia sistmica aumente de forma significativa. En los grupos blanco y el teraputico no aument significativamente, la endotoxemia sistmica. Tampoco existieron diferencias significativas entre los niveles de endotoxemia portal y sistmica en ambos grupos, siendo todos ellos muy bajos y prximos a los de deteccin del ensayo. Con niveles tan bajos niveles de endotoxina en sangre portal, parece poco lgico que se detecte en circulacin sistmica; sin embargo, este hallazgo, ya observado (80), puede estar justificado por la existencia de pequeas cantidades de la misma que pasan a la circulacin sistmica a travs de los linfticos, evitando as el hgado (71). Hay una tendencia similar en los aclaramientos del grupo blanco y grupo teraputico, por lo que es posible que la timoestimulina estimule, directa o indirectamente, los macrfagos de las ratas ictricas, hecho que se ha observado en la peritonitis experimental (224). En las ltimas dcadas, ha sido Posible operar procesos hepticos, biliares y pancreticos, causantes de obstruccin biliar, con tcnicas cada vez ms agresivas, que exigen una mejor preparacin de los enfermos. Creemos que los resultados presentadlos abren cl camino a nuevas posibilidades teraputicas para recuperar el sistema inmune antes ce la ciruga en los pacientes con ictericia obstructiva.

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VI. CONCLUSIONES
1) El modelo utilizado para producir la ictericia obstructiva, mediante ligadura y seccin de la va biliar, fue un modelo eficaz, en el que se elevaron significativamente los parmetros de colestasis a la semana de intermmpir el flujo biliar.

2) La obstruccin biliar produjo un descenso ponderal significativo en el grupo ictrico no tratado, pero no en el grupo tratado con timoestimulina. 3) Los niveles de creatinina en sangre se elevaron significativamente despus de la primera laparotoma para manipular o ligar la va biliar, siendo el aumento mayor para el grupo ictrico no tratado con timoestimulina. 4) La obstruccin biliar disminuy significativamente la respuesta linfocitaria a Concanavalina A en el grupo ce ratas ictricas no tratadas, pero no en los animales tratados con timoestimulina. 5) La obstruccin biliar produjo un aumento significativo de los niveles de endotoxemia portal en el grupo de ratas ictricas no tratadas, pero no en los animales tratados con timoestimulina. 6) La obstruccin biliar elev significativamente los niveles de endotoxemia sistmica en el grupo de ratas ictricas no tratadas, pero no en los animales tratados con timoestimulina. 7) La obstruccin biliar parece disminuir el aclaramiento de endotoxinas en el grupo ce ratas ictricas no tratadas, pero no en los animales tratados con timoestimulina.

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