Obtenção de Produtos Das Folhas de Copaifera Lagsdorfii Otimização Da Extração e Secagem ...

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Obteno de produtos a partir das folhas de Copaifera langsdorffii Desf.:
otimizao da extrao e secagem em spray dryer utilizando planejamentos
experimentais

Ana Rita de Mello Costa Machado

Ribeiro Preto
2011

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Obteno de produtos a partir das folhas de Copaifera langsdorffii Desf.:
otimizao da extrao e secagem em spray dryer utilizando planejamentos
experimentais

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas para a
obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

rea de concentrao: Medicamentos e Cosmticos.

Orientada: Ana Rita de Mello Costa Machado
Orientador: Prof. Dr. Lus Alexandre Pedro de Freitas

Ribeiro Preto
2011

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO POR QUALQUER MEIO, CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRFICA

Costa-Machado, Ana Rita de Mello
Obteno de produtos a partir das folhas de Copaifera langsdorffii Desf.: otimizao da
extrao e secagem em spray dryer utilizando planejamentos experimentais. Ribeiro Preto,
2011.
130 f.; 30 cm.

Dissertao de Mestrado apresentada Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro
Preto/ USP rea de concentrao: Medicamentos e Cosmticos.

Orientador: Freitas, Luis Alexandre Pedro de

1. Macerao dinmica, 2. Desejabilidade, 3. Cromatografia lquida, 4. Quercetrina, 5.
Afzelina

FOLHA DE APROVAO

Nome da aluna: Ana Rita de Mello Costa Machado
Ttulo: Obteno de produtos a partir das folhas de Copaifera langsdorffii Desf.: otimizao
da extrao e secagem em spray dryer utilizando planejamentos experimentais.

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas para a
obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

rea de concentrao: Medicamentos e Cosmticos.

Orientador: Prof. Dr. Lus Alexandre Pedro de Freitas

Aprovado em:
Banca Examinadora

Prof. (a) Dr.(a) _______________________________________________________________
Instituio:__________________________________Assinatura: ______________________
Prof. (a) Dr.(a) _______________________________________________________________
Prof. (a) Dr.(a) _______________________________________________________________

Dedicatria

Primeiramente, dedico este trabalho a Deus por me colocar a vista os simples e
maravilhosos milagres da vida e, com isso, me fazer acreditar que tudo
possvel.

Dedico este trabalho aos meus pais, Clia Ferreira de Mello Costa e Jos
Eugnio Costa, pelo amor, pacincia e respeito. Amo-os e sempre, sempre os
amarei!

A meu irmo, Alexandre, pela graa de existir e me querer to bem.

Dedico a alegria da concluso deste trabalho a meu bem, Guilherme Machado,
pela compreenso e pacincia quando no pude lhe fazer companhia para
poder fazer experimentos e escrever a dissertao, por me ouvir e compartilhar
minhas dificuldades, pelo apoio s minhas decises, por alegrar a minha vida
com a dele.

Agradecimentos

Agradeo especialmente ao Prof. Dr. Lus Alexandre Pedro de Freitas, pela orientao me
possibilitando clareza nos momentos de dvida juntamente com a concesso de autonomia
para direcionar meu trabalho. Agradeo tambm pela confiana, receptividade e acolhimento
ao longo destes 28 meses.

Agradeo aos Senhores Antnio Carlos Meda e Manoel Eduardo Tavares Ferreira, diretores
da Apis Flora, pela oportunidade concedida e possibilidade de realizar este trabalho.

Ao Prof. Dr. Jairo Kenupp Bastos, pela confiana e por me permitir participar de uma das
suas brilhantes pesquisas.

Profa. Dra. Simone de Pdua Teixeira e sua equipe, pelo auxlio na identificao e
localizao da rvore da espcie estudada.

Andresa Ap. Berretta e Silva, pela valiosa contribuio e pelas oportunidades
profissionais, alm de modelo de entusiasmo e motivao.

Paula Carolina Pires Bueno, minha colega e amiga, pela orientao valiosa, pelos
ensinamentos cientficos, profissionais e pessoais, pela amizade e felicidade de sua
companhia.

Ao Bruno mineiro, pela companhia, ajuda e suor (rsrs) para coletar as folhas da rvore, alm
de sua amizade.

Mirela Vaz, pelo auxlio ao desenvolvimento do mtodo cromatogrfico e pela amizade,
claro!

Ao amigo, Henrique Moretto, por me ensinar as malcias da vida e pela capa maravilhosa
desta dissertao.

Aos queridos colegas da Apis Flora, por fazerem do local de trabalho um segundo lar e pela
ajuda a este trabalho.

Aos funcionrios da Seo de Ps-Graduao, pela ateno.

Aos meus colegas do LADIFARP, pela ajuda, carinho e receptividade.

Agradeo ao apoio financeiro concedido pela Apis Flora, FINEP e FAPESP.

A todos que me auxiliaram e contriburam para a realizao deste trabalho.

i

RESUMO

Costa-Machado, A. R. M. Obteno de produtos a partir das folhas de Copaifera
langsdorffii Desf.: otimizaao da extrao e secagem por spray dryer utilizando
planejamentos experimentais. 2011. 130f. Dissertao (mestrado) Faculdade de Cincias
Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2011.

A planta brasileira Copaifera sp. uma rvore cujo leo tradicionalmente utilizado pela
populao principalmente como antiinflamatrio, analgsico e relaxante muscular justificando
o grande interesse cientfico em seu estudo. Entretanto, estudos tecnolgicos, fitoqumicos e
biolgicos sobre suas folhas so escassos. Assim, este trabalho props estudar e otimizar o
processo extrativo a partir das folhas de Copaifera langsdorffii Desf., alm de determinar as
melhores condies de secagem em spray dryer, j que formas farmacuticas slidas so mais
interessantes do ponto de vista mercadolgico e farmacotcnico e ambas as estapas so
fundamentais para o desenvolvimento de um futuro medicamento fitoterpico. As condies
timas de extrao e secagem em spray dryer foram obtidas atravs de diversos
planejamentos experimentais como o planejamento Box-Behnken, a inclinao ascendente e a
funo desejabilidade. Para obteno do extrato lquido atravs do processo de macerao
dinmica, objetivou-se maximizar as seguintes respostas: teor de slidos solveis e
flavonides totais e dos marcadores qumicos, quercetrina e afzelina. As condies timas de
extrao encontradas foram: massa de planta de 41 g, proporo etanol/ gua de 79GL,
tempo de extrao de 1 h, temperatura de extrao de 25C e velocidade de agitao de 600
rpm. No estudo do processo de secagem em spray dryer, foi realizado inicialmente um teste
preliminar onde oito diferentes excipientes disponveis foram estudados quanto s
caractersitcas fsico-qumicas entre elas fluidez, compactao e degradao dos marcadores
qumicos. As condies do equipamento foram: bico atomizador duplo fluido pneumtico
com orifcio de abertura de 1,2 mm que operou com vazo de ar de 40 L/min e presso de 5,0
bar; vazo do gs de secagem de 0,6 m
3
/min; temperatura de sada (Ts) de 80C e fluxo da
amostra (Ws) de 5,0 g/min. A proporo slidos do extrato lquido de C. langsdoffii:
excipiente foi de 3:1. Entre os excipientes estudados, o manitol foi o que forneceu o extrato
seco de C. langsdorffii com melhores caractersticas fsicas e fsico-qumicas e, por isso foi
utilizado no estudo seguinte, o planejamento Box-Behnken cujas variveis estudadas foram
concentrao da amostra (Cs), fluxo da amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts). Foram
avaliadas nove respostas das quais: densidade compactada, ngulo de repouso, ndice de Carr,
umidade absorvida, rendimento, eficincia de secagem, degradao de flavonides totais,
quercetrina e afzelina. Para obter a condio de secagem em que as nove respostas
apresentassem valores satisfatrios, utilizou-se a funo desejabilidade. Assim, as condies
de secagem para se obter o extrato seco de C. langsdorffii com boas caractersticas foram:
concentrao da amostra de 20,7% m/m, fluxo da amostra de 5 g/min e temperatura de sada
de 80C. Como resultado final deste trabalho, obteve-se um extrato lquido de C. langsdorffii
otimizado com teores mximos de slidos solveis e dos marcadores qumicos e um extrato
seco com propriedades fsicas, fsico-qumicas e farmacotcnicas adequadas para a obteno
de formas farmacuticas slidas.

Palavras-chave: macerao dinmica, desejabilidade, cromatografia lquida, quercetrina,
afzelina
ii

ABSTRACT

Costa-Machado, A. R. M. Obtainment of products from Copaifera langsdorffii Desf.
leaves: extraction and spray drying optimization by experimental designs. 2011. 130f.
Dissertation (Master) Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade
de So Paulo, Ribeiro Preto, 2011.

The Brazilian plant Copaifera sp. is a tree the oil of which is widely used in popular medicine
as an anti-inflammatory, analgesic and muscle relaxant, consequently it is the subject of huge
scientific interest. However, technological, phytochemical and biological studies regarding its
leaves are rare. Thus, this work aimed to study and optimize the extraction process from
Copaifera langsdorffii Desf. leaves, as well as to determine the best conditions for the spray
drying process, since pharmaceutical solid forms are more marketable and of
pharmacotechnical interests, with both steps being fundamental to the development of a future
phytomedicine. The best extraction and spray drying conditions were guided by several
experimental designs such as the Box-Behnken, the steepest ascent and the desirability
function. From liquid extract achievement through dynamic maceration, the purpose was to
maximize the following responses: soluble solids and total flavonoids contents and the
chemical markers, quercetrin and afzelin contents. The best extraction conditions found were:
plant mass of 41 g, ethanol/water proportion of 79GL, extraction time of 1 h, extraction
temperature of 25C and stirring speed of 600 rpm. In the spray drying study, a preliminary
test was accomplished, where eight different excipients were studied with regard to the
physicochemical features such as flowability, compaction and chemical marker degradation.
The equipment conditions were: a two-fluid pneumatic spray nozzle with an inlet orifice
diameter of 1.2 mm that operated on 40 L/min air rate and 5 bar pressure; 0.6 m
3
/min drying
air rate; 80C outlet temperature (Ts) and 5.0 g/min sample feed rate (Ws). The proportion of
C. langsdorffii liquid extract solids content: excipient was 3:1. Among the excipients studied,
mannitol provided the best physicochemical feature for C. langsdorffii dried extract, therefore
it was used in the following test, the Box-Behnken design, where the studied variables were
sample concentration (Cs), sample feed rate (Ws) and outlet temperature (Ts). Nine responses
were evaluated: tapped density, angle of repose, Carr index, humidity absorption, yield,
drying efficiency, total flavonoids and quercetrin and afzelin degradation. To obtain the
drying conditions where the nine responses presented satisfactory values, the desirability
function was used. Thus, the drying conditions to obtain a dried extract with good
physicochemical features were: sample concentration of 20.7% w/w, sample feed rate of 5.0
g/min and outlet temperature of 80C. As a final result of this work, an optimized C.
langsdorffii liquid extract presenting maximum soluble solids and chemical markers contents
and a dried extract presenting the appropriate physical, physicochemical and
pharmacotechnical properties to produce pharmaceutical solid forms were obtained.

Key-words: dynamic maceration, desirability, liquid chromatography, quercetrin, afzelin.

iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 Planejamento fatorial completo 2
2
com o total de ensaios e os fatores X
1
e X
2

codificados em nveis +1 e -1. .................................................................................................. 16
Tabela 1.2 Planejamento fatorial fracionrio 2
3-1
. ................................................................ 18
Tabela 1.3 Relao entre os fatores X
1
e X
2
no mtodo de inclinao.................................. 20
Tabela 3.1 Denominao codificada e no codificada dos fatores estudados no
planejamento fatorial fracionrio 2
5-2
e seus nveis alto +1 e baixo -1..................................... 30
5-2
com fatores codificados. X
1
= massa planta
(Mp), X
2
= proporo etanol/ gua (EA), X
3
= tempo de agitao (v), X
4
=temperatura de
extrao (T) e X
5
= velocidade de agitao (v).......................................................................... 30
Tabela 3.3 Fatores estudados no planejamento Box-Behnken e seus nveis +1, 0 e -1. ...... 31
Tabela 3.4 Planejamento Box-Behnken, com fatores codificados. X
1
= massa planta (Mp),
X
2
= proporo etanol/gua (EA) e X
5
= velocidade de agitao (v).......................................... 31
Tabela 3.5 Planejamento Fatorial Completo 3
2
, com fatores codificados. X
1
= massa planta
(Mp) e X
2
= proporo etanol/gua (EA). ................................................................................. 33
Tabela 3.6 Fatores estudados no Planejamento Fatorial Completo 3
2
e seus nveis +1, 0 e -
1. ............................................................................................................................................... 33
Tabela 3.7 Gradiente de eluio da fase mvel (%) no mtodo cromatogrfico.................. 35
Tabela 3.8 Volumes utilizados para a construo da curva analtica de quercetrina. .......... 36
Tabela 3.9 Volumes utilizados para a construo da curva analtica de quercetrina. .......... 36
Tabela 3.10 Fatores selecionados para a avaliao da robustez e seus valores. ................... 38
3-1
utilizado para avaliar a robustez do
mtodo cromatogrfico............................................................................................................. 39
Tabela 3.12 Lista dos excipientes utilizados no teste preliminar, seu fabricante ou
fornecedor e o respectivo lote................................................................................................... 41
Tabela 3.13 Fatores estudados no Planejamento Box-Behnken e seus nveis +1, 0 e -1. .... 42
Tabela 3.14 Relao entre ngulo de repouso e fluidez (USP XXX, 2008)......................... 43
Tabela 4.1 rea da quercetrina e do PI (cumarina) e razo entre elas e a concentrao
utilizada (n=3). ......................................................................................................................... 50
Tabela 4.2 rea da afzelina e do PI (cumarina) e razo entre elas e a concentrao utilizada
(n=3). ........................................................................................................................................ 50
iv

Tabela 4.3 Anlise estatstica das curvas analticas para obteno dos limites de deteco e
quantificao............................................................................................................................. 51
Tabela 4.4 Resultados do teor de quercetrina e afzelina no Extrato Lquido de C. langsdoffii
nas repeties no dia 1.............................................................................................................. 53
Tabela 4.5 Resultados do teor de quercetrina e afzelina no Extrato Seco de C. langsdoffii
Tabela 4.8 Resultados de varincia (S
2
) e do F
calc
para o teor de quercetrina e afzelina no
extrato lquido e extrato seco de C. langsdoffii. ....................................................................... 54
Tabela 4.9 Resultados para a recuperao do padro de quercetrina adicionado s amostras
de Extrato Lquido de C. langsdorffii....................................................................................... 55
de Extrato Seco de C. langsdorffii............................................................................................ 55
Tabela 4.11 Resultados para tempo de reteno (t
R
) da quercetrina e razo entre as reas de
quercetrina e do PI na anlise de robustez do mtodo cromatogrfico. ................................... 56
Tabela 4.12 Resultados para as respostas slidos solveis (SS), rendimento de slidos
solveis (0
SS
), flavonides totais (FT), quercetrina (Q) e afzelina (A) estudadas no
planejamento Box-Behnken para extrao a partir das folhas de C. langsdorffii Desf............ 62
Tabela 4.13 Valores de P obtidos da anlise estatstica para os fatores estudados na
extrao de quercetrina e afzelina das folhas de C. langsdoffii................................................ 68
Tabela 4.14 Determinao das condies de inclinao ascendente em direo regio
tima de flavonides totais. ...................................................................................................... 71
Tabela 4.15 Resultados das anlises de slidos solveis, rendimento de slidos solveis,
flavonides totais, quercetrina e afzelina para os pontos de inclinao ascendente (n=3)....... 71
solveis (0
SS
), flavonides totais (FT), quercetrina (Q) e afzelina (A) estudadas no
Planejamento Fatorial Completo 3
2
para extrao a partir das folhas de C. langsdorffii......... 72
Tabela 4.17 Previso dos valores para as respostas otimizadas na extrao a partir das
folhas de C. langsdorffii. .......................................................................................................... 74
Tabela 4.18 Resultados da caracterizao dos Extratos Lquidos utilizados na secagem. ... 75
Tabela 4.19 Resultados absolutos e degradao em porcentagem do teor de flavonides
totais, quercetrina e afzelina nos extratos secos de C. langsdorffii com diferentes excipientes
(n=1). ........................................................................................................................................ 85
v

Tabela 4.20 Tabela decisria com a pontuao dos extratos secos de C. langsdorffii com
seus respectivos excipientes. .................................................................................................... 87
Tabela 4.21 Resultados para as respostas densidade compactada (d
c
), ndice de Carr (IC),
ngulo de repouso (), rendimento (0), eficincia de secagem () e a degradao de
flavonides totais (
FT
) e dos marcadores qumicos, quercetrina (
Q
) e afzelina (
A
) estudadas
no planejamento Box-Behnken para secagem em spray dryer do extrato lquido de C.
langsdorffii. .............................................................................................................................. 89
Tabela 4.22 Valores estabelecidos para as respostas estudadas no processo de secagem para
realizar a funo desejabilidade.............................................................................................. 100
Tabela 4.23 Valores previstos para as respostas estudadas na secagem em condies
otimizadas............................................................................................................................... 101

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Representao das diversas etapas de desenvolvimento de um fitoterpico
(SIMES et al., 2001). ............................................................................................................... 2
Figura 1.2 Representao do trip a que se devem enquadrar os fitoterpicos (SIMES et
al., 2001)..................................................................................................................................... 3
Figura 1.3 Fotografia (A) da rvore, (B) das folhas nos galhos e (C) do tronco de Copaifera
langsdorffii Desf. na Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras no campus da USP de Ribeiro
Preto............................................................................................................................................ 5
Figura 1.4 Ilustrao da distribuio do gnero Copaifera (regio em verde)....................... 6
Figura 1.5 Estrutura qumica dos flavonis quercetrina e afzelina. ....................................... 7
Figura 1.6 Representao das formas farmacuticas originadas de drogas vegetais e suas
etapas de obteno (SIMES et al., 2001 com modificaes). ............................................... 11
Figura 1.7 Esquema dos fatores possivelmente envolvidos na extrao a partir de uma
droga vegetal (LIST e SCHMIDT, 1989)................................................................................. 12
Figura 1.8 Esquema grfico de um planejamento fatorial completo 2
2
(MYERS, 2003). ... 17
Figura 1.9 (A) modelo linear, (B) modelo quadrtico. (NIST/ SEMATECH, 2011). ......... 19
Figura 1.10 Esquema grfico do planejamento Box-Behnken com trs variveis e ponto
central (MYERS, 2003). ........................................................................................................... 19
Figura 1.11 Estruturas moleculares do manitol e sorbitol. ................................................... 24
Figura 1.12 Estrutura molecular da lactose monohidratada (ROWE, SHESKEY e OWEN,
2006). ........................................................................................................................................ 24
Figura 1.13 Estrutura molecular da unidade de maltodextrina (ROWE, SHESKEY e
OWEN, 2006). .......................................................................................................................... 25
Figura 1.14 Estrutura molecular da amilose e amilopectina do amido (ROWE, SHESKEY e
OWEN, 2006). .......................................................................................................................... 26
Figura 1.15 Estrutura molecular da celulose microcristalina (ROWE, SHESKEY e OWEN,
2006). ........................................................................................................................................ 26
Figura 1.16 Estrutura molecular do dixido de silcio coloidal (ROWE, SHESKEY e
OWEN, 2006). .......................................................................................................................... 27
Figura 3.1 Fotografia do LM MSD 0.5 (Labmaq do Brasil Ltda., Brasil) e seus sistemas
principais: 1) chave geral 2) controle do aquecimento; 3) controle de bombeamento de
lquido; 4) cmara de secagem 5) separador de p 6) indicador de temperatura de sada e 7)
frasco coletor (LABMAQ, 2003). ............................................................................................ 40
vii

Figura 3.2 Aparato utilizado para obteno do ngulo de repouso dos extratos secos. ....... 43
Figura 4.1 Distribuio granulomtrica das folhas secas e modas coletadas de C.
langsdorffii. .............................................................................................................................. 47
Figura 4.2 Cromatogramas de: (A) pico de PI (cumarina) na amostra de excipiente manitol;
(B) pico de PI na amostra de soluo hidroalcolica; (C) pico de PI e padro de quercetrina;
(D) pico de PI e padro de afzelina; (E) perfil do Extrato Lquido de C. langsdorffii; (F) perfil
do Extrato Seco de C. langsdorffii. PI (cumarina): t
R
= 40 minutos e
mx
= 277 e 309 nm;
Quercetrina: t
R
= 53 minutos e
mx
= 255 e 349 nm; e Afzelina: t
R
= 61 minutos e
mx
= 264 e
343 nm. ..................................................................................................................................... 49
Figura 4.3 Curva analtica e equao da reta para quercetrina............................................. 50
Figura 4.4 Curva analtica e equao da reta para afzelina. ................................................. 51
Figura 4.5 Diagrama para a resposta razo entre as reas de quercetrina e do PI na
avaliao de robustez do mtodo cromatogrfico. ................................................................... 57
Figura 4.6 Diagrama para a resposta tempo de reteno da quercetrina na avaliao da
robustez do mtodo cromatogrfico. ........................................................................................ 57
Figura 4.7 Diagrama para a resposta razo entre as reas de afzelina e do PI na avaliao de
robustez do mtodo cromatogrfico. ........................................................................................ 58
Figura 4.8 Diagrama para a resposta tempo de reteno da afzelina na avaliao da robustez
do mtodo cromatogrfico........................................................................................................ 58
Figura 4.9 Estimativa dos efeitos obtidos para cada fator estudado no planejamento fatorial
fracionrio 2
5-2
de acordo com as observaes: (A) slidos solveis; (B) rendimento de
slidos solveis; (C) flavonides totais, (D) teor de quercetrina e (E) teor de afzelina. Valores
positivos: e valores negativos:............................................................................................. 60
Figura 4.10 Superfcies de resposta para a extrao de slidos solveis em funo dos
fatores: (A) proporo etanol/ gua (EA) e massa de planta (MP); (B) velocidade de agitao
(v) e massa de planta (Mp); (C) velocidade de agitao (v) e proporo etanol/ gua (EA). Em
cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central. ................................................... 63
Figura 4.11 Superfcies de resposta para rendimento de slidos solveis em funo dos
fatores: (A) proporo etanol/ gua (EA) e massa de planta (MP); (B) velocidade de agitao
(v) e massa de planta (Mp); (C) velocidade de agitao (v) e proporo etanol/ gua (EA). Em
Figura 4.12 Superfcie de resposta para a extrao de flavonides totais em funo dos
fatores: (A) proporo etanol/ gua e massa de planta; (B) velocidade de agitao e massa de
planta; (C) velocidade de agitao e proporo etanol/ gua. Em cada superfcie, o demais
fator encontra-se no nvel central. ............................................................................................ 67
Figura 4.13 Superfcies de resposta para teor de quercetrina (A), (B) e (C) e afzelina (D),
(E) e (F) em funo dos fatores proporo etanol/ gua e massa de planta; velocidade de
agitao (v) e massa de planta (Mp); velocidade de agitao (v) e proporo etanol/ gua
(EA), respectivamente. Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central. ...... 69
viii

Figura 4.14 Superfcies de resposta representativas do Planejamento Fatorial Completo 3
2
:
(A) slidos solveis; (B) rendimento de slidos solveis. ....................................................... 72
Figura 4.15 Resultados da densidade compactada para os extratos secos de C. langsdorffii
obtidos por spray dryer contendo diferentes excipientes (n=3). .............................................. 76
Figura 4.16 Resultados do ndice de Carr para os extratos secos de C. langsdorffii obtidos
por spray dryer contendo diferentes excipientes (n=3). ........................................................... 77
Figura 4.17 Resultados do ngulo de repouso para os extratos secos de C. langsdorffii
Figura 4.18 Resultados do dimetro mdio de partcula para os extratos secos de C.
langsdorffii obtidos por spray dryer contendo diferentes excipientes (n=3). .......................... 79
Figura 4.19 Micrografia de MEV do extrato seco de C. langsdorffii obtido por spray dryer
a partir do Extrato Lquido a 2,5% m/m. .................................................................................. 80
Figura 4.20 Micrografia de MEV dos excipientes antes da secagem e dos extratos secos de
C. langsdorffii obtidos por spray dryer a partir do Extrato Lquido a 2,5% m/m contendo
diferentes excipientes. .............................................................................................................. 81
Figura 4.21 Resultados da umidade de equilbrio para os extratos secos de C. langsdorffii
Figura 4.22 Resultados do rendimento para os extratos secos de C. langsdorffii obtidos por
spray dryer contendo diferentes excipientes (n=1). ................................................................. 83
Figura 4.23 Resultados da degradao de flavonides totais, quercetrina e afzelina para os
extratos secos de C. langsdorffii obtidos por spray dryer contendo diferentes excipientes
(n=1). ........................................................................................................................................ 84
Figura 4.24 Superfcies de resposta para densidade compactada (d
c
) em funo dos fatores:
(A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra (Cs) e
temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e vazoda amostra (Ws). Em
Figura 4.25 Superfcies de resposta para ndice de Carr (IC) em funo dos fatores: (A)
vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra (Cs) e
Figura 4.26 Superfcies de resposta para ngulo de repouso () em funo dos fatores: (A)
vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra (Cs) e
Figura 4.27 Superfcies de resposta para rendimento do processo de secagem () em funo
dos fatores: (A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da
amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e vazoda
amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central...................... 95
ix

