ESTADO DO PARAN

SECRETARIA DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO - SEAB

DEPARTAMENTO DE FISCALIZAO E DEFESA AGROPECURIA DEFIS DIVISO DEFESA SANITRIA VEGETAL - DDSV DIVISO DE FISCALIZAO DE INSUMOS E SERVIOS AGRCOLAS - DFI CENTRO DE DIAGNSTICO MARCOS ENRIETTI - CDME

Nota Tcnica

Monitoramento do fluxo gnico entre lavouras de milho transgnico e no transgnico na regio Oeste do Paran
METODOLOGIA, RESULTADOS E CONCLUSES

Paran 2010

SILMAR PIRES BRER Chefe do Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria DEFIS ADRIANO RIESEMBERG Chefe da Diviso de Fiscalizao da Produo e Comrcio de Insumos e de Servios Agrcolas DFI GILMAR PAIOLA Chefe da Diviso de Defesa Sanitria Vegetal DDSV MARA ELIZA GASINO JOINEAU Chefe da Diviso Centro de Diagnstico Marcos Enrietti - CDME _____________________________________________________ Equipe Tcnica: Engenheiro Agrnomo MARCELO SILVA Coordenao Tcnica Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS Engenheira Agrnoma LOSANI PEROTTI Coordenao Tcnica Regional Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS Engenheiro Agrnomo ARLEI MACEDA Procedimentos Laboratoriais pelo Mtodo Imunoensaio de Fluxo Lateral Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento SEAB/DEFIS Centro de Diagnstico Marcos Enriette - CDME Bilogo GILLES FERMENT Pesquisador em Biossegurana Ministrio do Desenvolvimento Agrrio - MDA Ncleo de Estudos Agrrios e Desenvolvimento Rural - NEAD Biloga ANA PAULA GORI PALKA Procedimentos Laboratoriais pelo Mtodo PCR-rt Instituto Tecnolgico do Paran - TECPAR Diviso de Ensaios e Anlises Tecnolgicas DETEC Bilogo EDUARDO CSAR SANTOS Procedimentos Laboratoriais pelo Mtodo PCR-rt Instituto Tecnolgico do Paran - TECPAR Diviso de Ensaios e Anlises Tecnolgicas DETEC Farmacutica Bioqumica MARIA LENITA DE ROSSO Procedimentos Laboratoriais pelo Mtodo PCR-rt Instituto Tecnolgico do Paran - TECPAR Diviso de Ensaios e Anlises Tecnolgicas DETEC

Engenheiro Agrnomo RALPH RABELO ANDRADE Planejamento Estatstico e Anlise de Dados Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS Engenheiro Agrnomo OSVALDO DE CASTRO OLSEN Responsvel Tcnico do Laboratrio de Anlise de Sementes - CLASPAR Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento SEAB Engenheiro Agrnomo MILTON SATOSHI MATSUSHITA Geoprocessamento de Imagens Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Geoprocessamento - EMATER Administradora NELMA PEREIRA CUNHA HAGEMAIER Geoprocessamento de Imagens Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Geoprocessamento - EMATER Engenheira Agrnoma MARGORETH DEMARCHI Estatsticas da Produo de Milho Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Economia Rural - DERAL Engenheira Agrnoma JOS ALCIR DE OLIVEIRA Procedimentos de Campo Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS Engenheiro Agrnomo LEONI ZAGO Procedimentos de Campo Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS Engenheira Agrnoma MARY MIEKO TATEIWA SUGUIY Procedimentos de Campo Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS Engenheiro Agrnomo AMRICO NOBURO ONAKA Procedimentos de Campo Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEAB Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria - DEFIS

CONTEDO CONTEDO...................................................................................... 4 1. 2. RESUMO .................................................................................... 6 METODOLOGIA ........................................................................... 8

2.1 Arranjo padro das lavouras selecionadas para o monitoramento ..8 2.2 Fase I: estgio vegetativo ..............................................................................10 a) Amostragem.........................................................................................................10 b) Anlises laboratoriais .......................................................................................12 2.3 Fase II estgio reprodutivo ........................................................................15 a) Amostragem.........................................................................................................15 b) Preparo das amostras (laboratrio) ...........................................................19 c) Imunoensaio de fluxo lateral (IFL) .............................................................24 d) Polimerase Chain Reaction real time (PCR-rt) ...................................24 3. RESULTADOS ............................................................................25 3.1 Municpio de Farol, PR ..........................................................................................25 3.2 Municpio de Boa Esperana, PR .....................................................................27 3.3 Municpio de Juranda, PR ....................................................................................31 4. CONCLUSO..............................................................................38 5. ANEXOS....................................................................................40 Anexo I...............................................................................................................................41 Termo de Coleta de Amostra - Fase I................................................................41 Anexo II .............................................................................................................................42 Procedimento Operacional Padro Tcnicas de Diagnstico (Folhas) ...42 Anexo III ...........................................................................................................................43 Laudo Oficial - Fase I ...............................................................................................43 Anexo IV ............................................................................................................................44 Termo de Coleta de Amostra Fase II .............................................................44 Anexo V..............................................................................................................................45 Procedimento Operacional Padro Tcnicas de Diagnstico (Sementes) ..........................................................................................................................................45 Anexo VI ............................................................................................................................46 Relatrio de Ensaios - TECPAR .............................................................................46 Anexo VII ..........................................................................................................................47 Laudo Oficial - Municpio de Farol .......................................................................47 Anexo VIII.........................................................................................................................48 IFL - Municpio de Farol..........................................................................................48 Anexo IX ............................................................................................................................49 Laudo Oficial - Municpio de Boa Esperana ....................................................49 Anexo X..............................................................................................................................50 IFL - Municpio de Boa Esperana .......................................................................50 Anexo XI ............................................................................................................................51 Laudo Oficial - Municpio de Juranda .................................................................51 4

