PRUEBA DE LA RESISTENCIA A LA ACTIDIONA Esta prueba se utiliza para poner de manifiesto la capacidad de crecimiento de ciertas levaduras en medios con

actidiona. Medio de cultivo Se utiliza agar Sabouraud adicionado con 0,5 g/l de actidiona. El medio lleva tambin antibiticos para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes, siendo uno de los ms utilizados el cloranfenicol. La actidiona inhibe el crecimiento de ciertas levaduras y hongos. Frmula en g/l de agua destilada Peptona: 10 g. Glucosa: 20 g. Actidiona: 0,5 g. Cloranfenicol: 0,5 g. Agar: 15 g. pH: 6-6,3. Preparar el medio, autoclavar y repartir en placas o en tubos. Inoculacin Sembrar una o dos colonias sobre la superficie del medio. Incubacin Incubar a 25-37 C durante veinticuatro horas. Interpretacin de los resultados Se considera la prueba positiva cuando se observa crecimiento en el medio. Cuando hay inhibicin del crecimiento se considera la prueba como negativa. HIDROLISIS DEL ALMIDON Esta prueba determina la capacidad de ciertas bacterias para hidrolizar el almidn. Medio de cultivo Frmula en g/l de agua destilada Extracto de carne: 3 g. Almidn soluble:10 g. Agar: 12 g. pH: 7,5. Preparar el medio, autoclavar y dispensar en placas o en tubos, dejando enfriar stos en

posicin inclinada. Reactivo Yodo de Gram (lugol). Inoculacin Inocular un asa de cultivo formando una sla estra en caso de utilizar tubos. Realizar una siembra en aislamiento si se trata de placas. Incubacin Incubar a 35-37 C durante cuarenta y ocho horas. Interpretacin de los resultados Transcurrida la incubacin, inundar la superficie del cultivo con el reactivo (yodo de Gram). La aparicin de una zona incolora rodeando las colonias, indica la hidrlisis del almidn y se interpreta la prueba como positiva. Una coloracin prpura o azul-negro en el medio indica que el almidn no ha sido hidrolizado, considerndose la prueba como negativa. Cuando la prueba se realiza para la identificacin de Gardnerella vaginalis se utiliza como medio base el agar de Mueller Hinton adicionado de un 10 por 100 de almidn y un 5 por 100 de suero estril de caballo. PRUEBA DE LA ARILSULFATASA Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar ciertas especies de Micobacterias de crecimiento rpido, capaces de producir suficiente enzima arilsulfatasa como para dar la prueba positiva en tres das, como ocurre con las especies M. fortuitum y M. chelonei. Existen otras especies de Micobacterias de desarrollo ms lento que tambin son capaces de producir dicha enzima, como M. xenopi M. szulgai, M. marinum, M. kansaii, M. gordonae, M. avium-complex, etc., pero muchas de ellas tardan tanto en crecer que las cantidades de enzima producidas no son suficientes como para poder interpretar con facilidad los resultados de la prueba. Para demostrar la produccin de enzima arilsulfatasa por estas bacterias, se utiliza un medio de cultivo que lleva incorporado disulfato tripotsico de fenolftalena, de forma que al actuar dicha enzima sobre esta sal, se libera fenolftalena que se pone en evidencia por la aparicin de color rosa en el medio al aadir una solucin de carbonato sdico. Medio de cultivo Solucin de disulfato tripotsico de fenolftalena 0,08 M

 Disulfato tripotsico de fenolftalena: 2,6 g. Agua destilada: 50 ml. Medio de Dubos Frmula en g/l de agua destilada: Fosfato monopotsico: 1g. Fosfato disdico: 6,3 g. Asparagina: 2 g. Autolisado de casena: 2 g. Citrato frrico amnico: 0,05 g. Sulfato magnsico: 0,01 g. Cloruro clcico: 0,0005 g. Sulfato de zinc: 0,0001 g. Sulfato de cobre: O,OOO1 g. Tween 80: 0,5 g. Glucosa: 5 g. Fraccin V de plasma bovino: 5 g. Aadir 2,5 ml de la solucin de disulfato tripotsico de fenolftalena a 200 ml del medio de Dubos, y distribuir en tubos a razn de 2 ml en cada uno. Reactivo Solucin de carbonato de sodio: Disolver 10,6 g de carbonato de sodio anhidro en 100 ml de agua destilada. Inoculacin Inocular un asa de cultivo en el medio. Incubacin Incubar a 35-37 C durante tres das. Aadir seis gotas de la solucin de carbonato de sodio al finalizar la incubacin. Interpretacin de los resultados La aparicin de color rosa-rojo en el medio indica la presencia de fenolftalena libre, lo que har considerar la prueba como positiva. Para detectar cantidades menores de enzima arilsulfatasa, con perodos de incubacin ms prolongados (hasta catorce das), aadir 7,7 ml de la solucin de disulfato tripotsico de fenolftalena a 200 ml del medio de Dubos, y repartir en tubos a razn de 2 ml en cada uno. Inocular los tubos y despus de dos semanas de incubacin, proceder como en el caso anterior. PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA

