CREATINA FOSFOTRANSFERASE (CPK)

FINALIDADE Sistema colorimtrico para determinao de creatina fosfotransferase no soro. Somente para uso diagnstico in vitro. PRINCIPIO Em meio alcalino a creatina fosfotransferase (CPK) catalisa a seguinte reao:
Creatina + ATP CPK ADP + fosfocreatina.

BIOQUMICA CLNICA

NMERO DE TESTES 10 testes - 50L amostra 20 testes - 25L amostra EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSRIOS NO FORNECIDOS Espectrofotmetro ou fotocolormetro capaz de medir a absorvncia em 660nm ou filtro vermelho. Tubos de ensaio. Pipetas graduadas. Pipetas semiautomticas de 25L, 50L e 500L. Ponteiras descartveis. gua deionizada ou destilada. Banho maria (370C). Cronmetro. Proveta com capacidade volumtrica de 130mL. Frasco mbar, de vidro, com capacidade volumtrica de 130mL.

Em meio cido, a fosfocreatina neo-formada hidrolisada liberando-se creatina e on fosfato. O fosfato inorgnico liberado proporcional atividade enzimtica. PARTICULARIDADES DO SISTEMA Alta concentrao de creatina e ATP no substrato permite a obteno de timas condies de reao, mantendo-se cintica de zero ordem e linearidade da reao at 360 U.I./L. A presena de glutation ativa a CPK, permitindo a obteno de valores elevados, condizentes com o teor real dessa enzima no soro. O tempo total entre a incubao e a dosagem de on fosfato de 30 minutos.

ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Substrato: armazenar temperatura de 2-80C. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco, obedecidas as condies de armazenamento e manuseio. METODOLOGIA ATP-Glutation: armazenar temperatura Okinaka modificado. de 2-80C, enquanto fechado na embalagem plstica. Aps a retirada da embalagem REAGENTES plstica, armazenar a 100C negativos. Substrato: soluo 0,09M de Creatina em Estvel at a data de vencimento indicada no tampo TRIS 0,125M, pH 9. Devido alta rtulo do frasco, obedecidas as condies de concentrao de Creatina h saturao da armazenamento. mesma. Os pequenos cristais, por vezes Soluo padro 130U.I./L: armazenar presentes no fundo do frasco, no diminuem temperatura de 2-80C. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco, a sensibilidade da reao. ATP-Glutation: cada frasco contm 21,8mmol obedecidas as condies de armazenamento. armazenar temperatura de Adenosina Trifosfato, sal sdico e 26,1 cido Ascrbico: 0 de 2-30 C. Estvel at a data de vencimento mmol de Glutation, sob forma liofilizada. indicada no rtulo do frasco, obedecidas Soluo padro 130U.I./L: dentro da as condies de armazenamento. Aps o metodologia adotada, cada 0,5mL da soluo preparo, a soluo de cido Ascrbico dever corresponde a 130U.I./L de CPK. ser armazenada em frasco mbar de vidro, ao cido Ascrbico: cada frasco contm 2g de abrigo da luz. Manter o frasco bem fechado cido Ascrbico. e temperatura de 2-80C. A estabilidade da Reagente molibdato: soluo 0,016M de soluo de cido Ascrbico de 12 meses, Molibdato de Amnio em cido Sulfrico 1,5M. obedecidas as condies de manuseio, Soluo alcalina: soluo 16,5M de preparo e armazenamento. Monoetanolamina. Reagente molibdato: armazenar temperatura de 2-300C. Estvel at a data APRESENTAO de vencimento indicada no rtulo do frasco, Substrato 1 x 13,5mL obedecidas as condies de armazenamento ATP-Glutation (flaconetes) 10 x 21mg e manuseio. Soluo padro 130U.I./L 1 x 5mL Soluo alcalina: armazenar temperatura cido Ascrbico 1 x 2g de 2-300C. Estvel at a data de vencimento Reagente molibdato 1 x 40mL indicada no rtulo do frasco, obedecidas as Soluo alcalina 1 x 20mL condies de armazenamento e manuseio.

