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Rev Iberoam Micol. 2010;27(3):111118

Revista Iberoamericana a de Micolog

www.elsevier.es/reviberoammicol

Original

Desarrollo de un bioadsorbente laminar con Phanerochaete chrysosporium quel y al plomo para el tratamiento de aguas hipertolerante al cadmio, al n
a Mercedes Mart nez-Salgado b, Ana Bertha Diana Morales-Fonseca a, Katherine Ruiz-Tovar a, Mar c c d guez Va zquez y Aura Marina Pedroza-Rodr guez e, n , Ciro Falcony-Guajardo , Refugio Rodr Soto-Guzma
, Colombia a Aplicada, Grupo de Biotecnolog a Ambiental e Industrial, Departamento de Microbiolog a, Ponticia Universidad Javeriana, Bogota Laboratorio de Biotecnolog , a Ambiental y Suelos, Grupo de Biotecnolog a Ambiental e Industrial, Departamento de Microbiolog a, Ponticia Universidad Javeriana, Bogota Laboratorio de Microbiolog Colombia c sica, Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados, Instituto Polite cnico Nacional, D. F., Me xico Departamento de F d a y Bioingenier a, Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados del Instituto Polite cnico Nacional, D. F., Me xico Departamento de Biotecnolog e , Colombia a Aplicada, Grupo de Biotecnolog a Ambiental e Industrial, Departamento de Microbiolog a, Ponticia Universidad Javeriana, Bogota Laboratorio de Biotecnolog
b a

N D E L A R T INFORMACIO ICULO

R E S U M E N

culo: Historia del art Recibido el 9 de junio de 2009 Aceptado el 15 de enero de 2010 On-line el 24 de marzo de 2010 Palabras clave: n Bioadsorcio Phanerochaete chrysosporium Cadmium Plomo quel N

n de metales es una alternativa con respecto a los Antecedentes: El uso de basidiomicetes para la remocio todos tradicionales, ba sicamente porque la biomasa actu a como un intercambiador natural al remover me n. metales en solucio Objetivo: Desarrollar un bioadsorbente laminar empleando el hongo basidiomicete con mayor resistencia quel (Ni) y al plomo (Pb). al cadmio (Cd), al n la tolerancia de Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus y Phanerochaete chrysosporium todos: Se valoro Me quel. frente a concentraciones ascendentes de sulfato de sulfato de cadmio, acetato de plomo y cloruro de n un bioadsorbente a base de la minas de polietileno con biomasa fu ngica, que se evaluo en Se desarrollo tica con los 3 metales con una concentracio n nal de columnas de burbujeo empleando agua residual sinte el efecto de 300 mg/l. Finalmente, con un experimento complementario en matraces Erlenmeyer, se valoro n. mayor cantidad de biomasa sobre la eciencia de remocio s tolerante a C4H6O4Pb (10.000 mg/l), a Cl2Ni (300 mg/l) Resultados: El hongo P. chrysosporium fue la cepa ma ticas, el hongo removio el 69% de la y CdSO4 8H2O (1.500 mg/l). En el reactor y bajo condiciones no ligninol mica de ox geno, produjo enzimas como lignino peroxidasa (0,01 U/l) y manganeso demanda qu la acumulacio n de los metales en la pared. Al incrementar la biomasa a peroxidasa (0,6 U/l) y se observo la bioadsorcio n de los metales en la mezcla (el 57% para el Pb, el 74% para el Cd y el 1,6 (p/v) se favorecio una 98% para el Ni) y por separado (el 95% para el Pb, el 60% para el Cd y el 56% para el Ni). Se observo competencia entre el Ni y el Pb por los ligandos de la pared. un novedoso sistema laminar a base de biomasa viable de P. chrysosporium que n: Se desarrollo Conclusio rea supercial y tolera elevadas concentraciones de Cd, Ni y Pb, como alternativa para la posee gran a n de metales en aguas. remocio a. Publicado por Elsevier Espan a, S.L. Todos los derechos & 2009 Revista Iberoamericana de Micolog reservados.

Development of a laminar bioadsorbent with hypertolerant Phanerochaete chrysosporium to Cd, Ni and Pb for wastewater treatment
A B S T R A C T

Keywords: Biosorption Phanerochaete chrysosporium Cadmium Lead Nickel

Background: The use of basidiomycetes for metal removal is an alternative to traditional methods. In this, the biomass acts as a natural ionic exchanger removing metals from solution. Objective: To develop a laminar biosorbent using a basidiomycete fungus resistant to high Cd, Ni and Pb concentrations. Methods: The tolerance of Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium was evaluated using increasing concentrations of the heavy metal salts, cadmium sulphate, lead acetate and nickel chloride. A biosorbent system was developed based on polyethylene sheets with a fungal biomass. It was evaluated in bubble columns using synthetic wastewater with the 3 metal salts at a rate of 300 mg/l. Finally, in a complementary experiment using shake asks, the effect of a higher amount of biomass related to the metal removal efciency was evaluated.

