PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

I.

INTRODUCCIN:

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido, se parte de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel. II. OBJETIVOS: Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiologa. Preparar los diferentes medios de cultivos. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 1

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

III. FUNDAMENTO TEORICO: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Agar: Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azcares: Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos: Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas: Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales. 5. Fluidos corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos. 6. Sistemas amortiguadores: Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos. 7. Indicadores de pH: Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio. 8. Agentes reductores: Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 2

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

9. Agentes selectivos: Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO. Por su CONSISTENCIA: a) Slidos: Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada). b) Lquidos: Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers. Por su COMPOSICIN: a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems. d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS En trminos microbiolgicos se entiende por SIEMBRA el proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento. PARA UNA CORRECTA REALIZACIN DE LA SIEMBRA SON NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES: 1) Que se lleve a cabo con instrumentos estriles sobre medios de cultivo estriles: Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista microbiolgico.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 3

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

LA ESTERILIZACIN:

Se utilizan dos tipos principales de esterilizacin: Por MTODOS FSICOS (calor, filtracin, radiaciones). Por MTODOS QUMICOS (empleo de soluciones qumicas). Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso del calor hmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presin y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullicin del agua. Normalmente, se lleva la presin a 1 atmsfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126C, mantenindolo en estas condiciones durante 20 minutos. Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc.) se esteriliza con calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato ms empleado (se somete a temperaturas de 140-180 C durante 2h-3h). En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso. 2) Que el inculo no se contamine, modifique o destruya: Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y despus de su utilizacin, a pesar de estar esterilizados previamente. 3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo ms prximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo: Esto se resuelve con el uso de cabinas estriles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 4

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

IV.

MATERIALES: Agar. Cloruro de sodio. Pectina. Hilo pabilo. Extracto de carne. Agua destilada. Glucosa. Plumn indeleble. Gasa esterilizada. Algodn. Esptula. Balanza digital. Probeta graduada. Baln de destilacin con base. Equipos Autoclave. Cocina elctrica.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 5

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

V.

PROCEDIMIENTO: Para preparacin las siguientes muestras de cultivos se realizaron los siguientes pasos: Primero antes de comenzar con el procedimiento realizamos tapones con gasa y algodn para los 3 balones de destilacin con base, los cuales a continuacin demostraremos su procedimiento.

CALDO COMN: - Se procede a medir 50 ml de agua destilada en una probeta, la cual es echada al baln de destilacin con base. - Seguidamente empezamos a pesar 0.3 gramos de pectina.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 6

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Tambin pesamos 0.3 gramos de cloruro de sodio.

Finalmente pesamos 0.2 gramos de extracto de carne.

seguidamente procedemos a agregar ls ingredientes en el baln de destilacin, al mismo tiempo agitamos para as evitar que el extracto de carne se quede pegado en el fondo del baln, y a la vez para poder mezclar todos los ingredientes empleados.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 7

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

AGAR COMN: - Tambin procedemos a medir 50 ml de de agua destilada, la cual verteremos en el baln de destilacin con base. - Seguidamente empezamos a pesar 0.3 gramos de pectina. - Tambin pesamos 0.3 gramos de cloruro de sodio. - Pesamos 0.8 gramos de agar. - Finalmente pesamos 0.2 gramos de extracto de carne.
Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial Pgina 8

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

seguidamente procedemos a agregar los ingredientes en el baln de destilacin, de la misma manera agitamos el baln de destilacin para as evitar que el extracto de carne se quede pegado en el fondo del baln, y a la vez para poder mezclar todos los ingredientes empleados.

AGAR SABAROUND: - Como en los dems procedimientos se procede a medir 50 ml de agua destilad, la cual es vertida al baln de destilacin con base. - Pesamos 2 gramos de glucosa. - Seguidamente pesamos (0.5 gramos) de pectina. - Por ltimo pesamos 0.8 gramos de agar. - Despus de haber pesado, procedemos a mezclar todos los ingredientes empleados, teniendo cuidado que el extracto de carne no se pegue en el fondo del baln de destilacin, lo tapamos con los tapones ya antes preparados. Siguiendo el procedimiento, las 3 muestras se proceden a calentar por un corto tiempo, teniendo en cuenta de que al calentar estas no hiervan, ya que podran hacernos dao. Las muestras lo calentamos con el objetivo de disolver y mezclar los ingredientes empleados. Despus de haber calentado las 3 muestras, es llevado al autoclave para esterilizar los medios (matar las esporas), debemos de tener en cuenta tambin que cuando llegue a una temperatura de 121 C (15 PSI = 1 atmosfera), al llegar a esa temperatura debemos de controlar por un espacio de 15 minutos. Posteriormente al pasar ese tiempo, dejamos que la muestra se enfri a temperatura ambiente, luego procedemos a llevar a refrigerarse. Dato: los que contengan agar se gelidifican.

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 9

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Universidad Nacional Del Santa E.A.P: Ingeniera Agroindustrial

Pgina 10