Figura 4.28 Superfcies de resposta para eficincia de secagem () em funo dos fatores:
(A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra (Cs) e
Figura 4.29 Superfcies de resposta para degradao de flavonides totais (
FT
) em funo
dos fatores: (A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da
amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e vazoda
amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central...................... 98
Figura 4.30 Superfcies de resposta para degradao de quercetrina (
Q
) em funo dos
fatores: (A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra
(Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e vazoda amostra (Ws).
Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central. ............................................ 99

x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Angnca Nacional de Vigilncia Sanitria
CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
EC European Comunity
HMG CoA Hidroxi- Metil- Glutarial co-enzima A
INMETRO Instituto Metrolgico
MSR Metodologia de Superfcie de Resposta
Rec. Recuperao
USP Universidade de So Paulo

xi

LISTA DE SMBOLOS

nvel de significncia
coeficiente
ngulo de repouso (graus)
fator de inclinao ascendente
GL graus em Gay- Lussac
A afzelina (mg/mL)
a coeficiente angular
b coeficiente linear
Cs concentrao da amostra
CV coeficiente de variao
d dimetro (mm)
d
50
dimetro mdio de partcula (m)
d
90
dimetro igual ou acima do qual compreende 90% do dimetro das partculas
(m)
d
b
densidade bruta (g/cm
3
)
d
c
densidade compactada (g/ cm
3
)
EA proporo etanol/ gua (GL)
FT flavonides totais (mg/mL)
g grama
h altura (mm)
IC ndice de Carr
LD limite de deteco
LQ limite de quantificao
m massa (g)
m
exc
massa de excipiente (g)
m
f
massa de extrato seco de Copaifera langsdorffii obtido aps secagem (g)
xii

m
i
massa de extrato de Copaifera langsdorffii inicial (g)
mL mililitros
Mp massa de planta (g)
PI padro interno
Q quercertina (mg/mL)
R
2
coeficiente de correlao linear
S desvio padro
S
2
varincia
SS slidos solveis (% m/v)
T temperatura de extrao (C)
t tempo de extrao (horas)
t
R
tempo de reteno (minutos)
Ts temperatura de sada (C)
UR umidade relativa (% UR)
UV ultravioleta
v velocidade de agitao (rpm)
vol volume (mL ou cm
3
)
VR valor real (ng/mL)
VT valor terico (ng/mL)
Ws fluxo da amostra (g/min)
X varivel independente codificada
X
1
varivel independente codificada para massa de planta
X
2
varivel independente codificada para proporo etanol/ gua
X
3
varivel independente codificada para tempo de extrao
X
4
varivel independente codificada para temperatura de extrao
X
5
varivel independente codificada para velocidade de agitao
X
6
varivel independente codificada para temperatura de sada
xiii

X
7
varivel independente codificada para fluxo da amostra
X
8
varivel independente codificada para concentrao da amostra
Y varivel independente
o
A
degradao de afzelina (%)
o
FT
degradao de flavonides totais (%)
o
Q
degradao quercetrina (%)
0 rendimento de secagem (%)
0
SS
rendimento de slidos solveis (%)
eficincia de secagem (%)

SUMRIO

RESUMO .................................................................................................................................... i
ABSTRACT ............................................................................................................................... ii
LISTA DE TABELAS ..............................................................................................................iii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................ x
LISTA DE SMBOLOS ............................................................................................................ xi

1. Introduo ........................................................................................................................ 1
1.1. Medicamentos Fitoterpicos ............................................................................................. 1
1.2. Desenvolvimento de um Fitoterpico ............................................................................... 1
1.3. Padronizao ..................................................................................................................... 3
1.4. Copaifera langsdorffii Desf. ............................................................................................. 5
1.4.1. Aspecto Qumico............................................................................................................ 5
1.4.2. Atividades Biolgicas..................................................................................................... 7
1.4.3. Aspectos Toxicolgicos.................................................................................................. 9
1.5. Formas Farmacuticas....................................................................................................... 9
1.6. Extrao........................................................................................................................... 11
1.6.1. Mtodos Extrativos....................................................................................................... 13
1.6.2. Agente Extrator............................................................................................................. 13
1.6.3. Massa de Planta ............................................................................................................ 14
1.6.4. Tempo, Temperatura e Agitao .................................................................................. 14
1.7. Planejamento Experimental ............................................................................................ 15
1.7.1. Metodologia de Superfcie de Resposta (MSR) ........................................................... 18
1.7.2. Inclinao Ascendente (Descendente).......................................................................... 19
1.7.3. Funo Desejabilidade.................................................................................................. 21
1.8. Secagem em Spray Dryer................................................................................................ 22
2. Objetivos ......................................................................................................................... 28
3. Materiais e Mtodos ....................................................................................................... 29
3.1. Droga Vegetal ................................................................................................................. 29
3.1.1. Obteno....................................................................................................................... 29
3.1.2. Caracterizao .............................................................................................................. 29
3.2. Extrao........................................................................................................................... 29

3.2.1. Procedimento................................................................................................................ 29
3.2.2. Planejamentos Experimentais....................................................................................... 30
3.2.3. Caracterizao Fsico-Qumica dos Extratos Lquidos ................................................ 33
3.2.4. Validao do Mtodo Cromatogrfico ......................................................................... 35
3.3.1. Equipamento................................................................................................................. 39
3.3.2. Extratos Lquidos Utilizados para Secagem................................................................. 40
3.3.3. Experimento Preliminar e Excipientes Estudados........................................................ 41
3.3.4. Planejamento Experimental.......................................................................................... 41
3.3.5. Caracterizao Fsico-Qumica dos Extratos Secos ..................................................... 42
4. Resultados e Discusso .................................................................................................. 46
4.1. Droga Vegetal ................................................................................................................. 46
4.1.1. Caracterizao .............................................................................................................. 46
4.2. Validao do Mtodo Cromatogrfico............................................................................ 47
4.2.1. Seletividade .................................................................................................................. 48
4.2.2. Linearidade e Curva Analtica...................................................................................... 49
4.2.3. Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ) .......................................... 51
4.2.4. Preciso......................................................................................................................... 52
4.2.5. Exatido........................................................................................................................ 55
4.2.6. Robustez ....................................................................................................................... 56
4.3. Extrao........................................................................................................................... 59
4.3.1. Planejamento Fatorial Fracionrio................................................................................ 59
4.3.2. Planejamento Box-Behnken ......................................................................................... 62
4.3.3. Inclinao Ascendente (Descendente).......................................................................... 70
4.3.4. Planejamento Fatorial Completo 3
2
.............................................................................. 71
4.3.5. Otimizao das Condies de Extrao........................................................................ 73
4.4.1. Caracterizao dos Extratos Lquidos utilizados na secagem...................................... 75
4.4.2. Experimento Preliminar................................................................................................ 75
4.4.3. Planejamento Box-Behnken ......................................................................................... 88
4.4.4. Otimizao das Condies de Secagem..................................................................... 100
5. Concluso ..................................................................................................................... 102
6. Referncias ................................................................................................................... 104

1
1. Introduo

1.1. Medicamentos Fitoterpicos
Apesar da imensa biodiversidade brasileira e ampla utilizao das plantas medicinais
no Brasil, o pas ainda deixa a desejar quando se trata do desenvolvimento e pesquisas de
plantas nativas para estabelecer sua qualidade, eficcia e segurana. Tanto , que apenas 26%
das espcies vegetais com registro na ANVISA so provenientes da Amrica do Sul
(CARVALHO et al., 2008). Entretanto, desde 1994, a regulamentao de plantas medicinais e
medicamentos fitoterpicos tem sido desenvolvida baseada nas leis europias e internacionais.
Desta forma, os requerimentos legais para registro de plantas medicinais e medicamentos
fitoterpicos demandam uma documentao completa contemplando dados de eficcia,
segurana e controle de qualidade considerando os fitoterpicos como produtos
industrializados que contenham a planta medicinal e/ou preparaes dela com substncias
bioativas com a finalidade de tratar, aliviar, prevenir ou diagnosticar doenas (CALIXTO,
2000; BRASIL, 2004).
Sabendo-se que no objeto de registro ou cadastro a planta medicinal ou suas
partes, aps processos de coleta, estabilizao e secagem, podendo ser ntegra, rasurada,
triturada ou pulverizada surgiu o Programa de Farmcia Vivas no nordeste do pas como
forma de atender populao carente. Entretanto, vale ressaltar que as plantas medicinais que
no passam por padronizao e no apresentam estudos de eficcia e segurana apresentam
maiores riscos de efeitos adversos ou mesmo de no apresentarem efeito teraputico
(BRASIL, 2004; SILVA et al., 2006).
1.2. Desenvolvimento de um Fitoterpico
De acordo com a legislao brasileira, o registro de um medicamento fitoterpico,
pode ser feito de acordo com a Lista de Medicamentos Fitoterpicos de Registro Simplificado
(BRASIL, 2008) ou, no caso de plantas que no estam comtempladas nesta lista, o registro
pode ser obtido atravs da apresentao de estudos sobre eficcia e segurana publicados em
literaturas recomendadas e que sejam suficientes para registro. Entretanto, para o
desenvolvimento de um medicamento fitoterpico inovador, diversos estudos devem ser
realizados e, assim apresentados no ato de pedido de registro (BRASIL, 2004).
Introduo | 2

O desenvolvimento de um medicamento fitoterpico segue as mesmas etapas para
qualquer tipo de medicamento. Afinal a diferena bsica entre eles est na origem da matria-
prima. O desenvolvimento de um medicamento fitoterpico requer muito menos recursos e
tambm menor tempo de pesquisa que um novo medicamento sinttico, cujo valor de
investimento pode chegar a mais de US$ 1 bilho e at 15 anos de pesquisa (PHRMA; 2011;
BIAZS, 2008). Isto devido ao vasto conhecimento popular no uso de plantas medicinais,
estimando-se que haja uma reduo dos custos no desenvolvimento do fitoterpico no
ultrapassando 2 a 3% do previsto para o desenvolvimento de um novo medicamento sinttico.
Ainda, de acordo com a Comisso E (1998), os medicamentos fitoterpicos tendo como
constituintes componentes ativos primrios, secundrios e coadjuvantes manifestam melhores
efeitos e atividade teraputica de maior amplitude que substncias isoladas (BLUMENTHAL
et al., 1998; BIAZS, 2008).

Figura 1.1 Representao das diversas etapas de desenvolvimento de um fitoterpico
(SIMES et al., 2001).

Alm disso, sabe-se que um medicamento inovador que chega ao mercado alcana
uma margem de lucro extraordinria, cria barreiras para competidores e um monoplio
temporrio adquirido por patentes (BIAZS, 2008).
Estudos etnobotnicos
Extratos e fraes da planta
Estudos
toxicolgicos
in vitro
Estudos
toxicolgicos
in vivo
Estudos
farmacolgicos
in vitro
Estudos
farmacolgicos
in vivo
Desenvolvimento de
mtodos analticos
Estudo
fitoqumico
Desenvolvimento
farmacotcnico,
padronizao
Estudos de estabilidade
preliminar, acelerada e
de longa durao
Estudos de
sazonalidade
da planta
Estudos clnicos de
Fase I, II e III
Registro do
fitoterpico e
comercializao
Estudos
toxicolgicos
in vitro
Estudos
toxicolgicos
in vivo
Estudos
farmacolgicos
in vitro
Estudos
farmacolgicos
in vivo
Desenvolvimento de
mtodos analticos
Estudo
fitoqumico
Desenvolvimento
farmacotcnico,
padronizao
de longa durao
Estudos de
sazonalidade
da planta
Estudos clnicos de
Fase I, II e III
Registro do
fitoterpico e
comercializao
Estudos
toxicolgicos
in vitro
Estudos
toxicolgicos
in vivo
Estudos
farmacolgicos
in vitro
Estudos
farmacolgicos
in vivo
Desenvolvimento de
mtodos analticos
Estudo
fitoqumico
Desenvolvimento
farmacotcnico,
padronizao
de longa durao
Estudos de
sazonalidade
da planta
Estudos clnicos de
Fase I, II e III
Registro do
fitoterpico e
comercializao
Estudos
agronmicos
Plantio
Produo
Estudos de Fase IV
Introduo | 3

Com o intuito de compreender melhor os altos investimentos requeridos para o
desenvolvimento de um medicamento fitoterpico inovador, apresenta-se as etapas de seu
desenvolvimento na Figura 1.1.
Como j discutido anteriormente, a legislao brasileira exige uma documentao
completa de qualidade, eficcia e segurana. O requisito qualidade assegurado atravs da
padronizao do medicamento fitoterpico e reprodutibilidade de produo; o requisito
eficcia remete aos testes farmacolgicos e a segurana garantida por testes toxicolgicos
(Figura 1.2) (SIMES et al., 2001).

Figura 1.2 Representao do trip a que se devem enquadrar os fitoterpicos (SIMES et
al., 2001).

1.3. Padronizao
Chs de plantas so tradicionalmente utilizados pela populao, muitas vezes at
com a finalidade de tratar doenas. Entretanto, esta tpica forma de uso e mesmo a planta em
si no so padronizadas podendo acarretar efeitos adversos ou falta de eficcia aos seus
usurios. Alm disso, os constituintes qumicos de uma espcie so altamente variveis de
acordo com a localizao geogrfica, sazonalidade, variaes climticas, alelopatia, entre
outros fatores. Devido aos possveis efeitos adversos, falta de eficcia e alta variabilidade do
material vegetal, tem-se dado nfase padronizao (ONG, 2004; CAPASSO et al., 2000;
BANKOVA, 2005; WANG et al., 2009; GURIB-FAKIM, 2006).
A Comunidade Econmica Europia publicou recentemente a Diretiva 2004/24/EC
(MHRA, 2011), referente padronizao das plantas medicinais. Esclarece que a qualidade de
produtos vegetais apenas pode ser garantida se as matrias-primas so definidas de maneira
rigorosa e detalhada incluindo a identificao botnica da planta utilizada, a regio

Testes toxicolgicos
Padronizao e
Reprodutibilidade
Testes farmacolgicos

Eficcia
Segurana Qualidade
Introduo | 4

geogrfica, as condies climticas e de colheita, assim como o preparo das amostras e as
tcnicas de extrao, separao e as tcnicas analticas. Muitas vezes, tornam-se interessantes
a combinao da padronizao qumica e ensaios biolgicos para correlacionar os
constituintes qumicos aos efeitos teraputicos da planta medicinal (ONG, 2004).
Geralmente, a padronizao qumica envolve a identificao dos constituintes ativos
ou marcadores da planta por anlise espectrofotomtrica ou cromatogrfica sendo que a
anlise qumica de extratos de plantas tem um papel importante no desenvolvimento de
medicamentos fitoterpicos (ONG, 2004; BANKOVA, 2005).
Assim, a padronizao permite garantir que haja a quantidade necessria dos
constituintes ativos ou dos grupos de constituintes ativos da planta e, quando aplicvel, que
seja controlada a quantidade de constituintes txicos. Desta forma, a padronizao torna-se
essencial para garantir a qualidade alm de permitir a reprodutibilidade do produto originado
da planta (CAPASSO et al., 2000; GURIB-FAKIM, 2006).
Alm disso, deve-se levar em considerao a concentrao e dosagem dos
constituintes qumicos nos produtos originados da planta. Tais constituintes quando ingeridos
em doses excessivas podem provocar efeitos adversos assim como os medicamentos
convencionais. Por outro lado, baixas doses podem no ter efeito teraputico. Devido alta
variabilidade do material vegetal, utiliza-se geralmente uma concentrao mnima ou uma
faixa de concentrao para os constituintes ativos ao invs de um valor exato assim como um
limite de concentrao mxima para os constituintes potencialmente txicos igualmente
necessrio (GURIB-FAKIM, 2006).
A padronizao essencial para que se inicie o desenvolvimento do fitoterpico e,
posteriormente, para realizar o controle de qualidade da produo deste medicamento. Este
procedimento inicia-se com o estudo fitoqumico da planta que o conhecimento e
quantificao dos grupos de constituintes qumicos e, mais rigorosamente, dos constituintes
qumicos em si caractersticos da planta estudada. Estes grupos de constituintes qumicos ou
os constituintes qumicos caractersticos da planta so chamados marcadores qumicos. Alm
disso, a padronizao deve ocorrer no processo produtivo, desde o plantio at a produo
industrial (ZHAO et al., 2010).
Desta forma, a padronizao possibilita que seja conhecida a constituio qumica
em relao aos ativos ou grupos de ativos principais, bem como o efeito do processo
produtivo sobre esta constituio qumica do produto originado da planta, seus efeitos
farmacolgicos e dosagem txica, alm de permitir que o produto final seja, lote-a-lote,
Introduo | 5

reproduzido com as mesmas caractersticas qumicas e fsico-qumicas, permitindo ento a
mesma intensidade teraputica sem apresentar efeitos adversos (ZHAO et al., 2010).
Finalmente, importante salientar que produtos vegetais padronizados fornecem
maior segurana e aumentam a confiabilidade do consumidor.
1.4. Copaifera langsdorffii Desf.
1.4.1. Aspecto Qumico
O gnero Copaifera pertence famlia botnica denominada atualmente como
Leguminaseae Juss. e sub-famlia Caesalpinioideae Kunth., sendo que a famlia botnica pode
ser encontrada na literatura com a denominao anterior: Fabaceae Lindley (SOUSA, 2011).
Algumas espcies tm denominao popular prpria tanto em portugus como,
eventualmente, em outras lnguas. No Brasil, as espcies de Copaifera so conhecidas como
copaba, copaibeira, pau-de-leo, copaba, copava, copiva. Em particular, a espcie
Copaifera langsdorffii Desf. denominada de copaba vermelha, leo vermelho ou copaba da
vrzea no Amazonas, copaibeira em Minas, cupiva ou podoi no Piau e no Cear e de oleiro
ou cabimo na Venezuela (CARVALHO, 2004; VEIGA JNIOR, 2005; VEIGA JNIOR e
PINTO, 2002).
As rvores de copaba so frondosas e de crescimento lento podendo apresentar de 5
a 40 m de altura. Suas folhas so compostas, pecioladas com fololos alternos ou sobpostos
(SOUSA, 2011; CARVALHO, 2004).

Figura 1.3 Fotografia (A) da rvore, (B) das folhas nos galhos e (C) do tronco de Copaifera
langsdorffii Desf. na Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras no campus da
USP de Ribeiro Preto.

(B
(C (A
Introduo | 6

As espcies do gnero Copaifera se distribuem pela Amrica do Sul e Central, com
citaes de ocorrncia na poro ocidental da frica. A espcie C. langsdorffii apresenta-se
nas regies norte, nordeste, sudeste, centro-oeste e parte da regio sul do Brasil, assim como
na Venezuela, sul da Bolvia, nordeste da Argentina, e norte do Paraguai. (CARVALHO,
2004; VEIGA JNIOR e PINTO, 2005; VEIGA JNIOR e PINTO, 2002).

Figura 1.4 Ilustrao da distribuio do gnero Copaifera (regio em verde).

Somente no Brasil, ocorrem mais de vinte espcies do gnero Copaifera utilizadas
com as mesmas aes teraputicas. Algumas espcies tm denominao popular prpria tanto
em portugus como, eventualmente, em outras lnguas. De maneira geral, o gnero Copaifera
tem infinitas denominaes que podem ser encontradas na literatura (CARVALHO, 2004;
VEIGA JNIOR e PINTO, 2005; VEIGA JNIOR e PINTO, 2002).
Na literatura consta que o leo da espcie de C. langsdorffii apresenta como
constituintes qumicos principais diterpenos tetracclicos da srie caurano como os cidos
kaurenico e kauranico (FERRARI et al., 1971), clerodanos como o cido hardwckiico
(OHSAKI et al., 1994) e labdnicos como o cido coplico (CASCON e GILBERT, 2000;
MACIEL et al., 2002) e sesquiterpenos, predominando -cariofileno, -bisaboleno, -
bergamoteno e -selineno (CARVALHO, 2004; VEIGA JNIOR, 2005; VEIGA JNIOR e
PINTO, 2002; VEIGA JNIOR et al., 2007).
J na composio qumica das folhas de C. langsdorffii apresentam-se 3% do
aminocido, N-metil-trans-4-hidroxi-L prolina e sesquiterpenos como o o-cubebeno, o-
Amrica do
Sul
frica
Ocident
Amrica
Central
Introduo | 7

copaeno, cipereno, -copaeno, cariofileno, -humuleno, muroleno, -selineno, o-cadineno e y-
cadineno encontrados nas fraes hexnicas (LANGENHEIM et al., 1986a, 1986b;
MACEDO e LANGENHEIM, 1989a, 1989b).
Sousa (2011) isolou e identificou majoritariamente quercetina-3-O-ramnosdeo e
canferol-3-O-ramnosdeo de fraes dos extratos brutos hidroalcolicos obtidos a partir das
folhas da espcie C. langsdorffii e os utilizou como marcadores qumicos para desenvolver e
validar um mtodo em CLAE para diferentes espcies deste gnero.
A quercetrina pode tambm ser denominada quercimelina, quercetina-3-ramnosdeo,
quercetina-3-O-ramnosdeo, quercetina-3-L-ramnosdeo, quercetina-3-O-o-L-ramnopiranosdeo e
a afzelina que pode tambm ser denominado canferol-3-ramnosdeo, canferol-3-O-
glucoramnosdeo, canferol-3-O-o-L-ramnopiranosdeo so flavonis glicosilados que foram
isolados e identificados em muitas outras fontes vegetais (THE PUBCHEM PROJECT, 2011).
A quercetrina uma molcula com peso moleular 448,38 g/mol, coeficiente de
partio de 0,216 e logP (octanol/gua) de -0,540. praticamente insolvel em gua fria,
moderamente solvel em gua quente e solvel em etanol. Seus comprimentos de onda
mximos, quando em etanol, so em 258 e 350 nm (THE PUBCHEM PROJECT, 2011).
A afzelina tem peso molecular 432,38 g/mol, coeficiente de partio de 0,811 e logP
(octanol/gua) de -0,146. No solvel em gua. (THE PUBCHEM PROJECT, 2011).

Figura 1.5 Estrutura qumica dos flavonis quercetrina e afzelina.

1.4.2. Atividades Biolgicas
Apesar da C. langsdorffii ter uma grande utilizao popular, os trabalhos cientficos
para confirmao de suas atividades biolgicas ainda so em pequena quantidade. Muitas
substncias deste gnero foram identificadas, mas ainda no est estabelecida a relao entre
R = H:
afzelina
O
O
O
O OH
OH
OH
HO
OH
OH
R
Introduo | 8

atividade e os componentes das diversas espcies. Alguns experimentos so realizados com
leo bruto e de espcies indeterminadas, muitas vezes sem anlise qumica. Poucos trabalhos
existem de avaliao da atividade de fraes do leo, de substncias isoladas e ainda menos
envolvendo extratos das folhas de Copaifera sp (VEIGA JNIOR e PINTO, 2002;
CARVALHO, 2004; VEIGA JNIOR, 2005; SANTOS et al., 2008).
Entre as atividades farmacolgicas mais estudadas cientificamente para Copaifera sp
so: antiinflamatria, analgsica, antibacteriana, antitumoral, antioxidante, cicatrizante e
gastroprotetora, anti-helmntica, leishmanicida, tripanossomicida e relaxante muscular
(CARVALHO, 2004; VEIGA JNIOR, 2005; VEIGA JNIOR e PINTO, 2002; PAIVA et
al., 2003 e 2004).
Brancalion (2010) investigou a atividade antilitisica do extrato hidroalcolico das
partes areas de C. langsdorffii em ratos. Os clculos de oxalato de clcio foram introduzidos
na bexiga dos animais para o modelo de nefrolitase. Teve como resultados a diminuio na
massa mdia e no nmero mdio dos clculos e, ainda, observou que os clculos se tornaram
mais quebradios quebrando com a metade da presso necessria antes do tratamento.
Yokozawa et al. (1999) testou diversos flavonides, entre eles afzelina e quercetrina,
quanto ao efeito protetor da membrana de clulas renais. Ambos apresentaram efeito notrio
de proteo das clulas renais. Em seguida, propuseram que a atividade dos flavonides
amplamente influenciada pelo nmero e posio dos grupamentos de hidroxilas fenlicas
ligadas estrutura bsica.
Na literatura, encontram-se estudos de variadas atividades com a quercetrina e
afzelina. Entretanto, a afzelina avaliada em atividades como antioxidante (KIM et al., 2008;
XU et al., 2009), antiinflamatria e anti-sistema complemento (MIN et al., 2003; LEE et al.,
2005), inibidora de enzimas como HMG-CoA redutase e conversora de angiotensina-I
(KWON et al., 2010), tirosinase (RHO et al., 2010), ciclooxigenase-2 (KIM et al., 2008) e
mieloperoxidase (REGASINI et al., 2008) e de substncias como xido ntrico (KIM et al.,
2008) nem sempre apresentou resultados satisfatrios. J a quercetrina, quando estudada
concomitantemente nestes trabalhos, apresentou atividade.
Introduo | 9

1.4.3. Aspectos Toxicolgicos
H na literatura alguns dados sobre os aspectos toxicolgicos do leo de Copaifera
sp. Opdyke
1
(1976 apud ALONSO, 2004), Leung e Foster
2
(1996 apud ALONSO, 2004) e
Gruenwald
3
(1998 apud ALONSO, 2004) indicam que o leo de Copaifera sp no txico
em doses de at 2 g por dia. Quando administrada em doses maiores pode ocasionar diarria,
vmitos, insnia e irritao cutnea. Alm disso, j foi citado que o leo, por via interna, pode
ser irritante para mucosas principalmente do trato urinrio (ALONSO, 2004; GRUENWALD,
BRENDLER e JAENICKE, 2000).
Um estudo apresentado no Congresso Brasileiro de Gentica (ALVES et al., 2009)
avaliou o potencial mutagnico e ou antimutagnico do extrato metanlico das partes areas
de C. langsdorffii, por meio do teste de microncleo (teste para a avaliao de segurana pr-
clnica) em sangue perifrico de camundongo Swiss. Os resultados apresentaram ausncia de
citotoxicidade do extrato metanlico de C. langsdorffii. Alm disso, foi observado efeito
antimutagnico quando os animais foram tratados simultaneamente com diferentes doses do
extrato metanlico de C. langsdorffii (10, 20, 40 e 80 mg/kg) e doxorrubicina (15 mg/kg).
Outro estudo apresentado no mesmo evento avaliou o potencial mutagnico e ou
antimutagnico em clulas V79 (fibroblastos de pulmo de hamster) tambm pelo teste de
microncleo, mas desta vez, utilizando o extrato hidroalcolico das partes areas de C.
langsdorffii. Os resultados encontrados demonstraram que o extrato hidroalcolico de C.
langsdorffii no apresentou atividade mutagnica nas concentraes de 30, 60 e 120 L/mL e,
apresentaram efeito quimiopreventivo quando combinadas com metil- metanosulfonato (400
M) (CONGRESSO BRASILEIRO DE GENTICA, 2009b).
1.5. Formas Farmacuticas
Para desenvolver uma forma farmacutica deve-se realizar um estudo de pr-
formulao onde so verificadas caractersticas do frmaco ou droga vegetal como seu
aspecto, cor, sabor, suas caractersticas fsico-qumicas de solubilidade e coeficiente de
partio e sua estabilidade fsica, qumica e microbiolgica. Alm disso, a via de
administrao mais adequada para ao do frmaco ou droga vegetal deve ser considerada
(AULTON, 2005).

