Enzimologa clnica

Qumica Clnica II -2013-

Enzimologa clnica
Aplicacin del conocimiento de las enzimas al diagnstico, tratamiento y pronstico de una enfermedad.

Enzimas

Molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas, energticamente favorables. Poseen similar composicin y estructura que las dems protenas. Son afectadas por los mismos factores fsicos y qumicos.

Generalidades de las enzimas

Poseen propiedades catalticas Aumentan

la velocidad de reacciones qumicas in vivo e in vitro. Se encuentran en membrana, ncleo, citoplasma y organelos subcelulares (mitocondrias, lisosomas, ncleo, etc.)

Poder cataltico de las enzimas

Definiciones
Apoenzima:

enzima inactiva por falta de componente no proteico. Holoenzima: complejo formado por una enzima ms un componente no proteico asociado.
Cofactores:

sustancias no proteicas asociadas, necesarias para la actividad cataltica de una enzima (Mg+, Cl-, Zn2+, K+) Coenzima: molculas orgnicas asociadas necesarias para la actividad cataltica de una enzima
Cosustratos: NADP+, fosfato de piridoxal Grupos prostticos: grupos fuertemente considerados parte estructural de la enzima. unidos,

...Definiciones
Metaloenzimas:

enzimas con iones metlicos fuertemente unidos. Sitio activo: lugar en la enzima donde puede llevarse a cabo la catlisis de un sustrato especfico. Sitio alostrico: cavidad distinta al sitio activo que puede enlazar molculas reguladoras (cofactores).

Propiedades de las enzimas

Son efectivas en pequeas concentraciones

No son modificadas por la reaccin que catalizan

Afectan la velocidad de la reaccin para alcanzar el equilibrio.

No todas las enzimas son exclusivas de un solo tejido.

La alteracin de la concentracin srica de stas, orienta sobre los tejidos afectados

Cada enzima posee isoenzimas caractersticas.

Desnaturalizacin
Uniones

de metales pesados al sitio activo Cambios de temperatura extremos Adicin de cidos o bases fuertes Cambios de pH Cambios de presin Rayos ultravioleta Cambios en la concentracin de sales Detergentes Solventes orgnicos

Clasificacin y nomenclatura de las enzimas

EC (Enzime commission) IUB (International Union of Biochemestry) Sistema de nomenclatura (1961)
Sustrato en el que la enzima acta Reaccin catalizada Coenzima que participa en la reaccin

Acepta nombres triviales (ms prcticos)

Codificacin numrica EC EC 1.1.1.27

(LACTATO DESHIDROGENASA) 4 nmeros separados por puntos
1. Clase de enzima (oxidorreductasa) 1. Grupo sobre el que acta (-CH) 1. Coenzima o aceptor (NAD+ o NADP+) 27. Nmero de orden de la enzima

Clases de enzimas
1. Oxidorreductasas
2. Transferasas 3. Hidrolasas

4. Liasas
5. Isomerasas 6. Sintetasas

Oxidorreductasas

Transferencia de electrones/redox

A-red + B-ox A-ox + B-red

Sus

nombres

comunes

incluyen

las

palabras:
Deshidrogenasas, reductasas, oxidasas,

peroxidasas

Transferasas

Transferencia de un grupo distinto al hidrgeno (amino, carboxilo, glucosilo, metilo o fosforilo) de un sustrato a otro.

A-X + B

A + B-X

Ejemplo:

ALAT, quinasas, transcarboxilasas

Hidrolasas

Ruptura de enlaces C-O, C-N con la adicin de molculas de agua

A-B + H2O A-OH + B-H

Ejemplo:

FAL, amilasa, ureasa, pepsina, quimotripsina, peptidasas y esterasas

Poco uso clnico

Liasas Hidrolizan uniones C-C, C-O y C-N por eliminacin, con formacin de un doble enlace. Adicin de grupo al doble enlace (sintasa) Isomerasas Cambios estructurales geomtricos una molcula.

o en

ABC CAB

A + B AB (sintasa) AB A + B (liasa)

Poco uso clnico

Ligasas (sintetasas)
Dos molculas son unidas, con la hidrlisis del pirofosfato del ATP

A + B + ATP AB + ADP + Pi

Mecanismo cataltico de las enzimas

Factores que afectan las reacciones enzimticas

Concentracin del sustrato
Constante de Michaelis-Menten (1913) Km

Grfica de Lineweaver-Burk

Factores que afectan las reacciones enzimticas

Concentracin de la enzima
Siempre y cuando la concentracin de sustrato no sea limitante. La velocidad de reaccin ser proporcional a la concentracin de la enzima.

pH
Depende del origen fisiolgico de la enzima. Cualquier cambio de pH puede afectar la actividad biolgica de la enzima por cambios de estado inico de los aa en el sitio activo.