Anexo XII ..........................................................................................................................52 IFL - Municpio de Juranda .....................................................................................52 Anexo XIII.........................................................................................................................53 Curvas de PCR-rt - Arranjo de Juranda ............................................................53

1. RESUMO A edio da Resoluo Normativa n 04 de 16 de agosto de 2007, aprovada por maioria dos membros da Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio), levou os tcnicos da Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento do Paran (SEAB) a verificar a campo a viabilidade da chamada coexistncia entre lavouras de milho transgnico (GM) e no transgnico (no - GM). De fato, essa Resoluo estipula que, para permitir a coexistncia, a distncia entre uma lavoura comercial de milho geneticamente modificado e outra de milho no geneticamente modificado, localizada em rea vizinha, deve ser igual ou superior a 100 (cem) metros ou, alternativamente, 20 (vinte) metros, desde que acrescida de bordadura com, no mnimo, 10 (dez) fileiras de plantas de milho convencional de porte e ciclo vegetativo similar ao milho geneticamente modificado. Nesse contexto, no primeiro semestre do ano de 2009, agricultores de milho do oeste paranaense aceitaram participar voluntariamente do monitoramento descrito nesta nota tcnica. O mtodo aplicado consistiu em localizar arranjos especficos de lavouras de milho transgnico e no transgnico que, cultivadas lado a lado, apresentam possibilidades de polinizao cruzada apesar do respeito s distncias de isolamento estabelecidas pela Resoluo n 04. As aes de monitoramento esto agrupadas em duas fases distintas. A FASE I, executada nos meses de fevereiro e maro de 2009 consistiu da identificao, georreferenciamento, coleta e anlise laboratorial de amostras fiscais compostas de plantas de milho em estgio vegetativo. Essa fase teve como objetivo assegurar a natureza gentica das lavouras monitoradas (GM e no - GM). A FASE II teve como objetivo a deteco e quantificao do fluxo gnico por polinizao cruzada entre os dois tipos de lavouras. Para tanto, nos meses de maio e junho de 2009, foram coletadas espigas de milho e os gros analisados tanto por tcnicas imunocromatogrficas quanto pela reao da polimerizao em cadeia em 6

tempo real (PCR-rt), tcnica esta que permite a quantificao do fluxo dos transgenes. Esta Nota Tcnica apresenta os dados conclusivos os nveis do de monitoramento, expressando quantitativamente

contaminao de lavouras de milho no - GM por plen de milho GM. Traz assim a sustentao aos apontamentos descritos em documento anterior. Os dados confirmam que a Resoluo Normativa n 04 no suficiente para assegurar a proteo da integridade do patrimnio gentica prevista no Art. 225 da Constituio Federal de 1988.

2.

METODOLOGIA O mtodo coordenado e executado pelos tcnicos da Secretaria de

Estado da Agricultura e do Abastecimento do Paran teve como objetivo principal avaliar, a campo, a polinizao de lavouras de milho no - GM por plen oriundo de lavouras de milho GM, cultivadas imediatamente lado a lado, respeitado o isolamento espacial disposto pela Resoluo Normativa 04/CTNBio. Divididos em duas fases distintas, os trabalhos tiveram incio no primeiro semestre de 2009, quando a primeira safra de milho transgnico foi efetivamente semeada no Estado. Na ocasio, buscou-se por um arranjo padro que viabilizasse a aplicao do mtodo proposto. 2.1 Arranjo padro das lavouras selecionadas para o

monitoramento Os arranjos foram padronizados de modo que as lavouras de milho no - GM monitoradas estivessem localizadas ao lado de uma nica lavoura de milho GM. Aplicou-se uma distncia de pelo menos 30(trinta) metros entre as diferentes lavouras, complementados por uma barreira de isolamento de pelo menos 20(vinte) fileiras de milho no - GM, localizadas s margens da prpria lavoura monitorada (Foto 01).

Foto 01 Juranda, PR, maro de 2009

Lavoura de milho GM (esquerda) imediatamente ao lado de uma lavoura no - GM (direita)

Todos os arranjos selecionados apresentavam alto potencial de inter-polinizao dada sua poca de semeadura e similaridade de ciclo reprodutivo (Foto 02).

