MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL

DE LOS
MICROORGANISMOS

Dra. M. E. Arias Fernández

Dpto. Microbiología y Parasitología
E-mail: enriqueta.arias@uah.es
 PROGRAMA
• Métodos de observación de los microorganismos

El microscopio. Tipos de microscopios. Preparación y examen
de muestras. Tipos de tinciones.

• Métodos de aislamiento de los microorganismos

• Crecimiento de los microorganismos:

Nutrición microbiana: requerimientos nutritivos

Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo

Crecimiento microbiano: curva de crecimiento

Determinación del crecimiento.

Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento

Microorganismos extremófilos

• Control de poblaciones microbianas:

Métodos físicos: Esterilización y otros métodos

Métodos químicos: desinfectantes, antisépticos y
esterilizantes

Agentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos de
síntesis
MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS
 MICROORGANISMOS
MICROORGANISMOS

PROTOZOOS
BACTERIAS

HONGOS VIRUS

ALGAS

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

MICROSCOPIO ÓPTICO

VIRUS BACTERIAS EUCARIOTAS

1 nm 10 102 103 104 105 106

SUBVIRICAS
1 µm 1 mm

RANGO DE TAMAÑO DE LOS MICROORGANISMOS

 TIPOS DE MICROSCOPIOS

• Microscopio óptico:

Microscopio de campo claro

Microscopio de campo oscuro

Microscopio de contraste de fases

Microscopio de fluorescencia

Microscopio de láser confocal

• Microscopio electrónico:

De barrido

De transmisión

• Microscopio de fuerza atómica (AFM)

 EL
EL MICROSCOPIO
MICROSCOPIO ÓPTICO
ÓPTICO

CAMPO CLARO CAMPO OSCURO CONTRASTE DE FLUORESCENCIA CONFOCAL

FASES
 EL
EL MICROSCOPIO
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
ELECTRÓNICO
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM)
Haz de electrones que “barre” la superficie de un objeto sólido

Resolución: < 7nm

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM)
Haz de electrones que atraviesa cortes ultrafinos de una muestra

Resolución: 5 Å
 Manipulando
átomos...

Microscopio de efecto túnel

Microscopio de fuerza atómica
Obtiene imágenes con resolución de
menos de 1 nm
Observación de una espora de Aspergillus oryzae atrapada en un poro
con microscopio de fuerza atómica
 TIPOS
TIPOS DE
DE TINCIONES
TINCIONES

TINCIÓN
TINCIÓN SIMPLE
SIMPLE

TINCIÓN
TINCIÓN DIFERENCIAL
DIFERENCIAL
TINCIÓN DE GRAM TINCIÓN DE Ziehl-Neelsen

TINCIONES
TINCIONES ESPECÍFICAS
ESPECÍFICAS
TINCIÓN DE CÁPSULA TINCIÓN DE FLAGELOS TINCIÓN DE ESPORAS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE
LOS MICROORGANISMOS
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

• Siembra por estría en placa Petri

• Vertido en placa
• Extensión en placa:
- Diluciones seriadas
- Asa de Digralsky
MÉTODOS
MÉTODOS DE
DE AISLAMIENTO
AISLAMIENTO DE
DE CULTIVOS
CULTIVOS PUROS
PUROS

SIEMBRA POR ESTRÍA EN PLACA DE PETRI

 MÉTODOS
MÉTODOS DE
DE AISLAMIENTO
AISLAMIENTO DE
DE CULTIVOS
CULTIVOS PUROS
PUROS
DILUCIONES SERIADAS

Extensión en placa Vertido en placa

 MEDIOS DE CULTIVO

Medios definidos

Medios complejos

Medios selectivos

Medios diferenciales

Medios selectivos y diferenciales

Medios de enriquecimiento
 MEDIOS DE CULTIVO

COMPOSICIÓN DE UN MEDIO DEFINIDO Y UN MEDIO COMPLEJO

• Medio definido • Medio complejo: caldo nutritivo

 Glucosa…………. 10 g Peptona…………… 5 g
 (NH4)2SO4…………. 2 g Extracto de carne.. 3 g
 CaCl2 ……….......0,01 g NaCl…………………8 g
 FeSO4.7H2O…..0,005 g Agua destilada…….1 L
 MgSO4.7H2O…..0,02 g
 Agua destilada…… 1 L
 Agar……………… 15 g
 MEDIOS DE CULTIVO
Medios selectivos y diferenciales

Agar Entérico Agar Baird- Agar Levine

de Hektoen Parker (EMB) Agar Wilson-Blair
(Enterobacterias patógenas) (Estafilococos) (Coliformes) (Salmonella)