 Temperatura

Factores que afectan las reacciones enzimticas

A mayor temperatura mayor velocidad de reaccin (hasta la desnaturalizacin de la enzima). Por cada 10 C la velocidad de reaccin aumenta un 100% La temperatura de reaccin ptima depende del medio fisiolgico de cada enzima. El proceso de congelacin inactiva reversiblemente a las enzimas. 25, 30 y 37 C.

Factores que afectan las reacciones enzimticas

Cofactores
Entidades no proteicas que deben enlazarse a las enzimas para que stas se activen. Activadores: iones metlicos (calcio, hierro, magnesio, manganeso, zinc y potasio); iones no metlicos (cloro y bromo). Si se encuentran en exceso pueden inhibir la reaccin. Coenzimas: vitaminas y fosfatos de nucletidos.

Factores que afectan las reacciones enzimticas

Inhibidores
Competitivos: cuando la sustancia se une fsicamente al sitio activo de la enzima y compite con el sustrato por ste sitio activo. No competitivos: cuando la sustancia se une a la enzima en un lugar distinto al sitio activo. Inhibicin acompetitiva: la sustancia se une al complejo enzima-sustrato. A mayor cantidad de complejos, mayor inhibicin.

Inhibicin competitiva

Inhibicin no competitiva

Inhibicin acompetitiva

Qu se mide en el laboratorio respecto a las enzimas?

A. La cantidad de enzima presente en el suero. B. La velocidad a la que se lleva a cabo una reaccin catalizada por la enzima. C. La cantidad final de producto formado por la enzima.

RESPUESTA
B. La velocidad a la que se lleva a cabo una reaccin catalizada por la enzima.
"...De los varios miles de enzimas presentes en plasma, la medicin de la concentracin de una sola enzima, an cuando est presente en un valor muy elevado, es menor que el lmite deteccin para la mayora de los ensayos qumicos de protenas. El parmetro ms fcil de medir y que est biolgicamente relacionado a muchas condiciones clnicas es la cantidad de actividad cataltica de la enzima y cmo cambia con el tiempo." Qumica Clnica de Kaplan.

Actividad enzimtica
Cantidad

de sustrato que es convertida a producto por unidad de tiempo bajo condiciones definidas.
Es

un parmetro ms fcil de medir que la concentracin de una enzima y est directamente relacionado con la misma.
Biolgicamente

est relacionada muchas condiciones clnicas.

Principio del anlisis

La concentracin de enzimas en suero es muy baja, sin embargo, dada su eleva capacidad cataltica, es posible determinar su actividad y suponer que sta es proporcional a su concentracin.

El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostracin in vitro de la actividad cataltica.

Medicin de la actividad enzimtica

Se

puede medir mediante:

en la

Cuantificacin

del incremento concentracin de producto.

Disminucin Reduccin Aumento

en la concentracin de sustrato.

en la concentracin de coenzima

en la concentracin de coenzima

alterada.

Medicin de la actividad enzimtica

No

debe haber inhibidores que afectan la

Controlar

variables velocidad de reaccin

pH

constante por medio de amortiguadores

Temperatura

constante durante todo el ensayo dentro del rango de 0.1 C. (25, 30 37 C).
Tiempos

de incubacin exactos.

Medicin de la actividad enzimtica

Se

utilizan regularmente 2 mtodos:

Tiempo

fijo: se incuba la reaccin por un tiempo determinado, luego se detiene mediante la adicin de un cido dbil y se cuantifica el producto, coenzima, etc.
Cintico:

se hacen mediciones mltiples (normalmente cambios de absorbancia) a intervalos de tiempo especficos (30 a 60 segs) o en forma continua.

Medicin de la actividad enzimtica

La

EC defini las Unidades Internacionales para estandarizar un sistema de medicin de enzimas.

UI

= cantidad de enzima que cataliza la reaccin de un micromol de sustrato por minuto, en condiciones especficas de temperatura, pH, sustratos y activadores.
Regularmente

se expresa UI/L aunque el Sistema Internacional utiliza el katal (mol/s).