Foto 02 Juranda, PR, maro de 2009 Detalhe das inflorescncias: Flor emitindo plen GM (esquerda) ao lado de uma lavoura no - GM apta a ser polinizada (direita)

Os arranjos foram selecionados de modo que houvesse uma nica fonte de plen transgnico. A foto 03 demonstra uma lavoura de milho no - GM, ao fundo, isolada por uma lavoura de trigo. A lavoura de milho GM no aparece nesta imagem e situa-se ao lado oposto do apresentado.

Foto 03 Boa Esperana, PR, maro de 2009

Selecionados

os

arranjos,

foi

dado

incio

aos

procedimentos

descritos nas denominadas Fase I e Fase II do monitoramento.

2.2

Fase I: estgio vegetativo Essa fase teve como finalidade identificar a presena da protena

transgnica nas lavouras de milho GM, assim como sua ausncia nas lavouras de milho no - GM. Aplicada em todos os arranjos essa fase aferiu a veracidade das informaes prestadas pelos agricultores, garantindo a qualidade do experimento. Executada nos meses de fevereiro e maro de 2009, a etapa constituiu-se da coleta de amostras oficiais e posterior anlise laboratorial de plantas de milho (estgio vegetativo), sendo concluda pela emisso de laudo oficial. a) Amostragem Para coleta do material que comps a amostra, tcnicos da SEAB realizaram o caminhamento apresentado na Figura 01. Ao longo do caminhamento foram coletadas 50 (cinqenta) plantas de milho selecionadas aleatoriamente, em distribuio uniforme. As amostras descritas nessa fase foram coletadas em todos os arranjos, tanto das lavouras de milho GM quanto das lavouras de milho no - GM.

a) reas at 20 ha

b) reas entre 20 e 60 ha

Figura 1 - Modelo de caminhamento para coleta de amostras conforme a rea da lavoura 10

Uma vez coletadas, foram acondicionadas em sacos plsticos lacrados e enviadas ao Centro de Diagnstico Marcos Enrietti CDME/SEAB para devida anlise. A foto 04 representa uma amostra composta por cinqenta folhas de milho. Testes realizados sobre o material atestam que lavouras de milho GM foram cultivadas imediatamente ao lado de lavouras de milho no GM.

Foto 04 Amostra Fase I

Cada amostra foi anexada a um termo de coleta constando do detalhamento do material amostrado (Foto 05 e Anexo I).

Foto 05 Termo de coleta de amostra

11

b) Anlises laboratoriais Realizadas pelo Centro de Diagnstico Marcos Enriette CDME, diviso integrante do Departamento de Fiscalizao e Defesa Agropecuria DEFIS/SEAB, as anlises executadas na Fase I, basearam-se na deteco da protena CRY1Ab proveniente da insero de DNA exgeno em amostras de tecidos vegetais de milho. Atravs da tcnica de imunoensaio de fluxo lateral (IFL) foi possvel atestar a natureza gentica das lavouras selecionadas para o monitoramento. A rotina tcnica est registrada no Procedimento Operacional Padro: Tcnicas de Diagnstico (Folhas) - SEAB/DEFIS/CDME (Anexo II), e consta dos seguintes passos: Organizar e identificar as amostras a serem processadas, conforme POP n. UGQ/DVP/NEM/013; Abrir os sacos plsticos contendo as amostras que devem ficar armazenadas em geladeira de 2 a 10C at o processamento; Tomar o tero mediano das folhas (mnimo 10 e mximo 100 folhas), cortar com tesoura e passar para o copo do processador (Foto 06); Triturar na velocidade mxima, at que todo o tecido vegetal tenha se transformado em pequenos fragmentos, pulsar se necessrio;

Foto 06 Detalhe dos procedimentos laboratoriais Fase I

12

Retirar a lmina do processador e passar o triturado para o copo de 200 ml que corresponda amostra; Com auxlio de uma pina, tomar 0,5 g de massa em uma balana de preciso e passar para um copo de 50 ml; Com pipeta colocar 10 ml de gua de torneira em um Becker de 100 ml e ento adicionar o contedo de 0,5 g; Agitar vigorosamente e aguardar por 5 minutos, tempo para a extrao das protenas (Foto 07);

Foto 07 Detalhe dos procedimentos laboratoriais Fase I

Com a pipeta de Pasteur transferir 0,5 ml da suspenso, evitando detritos, para o tubo de eppendorf; Inserir a regio almofadada da fita no tubo de eppendorf, na posio vertical (Foto 08); Aguardar 5 minutos e realizar a leitura; Interpretar o resultado, conforme o manual de instruo do kit; Colocar a fita em uma bandeja plstica com papel toalha, deixar secar e arquivar juntamente com o laudo (Foto 09);

13

Foto 08 Imunoensaios de Fluxo Lateral - Fase I

Foto 09 Testes realizados

Todo o material utilizado foi lavado com detergente e gua em abundncia na extrao de uma amostra para outra. Aps lavagem foi passado pano com lcool. Os kits foram mantidos em geladeira a uma temperatura de 2 a 4C. Ao final das anlises descritas foi emitido Laudo Oficial atestando a presena ou ausncia da protena transgnica em cada amostra assegurando a continuidade do experimento (Anexo III).