Autor para correspondencia.

nico: aurapedroza@yahoo.com (A.M. Pedroza-Rodr guez). Correo electro a. Publicado por Elsevier Espan a, S.L. Todos los derechos reservados. 1130-1406/$ - see front matter & 2009 Revista Iberoamericana de Micolog doi:10.1016/j.riam.2010.02.002

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Results: P. chrysosporium strain was more tolerant to C4H6O4Pb (10,000 mg/l), Cl2Ni (300 mg/l) and CdSO4 8H2O (1,500 mg/l). In a reactor, under non-ligninolytic conditions, the fungus removed 69% of the chemical oxygen demand and produced enzymes such as LiP (0.01 U/l) and MnP (0.6 U/l.). An accumulation of metals in the wall was observed. By increasing the biomass to 1.6 (w/v), the metal biosorption was favored in the mixture (57% Pb, 74% Cd, and 98% Ni) and separately (95% Pb, 60% Cd, and 56% Ni). Competition between Ni and Pb by ligands of the wall was observed. Conclusion: A novel laminar system based on P. chrysosporium viable biomass was developed. It has a large surface area and tolerance to high concentrations of Cd, Ni and Pb. It seems to be an alternative for the removal of metals from water. a. Published by Elsevier Espan a, S.L. All rights reserved. & 2009 Revista Iberoamericana de Micolog

A partir de actividades industriales, como electroplateado, as, curtidos, textiles, entre otras, se pinturas, galvanoplastia, bater n de metales generan aguas residuales con elevada concentracio n y pesados, sustancias persistentes con tendencia a la acumulacio n en diferentes niveles tro cos8. Para su a la magnicacio n se han utilizado diversos adsorbentes naturales a base remocio de subproductos agroindustriales y microorganismos como s los bacterias, algas y hongos30, y han sido de especial intere hongos de la podredumbre blanca por tener mayor capacidad de n, de acuerdo con sus caracter sticas siolo gicas: a) su remocio car N-acetilglupared celular contiene subunidades del aminoazu dicos b 14, que pueden cosamina unidas por enlaces glucos remover los metales al formar uniones con ciertos grupos funcionales, como carboxilo y amino13,23; b) su crecimiento n de in vitro se puede controlar para favorecer la produccio rea biomasa en forma de una extensa red miceliar con elevada a a como un intercambiador natural12; c) toleran y supercial, y actu transforman una amplia variedad de compuestos recalcitrantes, n de enzimas ligninol ticas como lacasa por la produccio (E.C. 1.10.3.2), manganeso peroxidasa (MnP) (E.C. 1.11.1.13), til peroxidasa lignino peroxidasa (LiP) (E.C. 1.11.1.14) y versa (E.C. 1.11.1.16). Estas enzimas pueden oxidar la lignina y los ticos con similitud estructural, y se inducen por anillos aroma parte de concentraciones variables de metales21,22. Por esta n, tambie n podr an estar implicadas en la tolerancia a razo n de sustancias metales, ya que participan en la produccio nicas, como melaninas que se han relacionado con la orga n de e stos6. remocio ngica Diferentes autores han reportado el uso de la biomasa fu n y la libre, inmovilizada, viable e inactiva para la adsorcio n de metales. El hongo Trametes versicolor se detoxicacio en perlas de carboximetilcelulosa para la adsorcio n inmovilizo que despue s de 1 h se removieron de cadmio (Cd), y se observo 153 mg/l a 25 1C31. El efecto de la mezcla de metales sobre la capacidad adsortiva y la competencia por los grupos funcionales n se estudio empleando la biomasa viva y muerta de tambie Phanerochaete chrysosporium inmovilizada en alginato de sodio. Se que tiene diferente anidad por el Cd y el mercurio demostro (Hg), ya que al emplear la biomasa viable se removieron 70 mg/l de Cd y 75 mg/l de Hg, mientras que la biomasa inactiva perdio n al adsorber solamente 40 mg/l y 50 mg/l para el Cd sitios de unio meno similar se describio para y el Hg, respectivamente14. Un feno el mismo hongo, pero empleando pellets de biomasa para la n de Cd y plomo (Pb) en mezcla: se presento una bioadsorcio n26. competencia entre los iones por los sitios de adsorcio n combinada entre biomasa y soporte tambie n se La remocio en un estudio con T. versicolor inmovilizado en perlas de demostro n de cobre (Cu), Pb y zinc. carboximetilcelulosa para la remocio De acuerdo con los resultados, el soporte y la biomasa actuaron de forma complementaria, y permitieron mayores niveles de remo n con ce lulas muertas inmovilizadas (1,84 mg/l de Cu, 1,11 mg/l cio de Pb y 1,67 mg/l de zinc)4. n que regula la calidad de las aguas En Colombia, la legislacio mites de vertimiento en aguas residuales residuales exige como l