1
OPDYKE, D. L. Balsam Copaiba. Food Cosmet. Toxicol., v. 14, p. 687, 1976.
2
LEUNG A e FOSTER S. Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food, Drugs and
Cosmetics. New York, NY: John Wiley, 1996.
3
GRUENWALD, J.; BRENDLER, T. e JAENICKE, C. PDR for herbal medicines. Medical Economics
Introduo | 10

H diferentes terminologias e classificaes para as formas farmacuticas.
Geralmente, so classificadas em lquidos, semi-slidos e slidos. As formas farmacuticas
mais utilizadas obtidas de drogas vegetais so os extratos que podem ser lquidos ou slidos,
tambm conhecidos como extratos secos. Estes extratos, por sua vez, podem ser consumidos
como produto final sem modificaes ou serem produtos intermedirios empregados em
outras preparaes farmacuticas para a sim dar origem ao produto final (Figura 1.6). As
formas farmacuticas originadas de drogas vegetais esto brevemente citadas a seguir
(AULTON, 2005; SIMES et al., 2001).
Chs so formas farmacuticas lquidas obtidas atravs de uma forma caseira de
preparo podendo ser por infuso onde a droga vegetal imersa em gua quente at extrao
dos constituintes e, em seguida, separada por filtrao ou por decoco onde a droga vegetal
cozida por alguns minutos na gua fervente e, ento filtrada. Os chs geralmente so
preparados para consumo rpido devido instabilidade microbiolgica e, por isso, se tornam
inviveis para produo industrial (GURIB-FAKIM, 2006).
Tinturas referem-se a uma soluo alcolica ou hidroalcolica resultante da extrao
da droga vegetal ou da diluio de extratos. Geralmente, 10 mL de tintura correspondem a 1 g
da droga vegetal (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2010).
Outra preparao lquida originada de drogas vegetais so os extratos lquidos que se
assemelham s tinturas, mas podem corresponder a variadas quantidades da droga vegetal. Se
necessrio os extratos podem ser padronizados em relao quantidade de solvente, de
constituintes qumicos ou slidos solveis. Os extratos fluidos so um tipo de extrato lquido
onde 1 mL de extrato fluido corresponde a 1 g da droga vegetal. Podem ser obtidos por
diluio de extratos mais concentrados ou por concentrao de tinturas ou extratos mais
diludos (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2010).
Extratos moles so formas farmacuticas semi-slidas geralmente utilizadas como
produtos intermedirios obtidos por evaporao do solvente dos extratos e que contenha de 60
a 80% de resduo (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2010).
Extratos secos so formas farmacuticas slidas, pulverulentas ou granuladas obtidas por
retirada total do solvente do extrato atravs de tcnicas diversas como liofilizao, leito fluidizado
ou spray dryer e so adicionados ou no de adjuvante/ excipiente (FARMACOPIA
BRASILEIRA, 2010). Devem ser padronizados em teor de constituintes qumicos.
Os chs, tinturas, extratos lquido, mole e seco, podem ser utilizados como produtos
finais ou produtos intermedirios dando origem a solues, xaropes, suspenses, grnulos,
cpsulas, comprimidos, dentre outros.
Introduo | 11

Figura 1.6 Representao das formas farmacuticas originadas de drogas vegetais e suas
etapas de obteno (SIMES et al., 2001 com modificaes).

1.6. Extrao
A extrao dos constituintes qumicos de drogas vegetais consiste em um processo
em que ocorrem os seguintes fenmenos: contato da droga vegetal com o solvente fazendo
com ela se inche e se hidrate, possibilitando a permeabilidade das paredes celulares;
solubilizao dos constituintes qumicos da planta de maneira seletiva; e transferncia de
massa dos constituintes qumicos da droga vegetal solveis para o solvente por difuso ou
processo osmtico (LIST e SCHMIDT, 1989; JACQUES et al., 2007).
Os protocolos para o processo de extrao de constituintes qumicos de plantas so
diversos devido variedade de suas caractersticas qumicas, complexidade destes e
variedade de matrizes vegetais. Alm disso, o rendimento de extrao dos constituintes
qumicos depende do processo extrativo em si e dos diversos fatores que o afetam (CONTINI
et al, 2008).
Droga Vegetal
extrao
c
o
n
c
e
n
t
r
a
o
secagem
- Sem modificao
- Incorporao a uma matriz
- Diluio
Forma
Farmacutica
Lquida
Forma
Farmacutica
Slida
Chs,
Extratos ou
Tinturas
Extratos Concentrado
ou Mole
Extratos secos
Forma
Farmacutica
Semi-slida
d
i
l
u
i
o
Droga Vegetal
extrao
c
o
n
c
e
n
t
r
a
o
secagem
- Sem modificao
- Incorporao a uma matriz
- Diluio
Forma
Farmacutica
Lquida
Forma
Farmacutica
Slida
Chs,
Extratos ou
Tinturas
Extratos Concentrado
ou Mole
Extratos secos
Forma
Farmacutica
Semi-slida
Forma
Farmacutica
Semi-slida
d
i
l
u
i
o
Introduo | 12

H diversos processos extrativos descritos na literatura e que podem ser utilizados,
sendo um fator importante a ser considerado de acordo com os objetivos da extrao. Entre os
mtodos extrativos encontram-se mtodos convencionais e clssicos como macerao
esttica, percolao e extrao por Sohxlet os quais so geralmente recomendados pela
Farmacopia Brasileira (2010); e mtodos extrativos mais modernos como macerao
dinmica (FERNANDES, NAKASHIMA e SERRA, 2004; DENNY et al., 2007; LOPES
FILHO, 1999), turbo-extrao, extrao assistida por ultrasom (HU, CAI e LIANG, 2008;
LIAO et al., 2008) e microondas (TATKE e JAISWAL, 2011).
Ademais, inmeros so os fatores que influenciam os processos extrativos como a
diviso da droga, o estado da droga, se fresca ou seca, massa utilizada de droga, natureza dos
solventes, mistura dos solventes em diferentes propores, volume de solvente, temperatura,
agitao, pH e tempo de extrao (PRISTA, ALVES e MORGADO, 1995; LIST e
SCHMIDT, 1989; CHIRINOS et al., 2007). Como exemplo, os fatores que afetam a extrao
em uma macerao dinmica esto representados na Figura 1.7 e alguns deles so discutidos a
seguir.

Figura 1.7 Esquema dos fatores possivelmente envolvidos na extrao a partir de uma
droga vegetal (LIST e SCHMIDT, 1989).

Massa Natureza Umidade Diviso da droga
Droga Vegetal
Polaridade Volume
Solvente
Extrao
Proporo massa planta/
volume solvente
Temperatura
Tempo
Velocidade de agitao
Equilbrio da extrao
Filtrao
Extrato lquido Resduo da planta
Massa Natureza Umidade Diviso da droga
Droga Vegetal
Polaridade Volume
Solvente
Extrao
Proporo massa planta/
volume solvente
Temperatura
Tempo
Velocidade de agitao
Equilbrio da extrao
Filtrao
Extrato lquido Resduo da planta
Introduo | 13

1.6.1. Mtodos Extrativos
Os mtodos extrativos podem ser classificados de diferentes maneiras: convencionais
ou clssicos por serem citados e recomendados pelas farmacopias como a decoco, infuso,
macerao esttica, percolao, extrao por Sohxlet. Enquanto isso h mtodos extrativos
considerados modernos amplamente estudados nas ltimas dcadas e maior produtividade,
como macerao dinmica, turbo-extrao, extrao assistida por ultrassom, microondas ou
pulsos eltricos.
De acordo com List e Schmidt (1989), os mtodos extrativos podem ser classificados
como mtodos que estabelecem uma concentrao de equilbrio e mtodos exaustivos. Os
mtodos que estabelecem uma concentrao de equilbrio so aqueles em que ocorre a
estabilizao do processo de extrao, ou seja, quando a distribuio das substncias
extraveis entre o extrato e a droga vegetal alcana um valor constante. Os mtodos extrativos
que se incluem nesta classificao so: macerao esttica e dinmica, turbo-extrao,
extrao assistida por ultrassom, microondas e energia eltrica.
A extrao exaustiva definida como a remoo completa das substncias extraveis
da droga vegetal. Os mtodos extrativos que se enquadram como exaustivos so percolao e
a extrao por Sohxlet (LIST e SCHMIDT, 1989).
1.6.2. Agente Extrator
O agente extrator tambm chamado solvente um dos fatores que mais influenciam
no processo de extrao. Eles devem ser capazes de dissolver os constituintes qumicos de
interesse da planta sem que os alterem quimicamente separando-os do material vegetal
residual.
Os principais requisitos para serem considerados na escolha de um solvente so:
seletividade, facilidade de manipulao, custos, influncia no meio ambiente e segurana.
Podem ser lquidos ou gases, orgnicos ou inorgnicos. Os solventes mais
amplamente empregados so metanol, etanol, acetona e gua. Entre estes solventes, o metanol
apresenta a maior capacidade de extrair compostos fenlicos seguido do etanol e da gua
(CHIRINOS et al., 2007). Sabe-se que a fora de extrao de uma soluo metanlica
corresponde mesma fora de extrao que uma soluo etanlica com concentrao 10%
maior do etanol (LIST e SCHMIDT, 1989).
O solvente contribui na extrao seletiva de constituintes qumicos dependendo de
sua polaridade. A mistura de gua e outros solventes pode ser utilizada possibilitando variar a
Introduo | 14

polaridade e, assim a capacidade de dissolver determinados componentes qumicos da planta
pelo agente extrator.
Quando se realiza a extrao em uva utilizando-se lcool como solvente por
exemplo, observa-se uma liberao progressiva dos fenis da pele da uva em funo do tempo
de extrao enquanto que o tempo no to significativo quando se utiliza gua (PINELO et
al., 2005). Chirinos e colaboradores (2007) estudaram diferentes condies para extrao de
fenis totais, antocianidinas totais e flavonides totais de Tropaeolum tuberosum, entre elas
diferentes solventes como metanol, acetona, etanol, gua e hexano. A eficincia de extrao
para fenis totais apresentou-se como: metanol>acetona=guaetanol>hexano. J a eficincia
de extrao para antocianidinas totais e flavonides totais apresentou-se como:
metanol=acetona>etanol=gua>hexano. Assim, a escolha do solvente deve considerar os
constituintes qumicos de interesse e o objetivo da extrao (VILEGAS; MARCHI e
LANAS, 1997).
Alm disso, importante considerar que alguns solventes so txicos a exemplo do
metanol (LEAF e ZATMAM, 1952) e que se devem utilizar solventes ambientalmente
corretos para que os extratos sejam produzidos e comercializados industrialmente sem
oferecer riscos ao consumidor e ao meio ambiente (DIOUF, STEVONOVICA e BOUTIN,
2009).
1.6.3. Massa de Planta
O aumento da massa de planta com volume constantes de solvente relatado como
positivo no aumento da extrao como, por exemplo dos compostos fenlicos. Entretanto,
rendimento em relao massa de planta utilizada decresce (LIST e SCHMIDT, 1989).
Portanto, necessrio que haja um equilbrio envolvendo viabilidade econmica e descarte de
solventes, alm de evitar a saturao do solvente (PINELO, ARNOUS e MEYER, 2006).
1.6.4. Tempo, Temperatura e Agitao
O tempo de extrao deve ser considerado principalmente nos mtodos extrativos
que estabelecem uma concentrao de equilbrio visto que h um tempo mnimo para que o
agente extrator seja capaz de inchar e hidratar a droga vegetal, solubilizar os constituintes
qumicos e difund-los no meio extrator. Outros fatores como temperatura e ausncia ou
presena de agitao assim como a velocidade de agitao podem influenciar no tempo de
extrao (PRISTA, ALVES e MORGADO, 1995).
Introduo | 15

O aumento da temperatura da extrao provoca um aumento da extrao dos
constituintes qumicos da droga vegetal, pois estes so mais facilmente solubilizados no meio
e, assim alcanam o equilbrio mais rapidamente. Entretanto, deve-se atentar para os
constituintes qumicos termolbeis que sofrem alterao qumica em altas temperaturas
podendo afetar a qualidade do extrato (PRISTA, ALVES e MORGADO, 1995).
A agitao exerce influncia acentuada na extrao dos constituintes qumicos da
droga vegetal. Visto que o solvente em contato direto com a droga vegetal alcana a
concentrao de saturao dos constituintes qumicos mais rapidamente que o solvente que
no est, se for mantida em repouso, a extrao depender basicamente do coeficiente de
difuso no solvente, o qual pode ser aumentado pela agitao (PRISTA, ALVES e
MORGADO, 1995).
1.7. Planejamento Experimental
Nas ltimas duas dcadas, novas teorias e metodologias sobre planejamento
experimental foram desenvolvidas e esto sendo cada vez mais utilizadas de maneira eficiente
na maioria das cincias. Tem sido utilizada amplamente na agricultura (WILLERS et al,
2008; LEVIGNE, RALET e THIBAULT, 2002; LEWIS e SJSTROM, 2010) no
melhoramento da qualidade (BURSALI, ERTUNC e AKAY, 2006; ARTILES-LEN e
MELLA-CABRERA, 1997) e na reduo de custos. Recentemente, sua aplicao aumentou
acentuadamente na biologia, pesquisa mdica e estudos clnicos (LEON, 2010; LI, 2003).
Como exemplo na biologia, pode ser citado o estudo da expresso gnica em microensaios
(IMBEAUD e AUFFRAY, 2005; KERR e CHURCHILL, 2001) que afetada por diferentes
fatores assim como estudos clnicos em que os pacientes necessitam da combinao de
diversos medicamentos e o objetivo estudar a toxicidade e eficcia das diferentes
combinaes (LI, 2003).
Os avanos sobre planejamento experimental proporcionam uma ferramenta
poderosa para gerar, interpretar e aplicar experimentos cientficos de maneira mais eficaz. H
planejamentos experimentais multivariveis que estudam diversos fatores simultaneamente e
os planejamentos univariveis que variam um nico fator por vez. Os planejamentos
multivariveis tm certa vantagem sobre os univariveis porque, se h uma interao
significativa entre os fatores estudados, os planejamentos univariveis no so capazes de
detectar esta interao diferindo dos resultados dos planejamentos multivariveis. Portanto, os
Introduo | 16

planejamentos univariveis podem falhar desde que o efeito de um fator dependente dos
outros fatores envolvidos (FRANCIS et al., 2003; FERREIRA et al., 2007).
De maneira geral, os planejamentos experimentais trabalham com fatores chamados
variveis independentes (X) em diferentes valores ou nveis (n). Um exemplo fictcio poderia
ser no estudo de extrao de uma planta onde dois fatores so selecionados para o estudo
podendo ser pH e temperatura sendo ambos estudados nos nveis codificados como baixo (-1)
e alto (+1). Os valores codificados so relacionados com os valores reais, ou seja, pH 5 e 9 e
temperatura 20 e 50C. Alm disso, o planejamento experimental tem por finalidade estudar
uma resposta chamada varivel dependente (y) (BOX e BEHKEN, 1960).
Os nveis dos planejamentos podem ser dois, trs ou at cinco nveis de cada fator
em questo. O total de ensaios realizados depende do nmero de fatores e de nveis. Assim, n
X

= n total de ensaios a serem realizados. Assim, quando temos dois fatores estudados em dois
nveis, ento 2
2
= 4 ensaios (BOX e BEHKEN, 1960).
O planejamento muito utilizado quando h diversos fatores a serem estudados,
quando a regio experimental de interesse ampla e, principalmente, para triagem dos fatores
com o objetivo de verificar qual deles possui maior impacto na resposta o planejamento
fatorial completo. Ele possibilita reduzir o nmero de fatores a serem investigados nos
prximos planejamentos. Desta forma, espera-se eliminar fatores sem importncia antes de
investir em planejamentos mais elaborados. O planejamento fatorial completo mais simples
o 2
2
representado na Tabela 1.1 e na Figura 1.8 (MYERS, 2003; LI, 2003).

Tabela 1.1 Planejamento fatorial completo 2
2
com o total de ensaios e os fatores X
1
e X
2

codificados em nveis +1 e -1.
Ensaio X
1
X
2

1 -1 -1
2 -1 +1
3 +1 -1
4 +1 +1

Introduo | 17

Figura 1.8 Esquema grfico de um planejamento fatorial completo 2
2
(MYERS, 2003).

Se o nmero de fatores utilizados em um planejamento fatorial completo se torna
numeroso ainda que ele seja de dois nveis, o nmero de ensaios resultantes do estudo pode se
tornar razoavelmente grande. Por exemplo, um planejamento fatorial completo 2
5
perfaz um
total de 32 ensaios. Uma maneira de evitar este problema realizar apenas uma frao
especfica do planejamento fatorial completo e o planejamento passa a denominar-se
planejamento fatorial fracionrio. Assim, pode ser realizada uma meia frao ou um quarto de
frao. Exemplificando, a meia frao do planejamento 2
5
representada 2
5-1
perfazendo
metade do total de ensaios, ou seja, 16 ensaios (MYERS, 2003; LI, 2003).
Define-se um planejamento fatorial fracionrio como um experimento em que apenas
uma frao das combinaes de um planejamento fatorial completo selecionada de maneira
adequada. Diversas estratgias garantem a seleo adequada dos ensaios. Em um exemplo
simples, primeiramente, denota-se que 2
3-1
= 2
2
. A partir do planejamento fatorial completo
2
2
, apresentado na Tabela 1.1, inicia-se a construo do planejamento fatorial fracionrio.
Apesar de este planejamento ter o nmero de ensaios do 2
3-1
, 4 ensaios, ele no possui a
coluna do terceiro fator X
3
. Esta coluna construda multiplicando-se os sinais de X
1
pelos de
X
2
para obter X
1
*X
2
= X
3
. Desta forma, obtm-se o planejamento fatorial fracionrio 2
3-1
(Tabela 1.2). Desta forma, planejamentos fatoriais fracionrios maiores podem ser construdos
multiplicando os sinais das colunas do planejamento fatorial completo (NIST/ SEMATECH,
2011).

Introduo | 18

3-1
.
Ensaio X
1
X
2
X
3

1 -1 -1 +1
2 -1 +1 -1
3 +1 -1 -1
4 +1 +1 +1

Entretanto, o planejamento fatorial fracionrio no fornece estimativas dos efeitos
to precisas quanto um planejamento fatorial completo. Alm disso, o planejamento fatorial
fracionrio impossibilita obter a estimativa de interao de X
1
e X
2
sem que esteja relacionada
estimativa do fator principal de X
3
(BARROS-NETO, SCARMINIO e BURNS, 1996;
NIST/ SEMATECH, 2011).
1.7.1. Metodologia de Superfcie de Resposta (MSR)
A metodologia superfcie de resposta (MSR) compreende um grupo de tcnicas
estatsticas para explorar e construir modelos matemticos. Atravs de um planejamento
cuidadoso e anlise dos resultados, o MSR permite relacionar a resposta obtida e os fatores
estudados que a afeta. A MSR permite calcular a resposta em nveis intermedirios que no
foram realizados experimentalmente e direcionar para o objetivo desejado aumentando ou
diminuindo a resposta Alm disso, a MSR permite que seja estimada a interao e at mesmo
os efeitos quadrticos dos fatores possibilitando saber o formato da superfcie da resposta
estudada. utilizada com objetivo de encontrar condies timas ou melhorar as condies j
utilizadas, apontar problemas ou pontos fracos no processo, melhorar a robustez de produto
ou processo em relao a influncias externas ou no controlveis (MUTHUKUMAR,
MOHAN e RAJENDRAN, 2003).
Visto que a MSR capaz de detectar efeitos quadrticos torna-se interessante que o
planejamento utilizado possibilite verificar a curvatura da regio experimental fornecendo
modelos quadrticos ou de segunda ordem. Tais experimentos devem ser de trs nveis, 3
X
ou
mais j que os planejamentos de dois nveis fornecem modelos lineares ou de primeira ordem.
Na Figura 1.9, est representada a curvatura dos modelos linear e quadrtico.

Introduo | 19

(A) (B)
Figura 1.9 (A) modelo linear, (B) modelo quadrtico. (NIST/ SEMATECH, 2011).

Por isso, h alguns planejamentos que so mais utilizados para estudar a MSR e entre
eles encontra-se o planejamento Box-Behnken. Este planejamento possui caractersticas
estatsticas desejveis com apenas uma frao do total de ensaios requeridos em um
planejamento fatorial completo de trs nveis. Os nveis de seus fatores se encontram no meio
das arestas e no centro quando se observa sua representao grfica sendo que a geometria
deste planejamento sugere o formato de uma esfera dentro da regio experimental (Figura
1.10) (NIST/ SEMATECH, 2011; MYERS, 2003).

Figura 1.10 Esquema grfico do planejamento Box-Behnken com trs variveis e ponto
central (MYERS, 2003).

1.7.2. Inclinao Ascendente (Descendente)
Freqentemente, as condies iniciais dos experimentos se encontram afastadas da
regio onde a resposta tima devido ao pouco conhecimento do processo ou de quanto os
fatores iro influenciar na resposta. Em tais condies, torna-se necessrio direcionar o
experimento para a regio tima utilizando um procedimento experimental, simples, rpido,
Introduo | 20

econmico e eficiente (NIST/ SEMATECH, 2011; PORTAL ACTION, 2011; MYERS,
2003).
Se o objetivo obter a regio tima onde se observa a mxima resposta desejada, o
mtodo de inclinao ascendente pode ser aplicado, assim como se o objetivo obter a regio
tima onde se observa a mnima resposta desejada, o mtodo da inclinao descendente pode
ser aplicado (NIST/ SEMATECH, 2011; MYERS, 2003).
Para tanto, comum assumir um modelo de primeira ordem (Equao 1.1) como
aproximao da superfcie da resposta aos fatores estudados. Assim, a inclinao
proporcional grandeza dos coeficientes de regresso do modelo de primeira ordem e o sinal
dos coeficientes estabelece a direo. Alm disso, a direo da inclinao determinada
conforme o objetivo experimental, assim como a distncia experimental do prximo ponto e
do ponto inicial. Devem ser realizados experimentos em direo resposta objetivada at que
no haja mais progresso na resposta. Eventualmente, o experimento pode estar na regio
tima. H relatos na literatura de que esperado que at dois experimentos de inclinao
sejam suficientes (NIST/ SEMATECH, 2011; MYERS, 2003).

2 2 1 1 0
X X Y + + = (1.1)

Para encontrar a inclinao (), utilizam-se os coeficientes de regresso do modelo
de primeira ordem (Equao 1.2). A inclinao () correlaciona os fatores X
1
e X
2
. Assim,
quando X
1
=1, X
2
=
2
/
1
.

1
2
=
(1.2)

Tabela 1.3 Relao entre os fatores X
1
e X
2
no mtodo de inclinao.
Fatores codificados

X
1
X
2

Origem 0 0
1
2
/
1

Origem + 1
2
/
1

Origem + 2 2 2
2
/
1

Introduo | 21

1.7.3. Funo Desejabilidade
A funo desejabilidade um dos mtodos mais utilizados para otimizar
experimentos multivariveis. Este mtodo permite encontrar condies que fornecem a
resposta mais desejada a qual a combinao de mltiplas respostas dentro de limites
previamente estabelecidos evitando que alguma delas fique fora dos limites. Basicamente, a
funo desejabilidade permite transformar mltiplos problemas em um nico utilizando-se de
equaes matemticas (NIST/ SEMATECH, 2011).
Para utilizar a funo desejabilidade necessrio estimar a relao das respostas em
funo dos fatores estudados. Esta estimativa realizada por planejamentos experimentais e a
aplicao de MSR, que fornece a equao de ajuste que representa a superficie, como por
exemplo, no formato da Equao 1.3.

) ,... , , (
3 2 1 n i
X X X X f Y = (1.3)

Derringer and Suich (1980) propuseram um dos mais conhecidos mtodos de funo
desejabilidade onde se obtm uma desejabilidade global utilizando a mdia geomtrica das
respostas normalizadas, conforme demonstrado na Equao 1.4.

n
n i i
d d d d Y d
1
3 2 1
) .... . . ( ) ( = (1.4)

onde n o numero de respostas.

Ainda, para refletir a possvel diferena de importncia de cada resposta, a qual
estabelecida pelo pesquisador, atribuem-se pesos relativos para cada resposta variando-se de 0
para a menor importncia at 1 para a mxima importncia, conforme representado na
Equao 1.5.
Variando-se a importncia (w) de cada resposta, os valores dos fatores que fornecem
a melhor resposta global, ou seja, maior desejabilidade, podem ser alterados.
1 ...
3 2 1
= + + + +
n
w w w w
1 0 < <
i
w
(1.5)
) (
i i
Y d =
Introduo | 22

Sabendo-se que o objetivo a resposta maximizada (
i
), o valor de d
i
(Y
i
) fica
prximo de 1 quanto mais as respostas ficam otimizadas e se alguma das respostas estiver fora
da faixa desejvel, toda a funo ter valor zero. Ou seja, se d
i
(Y
i
) resultar em um valor
otimizado ou maior que o valor mais alto estabelecido (A
i
) no apresentar diferena na
otimizao, mas se d
i
(Y
i
) resultar em um valor indesejvel, menor que o valor mais baixo
estabelecido (B
i
), ento ter valor zero (LIU e TANG, 2010).