14

2.3

Fase II estgio reprodutivo Diferentemente da fase anterior, a Fase II consistiu exclusivamente

da coleta e anlise de sementes de milho provenientes das lavouras de milho no - GM. Aplicada sobre os arranjos selecionados, seus resultados permitiram concluses acerca da fecundao destas lavouras por plen de milho GM. Importante destacar que os arranjos foram selecionados de modo que houvesse uma nica lavoura de milho GM como fonte de plen. A identidade gentica dos arranjos foi comprovada pelos procedimentos descritos na Fase I. a) Amostragem Executada nos meses de maio e junho de 2009, a amostragem consistiu da coleta de espigas de milho da lavoura no - GM. Para tanto, tcnicos da SEAB retornaram aos arranjos selecionados e procederam do modo que segue: Com auxlio de trena, fitas sinalizadoras, mapas e GPS, foram delimitadas faixas paralelas entre si e distantes 10-25 (Isolamento), 30, 60, 90 e 120 metros da margem da lavoura de milho GM. Definido o mosaico, iniciou-se a coleta de amostras (Fotos 10 e 11).

Foto 10 Juranda, PR, maio de 2009 Lavoura de milho GM (esquerda) imediatamente ao lado de uma lavoura no - GM (direita). As amostradas foram retiradas da lavoura direita em faixas paralelas e distantes 25, 30, 60, 90 e 120 metros da lavoura de milho GM

15

As amostras receberam uma designao de origem conforme sua localizao e repetio. Logo, a quarta repetio de uma amostra coletada a 60 (sessenta) metros da margem da lavoura de milho GM recebeu a denominao L4-60; A segunda repetio de uma amostra coletada na faixa de isolamento (10-25 metros) recebeu a denominao de L2-I, e assim sucessivamente. Cada faixa de distncia contou com 10 (dez) repeties.

Foto 11 Tcnico da SEAB/DEFIS realizando a amostragem

Cada amostra foi constituda por uma nica espiga de milho. Sua posio foi rigorosamente georreferenciada, procedimento que assegurou o desenvolvimento de mapas temticos (Fotos 12, 13).

Foto 12 Espiga de milho da lavoura no - GM

16

Foto 13 Georreferenciamento

As amostras foram acondicionadas em caixas de papelo especficas para a coleta de sementes sendo devidamente identificadas e lacradas pelos tcnicos (Fotos 14 e 15).

Foto 14 Detalhe da amostra

As amostras coletadas foram anexadas a um documento fiscal identificando a origem do material, nome do agricultor, variedade cultivada, assegurando rigor ao procedimento aplicado (Anexo IV).

17

Foto 15 Detalhe da amostra coletada

Ao final da coleta, tomadas as coordenadas geogrficas, obtivemos a mapa demonstrado na figura 02.
10-25 m (I)
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30 m
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60 m
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90 m
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120 m

Figura 2 Exemplo de mapa temtico, Juranda, PR

Na figura acima o desenho ao centro (verde) representa as duas lavouras vicinais, sendo a parte superior a lavoura de milho GM e a 18

inferior a lavoura de milho no GM, na qual foram realizadas as coletas. Do lado direito vemos uma detalhamento das amostras realizadas. As linhas paralelas (horizontais) representam as distncias de 10-25 (I), 30, 60, 90 e 120 metros contados a partir da borda da lavoura GM. Em cada linha foram aplicadas 10 (dez) repeties, totalizando 50 amostras.

b) Preparo das amostras (laboratrio) As amostras uma vez coletadas foram encaminhadas para o Centro de Diagnstico Marcos Enriette CDME/SEAB, onde se procedeu ao preparo do material para posteriores anlises.

Foto 16 Recebimento da amostra

Identificadas e organizadas, o trabalho teve incio com a conferncia do material e posterior abertura das caixas (Fotos 16 e 17).

19

Foto 17 Rompimento do lacre

Cada amostra, constante de uma nica espiga, possui sua origem geogrfica devidamente identificada. No caso em questo trata-se da oitava repetio da faixa de isolamento L8-I (Foto 19).

Foto 18 Conferncia do material

20

Foto 19 Exemplo de amostra recebida pelo laboratrio

Todas as espigas foram limpas com pano embebido por lcool. Assim que secas, foram debulhadas manualmente (Foto 20).

Foto 20 Detalhe do preparo da amostra

21

Assim que debulhado, o material foi pesado em balana de preciso sendo contada a quantidade de sementes. Ao final, tomou-se a mdia dos referidos ndices apontados (Foto 21).

Foto 21 Pesagem do material debulhado

Todo o material foi depositado em triturador com suporte (copo) de vidro (Foto 22).

Foto 22 Material antes da triturao

22

O material foi triturado (Foto 23). Ao final de cada procedimento todo o equipamento utilizado foi submerso em soluo de hipoclorito de sdio (0,5%) permanecendo por uma hora e lavado, em seguida, com detergente e gua em abundncia (Foto 24). Assim que secos, os equipamentos foram tratados com lcool.