industriales concentraciones de 0,2 mg/l, 0,003 mg/l y 0,1 mg/l quel (Ni), el Cd y el Pb, respectivamente, pero en muchos para el n ndares no se cumplen y se realiza el vertido al casos, los esta alcantarillado o a cuerpos receptores con concentraciones elevadas, lo que se convierte en un grave problema ambiental y se n a trave s de las cadenas tro cas. Por asocia con la magnicacio sticas esto, es interesante evaluar microorganismos con caracter gicas especiales para el tratamiento de este tipo de siolo residuos7. En estudios previos, se ha demostrado que la biomasa viable de P. chrysosporium inmovilizada en espuma de poliuretano 1.537 mg/l del cromo total presente en el agua residual de removio como una cepa tolerante al curtido de pieles, y se la catalogo concentraciones de 85.000 mg/l12. sulfato de cromo, ya que soporto n, en el presente estudio se utilizo P. chrysospoPor esta razo a rium, Pleurotus ostreatus y T. versicolor, y se los enfrento diferentes concentraciones de Cd, Pb y Ni con el n de seleccionar s tolerante y desarrollar un sistema h brido laminar la cepa ma como alternativa no convencional para el tratamiento de aguas residuales industriales con elevadas concentraciones de los 3 metales. todos Materiales y me Microorganismos Los hongos P. ostreatus, T. versicolor (Laboratorio de Biotecnoa Aplicada de la Ponticia Universidad Javeriana, Bogota , log Colombia) y P. chrysosporium (Laboratorio de Compuestos Xeno ticos, Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados del bio cnico Nacional, D. F., Me xico) se reactivaron en Instituto Polite as a 30 1C en agar extracto de salvado con la cultivos de 8 d n (en g/l): glucosa, 10; peptona, 5; extracto siguiente composicio de levadura, 2; KH2PO4, 0,1; MgSO4 7H2O, 0,05; MnSO4 H2O, quido de salvado de trigo, 17525. 0,076; agar, 15; extracto l xima tolerada para C4H6O4Pb, Cl2Ni y n ma Concentracio CdSO4 8H2O La tolerancia de las 3 cepas a diferentes concentraciones de Cd, por medio de 2 experimentos identicados Ni y Pb se realizo como prueba de tolerancia a bajas concentraciones (PTBC) y prueba de tolerancia a elevadas concentraciones (PTEC). En las un rango de concentraciones entre 0,02 y 1,5 mg/l PTBC se evaluo as de incubacio n a midiendo el crecimiento en mm a los 10 d diariamente el 30 1C. Por el contrario, en las PTEC se cuantico crecimiento radial durante el mismo tiempo y las concentraciones evaluadas oscilaron entre 15 y 11.000 mg/l. El montaje se realizo metro que conten an empleando cajas de Petri de 50 mm de dia n fue glucosa de 2,5 g/l, 10 ml de agar Radha, cuya composicio KH2PO4 de 2,0 g/l, NH4Cl de 0,050 g/l, MgSO4 7H2O de 0,5 g/l, CaCl2 2H2 de 0,01 g/l, tiamina de 100 mg/l y agar de 15 g/l. A este n de elementos traza y el adieron 10 ml de una solucio medio se an n, se pH nal fue de 6,827. Al nalizar el proceso de esterilizacio

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adieron en concentraciones ascendentes las sales de cloruro de an Ni (NiCl3), sulfato de Cd (CdSO4 8H2O) y acetato de Pb n se realizo al colocar un disco de agar, (CH3COOPb). La inoculacio con los hongos previamente reactivados, en cada una de las cajas as. Como control negativo se y al incubarlas a 30 1C durante 10 d el medio Radha libre de metales. La concentracio n ma xima utilizo como el valor ma s alto de cada metal tolerada (CMT) se denio el crecimiento de los hongos; la con el que se observo n m nima inhibitoria se denio como la concentraconcentracio n ma s baja que inhib a el crecimiento fu ngico. cio n de biomasa para la inmovilizacio n del soporte Produccio Se tomaron 10 discos de agar colonizados con micelio, se an inocularon en matraces Erlenmeyer de 250 ml, que conten 50 ml de caldo de extracto de salvado de trigo, y se incubaron as a 30 1C y a 120 rpm. Al nalizar la propagacio n en el durante 8 d quido, la biomasa se recupero por ltracio n y se disgrego en un l ctrico durante 5 min a 1.000 rpm. El homogeneizado se molino ele en agua destilada este ril hasta completar un volumen resuspendio refrigerado a 4 1C para emplearlo como de 50 ml y se almaceno culo en la elaboracio n de los bioadsorbentes laminares. ino n o del poro del soporte y el tiempo de colonizacio Efecto del taman sobre la cantidad de biomasa inmovilizada n y el dia metro Para evaluar el efecto del tiempo de colonizacio ngica del poro de las mallas sobre la cantidad de biomasa fu un disen o experimental 22 (tabla 1)19. inmovilizada, se realizo Como variable de respuesta, se evaluaron los mg/cm2 de biomasa minas. El ana lisis de datos se realizo inmovilizada sobre las la usando los programas SAS 9.0s y Desing Expert 6.0s, y los rico que relaciona las resultados se trataron con un modelo emp respuestas cuanticadas con los factores evaluados y sus o de 2 factores, el modelo de respectivos niveles. Para un disen primer orden fue el siguiente: y bo b1 x1 b2 x2 b12 x1 x2 1

