INTRODUCCIN

Uno de los avances ms importantes en el campo de la ciencia, ms especficamente en el campo de la microbiologa, ha sido la invencin del microscopio; ya que esta herramienta abri las puertas a un mundo del cual solo se tenan nociones y era casi que imaginario.

El microscopio trajo consigo nuevas preguntas e inquietudes acerca del vasto mundo que ocupan los microorganismos, y a su vez ofrece una ventana que ha permitido la identificacin , clasificacin y estudio de estos seres; tambin este gran avance se dio en la medicina, ya que con la implementacin del laboratorio y la gran ayuda del microscopio, junto con las nuevas tcnicas y procedimientos para identificar microorganismos patgenos, se lograron combatir y estudiar las causas de muchas enfermedades que en su momento se pensaban incurables. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas solo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas, y ello tambin fue posible gracias a los mtodos de fijacin y coloracin de muestras.

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PRCTICA N 3

MTODOS DE FIJACION y COLORACIN DE MUESTRAS Se presentaran, y sustentaran tcnicas modernas para el estudio celular, como mtodos de fijacin y coloracin de clulas para lminas fijas-coloreadas. CONCEPTO de COLORANTES El trmino COLORANTE se da a las sustancias que se prefiere sean de origen orgnico o de procedencia de especies vegetales o animales como la Hematoxilina procedente del rbol mejicano (Hematoxylon campechianum); el carmn, que se extrae de la hembra de la cochinilla (Coccus cacti) y la orcena y el tornasol que se extraen de lquenes; pero tambin los hay de origen sinttico y pueden proceder de la anilina, alquitrn de hulla y son derivados del benceno. Aunque hoy en da se prefieren los colorantes orgnicos. Por otro lado de acuerdo a la necesidad o tipo de tejido se puede seleccionar el colorante por el tipo de afinidad o pH y as se consideran 03 grupos: cidos, bsicos y neutros. En la tabla siguiente presentaremos los ms usados en laboratorio. Colorantes cidos Acido pcrico Nigrosina Verde de Malaquita Verde de Jano Fucsina cida Floxina Colorantes bsicos Tionina Azul de metileno Cristal de violeta Violeta de metileno Hematoxilina Safranina O Rojo neutro (dbilmente bsico) Colorantes Neutros Giemsa Wright Leishman Lugol

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OBJETIVOS:

Presentacin para conocimiento de mtodos de fijacin y coloracin. Preparacin de muestras utilizando el microscopio para su observacin. Preparacin de FROTIS sanguneo y extensin

MATERIALES Microscopios Glbulos rojos Lpiz de cera, plumn o marcador de vidrio Pinzas Papel filtro absorbente Algodn Lminas portaobjetos Frasco de enjuague Colorantes: Azul de metileno 1% Eosina 1% Lugol 1% Tincin de Wright: Eosina Azul de metileno segn Wright Alcohol metlico Glicerina bidestilada Tincin Gram Cristal de Violeta Lugol Alcohol-cetona Fucsina -- Safranina Alcohol Lminas portaobjetos Agua destilada Lanceta estril Hisopos estriles Goteros Palitos mondadientes Colorante Wright Set de Coloracin Gram.

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PROCEDIMIENTO

1.- PREPARACIN DE FROTIS SANGUNEO: 1. Utilizar portaobjetos limpios, libres de grasa. 2. Marcar por el reverso de la lmina el nmero o cdigo de la muestra, o del grupo de trabajo. 3. Con las manos limpias o recin lavadas, limpiar con alcohol el extremo del dedo y con ayuda de la lanceta estril, pinchar y extraer una gota de sangre y colocarla en el extremo del portaobjeto. 4. Con un segundo portaobjetos sostenido entre los dedos pulgar e ndice, forme un ngulo de 30 con el primer portaobjetos. 5. Desplazar el segundo porta objetos sobre el primero de derecha a izquierda para que la sangre quede esparcida a lo largo detrs del portaobjetos, luego levante y quite el portaobjetos 6. Observar que al secarse quedar una capa muy delgada de sangre. 7. Introducir la lmina bien seca dentro de un frasco de enjuague para verter sobre ella el colorante de Wright que se mantiene sobre la lmina por 2 minutos. 8. Agregar agua destilada suficiente para quitar la mayor parte del colorante y dejar secar por 3 minutos. 9. Eliminar el resto de colorante, introduciendo la lmina en el frasco que contiene agua destilada, sujetndolo cuidadosamente por los bordes por espacio de 3 ' 10. Extraer la lmina y escurrir el exceso de agua, puede airearse para secar o ayudarse de papel absorbente, teniendo cuidado de no tocar la superficie coloreada.

Observacin del FROTIS SANGUNEO 11. Cuando la lmina est completamente seca, colocarla en el microscopio y observar a pequeo y Gram. aumento y con aceite de inmersin , los glbulos rojos se observan rosceos y los blancos son menos numerosos, de mayor tamao y el ncleo es caracterstico, segn el tipo de glbulo blanco y se colorea de azul. 12. Realizar el reconocimiento de los diferentes tipos de glbulos blancos y hacer un dibujo cada uno de acuerdo a las vista en clase y prepare su informe prctico.