Foto 23 Material triturado

Foto 24 Detalhe da limpeza dos equipamentos

23

Foto 25 Amostra finalizada

Finalizada a triturao, o material foi acondicionado em saco plstico devidamente identificado, estando pronto para as futuras anlises (Foto 25).

c) Imunoensaio de fluxo lateral (IFL) Realizadas pelo Centro de Diagnstico Marcos Enriette CDME, as anlises executadas nesta etapa basearam-se na deteco de protenas transgnicas especficas para o evento MON-810, proveniente da insero de DNA exgeno. A rotina tcnica est registrada no Procedimento Operacional Padro: Tcnicas de Diagnstico (Sementes) SEAB/DEFIS/CDME (Anexo V).

d) Polimerase Chain Reaction real time (PCR-rt) Realizado pela Diviso de Anlises e Ensaios Tecnolgicos do Laboratrio de Alimentos, diviso vinculada ao Instituto Tecnolgico do Paran - DETEC/TECPAR, os resultados constam no Relatrio de Ensaios n 09010080, tendo seus procedimentos indicados no anexo VI. 24

3. RESULTADOS Sero apresentados os resultados especficos obtidos das anlises realizadas com as amostras de sementes coletadas em distintos locais.

3.1 Municpio de Farol, PR As identidades genticas de ambas as lavouras (sendo uma plantada com milho no GM e uma com milho GM) e o isolamento delas em relao a outras lavouras de milho transgnico1 foram asseguradas com a realizao da FASE I conforme metodologia descrita no item 1.2 dessa Nota Tcnica.

Foto 26 Farol, PR, maro de 2009

Entretanto, o presente caso apresenta particularidade em relao metodologia seguida no que diz respeito FASE II. Os tcnicos da SEAB tomaram iniciativas visando realizar a FASE II coletando as 40 amostras apenas em duas fileiras de milho da lavoura identificada como no transgnica na FASE I. Para tanto, foram selecionadas fileiras situadas a partir de uma distncia de 30 (trinta) metros da bordadura da lavoura de milho GM,

A presena de lavouras de milho transgnico na vizinhana das lavouras monitoradas poderia representar uma fonte de poluio gentica e influir sobre os resultados desse estudo. Essa possibilidade foi ento rigorosamente descartada na seleo dos arranjos, conforme descrito no item 1.1 dessa Nota Tcnica.

25

assegurando assim coleta de espigas que poderiam conter gros oriundos de cruzamentos com milho GM, em coerncia com o objetivo do monitoramento. Os VIII. A tabela seguinte mostra o nmero e a porcentagem de espigas de milho coletadas que foram reagentes ou no ao teste de IFL: Tabela 01 Resultados por IFL, Farol, PR
Nmero de amostras (espigas) Reagente Amostras com protena transgnica Amostras com protena transgnica (%) No reagente

resultados

brutos

das

anlises

laboratoriais

por

fitas

de

Imunoensaio de Fluxo Lateral (IFL) esto disponveis nos anexos VII e

23

17

57,5

42,5

Assim, 23 espigas de milho oriundas de lavoura identificada como no transgnicas durante a fase vegetativa (conforme metodologia da FASE I) foram reagentes ao teste de IFL, acusando assim a fertilizao por plen transgnico e produo da toxina CRY1Ab. O georeferenciamento dos pontos de amostragem juntado aos resultados obtidos por testes de IFL (cor vermelha para reagente e cor azul para no reagente) resultou na Figura 03.

26

Figura 03 Resultados (IFL) para o arranjo de Farol, PR

A disposio das amostras reagentes toxina CRY1Ab apontam a ocorrncia de fluxo gnico em 23 casos. Cabe destacar que as duas fileiras amostradas seguem curvas de nvel do local.

3.2 Municpio de Boa Esperana, PR O arranjo de Boa Esperana constituiu-se de lavouras de milho GM e milho no GM2 semeadas lado a lado e separadas apenas por um cordo de isolamento de 15(quinze) fileiras de milho no GM com espaamento entrelinhas de 0,80 metros. Na foto 27 podemos observar a proximidade entre as lavouras, a faixa de isolamento e a ausncia de outras fontes de plen de milho GM.

As caractersticas genticas de ambas as lavouras (sendo uma plantada com milho no GM e uma com milho GM) e o isolamento delas em relao a outras lavouras de milho transgnico foram asseguradas com a realizao da FASE I conforme metodologia descrita no item 1.2 dessa Nota Tcnica.