n del bioadsorbente para los reactores se realizo La produccio as. Sin embargo, se de manera similar que la de las mallas pequen una modicacio n que consistio en utilizar mallas de realizo 20 30 cm colocadas sobre bandejas de aluminio de 35 25 cm an 150 ml del mismo agar. Posteriormente, se que conten n de biomasa y se incubaron inocularon con 50 ml de la suspensio a 30 1C durante 72 h. El peso seco de la biomasa nal en cada por medio del secado de las mallas bioadsorbente se realizo lculo de con la biomasa a 80 1C durante 12 h y por medio del ca n la diferencia de pesos, teniendo en cuenta el los mg/cm2 segu peso inicial de las mallas. n para C4H6O4Pb, Cl2Ni y CdSO4 8H2O a 300 mg/l Curvas de remocio en la columna de burbujeo Se utilizaron columnas de vidrio de 50 cm de largo y 5 cm de metro interno. Cada columna se inoculo con 2 mallas de dia ngica y 525 ml de medio 20 30 cm colonizadas con biomasa fu Radha suplementado con la mezcla de metales a 300 mg/l (agua tica). La temperatura y la aireacio n se mantuvieron residual sinte constantes a 30 1C y a 1 l/min. Los muestreos se realizaron cada cares reductores18, la actividad 24 h para determinar el pH, los azu tica tipo MnP17 y LiP29, la demanda qu mica de ox geno enzima trofas totales9. Las (DQO)10 y el recuento de bacterias hetero mallas colonizadas se secaron para calcular el peso seco nal y nico de barrido; se realizar su estudio en el microscopio electro un equipo JEOL JSM-6.300s adaptado a un detector de empleo n de energ a Noral Voyager II software 1100/ rayos X por dispersio lisis de los metales en 1110s para llevar a cabo el microana mico por la te cnica de espectrometr a de dispersio n porcentaje ato a de rayos X (EDX). de energ s, para demostrar si la biomasa fu ngica libre ten a Adema un mayor anidad por alguno de los metales, se realizo experimento complementario empleando matraces Erlenmeyer an 170 ml de agua residual sinte tica, y de 500 ml, que conten n nal de metales por separado y en mezcla a una concentracio stos se inoculo con 1,6 (p/v) de biomasa y 300 mg/l. Cada uno de e as a 30 1C y a 120 rpm. Se evaluaron los se incubaron durante 2 d n ato mica10, pH, niveles de los metales pesados por absorcio cares y microscopia electro nica acoplada a EDX. azu

a la variable dependiente, bo fue el Donde y correspondio intercepto, b1 y b2 fueron los coecientes lineales, y x1 y x2 fueron los factores o variables independientes. n del bioadsorbente laminar para el disen o factorial y los Elaboracio reactores de 750 ml o experimental se utilizaron mallas de 5 5 cm En el disen an 15 ml de agar colocadas sobre cajas de Petri de 9 cm que conten extracto de salvado de trigo. Se inocularon con 1,5 ml de la n de biomasa fu ngica y se incubaron a 30 1C durante 36 suspensio y 72 h.

Resultados En las PTBC, los 3 hongos soportaron todas las concentraciones un de CdSO4 8H2O, NiCl3 y CH3COOPb; asimismo, se observo as de incubacio n, sin crecimiento radial de 50 mm a los 10 d n ni en la morfolog a macrosco pica, ni en la microsco pica, alteracio ni en la presencia de melaninas difusibles en agar Radha. Los resultados de las PTEC mostraron que la tolerancia variaba de n; el NiCl3 fue el acuerdo con el tipo de metal y la concentracio s to xico para los 3 microorganismos con una CMT de 30, 300 y ma 500 mg/l para P. ostreatus, P. chrysosporium y T. versicolor,

Tabla 1 metro del poro y el tiempo de colonizacio n sobre la cantidad de biomasa inmovilizada por medio de un disen o factorial 22 Efecto del dia Tratamiento 1 2 3 4 Factor X1 Factor X2 metro del poro, mm Factor X1: dia 1 +1 1 +1 Nivel Nivel Nivel Nivel Factor X2: tiempo, d 1 1 +1 +1 5 mm 2 mm 3d 1,5 d Biomasa inmovilizada, mg/cm2 153 7 2,8 155 7 4 157 7 1,9 137 7 3,5

alto (+ ) bajo ( 1) alto (+ ) bajo ( 1)