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13.Tipos de Glbulo blanco: Linfocito, Monocito, Neutrfilo, Eosinofilo y Basofilo .Dibuje su forma, partes y coloree antes de presentar su informe lo que no alcance hacer visto en clase compltelo con literatura de consulta.

2.-CLULAS PROCARITICAS CON TINCIN GRAM 1. Hacer un frotis de la piel, tomar preferentemente zonas de pliegues, (p.ej. debajo del reloj) o tambin tomar un frotis de los ltimos molares. 2. Colocar sobre el portaobjetos con una gota de agua destilada. 3. Calentar lentamente, alternando y enfriando sobre el dorso de la mano, de tal manera que no se recaliente la lmina y se deformen las clulas, repetir la operacin hasta que haya desaparecido el lquido del portaobjetos. 4. Colocar secuencialmente los colorantes, primero, CRISTAL DE VIOLETA, tomando 1 para cada uno de ellos, verter el excedente de colorante y enjuagar a chorro continuo con agua. 5. Verter el LUGOL (mordiente-fijador) por 1, descartar y aplicar ALCOHOL-CETONA (decolorante) con un movimiento de balanceo por 30 debe ser rpido pues un mayor tiempo, decolora la lmina. Descartar y agregar o verter la FUCSINA o SAFRANINA por 1 descartar y lavar a chorro continuo. 6. Secar agitando al aire la lmina o con un secador, 7. Luego colocar al microscopio y enfocar a inmersin, colocando una gota de aceite de cedro. 8. Reconozca las formas variadas y repare en las diferencias de tamao. Mencione sus partes

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CUESTIONARIO

1. Con respecto a la preparacin coloreada con Wright, qu diferencia observa entre los glbulos blancos y rojos? El colorante Wright es ligeramente bsico, aproximadamente 7,2 pH, eso hace que los glbulos blancos se tian de violeta y algunas zonas del citoplasma de color rosa ; en cambio los eritrocitos o glbulos rojos se tieron de rosa en su totalidad.

2 Identifique cuntos tipos de glbulos blancos se conocen y cules observ en sus lminas. Se conocen 5 tipos: Linfocitos, Monocitos, Neutrfilos, Basfilos y Eosinfilos, los dos primeros son agranulocitos. En la muestra de la mesa N 1 notamos la presencia de Linfocitos, Neutrfilos y Monocitos.

3 Explique brevemente la funcin de los glbulos blancos e indique el porcentaje y numeracin y frmula normal de ellos acuda en bsqueda de literatura. Los leucocitos o glbulos blancos son un conjunto de clulas sanguneas cuya funcin principal es la defensa del organismo de sustancias ajenas o agentes infecciosos; especialmente los linfocitos T4.

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Los valores relativos y absolutos normales en sangre son los siguientes:

TIPO DE CLULA.

FRMULA RELATIVA.

FRMULA PROMEDIO. ABSOLUTA.

Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos

50-65 % 30-45% 5-7% 1-5% 0-1%

2000-6500 /mm3 1200-4500 /mm3 200-700 /mm3 40-500 /mm3 0-100 /mm3

4250/mm3 2850/mm3 450/mm3 270/mm3 50/mm

4Cul es el fundamento de la Coloracin de Wright? La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B. La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y da color rosado a los eritrocitos. Usada en histologa para facilitar la diferenciacin de los tipos de clulas de la sangre. Se usa principalmente para teir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogentica se usa para teir cromosomas, para facilitar el diagnstico de sndromes y enfermedades.

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5.Qu aumentos se han en la observacin de preparados en fijo y para que se usa el aceite de cedro y como estn dispuestos el diafragma y el condenso para permitir el enfoque correcto? El aumento utilizado es de 1000 aumentos debido a las estructuras celulares muy pequeas; adems para obtener una mayor nitidez en las plaquetas y tipos de leucocitos. Los microscopios tienen un espejo o una fuente de luz montada en la parte inferior brillando hacia arriba, hacia la muestra. Un condensador El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su funcin es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminacin hacia la preparacin; afinando drsticamente la imagen y permitiendo que el microscopio mantenga una imagen clara en resoluciones ms altas. En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya funcin es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y ajusta la Apertura Numrica). Es fundamental la realizacin de un enfoque correcto ; ya que se podr visualizar con mayor nitidez las clulas ; distinguiendo sus caractersticas y la tincin de sus estructuras. El aceite de cedro o ACEITE DE INMERSION ayuda a enfocar mejor el haz de luz que viene de la lmpara hacia el complejo de lentes que se encuentran en sistema ptico del microscopio. Para que esto ocurra el aceite colocado en la muestra debe tener contacto tambin con el lente del objetivo.