27

Faixa de Isolamento

Faixa de isolamento Lavoura de milho GM Lavoura de milho GM

Lavoura de trigo

Lavoura de trigo

Foto 27 Boa Esperana, PR, maro de 2009

Frente a esse arranjo, foi somada a faixa de isolamento presente mais 20 (vinte) metros localizados dentro da lavoura de milho no GM. Assim, nesse experimento a faixa de isolamento foi equivalente a 33,6 metros constitudos de 34 fileiras de milho no - GM. A amostragem da FASE II ocorreu conforme metodologia descrita no item 1.3. A figura 03 representa um croqui experimental dos 50 pontos de amostragem.
BOA ESPERANA
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!!!! !! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

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Figura 04 Mapa temtico do arranjo de Boa Esperana, PR

Os resultados brutos das anlises laboratoriais por fitas de IFL esto disponveis nos anexos IX e X. 28

A tabela seguinte mostra o nmero e a porcentagem de espigas de milho coletadas que foram reagentes ou no ao teste de IFL:
Tabela 02: Resultados IFL Boa Esperana, PR

Distncia da lavoura transgnica (m) 3 Repeties L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 Amostras com protena transgnica (%) 20 m (isolamento) Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente 100 Reagente 70 30 20 10 Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente 30 m Reagente 60 m 90 m 120 m

Os dados includos na parte amarela da tabela dizem respeito s espigas que apresentaram a toxina CRY1Ab nos seus tecidos, mesmo que tecnicamente a RN n 4 tenha sido respeitada. Esses dados apontam, assim, para um fluxo gnico via fecundao cruzada em 13 casos4 (ou 32% das amostras) apesar da lavoura de milho

O ponto 0 (zero metro) foi referenciado na fileira de milho GM mais prxima fileira de milho no GM, sendo as paralelas e perpendiculares sistematicamente respeitadas. 4 Essas espigas de milho foram identificadas como no transgnicas durante a fase vegetativa, conforme metodologia da FASE I descrita no item 1.2 dessa Nota Tcnica.

29

no - GM ter sido isolada espacialmente conforme as recomendaes legais de isolamento da RN n 4. Nota-se tambm que 70% das amostras coletadas imediatamente aps a faixa de isolamento apregoado pela CTNBio mostraram-se reagentes aos testes de IFL. O georeferenciamento dos pontos de amostragem juntado aos resultados obtidos por testes de IFL (cor vermelha para reagente e cor azul para no reagente) resultou na imagem da Figura 05:

Figura 05 Resultados (IFL) para o arranjo de Boa Esperana, PR

A disposio das espigas que acusaram polinizao cruzada com milho transgnico confirma o fluxo gnico dos transgenes da lavoura GM, sendo assegura a existncia de uma nica fonte de plen transgnico ao norte da lavoura de milho no GM. 30

3.3 Municpio de Juranda, PR O arranjo de Juranda constituiu de lavouras de milho GM e milho no GM5 lado a lado, separadas apenas por um carreador de largura de quatro metros. A lavoura de milho GM fazia frente face norte da lavoura de milho no GM.

Foto 28 Arranjo Juranda, PR, maro de 2009

Nesse arranjo, foi considerada a faixa de isolamento os 04 (quatro) metros limpos do carreador acrescidos de aproximadamente 35 fileiras da lavoura de milho no GM, o que totaliza 32 metros. Considerou-se novamente nesse experimento uma faixa de isolamento superior ao determinado pela RN n 04, o que permite concluir de forma mais conservadora e segura que a contaminao ocorre mesmo quando a regra cumprida. De fato, medida acautelatria considerar 4 metros vazios juntamente com as 35 fileiras (o que equivale a um total de aproximadamente 32 metros) como sendo mais restritivos para o fluxo gnico do que os 20 metros vazios acrescidos de 10 linhas estabelecidos pela RN n 04.

As caractersticas genticas de ambas as lavouras (sendo uma plantada com milho no GM e uma com milho GM) e o isolamento delas em relao a outras lavouras de milho transgnico foram asseguradas com a realizao da FASE I conforme metodologia descrita no item 1.2 dessa Nota Tcnica.

31

A FASE II ocorreu conforme metodologia descrita no item 1.3 dessa Nota Tcnica, onde pode ser encontrado um croqui experimental dos 50 pontos de amostragem. Os resultados brutos das anlises laboratoriais por fitas de IFL esto disponveis no anexo XI e XII. A tabela seguinte mostra o nmero e a porcentagem de espigas de milho coletadas que foram reagentes ou no ao teste de IFL.
Tabela 03: Resultados IFL Juranda, PR

Distancia da lavoura transgnica (m) 6 Repeties L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 Amostras com protena transgnica (%) Reagente Reagente 70 Reagente 70 50 20 20 Reagente Reagente 25 (isolamento) Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente 30 Reagente Reagente 60 90 120 Reagente

Os dados includos na parte azul da tabela dizem respeito s espigas com presena da toxina CRY1Ab nos seus tecidos, sendo que a amostragem foi feita alm das distncias estabelecidas pela RN n 04, que neste caso, tambm foi respeitada.

O ponto 0 (zero metro) foi referenciado na fileira de milho GM mais prxima fileira de milho no GM, sendo as paralelas e perpendiculares sistematicamente respeitadas.