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respectivamente. Con respecto al CdSO4 8H2O, las concentraciones fueron de 250, 1.500 y 1.500 mg/l para P. ostreatus, P. chrysosporium y T. versicolor, respectivamente (g. 1). El metal s tolerado fue el CH3COOPb, con valores de 2.000, 10.000 y ma 5.000 mg/l para el mismo orden de microorganismos. De acuerdo lisis estad stico, los hongos P. chrysosporium y con el ana s tolerantes a los 3 T. versicolor fueron signicativamente ma metales (p o 0,0001). Sin embargo, al comparar el tiempo de que crecimiento en presencia del metal, se determino el mejor crecimiento, en un menor P. chrysosporium presento valores de 10, 9 y tiempo que T. versicolor (p o 0,0001), y alcanzo as de incubacio n para el Ni, el Cd y el Pb, 12 mm a los 5 y 2 d ximo de respectivamente. Por el contrario, el crecimiento ma as, respectivamente. T. versicolor fue de 5, 6 y 7 mm a los 8, 4 y 10 d n o del poro del soporte y el tiempo de colonizacio Efecto del taman o factorial 22 sobre la cantidad de biomasa inmovilizada. Disen lisis de la variancia demostraron que el Los resultados del ana metro del poro de las mallas (X1) y el tiempo de colonizacio n dia (X2) no tuvieron efecto signicativo alguno ni por separado ni en conjunto sobre la cantidad de biomasa inmovilizada (p 4 0,0001), que el bioadsobente laminar se pod a elaborar lo que determino tanto en las mallas de 5 mm como en las de 2 mm, en 36 o 72 h. No el tratamiento 3 por ser en el que retuvo la obstante, se selecciono mayor cantidad de biomasa (157 mg/cm2, tabla 1). n de cadmio, n quel y plomo en la columna de Curvas de remocio burbujeo n de la DQO, el agua residual sinte tica Con respecto a la remocio a 1.700 mg/l de DQO, y en su mayor a la aporto la fuente de ten geno y bacterias hetero trofas (25 102 UFC/ml). carbono, nitro un 68% a las Bajo estas condiciones, el bioadsorbente removio una disminucio n del porcentaje 48 h; posteriormente, se presento equivalente a un 15%, que pudo haberse asociado con el trofos (30 108 UFC/ml) a medida que incremento de los hetero ngica absorb a los metales, lo que genero condiciola biomasa fu s favorables para las bacterias. Adema s, se presento una nes ma n negativa signicativa (p =0,0006) entre el porcentaje correlacio n de la DQO y la glucosa residual hasta el segundo d a, de remocio que la fuente de carbono se utilizo para mantener lo que demostro

la remocio n de la materia el metabolismo primario y favorecio nica representada en la disminucio n de la DQO. De la misma orga geno tambie n se pudo asimilar e forma, la fuente de nitro ntesis de compuestos como quitina, ADN, inmovilizar para la s nas, entre otros. De acuerdo con estos resultados, el ARN y prote s eciente que el soporte solo, ya que hongo inmovilizado fue ma n no supero el 10% al en el control libre de biomasa la remocio a. El consumo de glucosa se mantuvo constante hasta el quinto d a, en el que se presento un descenso que pudo haber cuarto d trofas estado relacionado con el incremento de las bacterias hetero (95 103 UFC/ml). En el control absoluto (agua residual sin n de microorganismos), no se presento remocio n de la adicio entre 3,4 y 3,7 g/l, y las poblaciones se DQO, la glucosa oscilo mantuvieron durante todo el experimento en 10 102 UFC/ml. En la gura 2 se observa el comportamiento de las enzimas n del tiempo; las 2 se produjeron desde el MnP y LiP en funcio s alta a los 2 comienzo del proceso, y alcanzaron la actividad ma as con 0,6 y 0,01 U/l (MnP y LiP, respectivamente). Se observo d n positiva altamente signicativa (p o 0,0001) con una correlacio n de DQO, posiblemente porque la presencia de los la remocio una induccio n al estimular la s ntesis de metales genero melaninas, que pudieron participar de manera complementaria n y como mecanismo de proteccio n para el hongo. en la remocio la actividad enzima tica, especialmente en Otro factor que afecto ltimos d as, fue el cambio en el pH, ya que al iniciar la cine tica los u se encontraba en 4,0 y gradualmente se fue incrementando hasta alcanzar un valor de 6,8.

lisis de energ nica de barrido y microana a de Microscopia electro rayos X sticas microsco picas En la gura 3A se observan las caracter ste correspond n. E a a del soporte empleado para la inmovilizacio rea supercial, un material delgado con densidad baja y elevada a sticos entrecruzados para estructuralmente formado por hilos pla metro de 2 mm. En la microfotograf a del formar una malla con dia una colonizacio n total, y se bioadsorbente laminar se observo destacaron la presencia de hifas delgadas y septadas, y la presencia de esporas sobre la supercie (g. 3B). En el lisis de EDX se presentaron picos de carbono, ox geno microana geno que correspondieron a elementos constitutivos de la y nitro ngica. biomasa fu

50 45
P.o. 250 ppm Cd P.o. 300 ppm Cd P.c. 1.500 ppm Cd P.c. 3.000 ppm Cd T.v. 1.500 ppm Cd T.v. 2.000 ppm Cd

50 45
P.o. 15 ppm Ni P.o. 25 ppm Ni P.c. 300 ppm Ni P.c. 500 ppm Ni T.v. 500 ppm Ni T.v. 750 ppm Ni