1.8. Secagem em Spray Dryer
A tcnica de secagem em spray dryer, tambm conhecida como secagem por
asperso, nebulizao ou atomizao, apesar de bem estabelecida, ainda inovadora quando
se trata de obter partculas cada vez mais sofisticadas. amplamente utilizada em processos
produtivos de diversas reas entre elas alimentcia, qumica, de fertilizantes, produtos
cermicos, de polmeros e farmacutica (VEHRING; FOSS e LECHUGA-BALLESTEROS,
2007; WANG e LANGRISH, 2009).
Atualmente, estima-se que h mais que 15000 equipamentos de spray dryer de
tamanho industrial em operao ao redor do mundo e aproximadamente o dobro de
equipamentos em escala piloto e laboratorial (WANG e LANGRISH, 2009).
Na indstria farmacutica, o spray dryer muito utilizado para preparar ps que
apresentam estabilidade fsico-qumica e boas caractersticas morfolgicas, propriedades de
vazoe de dispersibilidade. Por isso, utilizado para produzir vrios tipos de formas
farmacuticas principalmente aerossis administrados via pulmonar que devem apresentar
propriedades aerodinmicas adequadas (VEHRING; FOSS e LECHUGA-BALLESTEROS,
2007).
Alm disto, o spray dryer o principal equipamento para a secagem de materiais
termossensveis, como alimentos e materiais de origem biolgica entre eles extratos e
di(Yi) =
w
i i
i
i
B A
B Y
^

i
i B Y
^

i
i A Y
^
i
i
i
A Y B < <
^

(1.6)
Introduo | 23

produtos oriundos de plantas. Outro campo onde a secagem em spray dryer tem adquirido
destaque recentemente na microencapsulao de substncias (FREITAS et al., 2010).
A tcnica de spray dryer consiste em bombear a amostra para dentro da cmara de
secagem onde ser aspergida, nebulizada em gotculas. Dentro da cmara, as gotculas
formadas entram em contato com ar quente e seco o qual capaz de absorver toda a umidade
das gotculas dando origem ao p que arrastado da cmara para o sistema coletor. A
secagem das gotculas ocorre rapidamente devido sua grande superfcie de contato com o ar
quente e seco, ocorrendo em poucos minutos impedindo que amostra atinja temperatura maior
que a temperatura de sada (OLIVEIRA e PETROVICK, 2010).
Apesar de simples, a secagem por spray dryer influenciada por diversas variveis
que afetam diretamente a qualidade do produto obtido e do processo. As variveis devem ser
estudadas e controladas a fim de obter boas caractersticas tanto do produto quanto do
processo. As variveis existentes podem estar relacionadas ao produto de entrada como
viscosidade, tenso superficial, presena ou no de excipiente e seu tipo, concentrao da
amostra, o tipo de solvente da amostra. Alm disso, existem as variveis do equipamento que
podem influenciar tanto a qualidade do produto final quanto a qualidade do processo como a
temperatura de sada e de entrada, o vazoda amostra que entra na cmara de secagem, a
presso de atomizao, o tipo de bico atomizador, a vazo do gs de secagem (LIST e
SCHMIDT, 1989; OLIVEIRA e PETROVICK, 2010).
O uso de excipientes na secagem por spray dryer uma prtica muito comum
podendo ser utilizados excipientes com caractersticas diversas como amidos, acares como
maltodextrina e lactose, poliis como sorbitol e manitol, celulose, dixido de silcio coloidal,
fosfato triclcico, gelatina, gomas, entre muitos outros (OLIVEIRA e PETROVICK, 2010;
ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).
Para a secagem de extratos derivados de plantas, a seleo e o uso adequado de
adjuvantes no processo de spray drying uma fase de fundamental importncia, visto que
determina a estabilidade e a qualidade dos mesmos, podendo inclusive afetar as caractersticas
de biodisponibilidade (OLIVEIRA e PETROVICK, 2010).
A seguir, as caractersticas dos excipientes utilizados neste trabalho sero
brevemente relembradas de acordo com Handbook of Pharmaceutical Excipients (ROWE,
SHESKEY e OWEN, 2006).
O manitol, nome qumico D-manitol, um lcool hexahdrico ou poliol, ismero do
sorbitol. um p branco, sem cheiro, no higroscpico, podendo apresentar-se na forma cristalina
ou grnulos com bom fluxo. bastante usado em formulaes farmacuticas para diversos fins
Introduo | 24

entre eles como diluente em formulaes para compresses diretas ou granulaes midas, para
obteno de ps para administrao via pulmonar, para liberao controlada, entre outros. Sua
solubilidade em temperatura de 20C de 1 parte em 5,5 de gua e 1 parte em 83 de etanol 95%
(ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006). H estudos na literatura que avaliaram o polimorfismo
cristalino do manitol e as condies de secagem que o influenciaram (MAAS et al., 2011), assim
como a influencia da umidade na transio de polimorfismo (YOSHINARI et al., 2003).
O ismero do manitol, o sorbitol tambm um lcool hexahdrico ou polil, de cor
branca, sem cheiro e cristalino. Entretanto, higroscpico. H relatado quatro polimorfos
cristalinos do sorbitol e uma forma amorfa o que acarreta uma variao no seu ponto de
fuso. bastante utilizado tanto na em formulaes farmacuticas como cosmticas e
alimentcias. Sua solubilidade em temperatura de 20C de 1 parte em 0,5 de gua e 1 parte
em 25 de etanol 95% (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).

Figura 1.11 Estruturas moleculares do manitol e sorbitol.

A lactose classificada como um dissacardeo natural do leite formado pelos
monossacardeos glicose e galactose e pode apresentar-se como partculas cristalinas ou como p
branco. No estado slido, a lactose monohidratada apresenta-se em diversas formas isomricas
dependendo da cristalizao e das condies de secagem como, por exemplo, -lactose
monohidratada, -lactose anidra e -lactose anidra. Uma parte de lactose solvel em 5,24 partes
de gua a 20C. utilizada como agente ligante e diluente na compresso direta para obteno de
comprimidos ou na encapsulao e liofilizao (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).

Figura 1.12 Estrutura molecular da lactose monohidratada (ROWE, SHESKEY e OWEN,
2006).

Sorbitol Manitol
Introduo | 25

Outro acar utilizado neste trabalho foi a maltodextrina que um polmero de glicose
com pesos moleculares variados obtido a partir da hidrlise do amido. Dependendo de onde
ocorreu a hidrlise do amido a maltodextrina contm certo valor de dextrose equivalente (DE) que
o seu poder redutor expresso em gramas de glicose por 100 g de maltodextrina. Pode apresentar
peso molecular de 900 a 9000 g/mol. A solubilidade, higroscopicidade, sabor doce e
compressibilidade da maltodextrina aumentam com o aumento da DE. Tambm utilizado como
diluente ou ligante em comprimidos e cpsulas (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).

Figura 1.13 Estrutura molecular da unidade de maltodextrina (ROWE, SHESKEY e
OWEN, 2006).

Apesar da maltodextrina ser originada do amido, pouco ou nada tem de suas
caractersticas. O amido apresenta em sua estrutura a amilose e a amilopectina que so
polissacardeos de -glicose com peso molecular variando de 50000 a 160000 g/mol. um p
branco inodoro e inspido com grnulos pequenos com formato ovide ou esfrico dependente da
origem botnica, assim como o tamanho dos grnulos. comumente utilizado como ligante,
desintegrante ou diluente em formulaes slidas orais (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).
O Capsul um amido de milho modificado. O amido geralmente modificado para
evitar suas caractersticas no desejveis como gis coesivos e aguados, propriedades de
vazoruins, decomposio e resistncia trmica, entre outras. Assim a modificao feita
por derivatizao como eterificao, esterificao, reticulao, decomposio atravs de
hidrlise enzimtica ou cida ou de oxidao, ou por tratamento fsico por temperatura ou
umidade. As modificaes qumicas esto relacionadas com a introduo de um grupo
qumico na molcula do amido resultando, muitas vezes, em mudanas notveis em suas
propriedades fsico-qumicas (SINGH, KAUR e MCCARTHY, 2007)
Introduo | 26

Figura 1.14 Estrutura molecular da amilose e amilopectina do amido (ROWE, SHESKEY e
OWEN, 2006).

A celulose microscristalina obtida da despolimerizao da celulose e um p
branco cristalino, inodoro e inspido de partculas porosas. H no mercado celulose
microcristalina com diferentes tamanhos de partculas e umidade que apresentam diferentes
propriedades e aplicaes. Tambm muito utilizado como ligante, diluente, desintegrante ou
lubrificante em formulaes slidas orais (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).

Figura 1.15 Estrutura molecular da celulose microcristalina (ROWE, SHESKEY e OWEN,
2006).

O dixido de silcio coloidal foi o nico excipiente inorgnico utilizado. Por isso, ele
apresenta propriedades fsicas bastante diferentes. um p fino, bastante adsorvente e
Introduo | 27

possuiu rea de superfcie especfica na ordem de 100 vezes maior que os outros excipientes
utilizados. Por isso, apresenta baixa densidade aparente e boas caractersticas de vazosendo
amplamente utilizado em ps para melhorar o processo de compresso e encapsulao. um
excipiente muito utilizado em estudos para secagem por spray dryer de extratos vegetais
(ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).
Este excipiente seguro quando utilizado em produtos farmacuticos de via oral ou
tpica. Entretanto, injees intraperitoneais e subcutneas podem produzir reaes locais e/ou
granulomas. Alm disso, necessrio tomar precaues ao manipul-lo, pois sua inalao
pode causar irritao do trato respiratrio (ROWE, SHESKEY e OWEN, 2006).

Figura 1.16 Estrutura molecular do dixido de silcio coloidal (ROWE, SHESKEY e
OWEN, 2006).

28
2. Objetivos

O presente trabalho teve como objetivo estudar e otimizar o processo de extrao por
macerao dinmica a partir das folhas de C. langsdorffii assim como o processo de secagem
em spray dryer.
Para tanto, as seguintes metas foram estabelecidas:
- investigar os fatores do processo de extrao por macerao dinmica a partir das
folhas de C. langsdorffii;
- otimizar o processo de extrao para obter altos teores de slidos solveis,
flavonides totais e dos marcadores qumicos, quercetrina e afzelina;
- estudar diversos excipientes como adjuvantes de secagem dos extratos em spray
dryer;
- investigar os fatores do processo de secagem em spray dryer;
- avaliar as caractersticas fsicas, fsico-qumicas e farmacotcnicas dos extratos
secos por spray dryer;
- desenvolver e validar metodologia analtica por CLAE para a quantificao dos
marcadores qumicos, quercetrina e afzelina tanto nos extratos lquidos quanto nos extratos
secos.

29
3. Materiais e Mtodos
3.1. Droga Vegetal
3.1.1. Obteno
Para o desenvolvimento deste estudo, foram utilizadas folhas da planta C.
langsdorffii coletadas na Universidade de So Paulo (USP) no campus de Ribeiro Preto SP
no perodo da tarde no ms de setembro. Uma exsicata deste espcime foi registrada no
herbrio da Faculdade de Filosofia Cincias e Letras de Ribeiro Preto (USP) pelo coletor S.
P. Teixeira n36 & G. D. Pedersoli sob nmero 12083 e a identificao botnica foi realizada
pela Profa. Dra. Simone de Pdua Teixeira da Faculdade de Cincias Farmacuticas de
Ribeiro Preto (USP). O material vegetal foi limpo, seco em ambiente ventilado a sombra
com temperatura de 30 5 C, modo em moinho de facas e armazenado em saco plstico
hermeticamente fechado at utilizao.
3.1.2. Caracterizao
A amostra de material vegetal foi caracterizada, conforme a Farmacopia Brasileira
(2010), quanto: umidade, determinao de cinzas totais, cinzas insolveis em cido clordrico
e substncias extraveis por lcool. Alm disso, a distribuio granulomtrica das folhas secas
e modas foi avaliada atravs de jogo de tamises (ANSEL et al., 2000). As anlises foram
realizadas em triplicata.
3.2. Extrao
3.2.1. Procedimento
O mtodo de extrao utilizado foi macerao dinmica (LIST e SCHMIDT, 1989).
A massa de planta foi adicionada ao solvente em erlenmeyer devidamente tampado com
tampa esmerilhada. O contato da massa de planta com o solvente ocorreu por tempo pr-
determinado, com temperatura controlada e sob agitao magntica. Ao final deste tempo,
separou-se o residual de planta do extrato com auxlio de algodo e papel de filtro at obter o
volume de 100 mL de extrato.
Utilizaram-se variadas quantidades de massa de planta que foram definidas conforme
foram sendo obtidos os resultados dos planejamentos experimentais. Os solventes
selecionados para a extrao foram etanol e gua ou a mistura deles em diferentes propores.
Materiais e Mtodos | 30

Para determinar o volume de solvente adicionado massa de planta para obter o volume de
100 mL de extrato, foram realizados testes preliminares com cada quantidade de massa de
planta utilizada. Desta forma, verificou-se qual a quantidade de solvente se adsorvia massa
de planta e, assim, determinou-se a quantidade de solvente a se adicionar na extrao.
3.2.2. Planejamentos Experimentais
Ao longo do estudo de extrao, diversos planejamentos experimentais foram
utilizados de acordo com o objetivo de extrair o mximo de slidos solveis, flavonides
totais e dos marcadores qumicos selecionados: quercetrina e afzelina.
Executou-se o planejamento mostrado na Tabela 3.2 e avaliaram-se as respostas (Yi):
slidos solveis, rendimento de slidos solveis, flavonides totais e teor dos marcadores
quercetrina e afzelina. Mais especificamente, o planejamento fatorial fracionrio selecionado
foi 2
5-2
perfazendo um total de 8 experimentos (BARROS NETO, SCARMINIO e BURNS,
1996). Os nveis utilizados no planejamento foram alto (+1) e baixo (-1) (Tabela 3.1). Para a
construo da coluna de sinais para o fator temperatura de extrao multiplicou-se os sinais
dos fatores Mp, EA e t (X
1
* X
2
* X
3
) e para a velocidade de agitao multiplicou-se os fatores
Mp e EA (X
1
* X
2
) (Tabela 3.2).

Tabela 3.1 Denominao codificada e no codificada dos fatores estudados no
planejamento fatorial fracionrio 2
5-2
e seus nveis alto +1 e baixo -1.
Denominao Nveis
Fatores
Codificados No Codificados +1 -1
Massa de planta (g) X
1
Mp 20 4
Proporo etanol/ gua X
2
EA 70: 30 0: 100
Tempo de extrao (h) X
3
t 6 1
Temperatura de extrao (C) X
4
T 50 25
Velocidade de agitao (rpm) X
5
v 600 300

5-2
com fatores codificados. X
1
= massa planta
(Mp), X
2
= proporo etanol/ gua (EA), X
3
= tempo de agitao (v),
X
4
=temperatura de extrao (T) e X
5
= velocidade de agitao (v).
Ensaio X
1
X
2
X
3
X
4
X
5

1 -1 -1 -1 -1 +1
2 +1 -1 -1 +1 -1
3 -1 +1 -1 +1 -1
4 +1 +1 -1 -1 +1
5 -1 -1 +1 +1 +1
6 +1 -1 +1 -1 -1
7 -1 +1 +1 -1 -1
8 +1 +1 +1 +1 +1

A estimativa dos efeitos (ef) para cada fator em um planejamento fatorial fracionrio
com n ensaios e yi respostas foi calculada atravs da Equao 3.1. Esta equao permitiu
comparar a intensidade dos efeitos para cada fator estudado.

2
) ( ) (
1 1
n
Y Y
ef
n
i
n
i
i i
= =
+
= (3.1)

Aps selecionar os fatores que mais influenciaram na extrao, o planejamento Box-
Behnken (Tabela 3.4) foi selecionado a fim de avaliar a extrao de slidos solveis,
rendimento de slidos solveis, flavonides totais e os marcadores quercetrina e afzelina das
folhas de C. langsdorffii. O planejamento experimental e a anlise dos resultados foram
realizados utilizando-se o Software Statistica 5.
Assim, os nveis utilizados para a codificao dos fatores encontram-se na Tabela
3.3.

Tabela 3.3 Fatores estudados no planejamento Box-Behnken e seus nveis +1, 0 e -1.
Denominao Nveis
Fatores
Codificados No codificados -1 0 +1
Massa de planta (g) X
1
Mp 4 12 20
2
EA 30: 70 50: 50 70: 30
Velocidade de agitao (rpm) X
5
v 200 400 600

Tabela 3.4 Planejamento Box-Behnken, com fatores codificados. X
1
= massa planta (Mp),
X
2
= proporo etanol/gua (EA) e X
5
= velocidade de agitao (v).
Ensaio X
1
X
2
X
3

1 -1 -1 0
2 +1 -1 0
3 -1 +1 0
4 +1 +1 0
5 -1 0 -1
6 +1 0 -1
7 -1 0 +1
8 +1 0 +1
9 0 -1 -1
10 0 +1 -1
11 0 -1 +1
12 0 +1 +1
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0


Os fatores estudados foram codificados de acordo com as Equaes 3.2, 3.3 e 3.4.

8
12
1
=
Mp
X

20
50
2
=
EA
X

200
400
5
=
v
X

Para um planejamento envolvendo trs fatores a equao tem a forma da Equao
3.5, onde Y a resposta; X
i
so os fatores estudados que influenciam a reposta Y;
0
a
constante;
i
o coeficiente linear;
ii
o coeficiente quadrtico e
ij
(i j) a interao
linear entre X
i
e X
j
.
2
3
1
3
1
3
1
3
1
0 i
i
ii j i
i j
ij i
i
i
X X X X Y

= = =
+ + + =
Devido finalidade de extrair o mximo de flavonides totais e os marcadores

qumicos: quercetrina e afzelina e conhecendo, atravs do Box-Behnken, a resposta obtida na
regio estudada, o mtodo de inclinao ascendente foi selecionado para ser realizado em
seguida possibilitando direcionar o estudo para a regio de mxima resposta.
A inclinao ascendente calculada atravs da relao entre os coeficientes de
regresso linear da resposta estudada. Assim, ele calculado como na Equao 3.6.
1
2
Os coeficientes utilizados foram os lineares dos fatores: massa de planta e proporo

etanol/ gua.
Aps encontrar a regio de mxima extrao dos flavonides totais e dos marcadores
qumicos quercetrina e afzelina, foi realizado outro planejamento nesta regio para
(3.3)
(3.2)
(3.4)
(3.5)
(3.6)

confirmao. O planejamento utilizado foi fatorial completo 3
2
que perfez nove experimentos
(Tabela 3.5).
Tabela 3.5 Planejamento Fatorial Completo 3

2
, com fatores codificados. X
1
= massa planta
(Mp) e X
2
= proporo etanol/gua (EA).
Ensaio X
1
X
2

1 -1 -1
2 -1 0
3 -1 +1
4 +1 -1
5 +1 0
6 +1 +1
7 0 +1
8 0 -1
9 0 0
As relaes utilizadas para a codificao dos fatores encontram-se nas Equaes 3.7
e 3.8 e seus nveis na Tabela 3.6.
9
34
1
=
Mp
X
13
83
2
=
EA
X

Tabela 3.6 Fatores estudados no Planejamento Fatorial Completo 3
2
e seus nveis +1, 0 e -
1.
Denominao Nveis
Fatores
Massa de planta X
1
Mp 25 g 34 g 43 g
2
EA 70: 30 83: 17 96: 4

3.2.3. Caracterizao Fsico-Qumica dos Extratos Lquidos
Os extratos lquidos obtidos foram analisados fsico-quimicamente por densidade
(picnometria) e slidos solveis (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2010), rendimento de
slidos solveis (LIST e SCHMIDT, 1989), quantificao de flavonides totais (COSTA et
al., 2010; DOWD, 1959) e quantificao de quercetrina e afzelina por CLAE.
(3.7)
(3.8)

3.2.3.1. Rendimento de Slidos Solveis
Para obter o valor de rendimento de slidos solveis utilizou-se a Equao 3.9 (LIST
e SCHMIDT, 1989) onde 0
SS
o rendimento de slidos solveis; SS o valor encontrado na
anlise de slidos solveis; vol o volume obtido de extrato e Mp a massa de planta
utilizada.
Mp
vol SS
SS
100
=

3.2.3.2. Quantificao de Flavonides Totais
O grupo de marcadores qumicos quantificados foram flavonides totais j que o
estudo realizado por Sousa (2011) demonstrou que os compostos qumicos majoritrios
identificados nos extratos hidroalcolicos da folha de C. langsdorffii pertencem a este grupo.
Para a quantificao de flavonides totais, utilizou-se o mtodo de complexao com cloreto
de alumnio 2% em metanol. A quercetina (Sigma, lote 109H0882) foi utilizada como padro
de referncia. As amostras foram diludas em metanol para se obter concentrao reacional de
8 g/mL e analisadas por espectrofotmetro UV mini-1240 da Shimadzu em comprimento de
425 nm (COSTA et al., 2010; DOWD, 1959). As anlises foram realizadas em triplicata.
3.2.3.3. Quantificao de Quercetrina e Afzelina por CLAE
Os marcadores qumicos selecionados para o estudo da extrao e secagem a partir
das folhas de C. langsdorffii foram quercetrina (quercetin-3-O-ramnosdeo) (ChromaDex, lote
00017171-016) e afzelina (canferol-3-O-ramnosdeo) isolado e identificado no laboratrio de
farmacognosia da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto/ USP
(NOGUEIRA, 2011; SOUSA, 2011).
As anlises em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) foram realizadas em
um cromatgrafo Shimadzu (LC-20AT) com detector de arranjo de diodos (SPC-M20A)
operando em 254 nm. Foi utilizada coluna de fase reversa da marca Shimadzu (Shim-Pack
CLC-ODS (M) 4,6 mm x 250 mm, dimetro de partcula de 5 m, e dimetro do poro de 100
). A fase mvel consistiu de metanol e soluo aquosa acidificada com cido frmico (0,1%
v/v) pH 2,5 operando com vazo de 0,8 mL/min de acordo com o gradiente a seguir (Tabela
3.7).
(3.9)

Tabela 3.7 Gradiente de eluio da fase mvel (%) no mtodo cromatogrfico.
Tempo (min) Metanol (%)
gua Acidificada
(%)
0 20 80
35 30 70
45 45 55
60 45 55
65 90 10
71 90 10
77 20 80

3.2.4. Validao do Mtodo Cromatogrfico
O mtodo foi validado para a quercetrina contemplando os parmetros: seletividade,
linearidade, limite de deteco, limite de quantificao, preciso (repetibilidade e preciso
intermediria), exatido e robustez. Devido disponibilidade do padro de afzelina no ser
suficiente e devido a ambos marcadores qumicos serem flavonis glicosilados e
possivelmente apresentarem caractersticas semelhantes, assim como comportamentos
semelhantes na amostra, no foram contemplados os parmetros de validao do mtodo para
a afzelina de exatido (recuperao) e limite de deteco e quantificao.
3.2.4.1. Preparo das Amostras
Para o preparo das amostras, tanto os extratos lquidos quanto os secos foram
pesados em bales volumtricos de 10 mL e dissolvidos em metanol com o auxlio de banho
de ultrassom. Adicionou-se 50 nL de soluo de cumarina 4000 ng/mL como padro interno.
As solues foram filtradas em filtro 0,45 m para as anlises. A quantidade a ser pesada dos
extratos, correspondente ao ponto central da curva analtica, foi calculada visando obter
prximo de 30 ng/mL de quercetrina no balo volumtrico. Assim, a quantidade dos extratos
lquidos adicionada ao balo volumtrico variou de 0,1 a 2,5 g e dos extratos secos foi
aproximadamente de 15 mg.
3.2.4.2. Seletividade
Para avaliar a seletividade do mtodo cromatogrfico, os perfis cromatogrficos das
matrizes livres de qualquer adio de extrato soluo hidroalcolica dos extratos lquidos e
manitol dos extratos secos e dos padres quercetrina ou afzelina foram comparados para
avaliar se nenhum interferente eluia no tempo de reteno destas substncias e que seus picos
estavam bem separados dos demais compostos presentes nas amostras. Alm disso, a

comparao entre os espectros de UV dos picos de interesse foi realizada para os padres e
para as amostras (RIBANI et al., 2004; SOUSA, 2011).
3.2.4.3. Linearidade e Curva Analtica
Para a quercetrina, foi elaborada a curva analtica com as concentraes de 10, 30,
50, 70 e 90 ng/mL (Tabela 3.8) sendo cada uma delas feita em triplicata a partir de trs
solues-me de quercetrina na concentrao de 1 mg/mL e com diluies a partir destas
utilizando pipeta automtica de 100 nL. Utilizou-se uma soluo de cumarina (400 ng/ mL)
como padro interno (PI).

Tabela 3.8 Volumes utilizados para a construo da curva analtica de quercetrina.
Volume (nL) Concentrao
(g/mL) Soluo-me PI Metanol Final
10 10 50 940 1000
30 30 50 920 1000
50 50 50 900 1000
70 70 50 880 1000
90 90 50 860 1000

Para a afzelina, foi eleborada a curva analtica com as concentraes de 5, 15, 25, 35
e 45 ng/mL (Tabela 3.9) sendo cada uma delas feita em triplicata a partir de trs solues-me
de afzelina (0,5 mg/ mL) e com diluies a partir destas utilizando pipeta automtica de 100
nL. Utilizou-se uma soluo de cumarina (400 ng/ mL) como padro interno (PI).

Tabela 3.9 Volumes utilizados para a construo da curva analtica de quercetrina.
Volume (nL) Concentrao
(g/mL) Soluo-me PI Metanol Final
5 10 50 940 1000
15 30 50 920 1000
25 50 50 900 1000
35 70 50 880 1000
45 90 50 860 1000

As anlises estatsticas dos dados foram obtidas pelo mtodo de regresso linear
expressa pela equao de primeira ordem y = ax + b, onde y corresponde rea do pico, x
corresponde concentrao (ng/mL), a corresponde ao coeficiente angular e b ao coeficiente
lienar. O coeficiente de correlao R
2
tambm foi calculado (RIBANI et al., 2004; BRASIL,
2003).