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Esses dados apontam assim para um fluxo gnico via fecundao cruzada em 16 casos7 (ou 40% das amostras vlidas), mesmo com a lavoura de milho no GM tendo sido isolada espacialmente conforme as recomendaes legais de isolamento da RN n 04. Nota-se tambm que 70% das amostras coletadas na faixa de isolamento imediatamente alm da distncia mnima estabelecida legalmente mostraram-se reagentes aos testes de IFL. Alm dos resultados obtidos por testes IFL, uma busca do transgene responsvel pela expresso da toxina CRY1Ab nas espigas que acusavam contaminao gentica foi realizada em cada uma das 50 amostras com o uso da PCR-rt, ferramenta de biologia molecular. Nesse caso, o uso da PCR-rt teve dois objetivos principais. Em primeiro lugar, permitiu confirmar e contrapor, com segurana, os resultados de fluxo gnico constatados com o uso dos testes de IFL. Alm disto, a PCR-rt fornece informaes quantitativas (em porcentagem) sobre a presena do transgene responsvel pela produo do ncleo inseticida da protena CRY1Ab. Os resultados brutos das anlises laboratoriais por PCR-rt esto disponveis no anexo VI, sendo que no anexo XIII possvel constatar algumas das dezenas de curvas produzidas. A Tabela 04 fornece os dados quantitativos da contaminao gentica por fluxo transgnico observados nas espigas de milho coletadas nas lavouras naturais:

Tabela 04: Resultados PCR-rt Juranda, PR

Essas espigas de milho foram coletadas em uma lavoura identificada como no transgnica durante a fase vegetativa, conforme metodologia da FASE I descrita no item 1.2 dessa Nota Tcnica..

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Distancia da lavoura transgnica (m)8 Repeties L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 Amostras com transgenes (%) Proporo de transgenes (%) 25 (isolamento) 0,3 >5,0 0,2 1,3 0,3 0,2 nd 0,3 0,1 1,9 90 0,96 30 <0,1 0,1 0,4 >5,0 1,8 0,9 3,7 nd 0,3 0,6 90 1,29 60 0,3 0,5 <0,1 4,8 0,6 >5,0 0,2 nd 0,9 nd 80 1,24 90 nd9 0,8 nd 4,4 nd 0,9 nd 0,7 1,5 0,7 60 0,9 120 1,3 0,3 nd nd nc10 1,3 nd 1,2 nd nd 40 0,46

Os dados includos na parte amarela da tabela dizem respeito s espigas contendo a seqncia gentica do transgene Cry1Ab responsvel pela sntese do ncleo inseticida da protena CRY1Ab, mesmo com a RN n 04 tendo sido tecnicamente respeitada. Do ponto de visto qualitativo, esses dados asseguram assim a ocorrncia de um fluxo gnico via fecundao cruzada em 27 casos11 (ou 69,23% das amostras) apesar da lavoura de milho no - GM ter sido isolada espacialmente conforme as recomendaes legais de isolamento da RN n 04. O georeferenciamento dos pontos de amostragem juntado aos resultados obtidos por testes de PCR-rt (cor vermelha para deteco de transgene e cor azul para no deteco de transgene) resultou na imagem representada da figura 06.

O ponto 0 (zero metro) foi referenciado na fileira de milho GM mais prxima fileira de milho no GM, sendo as paralelas e perpendiculares sistematicamente respeitadas. 9 Transgene no detectado. 10 Teste PCR no conclusivo. 11 Essas espigas de milho foram coletadas em uma lavoura identificada como no transgnica durante a fase vegetativa, conforme metodologia da FASE I descrita no item 1.2 dessa Nota Tcnica.

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Figura 06 Resultados (PCR) para o arranjo de Juranda, PR

Destaca-se que a lavoura de milho GM est localizada ao norte da lavoura de milho no GM, sendo assegurada a existncia de uma nica fonte de plen transgnico ao norte da lavoura de milho no - GM. Adicionalmente, o uso consecutivo de testes de IFL e de PCR nas amostras coletadas fornece informaes sobre a eficincia e a confiabilidade das fitas de IFL em detectar um fluxo gnico especfico. A tabela 05 justape os dados obtidos por testes PCR e testes de IFL.

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Tabela 05: ndice de coincidncia entre os resultados PCR-rt e IFL, Juranda, PR

Distancia da lavoura transgnica (m) Repeties L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 Amostras com protena transgnica (%) Falsos negativos (%) Coincidncia 25 (isolamento) Reagente Reagente. Reagente Reagente . Reagente . . Reagente Reagente 30 Reagente . Reagente Reagente Reagente Reagente Reagente . . Reagente Reagente 60 . Reagente . Reagente Reagente Reagente . 90 . . . Reagente . Reagente . . . . . . . . 120 Reagente . . . Reagente .