Medios de enriquecimiento

Caldo Müller-Kauffmann
Caldo Giolitti-Cantoni (Salmonella)
(Estafilococos)
CRECIMIENTO Y CONTROL DE
LOS MICROORGANISMOS
NUTRICIÓN
NUTRICIÓN MICROBIANA:
MICROBIANA: REQUERIMIENTOS
REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS
NUTRITIVOS

Fuente de carbono:
- CO2: Autótrofos
- Compuestos orgánicos: heterótrofos

Fuente de energía: generación de ATP y poder reductor
- Luz: fototrofos
- Compuestos químicos: quimiotrofos
- compuestos orgánicos: quimioorganotrofos
- compuestos inorgánicos: quimiolitotrofos

Tipos nutricionales de los microorganismos:

 Fotoautótrofos
 Fotoheterótrofos
 Quimiolitotrofos autótrofos
 Quimiolitotrofos heterótrofos: mixotrofos
 Quimioorganotrofos heterótrofos (quimioheterótrofos)
CADENA
CADENA METABÓLICA:
METABÓLICA: ETAPAS
ETAPAS

1- ENTRADA DE NUTRIENTES
CADENA
CADENA METABÓLICA:
METABÓLICA: ETAPAS
ETAPAS

2- REACCIONES CATABÓLICAS
CADENA
CADENA METABÓLICA:
METABÓLICA: ETAPAS
ETAPAS

3- BIOSÍNTESIS
CADENA
CADENA METABÓLICA:
METABÓLICA: ETAPAS
ETAPAS

4- POLIMERIZACIÓN
CADENA
CADENA METABÓLICA:
METABÓLICA: ETAPAS
ETAPAS

5- ENSAMBLAJE
 FUENTE DE NITRÓGENO
(Nitrosomonas, Nitrobacter)

(Azotobacter,
Cianobacterias)

Inorgánica:
- NH4+
- NO3-
- N2
(Clostridium,
fototrofas rojas
y verdes)

(Bacillus, Pseudomonas)

Compuestos orgánicos nitrogenados:

- aminoácidos
- bases nitrogenadas, etc.
 OTROS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Fósforo: Fosfato (Thiobacillus,

Beggiatoa,Foto-
trofos erobios)

Azufre:
- SO4 2-
- SH2 (Desulfovibrio,
Desulfobacter)

- Compuestos
(Desulfuromonas,
orgánicos azufrados Archaea term.)

(B. Fototróficas

K, Mg, Na, Ca, Fe, etc. rojas y verdes)

Micronutrientes: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, etc.

Factores de crecimiento: vitaminas, aminoácidos,
purinas, pirimidinas, etc.
 CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• División celular en procariotas

Fisión binaria

1. Contraste de fases
El tiempo para completar el ciclo 2. Tinción de nucleoide
depende de factores
3. Tinción del anillo FtsZ
nutricionales y genéticos
4. Tinción de nucleoide y anillo
 CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES
• Crecimiento de poblaciones
- Velocidad de crecimiento
- Tiempo de generación
- Expresión del crecimiento
Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano que se inicia con una
sola célula y que tiene un tiempo de generación de 30 min:

Datos de una población que se

duplica cada 30 minutos Datos representados
en distintas escalas
CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• Curva de crecimiento: sus fases

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO
RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO

TURBIDIMETRÍA
DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO
RECUENTO DE VIABLES
EFECTO
EFECTO DE
DE FACTORES
FACTORES AMBIENTALES
AMBIENTALES SOBRE
SOBRE EL
EL CRECIMIENTO
CRECIMIENTO

• Temperatura
Reacciones enzimáticas
a la máxima velocidad
posible
Tasa de Crecimiento

Reacciones enzimáticas
incrementando sus
velocidades de reacción

Gelificación de membrana; Desnaturalización de

proceso de transporte Proteínas;
demasiado lento para Colapso de la membrana;
soportar el crecimiento citoplasmática; lisis térmica

Temperatura mínima y óptima

EFECTO
EFECTO DE
DE FACTORES
FACTORES AMBIENTALES
AMBIENTALES SOBRE
SOBRE EL
EL CRECIMIENTO
CRECIMIENTO

• Temperatura
Tipos de microorganismos según su temperatura óptima

Termófilos
Hipertermófilos Hipertermófilos
Mesófilos

Psicrófilos
EFECTO
EFECTO DE
DE FACTORES
FACTORES AMBIENTALES
AMBIENTALES SOBRE
SOBRE EL
EL CRECIMIENTO
CRECIMIENTO
Salinidad

Halófilo: discretos (1-6 %) y moderados (6-15 %) de NaCl

 Halotolerante: crecen en amplio rango de actividad de
agua
Halófilos extremos: 17-36 % NaCl
 aerotolerantes
Anaerobios

Facultativos

Microaerófilos
Aerobios

Anaerobios
Medio
Medio concon
tioglicolato
tioglicolato y
y resazurina
resazurina