3.2.4.4. Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ)
H diferentes maneiras de se obter os limites de deteco e de quantificao, mas o
mtodo baseado em parmetros da curva analtica o mais adequado por ser estatisticamente
mais confivel (RIBANI et al., 2004; BUENO, 2007; BRASIL, 2003). Para se calcular estes
dados uma nova curva analtica foi feita na faixa de concentrao prxima ao limite de
deteco.
As concentraes 0,5, 1,0 e 1,5 ng/mL foram selecionadas de maneira visual
conforme o rudo presente no cromatograma de uma amostra. As diluies foram feitas em
triplicata a partir de uma soluo-me 2 de concentrao de 0,1 mg/mL obtida da diluio de
10 vezes da soluo-me de quercetrina de 1 mg/mL. Trs curvas analticas foram obtidas por
regresso linear. Em seguida, obtiveram-se a estimativa do desvio padro do coeficiente linear
(Sb) e a estimativa do desvio padro do coeficiente angular (Sa) da curva. O LD foi calculado
de acordo com a Equao 3.10 e o LQ foi calculado de acordo com a Equao 3.11 (RIBANI
et al., 2004; BUENO, 2007).

Sa
Sb
LD . 3 , 3 =

Sa
Sb
LD . 10 =

3.2.4.5. Preciso
A preciso foi avaliada de duas maneiras: repetibilidade ou preciso intra-ensaio e
preciso intermediria ou preciso inter-ensaio (RIBANI et al., 2004; BRASIL, 2003).
As amostras utilizadas para avaliar este parmetro foram o extrato lquido de C.
langsdorffii do Planejamento Box Behnken ensaio 15 e o extrato seco de C. langsdorffii
tambm obtido do Planejamento Box Behnken ensaio 15. A anlise dos teores foi realizada
tanto para quercetrina quanto para afzelina.
Para a repetibilidade, seis preparaes de cada amostra foram injetadas em sequncia
no mesmo dia (dia 1), pelo mesmo analista sob as mesmas condies instrumentais e
cromatogrficas. Para anlise dos dados e determinao da preciso, calculou-se o coeficiente
de variao (CV) entre os teores quantificados no dia 1. Desta forma, o mtodo
(3.10)
(3.11)

cromatogrfico foi considerado preciso para a quantificao realizada no mesmo dia e nas
mesmas condies de anlise se o CV fosse menor que 5%.
Para a preciso intermediria, outras seis preparaes da amostra foram injetadas em
sequncia em outro dia (dia 2), pelo mesmo analista sob as mesmas condies instrumentais e
cromatogrficas. A varincia dos teores do dia 1 e do dia 2 foram ento obtidas para que se
pudesse realizar a comparao dos resultados empregando-se o teste F. Para tanto, a razo
entre a maior varincia pela menor varincia foi denominada F
calc
. O valor de F
calc
foi
comparado com o F
tabelado
com nvel de significncia () de 0,05 (5,05). Se F
calc
for menor que
F
tabelado
no h diferena estatsitca entre a quantificao dos teores do dia 1 e do dia 2 nas
mesmas condies de anlise. Assim, pode-se avaliar se o mtodo cromatogrfico foi preciso
para ensaios realizados em dias diferentes (BUENO, 2007; RIBANI et al., 2004; BRASIL,
2003).
3.2.4.6. Exatido
A exatido do mtodo foi realizada enriquecendo-se as amostras extrato lquido e
extrato seco de C. langsdorffii - com o padro de quercetrina em trs diferentes concentraes
(80, 100 e 120%) e avaliando-se sua recuperao dentro da faixa estudada. Para ambos os
extratos, a recuperao foi calculada para o padro atravs da razo entre sua concentrao
experimental e sua concentrao terica em porcentagem (RIBANI et al., 2004; BUENO,
2007; BRASIL, 2003).
3.2.4.7. Robustez
Para avaliar a robustez do mtodo utilizou-se a amostra de extrato lquido de C.
langsdorffii. Os fatores selecionados para avaliao foram o contedo de metanol na fase
mvel, o pH da gua acidifcada da fase mvel e a temperatura da coluna (Tabela 3.10). Com
o objetivo de avaliar estes fatores, foi utilizado um planejamento fatorial fracionrio 2
3-1

(Tabela 3.11).

Tabela 3.10 Fatores selecionados para a avaliao da robustez e seus valores.
Nveis
Fatores
(-1) (+1)
Contedo de metanol na fase mvel 2% a menos 2% a mais
pH da gua da fase mvel 2,3 2,7
Temperatura da coluna 35C 45C


3-1
utilizado para avaliar a robustez do
mtodo cromatogrfico.
Ensaio Temperatura da coluna
pH da gua da fase
mvel
Contedo de metanol na
fase mvel
1 -1 +1 -1
2 +1 +1 +1
3 -1 -1 +1
4 +1 -1 -1

As respostas avaliadas foram o tempo de reteno da quercetrina e da afzelina e o
valor da razo entre as reas de quercetrina ou afzelina e o padro interno. As respostas foram
analisadas pelo software Minitab 14.0 com nvel de significncia () de 0,05.
3.3.1. Equipamento
Os extratos secos foram obtidos por secagem em spray dryer de escala laboratorial
modelo LM MSD 0.5 (Labmaq do Brasil Ltda., Brasil) em regime de vazoconcorrente. A
cmara de secagem era cilndrica feita de material de vidro de borosilicato medindo 130 mm
de dimetro e 510 mm de altura. As condies de secagem estudadas no Planejamento Box-
Benken foram a temperatura de sada (Ts) e a vazoda amostra (Ws). No teste preliminar, a
Ts utilizada foi de 80C e a Ws foi de 5,0 g/min. O bico atomizador foi duplo fluido
pneumtico com orifcio de abertura de 1,2 mm que operou com taxa de vazo de ar de 40
L/min e presso de 5,0 bar. A vazo do gs de secagem foi de 0,6 m
3
/min. As condies de
secagem estudadas foram selecionadas dentro do limite de flamabilidade da mistura ar- etanol
(BERTHOLD e LOFFLER, 1993). O extrato seco foi coletado em frasco seco e tarado e, em
seguida, armazenado em frascos hermeticamente fechados contendo slica.

Figura 3.1 Fotografia do LM MSD 0.5 (Labmaq do Brasil Ltda., Brasil) e seus sistemas
principais: 1) chave geral 2) controle do aquecimento; 3) controle de
bombeamento de lquido; 4) cmara de secagem 5) separador de p 6) indicador
de temperatura de sada e 7) frasco coletor (LABMAQ, 2003).

3.3.2. Extratos Lquidos Utilizados para Secagem
O extrato lquido utilizado na secagem foi um extrato 1:5 (massa planta: volume de
extrato) obtido por 72h de macerao seguida de percolao com soluo hidroalcolica a
70GL. Este extrato foi denominado Extrato Lquido de C. lagnsdorffii 2,5% m/m. Para obter
os extratos com maior valor de slidos solveis (12,5% m/m e 22,5% m/m) o extrato 2,5%
m/m foi concentrado em rotoevaporador (Fisatom modelo 550) sob presso reduzida de -700
mmHg e temperatura de 55C at obter a concentrao terica de slidos solveis desejada.
Os Extratos Lquidos obtidos (2,5; 12,5 e 22,5% m/m) foram caracterizados quanto aos
teores de slidos solveis, flavonides totais, quercetrina e afzelina.

3.3.3. Experimento Preliminar e Excipientes Estudados
Inicialmente, foi realizado um estudo preliminar obtendo extrato seco de C.
langsdorffii com diferentes excipientes tendo por finalidade comparar estes extratos e
selecionar o excipiente que fornecesse as melhores caractersticas fsicas.
A proporo de slidos de C. langsdorffii: excipiente foi de 3:1 e foi mantida
constante.
Os excipientes utilizados, seu fabricante ou fornecedor e o respectivo lote esto
descritos na Tabela 3.12.

Tabela 3.12 Lista dos excipientes utilizados no teste preliminar, seu fabricante ou
fornecedor e o respectivo lote.
Excipiente
Nome qumico Nome Comercial
Fabricante ou
Fornecedor
Lote
Maltodextrina Maltodextrina Mor-Rex 1920 Corn Products 0000361377
Dixido de silcio coloidal Cabosil M-5 Makeni 1232691
Amido Amido Corn Products 0000394168
D-manitol Manitol (oral) Henrifarma H360912012
Lactose monohidratada Lactose M-200 (alimentcio) Henrifarma 13651
Sorbitol Sorbitol p Cosmoqumica 45229
Celulose microcristalina Celulose Microcrsitalina Henrifarma C1004047
Amido de milho modificado Capsul
National
Starch
HKY- 0840

3.3.4. Planejamento Experimental
O planejamento experimental utilizado para estudar as condies de secagem foi o
Planejamento Box-Behnken (Tabela 3.4). As condies selecionadas para estudo foram:
temperatura de sada (Ts), a vazoda amostra (Ws) e a concentrao do extrato (Cs). Estes
fatores foram codificados conforme as equaes 3.12, 3.13 e 3.14 e a relao para cada nvel
encontram-se na Tabela 3.13.

20
100
6
=
Ts
X

5 , 2
5 , 7
7
=
Ws
X

(3.12)
(3.13)

10
5 , 12
8
=
Cs
X
Tabela 3.13 Fatores estudados no Planejamento Box-Behnken e seus nveis +1, 0 e -1.
Denominao Nveis
Fatores
Temperatura de sada (C) X
6
Ts 80 100 120
Vazoda amostra (g/min) X
7
Ws 5,0 7,5 10,0
Concentrao do extrato (% m/m) X
8
Cs 2,5 12,5 22,5

3.3.5. Caracterizao Fsico-Qumica dos Extratos Secos
Os extratos secos obtidos foram avaliados por perda por dessecao, densidade
aparente, compactao atravs do ndice de Carr, fluidez atravs do ngulo de repouso,
dimetro mdio e distribuio granulomtrica (tamisao). As anlises foram feitas em
triplicata.
3.3.5.1. Umidade
A umidade dos extratos secos foi medida por mtodo gravimtrico utilizando-se um
equipamento de lmpada de halognio (MB 45, Ohaus Co., Pine Brook, NJ) pesando-se 0,5 g
dos extratos secos. Para extratos secos por spray dryer, considerada adequada umidade entre
3 e 7% (COUTO et al., 2011).
3.3.5.2. Densidade Compactada
Este valor foi obtido colocando-se uma massa (m) do extrato seco em uma proveta de
10 mL limpa e seca. O extrato seco foi compactado com 200 pancadas sucessivas da proveta
sobre um pedao de borracha e o volume por ele ocupado foi anotado (vol). A densidade
compactada (d
c
) foi calculada conforme a Equao 3.15.
vol
m
d
c
=

3.3.5.3. ndice de Carr
O ndice de Carr (IC) uma medida indireta para avaliar a capacidade de
compactao de ps. Para se calcular este ndice, utilizado a densidade compactada (d
c
), ou
seja o valor encontrado de densidade aps realizar a compactao do p na proveta, e a
densidade bruta (d
b
) que o valor de densidade antes que o p seja compactado (Equao
3.16).

(3.14)
(3.15)

100 x
d
d d
IC
b
b c

=
Valores abaixo de 15% para o ndice de Carr indicam uma excelente fluidez.
Entretanto, valores do ndice de Carr acima de 20% apresentam um vazodebilitado de certa
maneira (USP XXX, 2008).
3.3.5.4. ngulo de Repouso
O aparato utilizado consistiu de um funil de plstico considerando-se as medidas
internas do funil da maneira como esquematizado no Esquema 1. Um grama do extrato seco
foi suficiente para a realizao das anlises. Foram feitas trs determinaes.

Figura 3.2 Aparato utilizado para obteno do ngulo de repouso dos extratos secos.

Atravs da altura (h) e do dimetro (d) do cone pde-se calcular o ngulo de repouso
() pela Equao 3.17.
d
h
tg arc
2
=
A partir do ngulo de repouso pde-se analisar a fluidez dos extratos secos obtidos
de acordo com a Tabela 3.14.

Tabela 3.14 Relao entre ngulo de repouso e fluidez (USP XXX, 2008).
ngulo repouso () Fluidez
< 20 tima
h
6,9 cm
1,1 cm
1,0 cm
4,0 cm
4
,
0

c
m

4
,
0

c
m

3
,
0

c
m

0,9 cm
86

(3.16)
(3.17)
d

20 a 30 boa
30 a 40 aceitvel
> 40 ruim
3.3.5.5. Dimetro Mdio e Distribuio Granulomtrica
Foi utilizada a tcnica de peneiramento. Para a seleo do tamanho de abertura dos
tamises, realizou-se um teste inicial com os extratos secos, com a finalidade de obter a maior
quantidade da amostra dentro da faixa de tamanho das malhas dos tamises selecionados. O
tamanho da amostra variou de acordo com a quantidade de extrato seco disponvel. Foram
utilizados tamises produzidos pela Bronzinox Ltda. constitudos de tela em ao inox. Foram
utilizadas malhas com abertura de: 855, 605, 400, 256, 181, 128, 98, 76,5, 54, e 45 m. Os
ps foram previamente tamisados em tamis 1000 m para que os agregados fossem retirados
e desconsiderados. O dimetro mdio de partcula (d
50
) foi determinado atravs da
distribuio granulomtrica cumulativa (ANSEL et al., 2000; AULTON, 2005).
3.3.5.6. Umidade de Equilbrio
Um dessecador hermeticamente fechado contendo soluo saturada de cloreto de
sdio para proporcionar umidade de 75% UR e sob temperatura de 25C foi utilizado. Cem
miligramas de cada extrato seco foram pesados em recipiente aberto, seco e previamente
tarado e armazenados no dessecador por 72 h. Aps este perodo, os extratos foram pesados e
a diferena de peso inicial e final foi considerada como a umidade absorvida por eles
(KOPLEMAN et al., 2001).
3.3.5.7. Rendimento
O rendimento do processo de secagem (0) foi calculado com base na razo da massa
de extrato seco obtida aps secagem (m
f
) pelos slidos totais presentes na soluo de
alimentao. A Equao 3.18 apresenta como foi calculado o rendimento onde m
i
a massa
de extrato de C. langsdorffii utilizada, m
exc
a massa de excipiente e Cs a concentrao do
extrato de C. langsdorffii expresso em percentual (KOESTER et al., 2004; VASCONCELOS
et al., 2005).

100 .
] ) 100 . (
exc i
f
m m Cs
m
+
=

(3.18)

3.3.5.8. Eficincia de Secagem
A eficincia de secagem () foi calculada atravs da razo entre a massa de slidos
recolhida durante o tempo do processo de secagem pelo vazoda amostra (Ws) previamente
ajustado, onde m
i
a massa de extrato de C. langsdorffii utilizada, m
exc
a massa de
excipiente adicionado e t o tempo de secagem.

100 .
. Ws t
m m
exc i
+
=

3.3.5.9. Quantificao de Flavonides Totais
O teor de flavonides totais foi obtido pelo mesmo mtodo descrito em 3.2.3.2.
3.3.5.10. Quantificao dos Marcadores Qumicos por CLAE
Os marcadores qumicos quercetrina e afzelina foram quantificados pelo mesmo
mtodo descrito em 3.2.3.3.
3.3.5.11. Degradao de Flavonides Totais, Quercetrina e Afzelina
Para o clculo de degradao de flavonides totais, quercetrina e afzelina os extratos
lquidos de partida e os extratos secos foram quantificados. Denominou-se de teor terico o
obtido na quantificao do extrato lquido de partida considerado na base seca e de teor
prtico o teor obtido na quantificao do extrato seco. Assim, fez-se a razo entre a diferena
do teor terico e do prtico sobre o teor terico em porcentagem.

(3.19)
46
4. Resultados e Discusso

4.1. Droga Vegetal
4.1.1. Caracterizao
As folhas secas e modas de C. langsdorffii apresentaram 6,51 0,20% m/m de
umidade, 2,94 0,07% m/m de cinzas totais, 0,27 0,09% m/m de cinzas insolveis em
cido clordrico e substncias extraveis em lcool de 32,12 0,93% m/m.
De maneira geral, nas monografias da Farmacopia Brasileira (2010) de plantas das
quais se utilizam as folhas secas a mdia de limite mximo aceitvel de umidade de 10%
m/m, de cinzas totais de 5% m/m e de cinzas insolveis de 1% m/m. Portanto, os
resultados encontrados para as folhas secas e modas de C. langsdorffii esto aceitveis.
O valor de substncias extraveis em lcool considerado como o mximo possvel
de substncias que se pode extrair da planta devido ao drstico mtodo de extrao que se
utiliza para tanto. Cada planta apresenta uma quantidade de substncias extraveis em lcool
de acordo com suas caractersticas. Assim, este valor uma referncia para possvel
comparao dos resultados de rendimento de extrao de slidos solveis obtidos por outros
mtodos extrativos.
O dimetro mdio das folhas secas e modas foi de 561 m com distribuio
granulomtrica bimodal sendo que 90% delas apresentaram dimetro, d
90%
, abaixo de 925
m (Figura 4.1).
importante analisar a distribuio granulomtrica da droga vegetal utilizada, pois o
tamanho de partcula pode influenciar a extrao dos constituintes qumicos. H na literatura,
estudos em que a droga vegetal utilizada foi padronizada em tamanhos de partcula de 825 a
150 m. Desta forma, o tamanho mdio de partcula das folhas secas e modas de C.
langsdorffii utilizadas est coerente com os estudos realizados e disponveis na literatura
(LUTHRIA, BISWAS e NATARAJAN, 2007; DIOUF, STEVONOVICA e BOUTIN, 2009;
FAN et al., 2008; JACQUES et al., 2007).

Resultados e Discusso | 47

3
1
,
5
8
4
,
5
1
2
8
1
6
5
2
1
5
2
7
5
3
6
2
,
5
4
6
2
,
5
5
5
0
6
5
5
7
8
0
9
2
5
1
2
0
0
1
5
5
0
1
8
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110

F
r
e
q
u
n
c
i
a

g
r
a
n
u
l
o
m
t
r
i
c
a

(
%
)
Abertura mdia do tamis ( m)
Acumulada
Normal

Figura 4.1 Distribuio granulomtrica das folhas secas e modas coletadas de C.
langsdorffii.

4.2. Validao do Mtodo Cromatogrfico
Para desenvolver o mtodo analtico para as amostras de C. langsdorffii diferentes
gradientes para fase mvel foram avaliados assim como diferentes colunas de fase reversa
CN, C8 e C18, para que as condies cromatogrficas que apresentaram melhor separao e
resoluo dos picos pudessem ser selecionadas.
Para a escolha do padro interno, diversos padres disponveis em laboratrio foram
injetados: cido cafico, cido cinmico, cido p-cumrico, aromadendrina e isosakuranetina.
Todos estes padres eluram no mesmo tempo de reteno de outro pico da amostra e, por
isso, foram descartadas como possibilidade de padro interno. Em seguida, uma soluo de
cumarina foi injetada e observou-se que sua eluio no mtodo desenvolvido ocorria em uma
janela de anlise (t
R
= 40 min) e, portanto, a cumarina foi selecionada como padro interno.

4.2.1. Seletividade
A seletividade de um mtodo instrumental de separao a capacidade de avaliar, de
forma inequvoca, as substncias em exame na presena de componentes que podem interferir
com a sua determinao em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de
interferncia de espcies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de
degradao, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar,
porventura, presentes. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do
composto de interesse (RIBANI et al., 2004).
Para avaliar se o mtodo cromatogrfico desenvolvido foi seletivo para a quercetrina
e afzelina nas amostras de extrato lquido e extrato seco, comparou-se o perfil cromatogrfico
dos padres com o perfil cromatogrfico das amostras e dos excipientes (matrizes sem extrato
de copaba) alm de confrontar seus tempos de reteno e os espectros de UV.
Como pode ser observado, a soluo hidroalcolica utilizada no estudo de extrao
(Figura 4.2 B) e o excipiente manitol (Figura 4.2 A) utilizado no estudo de secagem no
apresentaram picos e nem interferentes que elussem com mesmo tempo de reteno do PI
(cumarina) ou dos marcadores qumicos quercetrina e afzelina.
Os picos do PI (cumarina) e dos marcadores qumicos quercetrina e afzelina em cada
cromatograma estavam sem interferentes visto que os comprimentos de onda mximos
apresentaram as bandas espectrofotomtricas caractersticas de cada substncia considerando-
se, assim, que no houve co-eluio.


Figura 4.2 Cromatogramas de: (A) pico de PI (cumarina) na amostra de excipiente manitol;
(B) pico de PI na amostra de soluo hidroalcolica; (C) pico de PI e padro de
quercetrina; (D) pico de PI e padro de afzelina; (E) perfil do Extrato Lquido de
C. langsdorffii; (F) perfil do Extrato Seco de C. langsdorffii. PI (cumarina): t
R
=
40 minutos e
mx
= 277 e 309 nm; Quercetrina: t
R
= 53 minutos e
mx
= 255 e
349 nm; e Afzelina: t
R
= 61 minutos e
mx
= 264 e 343 nm.

4.2.2. Linearidade e Curva Analtica
A linearidade corresponde capacidade do mtodo em fornecer resultados
diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame, dentro de uma
determinada faixa de aplicao (RIBANI et al., 2004).
10 20 30 40 50 60 70 min
254nm4nm (1.00)/smth
(A)
(E)
(D)
(C)
(F)
275nm4nm(1.00)/smth
(B)

A linearidade foi verificada na faixa de quantificao aplicada para as amostras
utilizando as concentraes para a elaborao das curvas analticas (Tabelas 4.1 e 4.2).

Tabela 4.1 rea da quercetrina e do PI (cumarina) e razo entre elas e a concentrao
utilizada (n=3).

y = 0,0854x - 0,088
R
2
= 0,9999
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100
Concentrao (g/mL)
R
a
z
o

d
a
s

r
e
a
s

Figura 4.3 Curva analtica e equao da reta para quercetrina.

Tabela 4.2 rea da afzelina e do PI (cumarina) e razo entre elas e a concentrao utilizada
(n=3).
rea Mdia Concentrao
(g/mL) Afzelina PI
Razo
5 186435,3 3441,6 812380,0 6930,8 0,229 0,002
15 653729,3 3978,3 835856,3 5744,4 0,782 0,004
25 1136661,3 2689,6 821891,3 1456,0 1,383 0,002
35 1604515,3 9161,1 844433,7 3592,8 1,900 0,003
45 2043496,7 9872,3 820350,3 6640,4 2,491 0,009

rea Mdia Concentrao
(g/mL) Quercetrina PI
Razo
10 683979,0 2804,1 871532,3 9267,6 0,785 0,008
30 2185681,7 12884,9 895250,7 9875,4 2,441 0,013
50 3682549,7 15011,7 883427,7 9024,4 4,168 0,035
70 5258439,3 57567,6 885601,3 13296,8 5,938 0,025
90 6747748,7 65068,6 890682,7 11719,5 7,576 0,027

y = 0,0564x - 0,0531
R
2
= 0,9996
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 10 20 30 40 50
Concentrao (g/mL)
R
a
z
o

d
a
s

r
e
a
s

Figura 4.4 Curva analtica e equao da reta para afzelina.

Como pode ser observado nas Figuras 4.3 e 4.4, os coeficientes de correlao linear
(R
2
) obtidos apresentaram valores acima de 0,999 aceito pela ANVISA e INMETRO
(RIBANI et al., 2004). Desta forma, o mtodo cromatogrfico linear para a quantificao de
quercetrina e afzelina na faixa de concentrao avaliada.
4.2.3. Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ)
O limite de deteco (LD) representa a menor concentrao da substncia de
interesse que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada, utilizando um
determinado procedimento experimental (RIBANI et al., 2004; BUENO, 2007).
O limite de quantificao (LQ) representa a menor concentrao da substncia em
exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental (RIBANI
et al., 2004; BUENO, 2007).
O LD foi calculado de acordo com a Equao 3.10 e o LQ foi calculado de acordo
com a Equao 3.11.
Para a quercetrina, o LD encontrado foi de 1,21 g/mL e o LQ foi de 3,66 g/mL.

Tabela 4.3 Anlise estatstica das curvas analticas para obteno dos limites de deteco e
quantificao.
rea Quercetrina Concentrao Quercetrina
(g/mL)
Curva 1 Curva 2 Curva 3
Mdia S
0,5 16141 16019 15989 16050 81
1 32877 34265 34249 33797 797
1,5 50611 51617 51720 51316 613
Coeficiente angular (a) 34470 35598 35731 35266 693
Coeficiente linear (b) -1260 -1631 -1745 -1545 253

mL g LD / 21 , 1
693
253
. 3 , 3 = =
(4.1)

mL g LQ / 66 , 3
693
253
. 10 = =
(4.2)

Os LD e LQ encontrados foram relativamente altos vistos os resultados de Sousa
(2011) que encontrou para a quercetrina 0,32 e 0,96 ng/mL, respectivamente. Deve-se
considerar que Sousa (2011) utilizou coluna monoltica e acetonitrila na fase mvel o que
pode ter feito com que o mtodo ficasse mais sensvel e preciso apresentando, assim menores
valores para limite de deteco e de quantificao para a quercetrina.
4.2.4. Preciso
A preciso representa a disperso de resultados entre ensaios independentes,
repetidos de uma mesma amostra sob condies definidas. A preciso foi avaliada de duas
maneiras: repetibilidade ou preciso intra-ensaio e preciso intermediria ou preciso inter-
ensaio (RIBANI et al., 2004).
A repetibilidade representa a concordncia entre os resultados de medies
sucessivas de um mesmo mtodo, efetuadas sob as mesmas condies. Para tanto, foram
feitas seis medies da mesma amostra, em diferentes preparaes e a repetibilidade foi
expressa atravs do coeficiente de variao (CV) (RIBANI et al., 2004).
Como observado na Tabela 4.4 e Tabela 4.5, os valores de coeficiente de variao
(CV) para a preciso das anlises de quercetrina e afzelina apresentaram-se menores que 5%.
Assim, pode-se dizer que o mtodo utilizado no apresentou grandes disperses nas respostas
de uma mesma amostra tanto para o extrato lquido quanto para o extrato seco de C.
langsdorffii e, por isso, apresenta repetibilidade.


nas repeties no dia 1.
Teor (mg/mL)
Amostras
Quercetrina Afzelina
1 0,683 0,391
2 0,699 0,400
3 0,698 0,399
4 0,706 0,405
5 0,712 0,406
6 0,714 0,410
Mdia 0,702 0,402
S 0,011 0,007
CV(%) 1,6 1,7
S
2
0,00012 0,00005

Teor (mg/g)
Amostras
1 24,896 7,367
2 25,102 7,519
3 25,691 7,753
4 26,051 7,831
5 26,181 7,922
6 25,826 7,807
Mdia 25,625 7,700
S 0,518 0,212
CV(%) 2,0 2,8
S
2
0,268 0,045

A preciso intermediria indica o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a
eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma
combinao destes fatores. A preciso intermediria reconhecida como a mais
representativa da variabilidade dos resultados em um nico laboratrio e, como tal, mais
aconselhvel de ser adotada. O objetivo da validao da preciso intermediria verificar que
no mesmo laboratrio o mtodo fornecer os mesmos resultados.
Para a preciso intermediria, a mesma amostra da repetibilidade foi novamente
preparada seis vezes de maneira semelhante, pelo mesmo analista sob as mesmas condies
instrumentais e cromatogrficas, porm em outro dia (dia 2).