50 45
P.o 3.000 ppm Pb P.o. 4.5000 ppm Pb P.c. 10.000 ppm Pb P.c. 11.000 ppm Pb T.v. 5.000 ppm Pb T.v. 10.000 ppm Pb

Crecimiento radial (mm)

35 30 25 20 15 10 5 0

Crecimiento radial (mm)

Crecimiento radial (mm)

40

40 35 30 25 20 15 10 5 0

40 35 30 25 20 15 10 5 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tiempo (das)

Tiempo (das)

Tiempo (das)

n de la concentracio n ma xima tolerada para CdSO4, Cl2Ni y C4H6O4Pb sobre agar Radha para los hongos de podredumbre blanca. Las vin etas oscuras Figura 1. Determinacio ximas toleradas y las claras a los valores de las concentraciones m nimas inhibitorias. Incubacio n durante 10 d as a 30 1C. corresponden a las concentraciones ma quel; Pb: acetato de plomo; P.o.: Pleurotus ostreatus; P.c: Phanerochaete chrysosporium; T.v.: Trametes versicolor. Cd: sulfato de cadmio; Ni: cloruro de n

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a Respecto a la mezcla de los 3 metales, con la microscop nica se observo que los 3 se adsorbieron sobre la pared electro n o (g. 4). Esta disposicio formando agregados de diferente taman n por los grupos pudo determinar una posible competicio n para los metales, situacio n funcionales con capacidad de unio con el microana lisis de EDX, en el que los que se corroboro micos para cada metal fueron de 0,19, 0,64 y 5,1% porcentajes ato para el NiCl3, el CdSO4 8H2O y el CH3COOPb en el bioadsorbente, n era 2, 8 y de 0,09, 0,08 y 0,1% en la malla sin biomasa. La adsorcio s alta cuando la biomasa recubr a la malla. La menor y 50 veces ma

n de NiCl3 se correlaciono con las pruebas de tolerancia, adsorcio s to xico con una CMT de 300 mg/l. ya que fue el metal ma

n de n quel, cadmio y plomo con biomasa viable sin Remocio inmovilizar Para vericar el efecto de una mayor cantidad de biomasa y la n entre metales por los ligandos de la pared se posible competicio un ensayo complementario en matraces Erlenmeyer, y se realizo

100 90 80 Remocin DQO (%) 70

Biomasa inmovilizada Soporte Control absoluto

9,0 7,5 6,0 4,5 3,0 1,5

Biomasa inmovilizada Soporte pH

9,0 0,6 7,5 Actividad MnP ( /l) 6,0 4,5 3,0 1,5 pH 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

MnP ( /l) LiP ( /l)

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Actividad LiP ( /l)

60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 Tiempo (das) 5 6

Glucosa (g/l)

2 3 4 Tiempo (das)

2 3 4 Tiempo (das)

n en la columna de burbujeo. Incubacio n durante 5 d as a 30 1C y aireacio n a 1 l/min. DQO: demanda qu mica de ox geno; LiP: lignino Figura 2. Curvas de remocio peroxidasa; MnP: manganeso peroxidasa.

metro de poro sin colonizar. B) MEB de la malla de polietileno de 2 mm a 2.000 . C) Malla colonizada (10 ) con Figura 3. A) Malla de polietileno (40 ) de 2 mm de dia as de incubacio n a 30 1C. D) Microscop a electro nica de barrido de las hifas y las esporas de P. chrysosporium que recubre la malla Phanerochaete chrysosporium tras 2 d (1000x).

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4 veces ma s biomasa en forma de pellets que en las coloco columnas de burbujeo. Con respecto al comportamiento de la mezcla, se obtuvieron remociones del 74, 57 y 98% para el CdSO4 8H2O, el CH3COOPb y el NiCl3, respectivamente, con una n por los metales, posible competencia por los sitios de unio especialmente entre el Pb y el Ni, ya que al realizar los experimentos con las mismas concentraciones de metal, pero de n de Pb aumento a un 95% y la manera independiente, la remocio al 56%. Asimismo, este resultado demuestra que de Ni disminuyo la biomasa de P. chrysosporium tuvo mayor anidad por el Pb seguido, del Cd (60%) y el Ni valores que concuerdan con los s adelante (gs. 57). resultados de EDX que se presentan ma genes por microscopio electro nico en presencia de En las ima sticas de la pared, como la Ni se observaron algunas caracter n de homogeneidad de la estructura asociada con la organizacio las subunidades de N-acetilglucosamina unidas por enlaces dicos b 14. En el microana lisis de EDX se conrmo glucos s afecto a la biomasa, al nuevamente que el Ni fue el metal que ma mico del 0,13% (g. 5). En lo referente acumular un porcentaje ato

nica de barrido (2.500 ) y energ a de rayos X para Figura 6. Microscopia electro la biomasa de Phanerochaete chrysosporium inmovilizada en contacto con CdSO4 a n durante 2 d as a 30 1C y a 120 rpm. 300 mg/l en Erlenmeyer. Incubacio

nica de barrido (2.000 ) y energ a de rayos X para Figura 4. Microscopia electro la biomasa de Phanerochaete chrysosporium inmovilizada en contacto con la mezcla n durante de CdSO4, Cl2Ni y C4H6O4Pb a 300 mg/l en el reactor de 750 ml. Incubacio as a 30 1C y aireacio n a 1 l/min. 5 d

nica de barrido (5.000 ) y energ a de rayos X para Figura 7. Microscopia electro la biomasa de Phanerochaete chrysosporium inmovilizada en contacto con n durante 2 d as a 30 1C y C4H6O4Pb a 300 mg/l en matraz Erlenmeyer. Incubacio a 120 rpm.