Esta prueba puede utilizarse como diagnstico presuntivo en la identificacin de los Streptococcus betahemolticos del grupo A de Lancefield, ya que, a diferencia de la mayora de los Streptococcus, suelen ser sensibles a bajas concentraciones de bacitracina. Medio de cultivo Se utiliza agar-sangre de carnero al 5 por 100. Reactivo Discos de bacitracina de 0,04 U, que pueden adquirirse comercializados. Inoculacin Inocular por diseminacin en superficie una placa de agar sangre con una suspensin del microorganismo problema. Dejar reposar quince minutos a temperatura ambiente. Colocar con unas pinzas estriles un disco de bacitracina en el centro de la placa inoculada. Incubacin Incubar a 35-37 C durante veinticuatro horas. Interpretacin de los resultados Se considera la prueba positiva cuando hay inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor del disco de bacitracina. La prueba ser negativa cuando no se observe inhibicin. PRUEBA DE LA BETA-GALACTOSIDASA (ONPG) Esta prueba demuestra la presencia de la enzima beta-galactosidasa en algunos microorganismos. Hay bacterias que a pesar de poseer enzimas hidrolizantes de la lactosa (betagalactosidasas), no pueden actuar sobre ella porque les faltan las enzimas extracelulares apropiadas (permeasas). A estas bacterias se les denomina mutantes crpticos. Para conocer si un microorganismo es productor de betagalactosidasa, basta aadir el compuesto orgnico O-nitrofenil-beta-D-galactopiransido (ONPG) que es incoloro. Si la bacteria posee las enzimas hidrolizantes (beta-galactosidasa), el compuesto se transforma en ortonitrofenol, un derivado cromognico de color amarillo. Todos los grmenes denominados fermentadores lentos de la lactosa son betagalactosidasa positivos. Reactivo Se utilizan discos de ONPG, de los que se puede disponer comercializados. Inoculacin

Preparar un inculo muy denso en 1 ml de solucin salina estril, y aadir asepticamente un disco de ONPG. Se favorece la reaccin si la bacteria procede de un medio lactosado. Incubacin Incubar a 37 C de veinte minutos a veinticuatro horas. Interpretacin de los resultados Si el microorganismo es productor de beta-galactosidasa, el lquido se volver de color amarillo. Si queda incoloro, indicar que el microorganismo no posee la enzima. PRUEBA DEL CRECIMIENTO EN BILIS La capacidad de crecimiento en medios con una determinada concentracin en bilis, es una prueba utilizada para la identificacin de ciertos anaerobios, como las especies de Bacteroides y Fusobacterium. Medio de cultivo Se puede utilizar caldo tioglicolato suplementado, adicionado con un 20 por 100 de bilis, para lo que se aaden 0,5 ml de bilis de buey al 40 por 100 a 10 ml de medio de tioglicolato suplementado. Inoculacin Se deben inocular dos tubos, uno con bilis y otro sin bilis. Incubacin Incubar en anaerobiosis a 35-37 C, durante cuarenta y ocho-setenta y dos horas. Interpretacin de los resultados Comparar el crecimiento en ambos tubos, con y sin bilis. Se considera la prueba positiva si se produce el mismo crecimiento en los dos tubos, o presenta mayor crecimiento el tubo que contiene bilis. La inhibicin de crecimiento total o parcial, en el tubo que contiene bilis, har interpretar el resultado como negativo. PRUEBA DE LA SOLUBILIDAD EN BILIS Se basa en la capacidad de determinadas especies bacterianas de lisarse en presencia de sales biliares, las ms utilizadas de las cuales son: el taurocolato y el desoxicolato de sodio. Ambas provocan un descenso de la tensin superficial, que, unido a la actuacin de enzimas autolticos, destruyen la clula. El efecto de esta enzima autoltica se pone de manifiesto tambin sobre las colonias viejas de Streptococcus pneumoniae crecidas en medios slidos, en las que se aprecia una umbilicacin central.