6.Cite dos colorantes ms y que uso tienen en la identificacin de clulas o microorganismos? ejemplo el colorante BAAR , Gram. La tincin de Ziehl-Neelsen , tambin conocida como BAAR (bacterias cidoalcohol resistentes) es una coloracin diferencial til en la identicacin de Micobacterias,como Myco Mycobacterium tuberculosum; aunque no permite la diferenciacin de distintas especies. La caracterstica de cido-resistencia de estos microorganismos hace de esta coloracin un mtodo rpido en el diagnstico, presuntivo, de infeccin micobacteriana. Las micobacterias son coloreadas de rojo por la Fucsina y retienen el color a pesar de la accin del cido y del alcohol. RODAMINA-AURAMINA: Es una tincin muy utilizada por bacterias cuando el volumen de muestras a examinar es muy elevado. Se fundamenta en la

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UNIIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA DEPARTAMENTO DE MORFOFISIOLOGA Curso: Estructura y Funcin Celular y Tisular I _________________________________________________________________________ afinidad que poseen los cidos miclicos de la pared celular de las micobacterias por los colorantes fluorescentes o fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo oscuro. Un aspecto muy importante de esta coloracin es que luego los frotis pueden ser reteidos con al coloracin Ziehl-Neelsen, directamente sobre la tincin con fluorocromo si se elimina antes el aceite de inmersin.

7. Indique el fundamento de la Coloracin de GRAM El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular bacteriana, con la ayuda del mordiente que refuerza la unin del colorante. Las bacterias GRAM POSITIVAS debido a la estructura y composicin bioqumica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y an despus del tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se observan al microscopio de color azul oscuro o violeta una vez concluida la tcnica de tincin. Las bacterias GRAM NEGATIVAS pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la pared celular lo que aumenta la permeabilidad celular, dando como resultado la prdida del complejo cristal violeta- lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razn por la cual estas clulas bacterianas se observan al microscopio de color rosado una vez concluida la tcnica de tincin.

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UNIIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA DEPARTAMENTO DE MORFOFISIOLOGA Curso: Estructura y Funcin Celular y Tisular I _________________________________________________________________________ 8 Haga un dibujo de un Bacilo o un Coco indicando sus partes bsicas como organismos Procariontes

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UNIIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA DEPARTAMENTO DE MORFOFISIOLOGA Curso: Estructura y Funcin Celular y Tisular I _________________________________________________________________________ 9.Escriba el tamao de las clulas procarionte y compare con las eucariontes indique a travs de ejemplo de algunos de ellos.

PROCARIOTAS 1-3m: Escherichia coli. 0.8m: Streptococcus.

EUCARIOTAS 8-50m: Oscillatoria 20 m: Hepatocitos

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-Colocar -Extender -Fijar

OSERVACIONES
La muestra en seco de sangre colocada a 1000 aumentos, nos permite ver clulas muertas ; la idea es extender la sangre para observar sus elementos y su distribucin. Los leucocitos, generalmente ms grandes que los eritrocitos y con sus ncleos intensamente teidos de color azul violeta; mientras que los eritrocitos son clulas anucleadas que estn teidas de un color naranja plido. Se puede observar distinta intensidad de coloracin entre el centro y la periferia, debido a su forma caracterstica de disco bicncavo. Las plaquetas son difciles de identificar porque se confunden con partculas de polvo u otras impurezas que aparecen dispersas por la extensin, pero son bastante abundantes.

Observamos bacterias se utiliz la coloracin Gram , es para cianobacterias ; teniendo al particularidad de poseer una serie de colorantes, entre ellos el cristal violeta, el Lugol, el Alcohol Acetona y la Safranina. En primer lugar se sac las bacterias, s ech el cristal violeta, despus se le agreg Lugol y finalmente la Safranina Si se pintan de violeta Gram Positivas; y si es Gram Negativa se decolorea con Safranina. En este caso es Gram Positiva.

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CONCLUSIONES:

Para poder apreciar los diferentes tipos de microorganismos y clulas es necesario la utilizacin de los colorantes tanto cidos como los bsicos y neutros, dependiendo el pH del cual vamos a trabajar. Es necesaria la utilizacin de aceites como los de cedro, para corregir las pequeas desviaciones de los rayos de luz que van desde la fuente hasta los oculares. Los diferentes organelos contenidos en el citoplasma tienen diferente pH.

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BIBLIOGRAFA: o o o o o o o o http://demostraciondelbacilodekoch.blogspot.com/2011/06/metodo-decoloracion-de-ziehl-neelsen_03.html http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Wright http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram http://es.scribd.com/doc/15024971/Cap-5-Coloraciones http://www.emagister.com/curso-microscopio/partes-microscopio-optico http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003643.htm http://leucocitosaltos.blogspot.com/2013/01/definicion-y-tipos-deleucocitos.html

df

o http://www.utchvirtual.net/recursos_didacticos/documentos/biologia/leucocitos.p

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CONTENIDO

1. MTODOS DE FIJACION y COLORACIN DE MUESTRAS

2. CUESTIONARIO 3. OBSERVACIONES 4. CONCLUSIONES 5. BIBLIOGRAFA

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