Teor (mg/mL)
Amostras
1 0,700 0,404
2 0,685 0,395
3 0,694 0,401
4 0,691 0,399
5 0,688 0,398
6 0,688 0,397
Mdia 0,691 0,399
S 0,005 0,003
CV(%) 0,8 0,8
S
2
0,00003 0,00001

Teor (mg/g)
Amostras
1 23,283 7,083
2 24,685 7,392
3 25,515 7,606
4 24,343 7,267
5 24,972 7,457
6 24,027 7,192
Mdia 24,471 7,333
S 0,776 0,190
CV(%) 3,2 2,6
S
2
0,602 0,036

Tabela 4.8 Resultados de varincia (S
2
) e do F
calc
para o teor de quercetrina e afzelina no
extrato lquido e extrato seco de C. langsdoffii.
Extrato lquido Extrato seco

Quercetrina Afzelina Quercetrina Afzelina
S
2
dia 1 0,00012 0,00005 0,268 0,045
S
2
dia 2 0,00003 0,00001 0,602 0,036
F
calc
0,231 0,239 2,245 0,803

Todos os F
calc
foram menores que o F
tabelado
(5,05) quando n=6 para ambos os dias e
nvel de significncia de 0,05. Desta forma, a disperso dos resultados para as anlises de
extrato lquido e extrato seco de C. langsdorffii no apresentaram diferena significativa entre
os diferentes dias.

4.2.5. Exatido
Representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados em
um determinado ensaio e um padro (RIBANI et al., 2004). Este parmetro deve ser avaliado,
pois a substncia de interesse pode ser perdida ao diluir a amostra provinda de matrizes
complexas em solues mais simples ou retida na prpria matriz durante o preparo da
amostra, levando a erros de quantificao (BUENO, 2007).

de Extrato Lquido de C. langsdorffii.
Amostras Concentrao VR Rec (%) Mdia S CV (%)
VT: 11,2 g/mL
1 9,645 86,120
2 9,610 85,807
3
80%
9,903 88,419
86,782 1,4 1,6
VT: 14,0 g/mL
1 12,078 86,268
2 12,536 89,545
3
100%
12,504 89,317
88,377 1,8 2,1
VT: 16,8 g/mL
1 15,662 93,228
2 15,417 91,766
3
120%
16,092 95,787
93,594 2,0 2,2
VR: valor real; VT: valor terico; Rec (%): recuperao; S: desvio padro;
CV: coeficiente de variao

de Extrato Seco de C. langsdorffii.
Amostras Concentrao VR Rec (%) Mdia S CV (%)
VT: 11,2 g/mL
1 10,965 97,902
2 10,255 91,559
3
80%
10,436 93,178
94,213 3,3 3,498
VT: 14,0 g/mL
1 12,488 89,199
2 13,122 93,726
3
100%
16,124 95,973
91,670 2,3 2,500
VT: 16,8 g/mL
1 15,866 94,438
2 10,965 97,902
3
120%
10,255 91,559
94,884 0,9 0,999
VR: valor real; VT: valor terico; Rec (%): recuperao; S: desvio padro;
CV: coeficiente de variao


A recuperao do mtodo apresentou-se com valores acima de 90% para o extrato
seco nas trs concentraes estudadas com coeficiente de variao menores que 5%. J para o
extrato lquido, a exatido foi crescente da menor para a maior concentrao tambm com
coeficientes de variao abaixo de 5%. Na literatura, se aceita exatido do mtodo entre 80 a
120%. Portanto, o mtodo satisfatrio quanto exatido para quantificao de quercetrina
em extrato lquido e extrato seco de C. langsdoffii.
4.2.6. Robustez
A robustez de um mtodo mede a sensibilidade que este apresenta frente a pequenas
variaes. Diz-se que um mtodo robusto quando ele no afetado por uma modificao
pequena e deliberada em seus parmetros (RIBANI et al., 2004).
Os fatores estudados para avaliar a robustez do mtodo foram: temperatura da
coluna, pH da gua da fase mvel e a porcentagem de metanol na fase mvel. Para tanto, foi
utilizado um planejamento fatorial fracionrio 2
3-1
. As respostas avaliadas foram tempo de
reteno e razo entre as reas de quercetrina ou afzelina e do PI (cumarina) (Tabela 4.11).

Tabela 4.11 Resultados para tempo de reteno (t
R
) da quercetrina e razo entre as reas de
quercetrina e do PI na anlise de robustez do mtodo cromatogrfico.
Resultados
Ensaio
Temperatura
da coluna
pH da gua
Metanol na
fase mvel
t
R
(min)
quercetrina
Razo entre
reas
1 -1 (35C) +1 (2,7) -1 (-2%) 58,643 2,44612
2 +1 (45C) +1 (2,7) +1 (+2%) 49,711 2,39398
3 -1 (35C) -1 (2,5) +1 (+2%) 53,676 2,56168
4 +1 (45C) -1 (2,5) -1 (-2%) 55,540 2,45626

Como pode ser observado na Figura 4.5, na avaliao da razo entre as reas de
quercetrina e do padro interno, nenhum valor de estimativa dos efeitos dos fatores foi acima
de 1,501, acima do qual representa significncia estatstica (=0,05).

Temperatura
pH
Metanol
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50

Estimativa dos Efeitos

Figura 4.5 Diagrama para a resposta razo entre as reas de quercetrina e do PI na
avaliao de robustez do mtodo cromatogrfico.

Como pode ser observado na Figura 4.6, na avaliao do tempo de reteno da
quercetrina, nenhum valor de estimativa dos efeitos dos fatores foi acima de 67,36, acima do
qual representa significncia estatstica (=0,05).
Temperatura
pH
Metanol
0 10 20 30 40 50 60 70

Figura 4.6 Diagrama para a resposta tempo de reteno da quercetrina na avaliao da
robustez do mtodo cromatogrfico.

Como pode ser observado na Figura 4.7, na avaliao da razo entre as reas de
afzelina e do padro interno, nenhum valor de estimativa dos efeitos dos fatores foi acima de
0,227, acima do qual representa significncia estatstica (=0,05).

Temperatura
pH
Metanol
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25


Figura 4.7 Diagrama para a resposta razo entre as reas de afzelina e do PI na avaliao de
robustez do mtodo cromatogrfico.

Como pode ser observado na Figura 4.8, na avaliao do tempo de reteno da
afzelina, nenhum valor de estimativa dos efeitos dos fatores foi acima de 77,59 acima do qual
representa significncia estatstica (=0,05).
Temperatura
pH
Metanol
0 10 20 30 40 50 60 70 80


Figura 4.8 Diagrama para a resposta tempo de reteno da afzelina na avaliao da robustez
do mtodo cromatogrfico.

Estes resultados demonstram que o mtodo cromatogrfico desenvolvido para
analisar extrato lquido e extrato seco de C. langsdorffii um mtodo robusto para o qual

pequenas variaes na porcentagem de metanol da fase mvel e no seu pH ou na temperatura
da coluna no induzem a erro analtico nas condies avaliadas.
4.3. Extrao
4.3.1. Planejamento Fatorial Fracionrio
Inicialmente, visto o grande nmero de possveis fatores a serem investigados na
extrao e o desconhecimento da relao das variveis sobre as respostas estudadas, o
planejamento fatorial fracionrio foi selecionado com a finalidade de realizar uma triagem dos
fatores evitando que fatores importantes fossem excludos do estudo e descartando fatores
menos significantes.
Com referncia na literatura (POMPEU, SILVA e ROGEZ, 2009; PIZARRO,
GONZLEZ-SIZ e PREZ-DEL-NOTARIO, 2006; SHEIBANI e GHAZIASKAR, 2008;
LIAO et al., 2008), os fatores massa de planta, proporo etanol/ gua, temperatura de
extrao, tempo de extrao e velocidade de agitao foram selecionados para realizar o
planejamento fatorial fracionrio com a finalidade de selecionar trs destes fatores para
utiliz-los nos prximos experimentos do estudo de extrao. Assim, utilizou-se um
planejamento fatorial fracionrio, ou seja, meia frao de um planejamento fatorial completo
de cinco fatores e dois nveis, perfazendo 8 experimentos (Tabela 3.2). A partir dos resultados
obtidos das repostas avaliadas (Yi): slidos solveis (SS), rendimento de slidos solveis
(O
SS
), flavonides totais (FT) e os marcadores qumicos quercetrina (Q) e afzelina (A) ,
realizou-se o clculo da estimativa dos efeitos atravs da Equao 3.1 para verificar as
influncias mais significativas na extrao (Figura 4.2).
A intensidade (valor em mdulo) da estimativa dos efeitos do planejamento fatorial
fracionrio permite avaliar, comparativamente entre os fatores, seu impacto nas respostas
estudadas. De maneira geral, os fatores que menos influenciaram nas respostas foram tempo
(t) e temperatura (T) seguidos da velocidade de agitao (v). Os fatores que mais
influenciaram em todas as respostas foram massa de planta (Mp) e proporo de etanol/ gua
(EA).

Figura 4.9 Estimativa dos efeitos obtidos para cada fator estudado no planejamento fatorial
fracionrio 2
5-2
de acordo com as observaes: (A) slidos solveis; (B)
rendimento de slidos solveis; (C) flavonides totais, (D) teor de quercetrina e
(E) teor de afzelina. Valores positivos: e valores negativos:

A literatura disponvel relata resultados divergentes em relao temperatura em
mtodos extrativos (MOURE et al., 2001). De maneira geral, o aumento na temperatura tende
a favorecer a extrao atravs do aumento da solubilidade do soluto, do coeficiente de difuso
Mp
EA
t
T
v
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Flavonides totais

Estimativa dos efeitos
Mp
EA
t
T
v
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Rendimento de Slidos Solveis

Mp
EA
t
T
v
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
Slidos Solveis

Mp
EA
t
T
v
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Teor de Afzelina

Mp
EA
t
T
v
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Teor Quercetrina

Mp
EA
t
T
v
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Flavonides totais

Mp
EA
t
T
v
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Rendimento de Slidos Solveis

Mp
EA
t
T
v
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
Slidos Solveis

Mp
EA
t
T
v
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Teor de Afzelina

Mp
EA
t
T
v
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Teor Quercetrina


e da constante dieltrica da gua (PINELO, SINEIRO e NUEZ, 2006). J que nos
experimentos realizados as temperaturas estudadas foram de 25C e 50C podem ter sido
baixas para visualizar que a temperatura capaz de afetar a solubilidade do soluto, o
coeficiente de difuso e a constante dieltrica da gua. Entretanto, bastante custoso realizar
o processo de extrao em larga escala a temperaturas maiores que 50C. Alm disso, a
temperatura no pode ser aumentada indefinidamente devido instabilidade dos compostos
fenlicos a temperaturas acima de 50C (CACACE e MAZZA, 2003).
A velocidade de agitao teve maior intensidade do efeito nas respostas que o tempo
de extrao e a temperatura indicando que a homogeneizao do solvente com o soluto auxilia
a extrao mesmo nas velocidades de 300 ou 600 rpm. Em uma comparao entre ensaios de
extrao sem e com agitao, seria possvel que o efeito da agitao sobre as respostas
pudesse ser mais pronunciado.
As observaes das respostas de slidos solveis, flavonides totais e teor de
quercetrina e afzelina (Figura 4.9 A, C, D e E, respectivamente) apresentaram, para todos os
fatores estudados, valores positivos da estimativa de efeitos. Portanto, pode-se inferir que a
extrao de slidos solveis, flavonides totais, quercetrina e afzelina das folhas de C.
langsdorffii foi diretamente proporcional aos fatores estudados. Assim, por exemplo, quanto
maior a massa de planta utilizada e quanto maior a proporo etanol/ gua, maior a extrao
de slidos solveis, flavonides totais, quercetrina e afzelina das folhas de C. langsdorffii.
Este resultado coerente com a literatura (LIST e SCHIMIDT, 1989) visto que slidos
solveis e compostos fenlicos, entre eles flavonides e fenis, so substncias extradas da
planta e, quanto maior a massa de planta utilizada, maior sua disponibilidade para serem
extrados. Alm disso, altas propores de etanol em solues hidroalcolicas auxiliam a
extrao de flavonides e compostos fenlicos (HUANG et al., 2009; PINELO, SINEIRO e
NUEZ, 2006).
A observao de rendimento de slidos solveis foi influenciada de maneira inversa
massa de planta o que representa que quanto maior a massa de planta utilizada menor o
rendimento de slidos solveis. Isso ocorre provavelmente porque ocorre saturao no
solvente tambm j observada e relatada na literatura (LIST e SCHIMIDT, 1989).
Desta forma, pde-se selecionar massa de planta (Mp), proporo de etanol/ gua
(EA) e velocidade de agitao (v) para dar continuidade ao estudo de extrao j que foram
estes fatores os que influenciaram mais significativamente na extrao de slidos solveis,
rendimento de slidos solveis, flavonides totais, quercetrina e afzelina.

4.3.2. Planejamento Box-Behnken
Atravs da tcnica estatstica de metodologia de superfcie de resposta (MSR) foi
possvel obter a relao matemtica da resposta com as variveis por regresso mltipla, ou
seja, foi possvel obter uma equao emprica de previso da resposta em funo das variveis
estudadas. Alm disso, a MSR permite identificar os efeitos das variveis estudadas de forma
isolada, assim como a interao entre elas e suas contribuies quadrticas
A influncia dos fatores massa de planta, proporo etanol/ gua e velocidade de
agitao sobre a extrao de slidos solveis (SS), rendimento de slidos solveis (O
SS
),
flavonides totais (FT), quercetrina (Q) e afzelina (A) foi estudada utilizando-se o planejamento
Box-Behnken. Os resultados para cada resposta estudada esto apresentados na Tabela 4.12.
A preciso dos resultados pode ser avaliada atravs das observaes obtidas no nvel
central do planejamento experimental (ensaios 13, 14 e 15), em que as diferenas foram
menores que 1% para slidos solveis, rendimento de slidos solveis, flavonides totais,
quercetrina e afzelina.
A identificao dos parmetros significativos foi realizada pelo software Statistica 5.
Estabeleceu-se como significativos os parmetros com P<0,05 e negligenciados os
parmetros que apresentaram nvel de significncia maior que 0,05.

solveis (0
SS
), flavonides totais (FT), quercetrina (Q) e afzelina (A) estudadas
no planejamento Box-Behnken para extrao a partir das folhas de C.
langsdorffii Desf.
Respostas
Ensaios
SS (% m/v)
SS
(%) FT (mg/mL) Q (mg/mL) A (mg/mL)
1 0,79 0,03 19,8 0,6 0,173 0,009 0,229 0,128
2 2,47 0,01 12,3 0,1 0,613 0,074 0,907 0,502
3 0,99 0,04 24,6 0,9 0,367 0,004 0,308 0,176
4 2,82 0,02 14,1 0,1 1,287 0,026 0,943 0,546
5 0,93 0,03 23,2 0,8 0,355 0,079 0,307 0,174
6 2,75 0,02 13,7 0,1 0,840 0,022 0,923 0,525
7 0,91 0,02 22,7 0,6 0,292 0,010 0,294 0,167
8 2,89 0,02 14,5 0,1 0,868 0,022 0,958 0,540
9 1,90 0,02 15,8 0,2 0,544 0,016 0,558 0,311
10 2,09 0,02 17,4 0,1 0,883 0,070 0,690 0,401
11 1,91 0,06 15,9 0,5 0,531 0,028 0,630 0,349
12 2,16 0,04 17,9 0,3 0,861 0,021 0,762 0,435
13 2,06 0,06 17,1 0,5 0,639 0,018 0,728 0,411
14 2,08 0,01 17,4 0,3 0,644 0,012 0,737 0,412
15 2,04 0,06 17,0 0,5 0,642 0,014 0,742 0,415

4.3.2.1. Anlise estatstica para Slidos Solveis (SS)
A Equao 4.3 o modelo ajustado (R
2
= 0,994) obtido da anlise estatstica que
relaciona a resposta, slidos solveis, e os fatores significativos codificados, massa de planta
(X
1
) e proporo etanol/ gua (X
2
).

SS= 2,065 + 0,913 X
1
+0,124 X
2
0,220 X
1
2
0,076 X
2
2
(4.3)

Os fatores massa de planta e proporo etanol/ gua foram significativos afetando
tanto com o efeito linear (P=0,000 e P=0,001, respectivamente) quanto com o quadrtico
(P=0,001 e P=0,044) para extrao de slidos solveis das folhas de C. langsdorffii. As
interaes no apresentaram efeito significativo, ou seja, P<0,05.
Os efeitos dos fatores estudados na extrao de slidos solveis podem ser tambm
observados na Figura 4.10, obtidas pelo mtodo de superfcie de resposta a partir da Equao 4.3.

Figura 4.10 Superfcies de resposta para a extrao de slidos solveis em funo dos
fatores: (A) proporo etanol/ gua (EA) e massa de planta (MP); (B)
velocidade de agitao (v) e massa de planta (Mp); (C) velocidade de agitao
(v) e proporo etanol/ gua (EA). Em cada superfcie, o demais fator encontra-
se no nvel central.

(A)
(C)
(B)

Na Figura 4.10 (B), observa-se uma regio de sela, sendo mxima a extrao de
slidos solveis quando a proporo etanol/ gua apresenta valor acima do nvel 0, ou seja,
acima de 50GL e quando a velocidade de agitao se apresenta nos seus extremos, 100 ou
700 rpm.
Entretanto, a velocidade de agitao no apresentou significncia sobre a extrao de
slidos solveis (P=0,24). Isso pode ser mais bem observado na Figura 4.10 (C) em que a
variao da velocidade de agitao no alterou os valores da extrao de slidos solveis.
4.3.2.2. Anlise estatstica para Rendimento de Slidos Solveis (0
SS
)
2
relaciona a resposta, rendimento de slidos solveis, e os fatores significativos codificados,
massa de planta (X
1
2
).

0
SS
= 17, 169 4,461 X
1
+ 1,288 X
2
+ 1,141 X
1
2
0,768 X
1
X
2
(4.4)

O efeito linear dos fatores massa de planta e proporo etanol/ gua (P=0,000 e
P=0,001, respectivamente), o efeito quadrtico do fator massa de planta (P=0,008) e o efeito
da interao massa de planta e proporo etanol/ gua (P=0,031) foram significativos para o
rendimento na extrao de slidos solveis das folhas de C. langsdorffii.
Os efeitos dos fatores estudados e de suas interaes na extrao de flavonides
totais apresentados na Figura 4.11 foram obtidos atravs da metodologia de superfcie de
resposta e foram construdas a partir da Equao 4.4.

Figura 4.11 Superfcies de resposta para rendimento de slidos solveis em funo dos
fatores: (A) proporo etanol/ gua (EA) e massa de planta (MP); (B)
velocidade de agitao (v) e massa de planta (Mp); (C) velocidade de agitao
(v) e proporo etanol/ gua (EA). Em cada superfcie, o demais fator encontra-
se no nvel central.

As Figuras 4.11 (A) e (B) apresentam que o rendimento de slidos solveis
inversamente proporcional massa de planta. Esta proporo coerente visto que o
rendimento de slidos solveis foi calculado de acordo com a Equao 4.4 que apresenta a
quantidade de massa de planta no denominador. Assim, quanto menor a massa de planta
maior ser o rendimento de slidos solveis. Alm disso, quando a massa de planta utilizada
menor, maior a possibilidade dos slidos solveis presentes na planta se difundirem para o
solvente j que no ocorre saturao. Estudos na literatura utilizando outras plantas relataram
que o rendimento aumenta quando se diminui a massa de planta em relao quantidade de
solvente utilizada (HUANG et al., 2009).
Na Figura 4.11 (A), pode-se observar que o rendimento de slidos solveis maior
quando a proporo etanol/ gua 50GL ou maior concomitantemente com a massa de
planta abaixo de 4 g. Assim, mesmo com a proporo etanol/ gua em 50GL ou maior, altas
(A) (B)
(C)

quantidades de massa de planta forneceram baixo rendimento de slidos solveis. Esta
situao ocorreu, pois h interao significativa entre estes fatores (P=0,03).
Na Figura 4.11 (C), apresenta uma regio de sela. Mais uma vez, a mxima extrao
de slidos solveis foi observada quando a proporo etanol/ gua apresentou valor acima do
nvel 0, ou seja, maior que 50GL devido ao seu efeito linear significativo (P=0,00).
Enquanto que a velocidade de agitao no apresentou efeito significativo (P=0,56)
possibilitando observar apenas ligeiro aumento na extrao quando se apresentava em seus
valores extremos, 100 ou 700 rpm.
4.3.2.3. Anlise estatstica para Flavonides Totais (FT)
2
relaciona a resposta, teor de flavonides totais, e os fatores significativos codificados, massa
de planta (X
1
2
).

FT = 0,642 + 0,313 X
1
+ 0,187 X
2
0,075 X
1
2
+ 0,112 X
1
X
2
(4.5)

A Equao 4.5 apresenta que o efeito linear dos fatores massa de planta e proporo
etanol/ gua (P=0,000 e P=0,000, respectivamente), o efeito quadrtico do fator massa de
planta (P=0,042) e o efeito da interao massa de planta e proporo etanol/ gua (P=0,008)
foram significativos e afetaram a extrao de flavonides totais das folhas de C. langsdorffii.
Os efeitos dos fatores estudados e de suas interaes na extrao de flavonides
totais apresentados na Figura 4.12 foram obtidos atravs da metodologia de superfcie de
resposta e foram construdas a partir da Equao 4.5.

Figura 4.12 Superfcie de resposta para a extrao de flavonides totais em funo dos
fatores: (A) proporo etanol/ gua e massa de planta; (B) velocidade de
agitao e massa de planta; (C) velocidade de agitao e proporo etanol/ gua.
Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central.

A interao entre massa de planta e proporo etanol/ gua pode ser observada na
Figura 4.12 (A). Mesmo em propores etanol/ gua favorveis, acima de 50GL, baixas
quantidades de massa de planta resultou em baixa extrao de flavonides totais. A extrao
de flavonides totais foi mxima quando se utilizou maior quantidade de massa de planta e
maior proporo etanol/ gua. Entretanto, no foi possvel observar a regio tima em funo
da proporo etanol/ gua e massa de planta.
Observando as Figuras 4.12 (B) e (C), pode-se observar que a velocidade de agitao
no influenciou significativamente na extrao de flavonides totais.
4.3.2.4. Anlise estatstica para Teor de Quercetrina (Q) e Afzelina (A)
Ao analisar os resultados da anlise estatstica para teor de quercetrina e de afzelina
foi possvel encontrar diversas semelhanas visto a semelhana qumica e estrutural das duas
(A) (B)
(C)

molculas. A primeira delas foi a significncia dos fatores massa de planta e proporo etanol/
gua (Tabela 4.13).

Tabela 4.13 Valores de P obtidos da anlise estatstica para os fatores estudados na
extrao de quercetrina e afzelina das folhas de C. langsdoffii.
Valor de P
Efeito
X
1
0,000* 0,000*
X
2
0,008* 0,002*
X
3
0,123 0,159
X
1
2
0,003* 0,003*
X
2
2
0,029* 0,031*
X
3
2
0,174 0,217
X
1
*X
2
0,529 0,926
X
1
*X
3
0,485 0,526
X
2
*X
3
1,000 0,913
* efeito significativo (P<0,05)

Desta forma a Equao 4.6 e a Equao 4.7 foram obtidas como modelos ajustados
(R
2
= 0,985 e R
2
= 0,986, respectivamente) da anlise estatstica que relaciona as respostas,
teor de quercetrina e de afzelina, e os fatores significativos codificados, massa de planta (X
1
) e
proporo etanol/ gua (X
2
) tanto com o efeito linear quanto o quadrtico.

Q = 0,736 + 0,324 X
1
+ 0,047 X
2
0,089 X
1
2
0,050 X
2
2
(4.6)

A = 0,413 + 0,184 X
1
+ 0,034 X
2
0,049 X
1
2
0,026 X
2
2
(4.7)

Atravs da Equao 4.6 e da Equao 4.7 foram obtidas as superfcies de resposta
que relacionam o teor de quercetrina e afzelina com os fatores estudados. Apresentam-se na
Figura 4.13 as superfcies de resposta para teor de quercetrina e teor de afzelina.


Figura 4.13 Superfcies de resposta para teor de quercetrina (A), (B) e (C) e afzelina (D),
(E) e (F) em funo dos fatores proporo etanol/ gua e massa de planta;
velocidade de agitao (v) e massa de planta (Mp); velocidade de agitao (v) e
proporo etanol/ gua (EA), respectivamente. Em cada superfcie, o demais
fator encontra-se no nvel central.