nica de barrido (5.000 ) y energ a de rayos X para Figura 5. Microscopia electro la biomasa de Phanerochaete chrysosporium inmovilizada en contacto con Cl2Ni a n durante 2 d as a 30 1C y a 120 rpm. 300 mg/l en Erlenmeyer. Incubacio

al Cd, se pudieron evidenciar los agregados del metal, y con la EDX que fue el segundo con respecto a la anidad (0,43%). se establecio ltimo, en el ensayo con Pb se demostro que este fue el metal Por u por el que la biomasa tuvo mayor anidad, con un porcentaje del s alto que el obtenido en la mezcla). Los datos se 8,1% (valor ma correlacionan con la prueba de tolerancia, ya que la cepa soporto hasta 10.000 mg/l de Pb (g. 7). ticas LiP y MnP se presentaron en todos Las actividades enzima los tratamientos, con valores de LiP de 0,028, 0,029, 0,024 y 0,02 U/l en el Ni, el Cd, el Pb y la mezcla. Con respecto a la enzima MnP, las actividades fueron de 0,2, 0,17, 0,13 y 0,016 U/l en an relacionarse con la misma secuencia. Los valores bajos podr n no ligninol tica del agua residual en asociacio n con la condicio la presencia de los metales, siendo inducidas para estimular la n de melaninas como prote nas de proteccio n contra los produccio n en el reactor, en metales. A diferencia de las curvas de remocio este ensayo en matraces Erlenmeyer y con mayor cantidad de una acidicacio n del medio en todos los biomasa se presento con tratamientos, con valores iniciales de pH de 5,2, y que nalizo

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valores de 3,4, 4,1, 3,6 y 4,7 para el Ni, el Cd, el Pb y la mezcla. Este cambio en el pH se pudo deber a la mayor cantidad de biomasa. ecientemente la glucosa como fuente de Esta biomasa utilizo un carbono, ya que en todos los tratamientos se presento consumo al nalizar el experimento.

n Discusio La elevada tolerancia de P. chrysosporium pudo haber aparecido n prolongada y ascendente de los 3 como respuesta a la exposicio metales, lo que determina que posiblemente se hayan activado ntesis de mecanismos como el engrosamiento de la pared, la s n de a cidos orga nicos2. Estos hongos melaninas y la produccio producen una pared celular compuesta principalmente por ridos (b 13 y b 16 glucanos), que atrapan los iones polisaca licos y ofrecen una barrera primaria contra el metal3. Otro meta tipo de ligandos son las melaninas, compuestos de alto peso n y la polimerizacio n de molecular formados por la oxidacio licos (dihidroxinaftaleno y tirosinasa). Estos compuestos feno an compuestos pueden existir como radicales libres que actu como receptores o donadores de protones, ya que contienen lico e hidroxilo, que se reducen por grupos carboxilo, amino, feno licos y oxidados por pero xido6. parte de iones meta Es factible que los 2 primeros mecanismos se hayan presentado en este microorganismo, ya que al observar la parte anterior n en la gama del cafe y el de las cajas era evidente una pigmentacio especialmente con el Cd. Por otro lado, amarillo, que se acentuo picas con bajo cuando se realizaron las observaciones microsco aumento (40x), las hifas no tomaron uniformemente el colorante azul de lactofenol, lo que demuestra que a medida que se fue n de metales, se genero un incrementando la concentracio stos y los grupos oxidrilo o hidroxilo de los complejo entre e meros de N-acetilglucosamina, y se ocasiono la disminucio n mono n para el colorante. Un feno meno similar se en los sitios de unio para Neurospora crassa expuesta a sulto de cadmio; los reporto n de un complejo meta lico con autores evidenciaron la formacio ciertos grupos funcionales de la quitina5. o experimental, la Con respecto a los resultados del disen n eciente del soporte se atribuyo a 2 mecanismos: la colonizacio n capacidad invasiva de las hifas de P. chrysosporium y la produccio de conidios. Cuando este microorganismo se cultiva in vitro ticas empleando medios que simulan condiciones ligninol n carbono/nitro geno 150300), crece formando abundante (relacio n, la colonizacio n fue eciente, ya que para micelio. Por esta razo geno y nutrientes, las hifas se acceder a la fuente de carbono, nitro fueron desarrollando apicalmente y fueron atravesando los poros que se formara una na capa sobre los de la malla, lo que origino soportes de 3 7 1 mm de espesor. De manera complementaria, los s pequen os que las hifas (30 7 2 mm), pudieron conidios, al ser ma atravesar con mayor facilidad los poros de 2 mm y se convirtieron en unidades germinativas que colonizaron la parte posterior del material. El desarrollo de este novedoso bioadsorbente laminar as presentadas en la tiene ventajas con respecto a otras geometr dica, ya que, al ser delgado, presenta una mayor a rea literatura me n por ambas caras y su supercial con capacidad de adsorcio exibilidad facilita su uso14,15. s, al tener un espesor de 3 mm, la transferencia de Adema geno se ve favorecida al no generarse zonas anaerobias o ox las que afecten el metabolismo aerobio del hongo. Se microaero n en el ha observado que en soportes muy gruesos, la colonizacio interior es deciente y puede estar relacionada con gradientes de geno12,25. ox n en la columna de burbujeo, la carga En las curvas de remocio inicial de la DQO fue alta y se puede atribuir a la fuente de geno, y a las poblaciones acompan antes, ya que el carbono y nitro