Fases de la actividad enzimtica

Fase de retardo (fase lag)

Ocurre justo despus de mezclar los reactivos con la muestra. Ocurre el encuentro y acoplamiento de sustrato y enzima. Su duracin variable (aunque sonpocos segundos).
La formacin de producto es constante en esta fase. En esta fase se realizan los ensayos. La velocidad de reaccin disminuye hasta anularse

Fase lineal

Fase de agotamiento de sustrato

.

Fases de la actividad enzimtica

Actividad enzimtica para el diagnstico

La enzima debe estar presente en fluidos corporales.

Debe ser fcil de analizar (automatizacin).

Deben existir diferencias significativas entre las concentraciones en estado patolgico y no patolgico

Debe

mantenerse

estable

por

un

tiempo

prudencial.

Enzimas como marcadores

Las enzimas del plasma se pueden clasificar en 2 grupos:

Enzimas especficas del plasma Enzimas no especficas del plasma

Enzimas de secrecin Enzimas del metabolismos intermediario

Enzimas como marcadores

Enzimas especficas del plasma:

Tienen una funcin especfica en el plasma. Estn presentes en concentraciones ms altas en el plasma que en los dems tejidos. Entre estas se encuentran las enzimas de la

coagulacin (pseudocolinesterasa, ferroxidasa

y fosfolipasa).

Se sintetizan en el hgado y sirven como marcadores de dao o disfuncin heptica cuando su concentracin disminuye.

Enzimas como marcadores

Enzimas no especficas del plasma:

No tienen una funcin especfica en el plasma.

Estn presentes en concentraciones ms bajas que en los dems tejidos. Regularmente no estn activas porque hay una deficiencia de activadores y cofactores en

el plasma.

Enzimas como marcadores

Enzimas no especficas del plasma:

Enzimas de secrecin:

Enzimas secretadas desde las glndulas exocrinas (pncreas y prstata)

Algunas provienen de la mucosa gstrica.

Son de utilidad clnica cuando sus valores se encuentran fuera del rango de referencia. Se elevan en sangre por sobreproduccin o por excrecin bloqueada. Disminuyen por necrosis del tejido que las produce.

Enzimas como marcadores

Enzimas no especficas del plasma:

Enzimas del metabolismo intermediario

Circulan en concentraciones bajas comparadas

con las concentraciones presentes en los tejidos.

Regularmente se observan elevaciones cuando existe dao inflamatorio o necrtico en los tejidos

que las producen.

Su disminucin no tiene significancia clnica. Algunos ejemplos de estas enzimas son: CK, LDH,

ALAT y ASAT.

Factores pre-analticos que afectan la medicin de actividad

Tiempo de muestreo adecuado

Las enzimas no poseen ciclos circadianos. Su concentracin vara segn el inicio de la condicin clnica (aguda y crnica).

Factores pre-analticos que afectan la medicin de actividad

Condiciones de almacenamiento

Las muestras deben almacenarse a bajas temperaturas porque las enzimas tienden a aumentar su actividad conforme el tiempo

Sexo
Raza

Edad
Ejercicio fsico

Factores analticos que afectan la medicin de actividad

Evitar ciclos de descongelamiento. congelamiento-

Evitar muestras con hemlisis y lipemia. Separar sueros rpidamente. Evitar estasis venosa durante extraccin sangunea. Transportar a bajas temperaturas.

ISOENZIMAS O ISOZIMAS

ISOENZIMAS
Mltiples formas de una enzima que

catalizan la misma reaccin bioqumica

Diferencias:
Estructura polipeptdica
Distinta afinidad por sustratos y cofactores

Similitudes:
Tamao molecular

Aclaracin importante:

Izoenzimas: se refiere genticamente distintos.

productos

Isoformas: se refiere a las modificaciones postraduccionales de una misma enzima.

Diferencias entre isoenzimas

Propiedades enzimticas
Capacidad de ser inhibidas por agentes especficos Constantes Km

Reactividad con diferentes sustratos.

Propiedades fsicas
Estabilidad trmica y carga.

Propiedades bioqumicas
Composicin de aminocidos y reactividad inmunolgica

Definiciones
Dmero: protena compuesta de dos
subunidades.

Heteropolmero: compuesto polimrico con

ms de un tipo de subunidades. Homopolmero: compuesto polimrico en el cual todas las subunidades son idnticas.

Diferentes formas de isozimas

La enzima puede estar compuesta de 2 subunidades distintas A y B (dmero).