70

70

50

20

20

20 80

20 80

30 70

40 60

30 60

Nessa tabela, a cor vermelha representa os falsos negativos, e a cor verde indica os casos onde testes de IFL e de PCR apontaram para o mesmo resultado. A cor branca num nico caso se refere a um teste de PCR-rt no conclusivo. Os falsos negativos correspondem aos casos onde a deteco da contaminao gentica no foi possvel via o uso do teste de IFL. Essa constatao pode ser o resultado de uma sntese de toxina CRY1Ab em quantidade inferior ao limite de deteco do teste de IFL, ou por causa de 36

um rigor do tcnico na interpretao da fita. Cabe ressaltar que no houve casos de falsos positivos (a fita acusar contaminao enquanto no h transgene na espiga analisada). Neste sentido, o uso da fita um teste conservador: se positivo h de fato a protena; se negativo, no necessariamente a amostra no apresenta a protena. Assim, houve coincidncia de 70% entre os dados obtidos por PCRrt e testes de IFL. No entanto isto no significa que os outros 30% tm resultados contraditrios. Os resultados indicam que a PCR-rt mais eficiente na deteco de presena dos transgenes que as fitas de imunoensaios. No houve resultados contraditrios entre os dois mtodos.

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4. CONCLUSO Aps a concluso desse plano de ao intitulado Plano de monitoramento do fluxo gnico entre lavouras de milho transgnico e no transgnico na regio Oeste do Paran realizado pelos fiscais da SEAB, a Secretaria disponibiliza as informaes seguintes em complemento a Nota Tcnica preliminar, encaminhada aos rgos responsveis. a) No caso das lavouras monitoradas no municpio de Juranda, os resultados PCR-rt revelam uma contaminao gentica por plen transgnico via fecundao cruzada com milhos transgnicos da lavoura vizinha em 27 das 40 amostras12 localizadas alm da distncia de isolamento definida pela RN n 04. b) O caso de Juranda revela que o fluxo gnico ocorreu entre milhos isolados por 4 metros livres de cultivo acrescidos de pelo menos 147 fileiras de milho convencional (linha dos 120 metros no experimento). Este fluxo gnico ocorreu assim numa situao que representa 112 fileiras a mais do que solicitado pela RN n 04. c) No caso de Juranda constatou-se tambm que a poluio gentica quantitativamente alta (mdia > 1% at os 90 metros no interior da lavoura, com uma amostra (L4-90) alcanando 4,4%), o que sugere dificuldades no cumprimento do Decreto n 4.680/2003 relativo rotulagem dos produtos transgnicos. d) Os dados qualitativos e quantitativos obtidos por PCR-rt no caso de Juranda corroboram com a literatura cientifica disponvel sobre fluxo gnico via fecundao cruzada de milho (confere com

12

Num total de 39 resultados conclusivos.

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dados da reviso dos onze melhores estudos realizada por Breckling ET AL., 200813). e) Os dados obtidos por testes IFL nos casos de Farol e Boa Esperana indicaram 23 e 13 respectivamente, casos de contaminao gentica apesar do respeito tcnico das medidas de isolamento definidas na RN n 04. f) A experincia obtida atravs do uso consecutivo de testes IFL e PCR-rt sobre as amostras coletadas no caso de Juranda permite considerar as fitas de IFL como uma ferramenta confivel para detectar qualitativamente (e semi-quantitativamente) a ocorrncia de fluxo gnico em distncias de vrias dezenas de metros. Nesse sentido, as lavouras de milho no GM monitoradas nos municpios de Farol e Boa Esperana podem ser consideradas como geneticamente contaminadas por transgenes apesar do respeito tcnico s medidas de isolamento definidas na RN n 04.

Breckling, B., Reuter, H., Verhoeven, R. (2008). Implications of GM-crop cultivation at large spatial scales. Proceedings of the GMLS conference 2008 in Bremen. Theorie in der kologie 14. Peter Lang, Frankfurt, Basel.

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5. ANEXOS I. Termo de Coleta de Amostra Fase I II. Procedimento Operacional Padro Tcnicas de Diagnstico (Folhas) III. Laudo Oficial Fase I IV.Termo de Coleta de Amostra Fase II V. Procedimento Operacional Padro Tcnicas de Diagnstico (Sementes) VI.Relatrio de Ensaios TECPAR VII. VIII. Laudo Oficial Municpio de Farol IFL Municpio de Farol

IX.Laudo Oficial Municpio de Boa Esperana X. IFL - Municpio de Boa Esperana XI.Laudo Oficial Municpio de Juranda XII. XIII. IFL - Municpio de Juranda Curvas de PCR-rt Arranjo de Juranda

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Anexo I

Termo de Coleta de Amostra - Fase I

41

Anexo II

Procedimento Operacional Padro Tcnicas de Diagnstico (Folhas)

42

Anexo III

Laudo Oficial - Fase I

43

Anexo IV

Termo de Coleta de Amostra Fase II

44

Anexo V

Procedimento Operacional Padro Tcnicas de Diagnstico (Sementes)

45

Anexo VI

Relatrio de Ensaios - TECPAR

46

Anexo VII

Laudo Oficial - Municpio de Farol

47

Anexo VIII

IFL - Municpio de Farol

48

Anexo IX

Laudo Oficial - Municpio de Boa Esperana

49

Anexo X

IFL - Municpio de Boa Esperana

50

Anexo XI

Laudo Oficial - Municpio de Juranda

51

Anexo XII

IFL - Municpio de Juranda

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Anexo XIII

Curvas de PCR-rt - Arranjo de Juranda

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