Fundamentos da Engenharia Gentica Engenharia Gentica- conjunto de tcnicas que possibilitam a identificao, manipulao, propagao e transporte de genes entre

diferentes seres vivos. Ferramentas utilizadas na Engenharia Gentica Enzimas de Restrio: o Algumas bactrias produzem enzimas de restrio para se defenderem de vrus. o Estas enzimas seccionam o DNA viral, fragmentando-o em pequenas poroes inofensivas, mas no atacam o DNA endgeno das bactrias. o Cada enzima de restio corta ligaes entre o grupo hidroxilo 3 de um nucletido e o grupo fosfato 5 do grupo adjacente, sempre que encontra uma sequncia especfica de DNA (locais de restrio). o Os locais de restrio so constitudos por cerca de 4 a 6 nucletidos e so palndromos. o Extremidades coesivas podem emparelhar por complementaridade com outras extremidades coesivas coseguidas com a mesma enzima de restrio. o Cada enzima reconhece e corta sequncias de bases especficas. o Possibilitam a criao de DNA de origens diversas. DNA ligase: o Enzimas que promovem as ligaes entre duas molculas de DNA o 2 extremidades coesivas obtidas sob aco de enzimas de restrio tendem a emparelhar, cabendo a ligao final dos fragmentos DNA ligase. o Obtm-se uma molcula nica de DNA, com origem mltipla. DNA recombinante. Transcritase reversa: o Aparecem na constituio de alguns retrovrus e permitem a produo de DNA atravs de RNA. (aps a injeco do seu material gentico na clula hospedeira)

Vectores de clonagem (para transferir genes entre dif. seres vivos) : necessrio ultrapassar 2 obstculos para inserir DNA estranho numa clula: Conseguir que o DNA entre na clula; Garantir que o mesmo se consiga replicar, sempre que a clula entre em diviso.

Solues para estes problemas: Seleccionar vectores com alguma habilidade natural para penetrarem dentro das clulas; Introduzir o gene de interesse numa poro de DNA que contenha uma unidade de replicao.

Um bom vector deve: Ser pequeno quando comparado aos cromossomas da clula hospedeira; Ter capacidade de se replicar de forma independente da clula hospedeira; Possuir zonas de restrio especficas, para actuarem enzimas de restrio, permitindo posteriormente combin-lo com o novo DNA; Possuir um gene reprter, que determine a produo de algo que permita detectar a presena do vector.

Vectores utilizados (por ordem crescente de grandeza): Plasmdeos: pequenos cromossomas circulares, de bactrias, com cerca de uma dzia de genes, e com a sua prpria unidade de replicao; o Apresentam caractersticas que os tornam ptimos vectores: pequenos; possuem locais de restrio; muitos contm genes de resistncia a antibiticos (marcadores), tm uma origem de replicao e replicam-se idependentemente dos cromossomas da clula hospedeira. o O nico inconveniente o facto de s permitirem a insero de fragmentos de DNA relativamente pequenos. Bacterifagos: vrus que infectam bactrias; o Primeiro eleminam-se os genes virais que provocam a lise e a morte das clulas hospedeirasm, substituindo-os por genes de interesse. o Vantagem em relao aos plasmdeos: permitem a insero de fragmentos de DNA de maiores dimenses; so mais rendveis na produo de bibliotecas ou bancos de genes. Cosmdeos: molculas hbridas que tm pores de plasmdeos com extremidades de bacterifagos. So criados pelo Homem. Cromossomas artificiais: Sintetizados a partir de um plasmdeo (com origem de replicao, locais de restrio e genes marcadores), que cortado. De seguida adicionam-se fragmentos de DNA (centrmeros e telmeros de cromossomas de levedura). o Quando colocado numa clula hospedeira, o cromossoma artificial comportase como um cromossoma normal, sofrendo meiose e mitose naturalmente. o Utilizado quando o DNA a clonar de dimenses muito grandes.

Tcnicas utilizadas em Engenharia Gentica: Tcnica do DNA recombinante: o Seleco do gene com interesse, sujeitando-o aco de uma determinada enzima de restrio; o Seleco de um vector, sujeitando-o ao mesmo tipo de enzima de restrio; o Juno de ambos os fragmentos de DNA, que vo emparelhar; o Adio de DNA ligase para establecer a ligao fosfo-dister entre os fragmentos de DNA de origens diferentes, obtendo-se DNA de origem hbrida, ou seja, DNA recombinante (rDNA).

Tcnica do DNA complementar: o Isolamento de uma molcula de mRNA de interesse: o Adio de desoxirribonucletidos e da enzima transcritase reversa; o Transcrio de uma cadeia de DNA, por complementaridade, a partir do molde de mRNA; o Adio de enzimas que degradam a cadeia de mRNA (Rnases), obtendo-se, assim, apenas uma cadeia sintetizada de DNA; o Adio da enzima DNA polimerase e desoxirribonucletidos, para que construa, por complementaridade de nucletidos, a nova cadeia de DNA, obtendo-se finalmente uma molcula de DNA de dupla cadeia- DNA complementar (cDNA). Tcnica de reaco em cadeia da polimerase (PCR): o Ocorre in vitro e permite obter vrias cpias de uma molcula de DNA; o Desta forma possvel amplificar pequenas amostras iniciais, sem recorrer a clulas vivas para produzir DNA; o Ocorre por ciclos, duplicando-se em cada um deles o n de molculas de DNA. Em cada ciclo ocorrem as seguintes fases: 1 fase- molcula original de DNA desnaturada: para tal, sujeita-se a temperaturas muito elevadas (95C) que quebram as ligaes por pontes de hidrognio entre as bases complementares; 2 fase- Procede-se ao emparelhamento dos primers. Este processe ocorre a uma temperatura adequada ao emparelhamento especfico dos primers com as cadeias molde (por ex. 55C) e tem como objectivo amplificar apenas a poro de DNA compreendida entre os 2 primers. 3 fase: Ocorre sntese de DNA (a 72C). Requer a presena de desoxirribonucletidos e de DNA polimerase (ligao dos nucletidos).

Aplicaes da Engenharia Gentica: Bancos de genes: coleco da totalidade de genes de uma determinada espcie. Isolar genes para que possam ser estudados e manipulados. Bibliotecas de genes: o Bancos genmicos: so representativos de todos os genes de um indivduo, nas pores que se encontram nele mesmo; o Bancos de cDNA: obtm-se apenas os produtos gnics que so expressos por uma determinada clula e nas propores expressas pela mesma.