AA (Homodmero) BB (Homodmero B) AB (Heterodmero AB)

Las 3 formas son anteriores son isoenzimas. Este sucede en el caso de CK, la cual tiene 3 isoenzimas MM, MB, BB

Finalidad de las isoenzimas

Funciones distintas que dependen de:
Factores microambientales de los organelos intracelulares en las que se encuentren.

Principales isoenzimas:
Creatinkinasa Lactato deshidrogenasa

Factores macroambientales por la demanda metablica y energtica de los tejidos que las produzcan.

Fosfatasa alcalina
Fosfatasa cida

Creatinkinasa
Dmero formado de subunidades M o B
Cataliza en forma reversible la siguiente reaccin:

Creatina + ATP fosfato de creatina + ADP

Principalmente citoplasmtica
No atraviesa la barrera hematoenceflica (85,000 Da) CK-MM: tejido muscular adulto

CK-BB: cerebro
CK-MB: miocardio

Creatinkinasa
CK total:
[ ] en casos de: infarto, traumatismos, inyecciones IM, intervenciones quirrgicas, hipotiroidismo, embolia, diabetes, entre otras.

CK-MB:
[ ] compatible con dao cardaco. Inicia el

aumento 3-6 h 12-24 recuperacin 24-72

CK-MB
[ ]: Necrosis del msculo cardiaco (infarto) Falla congestiva cardaca Intervenciones cardacas Distrofia muscular (Duchene) Polimiositis [ ]: Sexo: F < M Pacientes hospitalizados

Mtodos para cuantificar/detectar isoenzimas de CK

Electroforesis (mtodo de referencia) Cromatografa de intercambio inico

Inmunoensayos
Radioinmunoensayo (RIA) Inmunoinhibicin

Dimensionales
Segn el mtodo:
Unidades por litro (UI/L)
Kilounidades por litro (KU/L)

Nanogramos por mililitro (ng/mL)

Microgramos por mililitro (g/mL)

% diferencial entre CK/CK-MB

ndice de CK-MB (mayor utilidad)

Lactato deshidrogenasa
Cataliza la reduccin de piruvato a lactato Tetrmero de subunidades M y H 5 isoenzimas

LD1 y LD2: corazn y eritrocitos

LD3: corteza renal, pulmn, linfocitos, bazo y pncreas LD4 y LD5: hgado y msculo esqueltico.

Distribucin tisular de isoenzimas de LDH

Lactato deshidrogenasa
Su concentracin aumenta en casos de:
Lesin miocrdica Miopatas Traumatismos musculares Embolia pulmonar Hemlisis Enfermedades hepticas y renales Leucemia Shock

Fosfatasa alcalina
Se expresa en:
Mucosa intestinal Hgado Hueso Rin Placenta

En RN y nios, la mayor parte de la FAL serolgica proviene del hueso

En el adulto: hueso, hgado, rin, intestino

Posee 3 isoenzimas ALP-I, ALP-L y ALP-P

Fosfatasa alcalina

Causas fisiolgicas de aumento:

Causas patolgicas de aumento:

Crecimiento Deficiencia vitamina D de

Ictericia obstructiva Hiperparatiroidismo Osteomalacia Raquitismo Metstasis seas Fracturas

Embarazo (2 meses postparto) Post menopausia

Fosfatasa alcalina

Centrifugar la mx antes de 30 minutos Procesar el mismo da - 30 % Su actividad disminuye con el uso de anticoagulantes (muestras de plasma). Frmacos:

actividad: alopurinol, anticonvulsivantes, antineoplsicos, isoniazida, fenobarbital, anticonceptivos orales,

: calcitrol, nitrofurantona, oxalatos.

Fosfatasa cida
Fosfatasa no especfica que presenta mxima actividad alrededor de pH 5.0

Fosfatasa cida
Se encuentra en los lisosomas de casi todas las clulas, pero principalmente en:

Hgado Bazo

Plaquetas, eritrocitos, leucocitos

Glndula prosttica (FAP) Testculo

Vejiga
Pncreas

Fosfatasa cida
Se observa aumento en su [ ] en:
Procesos malignos de prstata
CA con metstasis sea (pulmn, pncreas, clulas

renales, hueso, mama, vejiga)

HPB (Hipertrofia prosttica benigna)
Anemias: hemoltica-megaloblstica Mononucleosis

Osteoporosis
Prostatitis

Fosfatasa cida

Es muy inestable en suero separado y a temperatura ambiente. Se debe congelar si no se va a procesar inmediatamente. Suele elevarse 48 hrs post tacto rectal.

Se utiliza con fines forenses en los casos de violacin como evidencia legal del asalto sexual.