sin control de esterilidad. Bajo estas experimento se realizo n de la DQO se atribuyo a la utilizacio n de condiciones, la remocio s de rutas como la gluco lisis y el ciclo de los la glucosa a trave cidos tricarbox licos20, que no se vieron inhibidas por la a presencia de los 3 metales (al nal de las curvas el peso de la la viabilidad del hongo al biomasa fue superior). Se conrmo el sembrar un fragmento de la malla en agar salvado, y se observo stico a los 8 d as de incubacio n (datos no crecimiento caracter s, se pudieron formar a cidos orga nicos, como mostrados). Adema cido oxa lico, que funcionar a como agente quelante para el a licos en solucio n. El efecto sine rgico de la remover los iones meta demostrado al comparar los biomasa y el soporte quedo n de la DQO con el soporte solo. Los resultados con la remocio n de las enzimas posibles mecanismos implicados en la produccio an explicar por 2 teor as. Segu n la primera, las enzimas se se podr pueden inducir por la presencia de metales pesados, mecanismo que se lleva a cabo a nivel transcripcional y genera un incremento en los niveles de ARNm. Los estudios han documentado ampliamente para manganeso, Cu, Cd, Hg y cobalto11,16,24, completamente dilucidado, ya aunque el mecanismo no esta que son muy pocas la investigaciones que se reportan en las que n de la actividad enzima tica asociada se realice la cuanticacio n de metales pesados. La segunda teor a esta con la remocio n de melaninas como mecanismo de relacionada con la produccio n contra los metales, ya que en la s ntesis de estos proteccio compuestos intervienen peroxidasas y polifenol oxidasas. Por lo ticas tanto, al sintetizarse las melaninas, las enzimas ligninol an su actividad para participar en su produccio n sin incrementar lico6,12. sustraer electrones en el compuesto meta n de Con respecto a los resultados de la EDX y a la cuanticacio a de absorcio n ato mica, los los metales por espectrofotometr resultados indican que posiblemente la biomasa libre tenga sitios n, como los grupos suldrilo, amino, carboxilo, fosfato, de unio licos se pudieron entre otros, por medio de los que los iones meta n. Adema s, se capturar y llevarse a cabo el proceso de adsorcio un comportamiento similar al colocar el hongo en cada observo stos. No obstante, se presento tipo de metal y en la mezcla de e mayor anidad por el Pb, y es evidente que en la mezcla se genero un proceso de competencia entre el Pb y el Ni por los ligandos de para P. chrysosporium al la pared. Este mismo resultado se reporto ser expuesto a Cd, a Pb y a Cu. De acuerdo con los resultados de n, el orden de anidad en la mezcla fue Cu (II) 4 Pb acumulacio (II) 4 Cd (II), secuencia que se mantuvo al evaluar de manera stos28. La disminucio n de los independiente cada uno de e n se ha asociado con el feno meno de porcentajes de remocio la competencia de los cationes1. Otro factor que favorecio n en el experimento en matraz fue la acidicacio n del remocio la solubilizacio n de los metales y una medio, ya que se permitio n ma s ecaz a los ligandos anio nicos como grupos fosfo ricos, unio xidos, que se activan en presencia de carbonilos, suldrilos e hidro los metales. Finalmente, los resultados de este trabajo permitieron desan a rrollar un novedoso sistema laminar con capacidad de absorcio rea base de la biomasa viable de P. chrysosporium, con una gran a supercial y tolerancia a concentraciones elevadas de Cd, Ni y Pb. s, actividades enzima ticas como la MnP y la LiP podr an Adema estar relacionadas con ciertos mecanismos de tolerancia e n. induccio

n Financiacio El presente estudio forma parte del proyecto N.o 00002769, n de la nanciado por la Ocina de Fomento a la Investigacio a Acade mica de la Ponticia Universidad Javeriana, Vicerrector , Colombia. Bogota

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