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CUIDADOS E PRECAUES COM O USO DOS REAGENTES Todos os reagentes so somente para uso diagnstico in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se contato com pele e mucosas. Em caso de contaminao acidental, lavar a parte afetada em gua corrente. O descarte do material utilizado dever ser feito obedecendo-se aos critrios de biossegurana estabelecidos pelo laboratrio, de acordo com as normas locais, estaduais ou federais.
Observar ainda a simbologia constante nos rtulos do produto: Corrosivo Irritante

Soro
Reagente molibdato cido Ascrbico 0,084M

- 1mL 3mL

50L 1mL 3mL

- 1mL 3mL

1mL 3mL

Deixar repousar por 10 minutos temperatura ambiente. O tempo de 10 minutos, aps a adio de reagente molibdato e cido Ascrbico , deve ser observado com ateno, pois nesse perodo se d a hidrlise da fosfocreatina neo-formada. Aps o repouso proceder como segue:
Soluo alcalina 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL

AMOSTRA Soro. Os anticoagulantes (fluoretos, edta, citrato e heparina) inibem a atividade enzimtica. A enzima permanece estvel por 48 horas, temperatura de 200C; 7 dias, temperatura de 2-80C e 2 meses, temperatura de 200C negativos. Todas as amostras biolgicas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. PROCEDIMENTO TCNICO Preparo da soluo de cido Ascrbico 0,084M: Medir em uma proveta 130mL de gua destilada ou deionizada. Transferir o contedo de um frasco de cido Ascrbico para a gua destilada ou deionizada e dissolver. Aps o preparo, armazenar em frasco mbar, ao abrigo da luz, temperatura de 2-80C. A estabilidade da soluo de cido Ascrbico de 12 meses obedecidas as condies de manuseio, preparo e armazenamento. Preparo do substrato de uso: A um frasco de ATP-Glutation, adicionar 1,2mL do Substrato e agitar at dissolver. Contm material suficiente para uma dosagem. Rotular 4 tubos de ensaio com B (branco), BT (branco teste), T (teste), P (padro). Proceder como segue:
B Substrato de uso Soluo padro gua destilada - - 0,5mL BT 0,5mL - - T 0,5mL - - P 500L -

Homogeneizar por agitao (as protenas se dissolvem). Deixar em repouso de 1 a 2 minutos. Ler as absorvncias dos tubos T (teste), BT (branco teste) e P (padro), em espectrofotmetro ou fotocolormetro em 660nm ou filtro vermelho, acertando o zero com o branco (B). CURVA DE CALIBRAO
Conc. (U.I/L) 0 26 52 130 260 300 360 390

Padro Absorvncia 1 0.000 2 0.043 3 0.086 4 0.213 5 0.424 6 0.489 7 0.590 8 0.605

Colocar em banho maria, 37oC, durante 3 minutos.

Soro

50L

Incubar durante 20 minutos em banho maria (37oC). Retirar do banho maria e proceder como segue:

Obs.: No utilizar esta curva para determinar o resultado de seu ensaio. A curva de calibrao a representao grfica da relao entre os valores das absorvncias com os valores das concentraes de um conjunto de solues padro. A curva de calibrao demonstra a linearidade da reao at uma determinada concentrao, na qual pode ser determinado um fator de calibrao (F), de acordo com a Lei de Beer. A reao linear at 360U.I./L (ver curva acima). Obtendo-se valores mais elevados, dilui-se a amostra com soluo fisiolgica e procede-se a nova dosagem. Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluio. O kit de Creatina Fosfotransferase (CPK) Doles possui padro no intervalo de linearidade conforme explicitado na curva de calibrao. O laboratrio deve realizar o ensaio com o padro que acompanha o kit e calcular seu fator de calibrao (F), como demonstrado nos clculos abaixo.

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 O fator deve ser refeito periodicamente Por vezes a leitura do branco teste (BT) e a cada lote do produto. superior do teste (T). Nessas condies, Os padres utilizados na montagem da considerar o resultado do paciente como curva de calibrao foram ajustados em sendo 0 U.I./L concentrao de fosfato, tendo como O tempo de 10 minutos, aps a adio do referncia Standard Phosphorus Solution reagente de molibdato e soluo de cido (20 g fosforo/mL). Cat. 661-9 Sigma Ascrbico 0,084M, deve ser observado com Chemical Company. ateno pois nesse perodo se d a hidrlise da fosfocreatina neo-formada. CLCULOS

CPK (U.I./L) = absorvncia (P)

absorvncia (T) - absorvncia (BT)

x 130

Exemplo: (T) = 0,460

(BT) = 0,415

(P) = 0,213

0,460 - 0,415 CPK (U.I./L) = x 130 = 27,56 0,213 Como a reao corada segue estritamente a lei de Beer, basta que se determine um fator (F) para clculo dos resultados. Fator (F) = 130 absorvncia (P)

CPK (U.I./L) = (absorvncia T - absorvncia BT) x F Para determinao do fator, recomenda-se dosar em triplicata o padro, ler as absorvncias e tirar a mdia aritmtica das mesmas. Exemplo: Teste (T) = 0,460 Branco teste (BT) = 0,415 Padro (P) = 0,212, 0,213, 0,214

CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA 1.A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado so de fundamental importncia para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos. No usar detergente base de fosfato. 2.A gua utilizada na limpeza do material, no preparo dos reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade. 3.Colunas deionizadoras saturadas liberam ons diversos, aminas e agentes oxidantes, que deterioram os reagentes. 4.As pipetagens devem ser precisas. 5.O nvel da gua do banho maria deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio e a temperatura (37oC), observada. 6.O uso de soro controle de referncia deve ser uma prtica rotineira do laboratrio. Recomenda-se utilizar um soro controle com valor na faixa de normalidade e outro soro controle de valor elevado.

VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Como orientao, sugerimos os seguintes valores: 0,212 + 0,213 + 0,214 Mdia aritmtica (P) = = 0,213 0 - 30 U.I. /L 3 SIGNIFICADO CLNICO 130 A creatina fosfotransferase uma enzima, Fator (F) = = 610 predominantemente, da musculatura estriada. 0,213 Aumenta secundariamente no soro nas CPK (U.I./L) = (0,460 - 0,415) X 610 = 27,45 patologias que comprometem a musculatura estriada. A CPK um sensvel indicador, com Conceito de unidade: uma U.I. de CPK corresponde a aumentos precoces e elevados, nos casos 1mol de fosfocreatina neo-formada por litro de soro de infarto do miocrdio e distrofia muscular em um minuto. progressiva. Atividades aumentadas de CPK so LIMITAES DO SISTEMA Para se obter timo desempenho do sistema, encontradas, ocasionalmente, em patologias necessrio que o procedimento tcnico do sistema nervoso central, bem como em seja rigorosamente seguido conforme casos de acidente vascular cerebral. Em instrues de uso. Qualquer alterao pacientes portadores de hipotiroidismo, podem ser detectados nveis elevados de CPK. poder levar a resultados errneos.

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CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO Foram realizados 42 testes em amostras cujo teor de CPK situava se no intervalo de 0 - 260 U.I./L. A comparao do kit de Creatina Fosfotransferase Doles (Y) com a metodologia de referncia (X) deu origem seguinte equao de regresso linear: Y= 0,87 + 1,06X, sendo o coeficiente de correlao 0,99. O acrscimo de enzima a soros com nveis de CPK, oscilando entre 15 e 140 U.I./L, mostrou uma recuperao entre 97,5 e 102%. O erro da mdia foi de 3,2%. Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 2 amostras, obtendose os seguintes resultados:
Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%)
Amostra 1 Amostra 2

Substncias interferentes: as amostras colhidas com anticoagulantes no devem ser utilizadas, pois esses so inibidores da atividade enzimtica. Resduos de fosfatos presentes na vidraria interferem decisivamente, levando a reaes finais intensamente coradas. Certas drogas podem alterar os nveis de CPK. Para controle de tal interferncia, recomendado que o paciente seja questionado quanto ao uso de medicamentos. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA Okinaka, S. e cols.: A.M.A. Arch Neurol. 4:520, 1961. Doles, J.: Mtodo simples e direto para dosagem da Creatina Fosfotransferase no soro. Trabalho apresentado ao VII Congresso Brasileiro de Patologia Clnica de Curitiba, 1972. Tibrcio, H.M.: Controle interno da qualidade analtica, 1aed. maro/1995. Doles: dados de arquivo. TERMOS E CONDIES DE GARANTIA DA QUALIDADE DO PRODUTO As garantias do fabricante ao consumidor seguem estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1.990 Cdigo de Defesa do Consumidor. Os reagentes que compem este sistema para diagnstico so garantidos na sua performance, reprodutibilidade e qualidade at a data de vencimento. Os produtos que apresentarem problemas tcnicos comprovados sero substitudos, sem nus para o consumidor. Doles Reag. Equip. para Laboratrios Ltda. CNPJ: 01.085.513/0001-05 Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07 Conjunto Palmares. CEP: 74775-027 Goinia - GO Brasil e-mail: doles@doles.com.br M.S.: no 10231810020 Reviso: 16 (06/2010)

24,87 0,78 3,14

140,18 2,02 1,44

Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens, durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes resultados:
Concentrao (U.I./L) Desvio padro
Amostra 1 Amostra 2

22,09 0,73

160,40 2,45 1,53

Coeficiente de variao (%) 3,30

Especificidade: a presente metodologia especfica para determinao de creatina fosfotransferase (CPK). A presena de glutation ativa a CPK, permitindo a obteno de valores elevados, condizentes com o teor real dessa enzima na amostra. Sensibilidade: a absorvncia encontrada, de 0,002, corresponde a 1 U.I./L de concentrao de creatina fosfotransferase (CPK), quando medida em espectrofotmetro a 660nm. A sensibilidade do sistema est diretamente relacionada com a do aparelho utilizado no laboratrio. Diluio da matriz: estudos sucessivos de diluio da matriz mostram que existem aumentos significativos da CPK, provavelmente por diluio de fatores inibidores existentes no soro.

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