Tipos de microorganismos en relación

con el oxígeno
CULTIVO DE ANAEROBIOS

Catalizador (Pd)

2H2+O2 2H2O

H2
Radicales tóxicos del oxígeno
 Pyrococcus furiosus

Enzimas que destruyen

radicales tóxicos del O2
 MÉTODOS
MÉTODOS DE
DE CONTROL
CONTROL MICROBIANO:
MICROBIANO: TERMINOLOGÍA
TERMINOLOGÍA

Esterilización: destrucción total de formas vivas/material inerte

Desinfección: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado

vegetativo en material inerte desinfectantes

Antisepsia: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado

vegetativo en la superficie de tejidos vivos antisépticos

Saneamiento: reducción población microbiana en material inerte o

tejidos vivos hasta niveles seguros limpieza mecánica/productos

Quimioterapia: control crecimiento microbiano dentro de un

hospedador agentes quimioterapéuticos antimicrobianos
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos físicos: esterilización por calor

Calor seco

 Flameado (incineración)

 Horno Pasteur (170°C/ 1-2h)

 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos físicos: esterilización por calor

Calor húmedo

 Esterilización a temperatura
 Hervido (100°C) ultraelevada (UHT)

 Tindalización (100°C)

 Vapor de agua a presión:

el autoclave (121°C/ 20min)  Pasteurización: Reducción de
población microbiana y alargamiento vida
útil

HTST: 71-72°C
durante 15 seg.
 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos físicos: esterilización por filtración

Filtración de soluciones termosensibles

Filtración del aire:

 Algodones en los tubos de vidrio, mascarillas
 Filtro de alta eficacia de retención de partículas (HEPA)
 Cabinas de seguridad biológica de flujo laminar
 Habitaciones especiales de hospitales (inmunosuprimidos)
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos físicos: esterilización por radiación

Depende de la energía (λ), intensidad y duración

Radiaciones utilizadas:
 IONIZANTES (λ < 200nm) Suministros quirúrgicos,
 Rayos γ (60Coy 137Cs) medicamentos, materiales de
 Rayos de electrones laboratorio, industria alimentos,
productos cárnicos
 Rayos X

 NO IONIZANTES (λ > 200nm)

Desinfección de
 Luz UV (λ = 260nm) superficies, aire, etc.
 Microondas
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Métodos físicos: otros métodos

Control por bajas temperaturas
 Congelación
 Refrigeración (0-5°C)

Desecación
 Evaporación (Industria alimentaria)

 Liofilización (conservar cultivos, hemoderivados, etc)

Soluciones hipertónicas (salazón, miel, mermeladas, etc)

 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicos
Propiedades de los agentes químicos:

1. Inocuo para las personas y no corrosivo para materiales

2. Amplio espectro
3. Eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgánica
4. Soluble en agua
5. Estable, inodoro y económico

Tipos de agentes químicos:

Antisépticos

Desinfectantes

Esterilizantes
 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicos
Principales grupos de antisépticos:

AGENTE APLICACIÓN
 Alcohol (60-85% etanol) Piel
 Fenoles (hexaclorofeno, Jabones, lociones, cosméticos
triclosan, clorhexidina) y desodorantes
 Detergentes catiónicos Jabones y lociones
(cloruro de benzalconio)
 Peróxido de hidrógeno al 3% Piel
 Compuestos de yodo (Betadine) Piel
 Nitrato de Plata Ojos neonatos
 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicos
Principales grupos de desinfectantes y esterilizantes

AGENTE APLICACIÓN
 Alcohol (60-85% etanol) Instrumental médico
 Gas Cloro Suministro de agua

 Compuestos Clorados Industria alimentaria (equipos)

 Detergentes catiónicos
(amonio cuaternario)
 Formaldehído (3-8%)
Instrumental médico, alimentos y
equipos de industria lácteas
Superficies

 Sulfato de cobre Algicida

 Óxido de etileno (gas) Esterilizante de material

termosensible
 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
• Métodos químicos
Agentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos
de síntesis
Antibiogramas

Howard Florey y Ernst Chain

Alexander Fleming

Penicilinas
Sulfanilamida
Gerhardt Domagk
Bacteriostático

Bactericida

Tipos de agentes
antimicrobianos

Bacteriolítico
 CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Antibióticos: microorganismos productores

Bacterias
 Actinomicetos (4600)
 Bacillus (950)

Hongos (1600)

Plantas

5-
Metoxihidrocarpaina
Animales
 PROBLEMAS ACTUALES EN TERAPIA

Aumento de resistencias:
 Abuso y mal uso de los antibióticos
 Enfermedades crónicas

Soluciones:
 Uso restringido de los antibióticos
 Búsqueda de nuevos antimicrobianos
 Mejora de los ya existentes