(A)
(B)
(D)
(F)
(C)
(E)

Devido significncia dos efeitos linear e quadrtico do fator massa de planta pode-
se observar nas Figuras 4.13 (A) e (B) que seu aumento induz ao aumento no teor de
quercetrina e afzelina nos extratos obtidos.
Somente nas Figuras 4.13 (C) e (F), foi possvel observar o efeito quadrtico do fator
proporo etanol/ gua bastante pronunciado. Estas figuras apresentam forma de pra- quedas,
visto que permitem visualizar que a regio experimental fornece a mxima resposta para o
teor de quercetrina e afzelina nos extratos obtidos.
De maneira geral, no Planejamento Box-Behnken, foi observado que a mais alta
proporo etanol/ gua utilizada foi capaz de fornecer maiores valores de slidos solveis,
flavonides totais, quercetrina e afzelina nos extratos e at mesmo de rendimento de slidos
solveis. Propores de etanol em solues hidroalcolicas auxiliam a extrao de
flavonides e compostos fenlicos (HUANG et al., 2009; PINELO, SINEIRO e NUEZ,
2006). Alguns trabalhos encontrados na literatura relatam que a extrao de fenis totais
ocorre com mais sucesso quando se utiliza maiores propores de gua (PROMMUAK; DE-
EKNAMKUL e SHOTIPRUK, 2008). Entretanto, deve-se observar que a constante dieltrica
da gua decresce com o aumento da temperatura aumentando sua capacidade de interagir e,
conseqentemente, extrair solutos mais apolares como alguns flavonides (CACACE e
MAZZA, 2003).
Como j discutido no Planejamento Fatorial Fracionrio, quanto maior a massa de
planta utilizada, maior disponibilidade de slidos solveis e compostos fenlicos, entre eles
flavonides e fenis, para serem extrados visto que so substncias extradas da planta (LIST
e SCHIMIDT, 1989).
Como as respostas estudadas: slidos solveis, rendimento de slidos solveis,
flavonides totais no apresentaram uma regio tima, ou seja, os valores dos fatores no
permitiram observar a mxima resposta, decidiu-se realizar a inclinao ascendente.
4.3.3. Inclinao Ascendente (Descendente)
Como foi observado nos resultados do Planejamento Box-Behnken, ainda possvel
aumentar a extrao de slidos solveis e flavonides totais quando ambas, massa de planta e
proporo etanol/ gua, so aumentadas. Por isso, decidiu-se aplicar a tcnica experimental de
inclinao ascendente que possibilita ao pesquisador caminhar de maneira perpendicular
regio tima.
Assim, para se obter as condies em direo regio tima, utilizou-se a razo dos
respectivos coeficientes dos fatores massa de planta e proporo etanol/ gua da Equao 4.4

de predio da resposta de flavonides totais, ou seja, 0,187/ 0,313. Assim, a cada aumento de
nvel 1 de massa de planta, aumenta-se 0,597 de proporo etanol/ gua. Para obter os valores
no codificados de massa de planta e proporo etanol/ gua utilizaram-se as Equaes 3.2 e
3.3, respectivamente. Os dois pontos selecionados esto descritos na Tabela 4.14.

Tabela 4.14 Determinao das condies de inclinao ascendente em direo regio
tima de flavonides totais.
Codificadas No codificadas

X
1
X
2
Mp (g) EA (GL)
Origem 0 0 12,0 50
1,00 0,597 8,0 12
A Origem+ 2,8 2,75 1,640 34,0 83
B Origem+ 3,85 3,85 2,297 42,8 96

Como pode ser observado na Tabela 4.15, os resultados das anlises realizadas para o
ponto B, que utilizou maior massa de planta e maior proporo etanol/ gua, 43g e 96GL,
respectivamente, apresentaram menores valores de slidos solveis, flavonides totais,
quercetrina e afzelina em relao ao ponto A, 34g e 83GL. Isso indica que foi possvel
encontrar a regio tima para a extrao de slidos solveis e flavonides totais. Entretanto,
ainda torna-se necessrio realizar um experimento de superfcie de resposta nesta regio para
encontrar o ponto exato que corresponde s condies que apresentem o maior valor para a
extrao destas respostas.

Tabela 4.15 Resultados das anlises de slidos solveis, rendimento de slidos solveis,
flavonides totais, quercetrina e afzelina para os pontos de inclinao
ascendente (n=3).
Anlises SS (% m/v)
SS
(% m/m) FT (mg/mL) Q (mg/mL) A (mg/mL)
A 3,79 0,20 11,69 0,58 1,991 0,125 1,586 0,310 1,067 0,211
B 2,00 0,06 4,88 0,15 1,390 0,086 0,643 0,040 0,413 0,028
4.3.4. Planejamento Fatorial Completo 3
2

O Planejamento Fatorial Completo 3
2
foi selecionado para visualizar a superfcie de
resposta da regio tima para extrao mxima de slidos solveis, flavonides totais,
quercetrina e afzelina (Figura 4.14). Os resultados deste planejamento esto apresentados na
Tabela 4.16.

solveis (0
SS
), flavonides totais (FT), quercetrina (Q) e afzelina (A) estudadas
no Planejamento Fatorial Completo 3
2
para extrao a partir das folhas de C.
langsdorffii.
Observaes
Ensaio
SS (% m/v)
SS
(%) FT (mg/mL) Q (mg/mL) A (mg/mL)
1 3,420,04 13,610,15 1,5530,058 1,254 0,624
2 3,340,02 13,290,07 1,7380,041 1,315 0,643
3 1,540,00 6,140,02 0,9780,007 0,491 0,278
4 4,660,03 10,820,06 2,1560,039 1,701 0,859
5 4,350,07 10,110,16 2,4620,049 1,638 0,770
6 2,510,01 6,420,02 1,8440,101 0,838 0,483
7 2,300,02 7,450,05 1,6850,085 0,779 0,449
8 3,470,06 10,200,16 1,5790,043 1,260 0,638
9 4,270,05 14,270,18 2,4070,161 1,626 0,775

Foram feitas tambm as superfcies das respostas avaliadas. Todas apresentaram
perfil semelhante. A Figura 4.14 (A) e (B) representam as superfcies das respostas avaliadas.

Figura 4.14 Superfcies de resposta representativas do Planejamento Fatorial Completo 3
2
:
(A) slidos solveis; (B) rendimento de slidos solveis.

O Planejamento Fatorial Completo 3
2
permitiu visualizar que a proporo etanol/
gua foi significante (P<0,05) com efeito linear e quadrtico para a extrao de slidos
solveis, quercetrina e afzelina e com efeito linear para rendimento de slidos solveis e
flavonides totais. A regio de proporo etanol/ gua que possibilitou a mxima extrao foi
prxima de 83GL.
O fator massa de planta foi significante com efeito linear para slidos solveis,
flavonides totais e quercetrina. Este resultado indica que aumentando a massa de planta de
25 para 43 g ainda h o aumento destas respostas.
(A) (B)

Por outro lado, o aumento de massa de planta de 25 para 43 g no foi significativo
para o rendimento de slidos solveis e para a extrao de afzelina. Em relao ao rendimento
de slidos solveis, esse resultado pode ser explicado pelo aumento da massa de planta
proporcionalmente maior que a extrao de slidos solveis visto que ambos so utilizados no
clculo para obter o rendimento de slidos solveis (Equao 3.7). Em relao afzelina, o
resultado pode ser explicado devido saturao do solvente que ocorreu com o aumento da
massa de planta. Uma hiptese para este resultado tambm no ter sido encontrado para as
respostas de slidos solveis, flavonides totais e quercetrina que a solubilidade e outros
fatores qumicos intrnsecos de cada substncia importantes para sua extrao podem ser
influenciados pela complexidade da matriz vegetal. Desta forma, o equilbrio de extrao
encontrado para a afzelina foi utilizando-se massa de planta de 25 a 43 g enquanto que para
slidos solveis, flavonides totais e quercetrina o equilbrio de extrao possvel que seja
encontrado utilizando-se maior massa de planta.
Considerando o objetivo inicial de estudar o processo extrativo de macerao
dinmica a partir das folhas de C. langsdorffii variando os fatores nele envolvidos com a
finalidade de obter um extrato com altos teores de slidos solveis, flavonides totais,
quercetrina e afzelina, foi possvel visualizar que estas repostas so maximizadas ou esto
muito prximas da regio de mxima quando a proporo etanol/ gua de cerca de 83GL.
Comparando-se este estudo de macerao dinmica com estudos de extrao-
percolao pode-se considerar o tempo da macerao dinmica como mais vantajoso, de 1 h,
frente a 72 h ou mais da macerao-percolao descritas na literatura (LIST e SCHMIDT,
1989).
4.3.5. Otimizao das Condies de Extrao
O ponto timo das condies de extrao foi considerado para obter as mximas
respostas, ou seja, mxima extrao de slidos solveis, flavonides totais, teor de quercetrina
e afzelina e altos valores de rendimento de slidos solveis tambm. Para tanto, utilizou-se a
funo desejabilidade utilizando-se o software Minitab 14.0. Os valores estabelecidos para o
software como baixo, alto e a resposta desejada foram retirados da regio experimental do
Planejamento Fatorial Completo 3
2
(Tabela 4.16) e todas as respostas foram determinadas
com peso um.
O ponto determinado pela funo desejabilidade para obter o valor mximo das
respostas foi: massa de planta de 41 g e proporo etanol/ gua de 79GL com valor de

desejabilidade composta de 0,928. Este valor demonstra que o valor encontrado para os
fatores fornecem o valor muito prximo do mximo estabelecido para todas as respostas.
O valor previsto para as respostas quando a extrao realizada nestas condies
consta na Tabela 4.17.

Tabela 4.17 Previso dos valores para as respostas otimizadas na extrao a partir das
folhas de C. langsdorffii.
Respostas Valores previstos
Slidos solveis 4,604 % m/v
Rendimento de slidos solveis 12,06 % m/m
Flavonides totais 2,462 mg/mL
Quercetrina 1,744 mg/mL
Afzelina 0,837 mg/mL

As condies timas obtidas devem ser consideradas para os objetivos propostos
iniciais de obter um extrato lquido com altos teores de slidos solveis, flavonides totais,
teor de quercetrina e afzelina. Entretanto, deve-se atentar que o rendimento, ainda que
maximizado, foi baixo principalmente comparado com o teor de substncias extraveis em
lcool obtido pela extrao exaustiva em Soxhlet de 32,12 0,93% m/m. Se a resposta
rendimento de slidos solveis tivesse sido considerada todo o planejamento seria realizado
para obter sua maximizao utilizando, por exemplo, um mtodo exaustivo ou mesmo a
macerao dinmica com quantidade menor de massa de planta e alterando outros parmetros
como temperatura, velocidade de agitao, proporo etanol/ gua entre outros.
Com estas informaes, a relao entre a quantidade tima de massa de planta para
obter 100 mL de extrato otimizado de C. langsdorffii de 1 parte para 2,5 partes de extrato.
Como pode ser observado na Farmacopia Brasileira (2010), h as tinturas e extratos que so
geralmente obtidas por extrao exaustiva. H tambm os extratos fluidos comumente obtidos
pela concentrao das tinturas ou de extratos mais diludos.
Entretanto, apesar da macerao dinmica no ser exaustiva o equilbrio em que
ocorre a extrao pode ser mais favorvel para obter um extrato com teores mais elevados dos
marcadores ou mesmo das substncias ativas da planta e menores valores de slidos solveis
os quais consideram tanto marcadores ou substncias ativas quanto substncias inertes ou at
mesmo indesejveis. Para poder ter a informao de qual destes mtodos mais seletivo,
vantajoso e com menor custo seria ideal estudar e comparar ambos quanto a parmetros
fsico-qumicos como aspecto, teor de marcadores e slidos solveis, quanto realizar um
estudo de custo.

4.4.1. Caracterizao dos Extratos Lquidos utilizados na secagem
Os Extratos Lquidos utilizados na secagem foram caracterizados quanto ao teor de
slidos solveis, flavonides totais, quercetrina e afzelina e esto apresentados na Tabela
4.18.

Tabela 4.18 Resultados da caracterizao dos Extratos Lquidos utilizados na secagem.
Extrato Lquido 2,5% m/m 12,5% m/m 22,5% m/m
Slidos solveis (% m/m) 2,450,01 12,620,41 21,980,97
Flavonides totais (mg/g) 1,1580,040 5,8010,062 10,2090,107
Quercetrina (mg/g) 0,895 4,622 8,100
Afzelina (mg/g) 0,270 1,367 2,410
4.4.2. Experimento Preliminar
Para os extratos secos de C. langsdorffii obtidos com os diferentes excipientes foram
determinados a umidade, densidade compactada, ndice de Carr, ngulo de repouso, umidade
de equilbrio a 75% UR, dimetro mdio de partcula, rendimento e degradao de
flavonides totais, quercetrina e afzelina. Em seguida, os valores obtidos foram comparados
entre si e discutidos.
A umidade um indicativo da eficincia do processo de secagem alm de ser
importante para manter a estabilidade qumica e microbiolgica e as propriedades fsicas
como compactao, fluidez, densidade, aglomerao das partculas e distribuio de tamanho
de partcula do p. A umidade apresentada pelos extratos secos de C. langsdorffii variou de 4
a 6% e, portanto, esto adequadas de acordo com a literatura (3 a 7%) (COUTO et al., 2011).
Observando a Figura 4.15, o extrato seco contendo manitol (0,380 0,020) seguido
do extrato seco contendo cabosil (0,377 0,022) e do extrato seco puro obtido a partir do
Extrato Lquido de C. langsdorffii a 12% m/m (0,368 0,017) foram os que apresentaram
maior densidade compactada. interessante que ps apresentem alta densidade compactada
para que um grama do p ocupe menor volume. Altos valores de densidade compactada so
interessantes para ocupar menor volume no armazenamento e transporte do p, assim como
para a obteno de comprimidos e, principalmente na encapsulao visto que cada tamanho
de cpsula possui um volume determinado (COUTO et al., 2011; GANESAN;
ROSENTRATER, MUTHUKUMARAPPAN, 2008).

C
o
p

1
2
%
C
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p

2
,
5
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M
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p
s
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l
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40

D
e
n
s
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d
a
d
e

C
o
m
p
a
c
t
a
d
a

Figura 4.15 Resultados da densidade compactada para os extratos secos de C. langsdorffii
obtidos por spray dryer contendo diferentes excipientes (n=3).

Em seguida, foi obtido o ndice de Carr visto que este ndice uma relao entre a
densidade bruta e a densidade compactada. Alm disso, o ndice de Carr uma medida
indireta da capacidade de compactao do p. Valores abaixo de 15 para o ndice de Carr
indicam uma excelente fluidez e de 15 a 25 indicam fluidez razovel. Entretanto, ps com
valores do ndice de Carr acima de 25 apresentam um vazodebilitado de certa maneira (USP
XXX, 2008).

C
o
p

1
2
%
C
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2
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5
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M
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15
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25
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35
40

n
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d
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C
a
r
r

Figura 4.16 Resultados do ndice de Carr para os extratos secos de C. langsdorffii obtidos
por spray dryer contendo diferentes excipientes (n=3).

Na Figura 4.16, pode-se observar que o extrato seco contendo manitol foi o que
apresentou menor valor do ndice de Carr (27,3% 1,3), portanto, o que apresentou maior
capacidade de compactao entre os extratos secos obtidos.
Ps devem apresentar, alm de boa compactao, boa fluidez para que seja possvel
alimentar a mquina compressora ou encapsuladora sem dificuldades. Estes parmetros so
essenciais para obter um produto com quantidades uniformes da droga e dos excipientes,
assim como da dosagem (COUTO et al., 2011).
Para obter uma medida indireta de fluidez realizou-se a medida do ngulo de
repouso. Valores de ngulo de repouso abaixo de 20 indicam tima fluidez, de 20 a 30
indicam boa fluidez, de 30 a 40 aceitvel e acima de 40 fluidez ruim (USP XXX, 2008).

C
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Figura 4.17 Resultados do ngulo de repouso para os extratos secos de C. langsdorffii

Na Figura 4.17, pode-se observar que o extrato seco puro obtido a partir do Extrato
Lquido de C. langsdorffii a 12% m/m e o extrato seco contendo manitol foram os que
apresentaram menor ngulo de repouso, 24 0 e 22 1, respectivamente.
A compactao e fluidez dependem do tamanho e distribuio de tamanho da
partcula, da morfologia das partculas, umidade, higroscopicidade e caracterstica
eletrosttica do material assim como da rea superficial e da fora de frico entre elas. Por
isso, foi obtido o dimetro mdio das partculas e foram feitas micrografias por microscopia
eletrnica de varredura dos extratos secos. Geralmente, a fluidez do p aumenta com o
aumento do tamanho de partcula e, aparentemente h um tamanho crtico acima do qual a
fluidez no influenciada (ABDULLAH

e GELDART, 1999; WALTON, 2000).
O extrato seco contendo manitol apresentou resultados que o qualificam como p de
melhor fluidez e compactao. Entretanto, o seu dimetro mdio de partcula apresentou valor
intermedirio (244 nm) quando comparado com os outros extratos secos (210 a 595 nm)
(Tabela 4.19).

Entretanto, outro fator importante que afeta a fluidez do p a aglomerao das
partculas. Ps que tem boa fluidez normalmente no apresentam partculas aglomeradas nas
micrografias como observado no extrato seco contendo cabosil e manitol (Figura 4.20 2b e
4b, respectivamente). Entretanto, ps com caracterstica coesiva apresentam aglomerao em
massa como apresentado pelo extrato seco contendo amido, lactose e celulose microcristalina
(Figura 4.20 3b, 5b e 7b, respectivamente) (WALTON, 2000).
C
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C
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0
100
200
300
400
500
600
700

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m
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p
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c
u
l
a

(

m
)

Figura 4.18 Resultados do dimetro mdio de partcula para os extratos secos de C.
langsdorffii obtidos por spray dryer contendo diferentes excipientes (n=3).

O tamanho de partcula e a distribuio das partculas influenciam na fluidez do p.
Geralmente, maiores tamanhos de partcula e distribuies largas aumentam a fluidez do p.
O extrato seco contendo manitol apresentou resultados que o qualificam como p de melhor
fluidez e compactao. Entretanto, o seu dimetro mdio de partcula apresentou valor
intermedirio (244 nm) quando comparado com os outros extratos secos (210 a 595 nm)
(Tabela 4.19). Alm disso, o extrato seco contendo lactose apresentou baixa fluidez, todavia
foi o que apresentou maior tamanho mdio de partcula. possvel que este resultado seja
devido formao de aglomerados que foi observada nas micrografias (Figura 4.20 5b).
Assim, microscopia eletrnica de varredura permitiu visualizar a morfologia e
detalhes da superfcie das partculas.

Figura 4.19 Micrografia de MEV do extrato seco de C. langsdorffii obtido por spray dryer
a partir do Extrato Lquido a 2,5% m/m.

Aparentemente, as micrografias da Figura 4.20 3b, 5b e 7b apresentaram-se como
aglomerados em massa onde no possvel observar o delineamento de cada partcula. Uma
explicao que as partculas aglomeraram-se antes da secagem impedindo a formao de
cada uma completamente. Os resultados para fluidez e compactao destes extratos secos
foram ruins e, portanto, coerente com estas micrografias. Estes aglomerados apresentaram-se
com formato irregular
As micrografias da Figura 4.19 e da Figura 4.20 1b apresenta aglomerados
tambm, entretanto pode-se observar que possvel delinear cada partcula. Desta forma, os
aglomerados podem ter sido formados aps a completa secagem de cada partcula.
As micrografias da Figura 4.20 2b, 4b e 8b apresentaram partculas mais dispersas
com aglomerados formados de poucas partculas as quais esto bem delineadas entre si. Os
extratos secos das Figura 4.19 e Figura 4.20 2b e 8b apresentaram formato arredondado
enquanto que a Figura 4.20 4b apresentou partculas com formato irregular, algumas
arredondadas outras pontiagudas.
A Figura 4.20 - 6b do extrato seco de manitol apresentou-se com formato de pra e
aparentemente maior que as partculas dos outros extratos secos.
Walton (2000) discutiu que geralmente ocorre formao de poucos aglomerados ou
mltiplos aglomerados e raramente ocorrem aglomerados macios como em ps de iogurte,
leite desnatado e argila como observado na Figura 4.20 3b, 5b e 7b. Estes ps parecem
formar uma fase contnua a qual age como uma barreira no porosa dificultando a
transferncia de massa. Isso observado com materiais que apresentam plasticidade
acarretando a distoro da partcula visto que h a liberao da presso de vapor durante a
secagem e, assim a partcula pode inflar e, em seguida, se romper formando crateras e buracos
na superfcie. Estas partculas so inevitavelmente ocas (WALTON e MUMFORD, 1999;
WALTON, 2000).

Figura 4.20 Micrografia de MEV dos excipientes antes da secagem e dos extratos secos de
C. langsdorffii obtidos por spray dryer a partir do Extrato Lquido a 2,5% m/m
contendo diferentes excipientes.
1a: maltodextrina e 1b: extrato seco de C. langsdofffii contendo maltodextrina;
2a: cabosil e 2b: extrato seco de C. langsdofffii contendo cabosil;
3a: amido e 3b: extrato seco de C. langsdofffii contendo amido;
4a: manitol e 4b: extrato seco de C. langsdofffii contendo manitol;
5a: lactose e 5b: extrato seco de C. langsdofffii contendo lactose;
6a: sorbitol e 6b: extrato seco de C. langsdofffii contendo sorbitol;
7a: celulose microcristalina e 7b: extrato seco de C. langsdofffii contendo celulose
microcristalina;
8a: capsul e 8b: extrato seco de C. langsdofffii contendo capsul.

Outro parmetro que pode influenciar a fluidez a umidade presente no p ou
mesmo sua caracterstica higroscpica (TEUNOU e FITZPATRICK, 1999). A umidade de
equilbrio a habilidade de uma substncia de atrair e manter consigo molculas de gua do
meio ambiente por absoro e adsoro alterando de certa forma seu estado fsico podendo
aumentar seu volume ou se tornando pegajosa. Por isso, devem ser armazenadas em
recipientes bem vedados (SCHWARTZ e GOODMAN, 1982).
1a 1b
2b 2a
3b 3a
4b 4a
5a
6a
7a
8a
6b
5b
7b
8b

C
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p

1
2
%
C
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2
,
5
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2
4
6
8
10
12
14
16
18

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a

7
5
%

U
R

Figura 4.21 Resultados da umidade de equilbrio para os extratos secos de C. langsdorffii

Na Figura 4.21 observa-se que o extrato seco que adsorveu menos umidade do meio
foi o extrato seco contendo cabosil, seguido dos extratos secos contendo amido, manitol e
lactose. Estes extratos secos apresentaram mdia de umidade de equilbrio entre 6 e 8% m/m.
O rendimento dos extratos secos obtidos variou entre 13 e 64%. Os extratos secos
que apresentaram maior rendimento foi o extrato seco de C. langsdorffii puro obtido a partir
do Extrato Lquido de C. langsdorffii 12% m/m e o extrato seco contendo cabosil (64 e 61%,
respectivamente) (Figura 4.22).
Pode-se considerar que a proporo utilizada excipiente: slidos da planta (1:3) foi
adequada e que a presena de excipiente importante para obter maiores rendimentos,
principalmente quando se tem baixa concentrao da amostra Extrato Lquido de C.
langsdorffii 2,5% m/m. Alm disso, a concentrao da amostra menor, por fornecer partculas
com dimetros de partculas menores, pode ter possibilitado a perda destas partculas
juntamente com o ar de secagem no ciclone. A importncia da concentrao da amostra de
partida tambm pode ser observada com o valor de rendimento do extrato seco obtido da
secagem do Extrato Lquido de C. langsdorffii 12% m/m.

C
o
p

1
2
%
C
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p

2
,
5
%
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0
10
20
30
40
50
60

R
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n
t
o

Figura 4.22 Resultados do rendimento para os extratos secos de C. langsdorffii obtidos por
spray dryer contendo diferentes excipientes (n=1).

Gonnissen et al. (2007) encontrou rendimentos de 70, 82 e 75% ao secar
acetominofeno com eritritol, maltodextrina e mantiol, respectivamente. Teixeira, Teixeira e
Freitas (2010) encontraram rendimentos de at 69% e consideraram este valor um excelente
resultado de rendimento para secagem em spray dryer em escala laboratorial, visto que a
literatura raramente relata valores acima de 50%. Entretanto, comum que o processo de
secagem em spray dryer de escala laboratorial apresente rendimentos baixos quando
comparado com escala industrial devido ao maior acmulo do p nas paredes j que o tempo
de residncia do ar e a distncia radial do atomizador at a cmara menor (AMERI e MAA,
2006).
Como pode ser observado na Figura 4.23 e na Tabela 4.19, os excipientes que menos
permitiram degradao de flavonides totais, quercetrina e afzelina foram: amido (4,2, 0,9 e
0,0%, respectivamente), capsul (0,6, 2,8 e 1,8%, respectivamente) e maltodextrina (2,2, 5,0 e
3,9%, respectivamente). J a celulose microcristalina foi o excipiente que permitiu maior
degradao de flavonides totais (19,6%), quercetrina (21,4%) e afzelina (19,6%).

C
o
p

1
2
%
C
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p

2
,
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%
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l
5
10
15
20
25

D
e
g
r
a
d
a
o

(
%
)
Flavonides totais
Quercetrina
Afzelina

Figura 4.23 Resultados da degradao de flavonides totais, quercetrina e afzelina para os
extratos secos de C. langsdorffii obtidos por spray dryer contendo diferentes
excipientes (n=1).

Todos estes excipientes so, em nvel molecular, polmeros de glicose. A
maltodextrina obtida por hidrlise da molcula do amido e o capsul por modificaes, como
eterificao, esterificao, reticulao, adio ou mesmo hidrlise da molcula do amido.
Entretanto, todas mantm a mesma conformao estrutural enquanto que a celulose
microcristalina tem conformao diferente. Assim, possivelmente e, de alguma forma, a
conformao molecular auxiliou a proteger ou expor os componentes do extrato sendo
possvel observar aumento ou diminuio da degradao dos componentes analisados.
Os extratos secos com os demais excipientes, cabosil, manitol, lactose e sorbitol
apresentaram degradao semelhante aos extratos de C. langsdorffii secos sem utilizar
excipientes. Estes excipientes so molculas pequenas que esto presentes no extrato seco,
mas provavelmente no foram capazes de proteger ou expor os componentes analisados.


Tabela 4.19 Resultados absolutos e degradao em porcentagem do teor de flavonides totais, quercetrina e afzelina
nos extratos secos de C. langsdorffii com diferentes excipientes (n=1).

Flavonides totais (mg/g) Quercetrina (mg/g) Afzelina (mg/g)
Amostras Teor
terico
Teor
prtico
Degradao
(%)
Teor
terico
Teor
prtico
Degradao
(%)
Teor
terico
Teor
prtico
Degradao
(%)
Cop 12% 48,224 47,052 2,4 38,416 34,663 9,8 11,457 10,329 9,8
Cop 2,5% 45,224 43,016 4,9 36,816 32,586 11,5 10,980 9,754 11,2
Maltodextrina 33,978 33,237 2,2 27,661 26,274 5,0 8,249 7,931 3,9
Cabosil 34,020 31,022 8,8 27,695 24,622 11,1 8,259 7,469 9,6
Amido 34,055 32,639 4,2 27,723 27,474 0,9 8,268 8,270 0,0
Manitol 34,014 30,889 9,2 27,690 25,456 8,1 8,258 7,706 6,7
Lactose 34,051 32,737 3,9 27,721 25,167 9,2 8,267 7,618 7,8
Sorbitol 34,080 30,293 11,1 27,744 25,051 9,7 8,274 7,587 8,3
Celulose Microcristalina 34,019 27,347 19,6 27,694 21,761 21,4 8,259 6,638 19,6
Capsul 34,003 33,815 0,6 27,681 26,897 2,8 8,255 8,111 1,8

Para selecionar um dos excipientes estudados e dar continuidade ao estudo das
condies de secagem, foi dado um peso, ou importncia s diversas respostas realizadas,
assim como foi selecionado um valor limite para cada uma delas de acordo com informaes
da literatura, mas considerando tambm os resultados obtidos dos extratos secos estudados
com a finalidade de conseguir selecionar o que apresentava as caractersticas mais desejveis
dentre eles.
Para densidade aparente, quanto maior seu valor mais interessante. Por isso,
considerou-se o valor de 0,350 e peso 1. Assim, quando o resultado de densidade aparente
para o extrato seco era acima deste valor o excipiente recebeu 1 ponto e abaixo, zero ponto.
Para o ndice de Carr, que um ndice referente compactao do p e quanto mais
baixo valor melhor a caracterstica de compactao. Assim, foi considerado um peso 2 para o
ndice de Carr e valor 30 sendo que acima de 30 o excipiente recebia 0 ponto e abaixo recebia
2 pontos.
Quanto menor o ngulo de repouso melhor a fluidez do p. Na literatura, ngulo de
repouso abaixo de 25 considerado parmetro de boa fluidez. E fluidez caracterstica
importante para diversos operaes unitrias e, por isso, recebeu peso 2.
A capacidade de adsorver/absorver gua do meio, a umidade de equilbrio, pode ser
controlada com bom armazenamento do extrato seco. Por isso, o peso para umidade de
equilbrio foi de 1 e o valor definido como limite mximo foi de 8% de ganho de massa.
Devido ao rendimento em pequena escala ser baixo e tambm ter sido observado
baixos rendimentos nas secagens realizadas, o peso definido para rendimento foi 1 e o valor
limite mnimo foi de 50%.
Apesar do tamanho mdio de partcula influenciar bastante na caracterstica do p, a
sua distribuio granulomtrica tambm influencia. Como foi observado que os extratos secos
obtidos apresentaram faixa larga de tamanho de partcula, ou seja, no foi observado um
dimetro em que se concentrassem a maioria das partculas, considerou-se que tamanho
mdio de partcula acima de 200 nm receberia pontuao com peso 1, o que foi observado
para todos os extratos secos.
Como a degradao dos marcadores qumicos, quercetrina e afzelina e de outros
componentes qumicos representados pelos flavonides totais no extrato uma caracterstica
importante em secagem de extratos vegetais, considerou-se aceitvel degradao de at 10%
com peso 2.

Ao final, o excipiente com maior total de pontos foi considerado aquele que
apresentou as caractersticas desejveis para dar continuidade ao estudo do processo de
secagem.

Tabela 4.20 Tabela decisria com a pontuao dos extratos secos de C. langsdorffii com
seus respectivos excipientes.

Como pode ser observado na Tabela 4.20, o manitol foi o excipiente que forneceu ao
extrato seco de C. langsdorffii as caractersticas mais desejveis dentre os excipientes
estudados. Em seguida, o estrato seco obtido a partir do Extrato Lquido a 12% m/m foi o que
apresentou as melhores caractersticas. Por isso, decidiu-se utilizar no prximo experimento o
manitol como excipiente e estudar a concentrao do Extrato Lquido a ser seco.
Bruschi et al (2003) estudaram a secagem por spray dryer do extrato de prpolis
utilizando gelatina sem e com manitol como excipientes. As micropartculas de gelatina
contendo manitol apresentaram o maior rendimento e a menor umidade nas mesmas
condies de secagem entre as formulaes estudadas. Ainda relembrou que o manitol
utilizado em formulaes para secagem em spray dryer para melhorar suas caractersticas e
evitar que o p grude.
O manitol utilizado em formulaes de acetominofeno secas por spray dryer
forneceu ps com boas caractersticas de fluxo, alta densidade e baixa umidade de equilbrio.
Alm disso, o manitol aumentou a dureza dos comprimidos obtidos por compresso direta
(GONNISSEN et al., 2007).
Gonnissen et al. (2008) resuspenderam e secaram em spray dryer as drogas
acetaminofeno, ibuprofeno e cimetidina utilizando manitol, eritritol, Glucidex 9, Kollidon
CL, dixido de silcio coloidal e sorbitano de polioxietileno 20 como excipientes de secagem.
Degradao
Amostras d
c
IC H d
50

FT

Q

A

TOTAL
Cop 12% 1 0 2 0 1 1 2 2 2 11
Cop 2,5% 0 0 0 0 0 1 2 0 0 3
Maltodextrina 0 0 0 0 1 1 2 2 2 8
Cabosil 1 0 2 1 1 1 2 0 2 10
Amido 0 0 0 1 1 1 2 2 2 9
Manitol 1 2 2 1 0 1 2 2 2 13
Lactose 0 0 0 1 1 1 2 2 2 9
Sorbitol 0 0 0 0 0 1 0 2 2 5
Celulose Microcristalina 0 0 0 0 1 1 0 0 0 2
Capsul 0 0 0 0 0 1 2 2 2 7

Demonstraram que as formulaes foram viveis para compresso direta tanto em escala
laboratorial quanto industrial.
Gonnissen et al. (2007) obteve como resultado um p vitrificado que grudou nas
paredes da cmara, do ciclone e do bico atomizador quando utilizou o sorbitol como
excipiente para secagem de acetominofeno.
4.4.3. Planejamento Box-Behnken
Aps selecionar o excipiente, manitol, iniciou-se o estudo do processo de secagem.
Como foi observada tambm no experimento preliminar, a concentrao do extrato
proporcionou um extrato seco com boas caractersticas fsicas. Assim, um dos fatores
estudados foi a concentrao do extrato (Cs). Com o objetivo de obter partculas maiores
acreditando-se que o tamanho da partcula influenciaria nas suas caractersticas fsicas, a
vazo de alimentao da amostra (Ws) tambm foi selecionada para este estudo. O
rendimento dos extratos foi outro aspecto a ser aprimorado e, por isso, o terceiro fator
selecionado foi a temperatura de sada (Ts).
A influncia dos fatores selecionados sobre as respostas densidade compactada (d
c
),
ndice de Carr (IC), ngulo de repouso (), rendimento (O) eficincia de secagem () e a
degradao de flavonides totais (
FT
) e degradao dos marcadores qumicos, quercetrina
(
Q
) e afzelina (
A
) foi estudada utilizando-se o planejamento Box-Behnken. Os resultados
para cada resposta estudada esto apresentados na Tabela 4.21.
A preciso dos resultados no processo de secagem pode ser avaliada atravs das
observaes obtidas no nvel central do planejamento experimental (ensaios 13, 14 e 15), em
que os valores para as respostas estudadas no apresentaram variao menor que 1%.
A identificao dos parmetros significativos foi realizada pelo software Statistica 5.
Estabeleceram-se como significativos os parmetros com P<0,05 e negligenciaram-se os
parmetros que apresentaram valores maiores. O nvel de significncia utilizado foi de 0,05.


Tabela 4.21 Resultados para as respostas densidade compactada (d
c
), ndice de Carr (IC),
ngulo de repouso (), rendimento (0), eficincia de secagem () e a degradao
de flavonides totais (
FT
) e dos marcadores qumicos, quercetrina (
Q
) e
afzelina (
A
) estudadas no planejamento Box-Behnken para secagem em spray
dryer do extrato lquido de C. langsdorffii.
Resultados
Degradao (%)
Ensaio
d
c

(g/cm3)
IC
(%)

()
d
50

(m)

(%)

(%)
FT

Q

A

1 0,253 0,009 282 161 367 42 116 0 3 2
2 0,2560,021 312 191 553 19 116 2 1 2
3 0,2620,015 304 162 160 41 104 4 3 4
4 0,2420,011 284 171 317 17 95 6 4 5
5 0,1690,006 313 150 177 50 93 5 6 7
6 0,2840,001 250 70 219 4 93 4 0 1
7 0,3140,021 331 142 179 52 101 1 1 1
8 0,2220,023 345 181 153 28 100 1 0 0
9 0,1440,004 342 131 192 16 112 4 4 5
10 0,1690,003 333 121 308 4 97 0 2 3
11 0,1160,008 353 212 164 39 105 0 4 5
12 0,1160,013 345 201 232 30 101 2 0 1
13 0,2400,014 355 161 210 23 107 0 6 8
14 0,2440,006 362 162 214 21 107 0 6 7
15 0,2410,009 351 151 219 21 107 0 6 8

4.4.3.1. Anlise Estatstica para Densidade Compactada (dc)
2
relaciona a resposta, densidade compactada, e os fatores significativos codificados,
temperatura de sada (X
6
), vazoda amostra (X
7
) e concentrao da amostra (X
8
).

d
c
= 0,242 + 0,061 X
6
2
0,050 X
7
2
0,056 X
8
2
0,052 X
6
*X
8
(4.8)

Os fatores temperatura de sada, vazoda amostra e concentrao da amostra foram
significativos afetando a resposta com o efeito quadrtico (P=0,01, P=0,02 e P=0,01,
respectivamente), assim como a interao dos fatores temperatura de sada e concentrao da
amostra (P=0,01).


Figura 4.24 Superfcies de resposta para densidade compactada (d
c
) em funo dos fatores:
(A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da
amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e
vazoda amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel
central.

Como pode ser observado na Figura 4.24 (A) e (B), o aspecto de sela de cavalo e na
Figura 4.24 (C) o pra-quedas indicando que o efeito quadrtico dos fatores foi bastante
pronunciado. Visto que se objetiva obter maior valor de densidade compactada tem-se que
quando a temperatura de sada foi utilizada em seus valores extremos (80 e 120C) a
densidade compactada dos extratos secos foi maior. J os fatores vazoda amostra e
concentrao da amostra forneceram maior densidade compactada dos extratos secos em seus
nveis intermedirios, ou seja, de 7,5 g/min e 12,5% m/m, respectivamente. A interao destes
ltimos fatores indica que ambos devem estar com este valor para haver a mxima resposta e
se o valor de um deles alterar a resposta diminui.
(A) (B)
(C)

Walton (2000) discutiu que, de maneira geral, se pode assumir que a densidade
aumenta quando a concentrao da amostra aumentada e no com o aumento da temperatura
do ar de secagem ou a presso de atomizao, apesar de resultados opostos j terem sido
observados.
4.4.3.2. Anlise Estatstica para ndice de Carr (IC)
2
relaciona a resposta, ndice de Carr, e o fator significativo codificado, temperatura de sada
(X
6
).

IC= 34,750 4,528 X
6
2
(4.9)

O fator temperatura de sada foi o nico significativo afetando a resposta com o
efeito quadrtico (P=0,008).
Como pode ser observado na Figura 4.25 (A) e (B) h uma curvatura na resposta
quando ocorre a variao da temperatura de sada indicando o efeito quadrtico. Assim, o
menor ndice de Carr, o que est relacionado a uma boa capacidade de compactao,
observado quando a temperatura de sada tem seus valores extremos de 80 ou 120C. Este
resultado coerente com os resultados da densidade compactada a qual foi maior quando a
temperatura de sada (Ts) tinha valores extremos de 80 ou 120C e visto que ambos remetem
capacidade de compactao do p.
possvel que a temperatura em seus valores extremos possibilite a formao de
tamanhos de partcula com maior distribuio granulomtrica e, desta forma, aumente a
capacidade de compactao do p.


Figura 4.25 Superfcies de resposta para ndice de Carr (IC) em funo dos fatores: (A)
vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra
(Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e vazoda
amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central.

4.4.3.3. Anlise Estatstica para ngulo de Repouso ()
2
relaciona a resposta, ngulo de repouso, e seus fatores significativos codificados,
concentrao da amostra (X
8
) e a interao da concentrao da amostra e temperatura de sada
(X
6
*X
8
).

= 15,903 + 3,366 X
8
+ 3,155 X
6
*X
8
(4.10)

(B)
(C)
(A)

O fator concentrao da amostra foi significativo afetando a resposta com o efeito
linear (P=0,002) e sua interao com a temperatura de sada (P=0,012).

Figura 4.26 Superfcies de resposta para ngulo de repouso () em funo dos fatores: (A)
vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da amostra
(Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e vazoda
amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator encontra-se no nvel central.

Como pode ser observado na Figura 4.26 (B), quanto menor a concentrao da
amostra e maior a temperatura de sada, os extrato secos obtidos apresentaram menores
ngulos de repouso.
Este resultado pode ser explicado pela formao de partculas menores e/ou mais
arredondadas devido baixa concentrao da amostra. Alm disso, a interao da baixa
concentrao da amostra com alta temperatura de sada permitiu a rpida evaporao do
(A) (B)
(C)

solvente. Assim, possivelmente pela formao de partculas menores e/ou mais arredondas
direcionou aos mais baixos valores de ngulo de repouso.
4.4.3.4. Anlise Estatstica para Rendimento do Processo de Secagem (0)
2
relaciona a resposta, rendimento do processo de secagem, e seus fatores significativos
codificados, temperatura de sada (X
8
) e a concentrao da amostra (X
6
) e

0 = 21,868 14,529 X
6
+ 9,596 X
6
2
+ 9,081X
8
(4.11)

O fator temperatura de sada foi significativo afetando a resposta com o efeito linear
e quadrtica (P=0,001 e P=0,020) e a concentrao da amostra com seu efeito linear
(P=0,006).
O rendimento do processo de secagem foi influenciado pela temperatura de sada e
pela concentrao da amostra. Como pode ser observado nas Figuras 4.27 (A) e (B), a
temperatura de sada foi um fator que influenciou diretamente o rendimento do processo de
secagem e o aumento da temperatura pode ter levado ao baixo rendimento devido ao
excipiente utilizado, manitol, poder ter se caramelizado a temperaturas mais altas que 100C,
promovendo a grande deposio de extrato seco na cmara de secagem.
Como j discutido no experimento preliminar, a concentrao da amostra menor, por
fornecer partculas com dimetros de partculas menores, pode ter possibilitado a perda destas
partculas juntamente com o ar de secagem no ciclone.


Figura 4.27 Superfcies de resposta para rendimento do processo de secagem () em funo
dos fatores: (A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B)
concentrao da amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da
amostra (Cs) e vazoda amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator
encontra-se no nvel central.

4.4.3.5. Anlise Estatstica para Eficincia de Secagem ()
2
relaciona a resposta, rendimento do processo de secagem, e seus fatores significativos
codificados, a concentrao da amostra (X
6
) e vazoda amostra (X
7
).

= 107,070 6,502 X
7
6,901 X
6
2
(4.12)

quadrtico (P=0,016) e a vazo da amostra com seu efeito linear (P=0,004).
(C)
(A) (B)

Figura 4.28 Superfcies de resposta para eficincia de secagem () em funo dos fatores:
(A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao da
amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e
central.

Devido eficincia de secagem estar relacionada diretamente ao vazoda amostra e
este razo entre a quantidade de amostra seca em um determinado tempo, coerente que a
concentrao da amostra e o vazoda amostra sejam significativos para esta resposta. Como
pode ser observado na Figura 4.28 (B) e (C), o efeito quadrtico da concentrao da amostra
(Cs) pronunciado apresentando a curvatura na superfcie de resposta. Na Figura 4.28 (A) e
(C), observa-se certa curvatura no eixo do vazoda amostra (Ws). Entretanto, seu efeito
quadrtico no foi significativo. Assim, a eficincia de secagem aumentou de maneira linear
quando o valor do vazoda amostra era mais baixo.
Quando a concentrao da amostra era menor havia maior quantidade de amostra a
ser seca para ao final ter a mesma quantidade terica de extrato seco em todos os ensaios.
(C)
(A) (B)

Desta forma, para no final do processo de secagem obter aproximadamente 8 g de extrato
seco, foi utilizado 250 g de Extrato Lquido a 2,5% m/m, 50 g de Extrato Lquido a 12,5%
m/m e 28 g de Extrato Lquido a 22,5% m/m adicionados de 2 g de manitol. Assim, quando a
quantidade de amostra a ser seca foi de 250 g ou de 28 g o tempo de secagem foi maior
diminuindo a eficincia de secagem. possvel que o tempo para estas amostras foi maior
devido amplificao do erro na calibrao do vazoda amostra no aparelho ao secar maiores
quantidades de amostra j que o controlador no era preciso e maior viscosidade do Extrato
Lquido a 22,5% m/m dificultando seu bombeamento para dentro da cmara de secagem.
4.4.3.6. Anlise Estatstica para Dimetro Mdio de Partcula (d
50
)
No foi possvel ajustar um modelo correlacionando os fatores estudados e o
dimetro mdio de partcula (R
2
= 0,000). Assim, nenhum dos fatores foi significativo para
esta resposta.
Isto pode ter ocorrido devido agregao do p acarretando resultados falsos do
tamanho das partculas somado ao mtodo de anlise por tamisao que dificulta excluir os
agregados antes de realizar a anlise. Ou ainda a realmente no haver relao dos fatores
estudados: concentrao da amostra, vazoda amostra e temperatura de sada com o tamanho
da partcula dos extratos seco de C. langsdoffii utilizando manitol como excipiente.
4.4.3.7. Anlise Estatstica para Degradao de Flavonides totais, Quercetrina e
Afzelina
O modelo ajustado (R
2
= 0,464) para a degradao de flavonides totais est
representado pela Equao 4.13 obtido da anlise estatstica que relaciona a resposta,
degradao de flavonides totais, e seu fator significativo codificado, a concentrao da
amostra (X
6
).

FT
= 4,075 + 0,574 X
6
0,970 X
6
2
(4.13)

linear (P=0,033) e quadrtico (P=0,020).

Figura 4.29 Superfcies de resposta para degradao de flavonides totais (
FT
) em funo
dos fatores: (A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B)
concentrao da amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da
amostra (Cs) e vazoda amostra (Ws). Em cada superfcie, o demais fator
encontra-se no nvel central.

Tambm foi possvel obter um modelo ajustado (R
2
=0,593) para a degradao de
quercetrina representado pela Equao 4.14. A degradao de quercetrina apresentou como
fator significativo a concentrao da amostra com seu efeito quadrtico (P=0,004).

Q
= 2,887 1,508 X
6
2
(4.14)

(C)
(A) (B)

Figura 4.30 Superfcies de resposta para degradao de quercetrina (
Q
) em funo dos
fatores: (A) vazoda amostra (Ws) e temperatura de sada (Ts); (B) concentrao
da amostra (Cs) e temperatura de sada (Ts); (C) concentrao da amostra (Cs) e
central.

Com estes resultados podemos observar que a concentrao da amostra foi a que
mais influenciou a degradao do marcador qumico quercetrina e dos flavonides totais.
Isto pode ser observado tanto na Figura 4.29 quanto na Figura 4.30. Na Figura 4.29
(B) pode-se observar melhor o efeito linear do fator concentrao da amostra enquanto que na
Figura 4.29 (C) pode-se observar seu efeito quadrtico com o aumento exponencial da
degradao de flavonides totais ao diminuir a concentrao da amostra (Cs). J na Figura
4.30, as superfcies de resposta so em formato de pra-quedas demonstrando o efeito
quadrtico dos fatores. Entretanto, apenas o efeito quadrtico da concentrao da amostra (Cs)
foi significativo. Isto pode ter ocorrido porque quando a concentrao da amostra baixa as
partculas formadas na asperso ficam mais susceptveis a degradao.
(C)
(A) (B)

Entretanto, o marcador qumico afzelina no apresentou nenhum fator significante
sua degradao apesar de ser um flavonol bastante semelhante quercetrina.
Com as respostas que apresentaram algum fator significante no processo de secagem,
foi realizada a funo desejabilidade selecionando valores com base na literatura e coerentes
com os resultados obtidos como objetivo.
4.4.4. Otimizao das Condies de Secagem
Os valores das respostas para se obter o ponto timo das condies de secagem
foram selecionados a partir dos resultados encontrados no Planejamento Box-Behnken. Os
valores selecionados como baixo, alto e a resposta desejado para cada fator est apresentado
na Tabela 4.22.

Tabela 4.22 Valores estabelecidos para as respostas estudadas no processo de secagem para
realizar a funo desejabilidade.
Valores
Respostas Objetivo
Baixo Alvo Alto
Peso
Densidade compactada Maximizar 0,116 0,350 0,350 1
ndice de Carr Minimizar 20 20 36 1
ngulo de Repouso Minimizar 7 7 21 1
Rendimento Maximizar 4 60 60 1
Eficincia secagem Alvo 93 100 116 1
Dimetro mdio partcula Alvo 250 450 550 1
Degradao Flavonides Minimizar 0 0 6 1
Degradao Quercetrina Minimizar 0 0 8 1
Degradao Afzelina Minimizar 0 0 6 1

O ponto determinado pela funo desejabilidade foi temperatura de sada de 80C,
vazoda amostra de 5,0 g/min e concentrao da amostra de 20,7% m/m com valor de
desejabilidade de 0,528. Este valor demonstra que o valor encontrado para os fatores
fornecem valores no muito prximo dos objetivos estabelecidos para as respostas. Vale
lembrar que as respostas consideradas foram nove dificultando a desejabilidade composta
porque todas elas devem ser consideradas.


Tabela 4.23 Valores previstos para as respostas estudadas na secagem em condies
otimizadas.
Respostas Resposta Prevista Desejabilidade
Densidade compactada 0,255 0,592
ndice de Carr 29 0,434
ngulo de Repouso 16 0,335
Rendimento 51 0,842
Eficincia secagem 108 0,522
Dimetro mdio partcula 283 0,166
Degradao Flavonides 2,199 0,633
Degradao Quercetrina 1,531 0,809
Degradao Afzelina 0 1,000

102
5. Concluso

Neste trabalho, foi possvel otimizar as condies do processo de extrao a partir
das folhas de C. langsdorffii e do processo de secagem dos extratos lquidos atravs do
emprego de planejamentos experimentais. Os planejamentos utilizados permitiram direcionar
as condies de ambos os processos para a resposta desejada. No caso da extrao, a resposta
objetivada foi a maximizao dos teores de slidos solveis, flavonides totais, quercetrina e
afzelina e no caso da secagem, a maximizao das caractersticas relacionadas fluidez e
compactao. Desta forma, os processos otimizados permitiram obter extratos padronizados
de C. langsdorffii e podem contribuir como modelo para otimizar outros processos e obter
extratos padronizados de outras fontes vegetais.
Todavia, deve-se atentar que para a maximizao de um conjunto de variveis nem
sempre as condies timas sero as mesmas que para outro conjunto de variveis. Um
exemplo foi observado no processo extrativo com a extrao de slidos solveis, flavonides
totais, quercetrina e afzelina que apresentam tendncia oposta ao rendimento de slidos
solveis. Ademais, quanto maior o nmero de respostas estudadas maior a dificuldade de se
encontrar a condio tima em que se possa observar a maximizao de todas as respostas
objetivadas. Como exemplo, teve-se a otimizao das condies do processo de secagem,
onde haviam nove respostas estudadas e a desejabilidade composta foi de 52,8%, enquanto
que no processo extrativo, onde foram estudadas quatro respostas, a funo desejabilidade foi
de 92,8%.
De qualquer maneira, a funo desejabilidade foi essencial para definir as condies
timas do processo extrativo por macerao dinmica que apresentaram baixa temperatura e
curto tempo de extrao sendo provavelmente vivel para aplicao em escala industrial. No
entanto, apesar das relaes complexas de extrao demonstradas neste trabalho, o processo
extrativo por macerao dinmica foi adequado aos objetivos propostos apresentando bons
resultados.
No processo de secagem, o excipiente manitol foi o que forneceu melhor
caracterstica para o extrato seco de C. langsdorffii e a secagem em spray dryer foi adequada,
pois possibilitou obter um extrato com boas caractersitcas fsicas, fsico-qumicas e
farmacotcnicas possibilitando obter formas farmacuticas slidas como cpsulas e
possivelmente comprimidos por compresso direta.
Concluso | 103

O mtodo de quantificao dos marcadores qumicos da C. langsdorffii por CLAE
foi adequado, pois apresentou linearidade, preciso, exatido e robustez para os dois tipos de
formas farmacuticas desenvolvidas: extrato lquido e extrato seco.
Assim, possvel concluir que, a insero de planejamentos experimentais no
desenvolvimento farmacotcnico bem como a utilizao de um mtodo de anlise confivel
foram de fundamental importncia para que se pudesse avaliar criticamente quais so os
principais parmetros a serem controlados na produo de extratos padronizados no somente
em escala laboratorial, mas qui em escala industrial.

104
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FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

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