Medio de cultivo Se utiliza cualquier caldo nutritivo que no incluya glucosa, y que durante la experiencia permita mantener un pH no inferior a 7. Tambin puede servir una suspensin de microorganismos efectuada en agua destilada y a pH 7, a partir de un cultivo en placa de dieciocho-veinticuatro horas. Inoculacin A 5 ml del cultivo de veinticuatro horas en caldo, o de la suspensin, se le aaden 0,5 ml de una solucin al 10 por 100 de sal biliar (preferentemente desoxicolato de sodio). Estas sales de sodio pueden adquirirse comercializadas. Incubacin Agitar con cuidado la mezcla e incubar a 35-37 C en estufa o en bao Mara durante tres horas. Es conveniente realizar otra prueba paralela con un control, al que en vez de desoxicolato de sodio se le aadir suero fisiolgico a pH 7. Interpretacin de los resultados Si antes de las tres horas de incubacin se produce aclaramiento del contenido del tubo, se interpreta como resultado soluble en bilis (Streptococcus pneumoniae). Si la solucin permanece turbia, se indica como insoluble en bilis (otros Streptococcus). En esta prueba es esencial el control de pH del medio. Si las condiciones son cidas (pH 6,8), se puede producir una precipitacin del desoxicolato que enmascare el resultado de la prueba dando falsos negativos. Si las condiciones son bsicas, la lisis puede provenir exclusivamente de la alcalinidad, produciendo resultados falsamente positivos. PRUEBA DE LA BILIS-ESCULINA Esta prueba determina la propiedad que poseen algunos microorganismos de hidrolizar el glucsido esculina en esculetina y glucosa, en presencia de un 10 a un 40 por 100 de bilis. La esculetina producida reacciona con una sal de hierro incorporada al medio, dando un color castao oscuro o negro. Medio de cultivo Frmula en g/l de agua destilada: Peptona: 5 g. Extracto de carne: 3 g. Bilis de buey: 40 g. Esculina: 1 g. Citrato de hierro: 0,5 g.

 Agar: 15 g. pH:7. Preparar el medio y calentar hasta su completa disolucin. Repartir en tubos y esterilizar en autoclave. Dejar enfriar en posicin inclinada. Inoculacin A partir de una colonia aislada, sembrar en estra en la zona del pico de flauta. Incubacin Incubar a 35-37 C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas, pero no se considera la prueba negativa hasta transcurridas setenta y dos horas. Interpretacin de los resultados La aparicin de un color castao oscuro o negro en el medio indica hidrlisis de la esculina. Si no hay cambio de color, se considera la prueba como negativa. PRUEBA DEL CAMP (CAMP FACTOR TEST) Es una prueba presuntiva de identificacin de los Streptococcus del grupo B, descrita por Christie, Atkins y Munch-Petersen. Esta basada en la potenciacin de la zona de lisis formada por Staphylococcus aureus productores de beta-lisina, por una sustancia denominada CAMP-factor, elaborada por los Streptococcus del grupo B. Medio de cultivo Se utiliza agar sangre ovina o bovina. Inoculacin La prueba se puede realizar utilizando una cepa de Staphylococcus aureus productora de beta-lisina, o bien discos que contengan beta-lisina estafiloccica. Sembrar una estra espesa con el Streptococcus problema y, perpendicularmente a ella, y a 3 4 mm de distancia, una estra de la cepa de Staphylococcus aureus productora de beta-lisina (o un disco con betalisina estafiloccica). Incubacin Incubar en aerobiosis o con atmsfera parcial de C02 a 35-37 C durante veinticuatrocuarenta y ocho horas. Interpretacin de los resultados Se considera la prueba positiva, si se observa una hemlisis clara en tringulo o punta de flecha.

PRUEBA DE LA CATALASA La catalasa es una enzima propia de la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que poseen citocromos, con la excepcin de Streptococcus. Su funcin es descomponer el perxido de hidrgeno (H202), desprendiendo oxgeno libre. La prueba se puede realizar en porta o directamente sobre el cultivo. Reactivo Agua oxigenada al 3 por 100. Mtodo Tomar con el asa una colonia de veinticuatro horas y depositarla sobre un porta. Aadir con una pipeta una gota de agua oxigenada al 3 por 100; lo que no debe hacerse es homogeneizar el asa con el cultivo sobre una gota de H202 depositada previamente en el porta, pues produce falsos positivos. La prueba puede realizarse tambin aadiendo el agua oxigenada directamente sobre una placa que contiene un cultivo puro. Si la colonia procede de una placa de agar sangre puede dar falsos positivos debido a la presencia de eritrocitos, que tambin poseen catalasa. No existe dicha posibilidad si procede de otro medio de cultivo, incluido el agar chocolate. Interpretacin de los resultados Se considera la prueba positiva cuando se observa desprendimiento de burbujas de gas (02). PRUEBA DE LA CATALASA PARA ANAEROBI0S La prueba de la catalasa para grmenes anaerobios se realiza de la misma forma que la de aerobios, con la salvedad de que las placas que se han incubado en anaerobiosis deben permanecer expuestas al aire durante treinta minutos, por lo menos, antes de iniciar la prueba. Tampoco es correcto efectuar la prueba en microorganismos crecidos en medios que contienen sangre. La interpretacin se realiza de la forma descrita anteriormente, aunque las burbujas tardan ms en aparecer (hasta un minuto). Si se dispone de un cultivo puro en caldo tioglicolato se puede investigar la presencia de catalasa aadiendo 1 ml de H2O2 y comprobando la aparicin de burbujas en caso positivo, que a los pocos minutos produce superficialmente una capa espumosa. PRUEBA DE LA CATALASA PARA MICOBACTERIAS La prueba de la catalasa para Micobacterias tiene el mismo fundamento que el descrito para otros microorganismos, pero se diferencia en los reactivos utilizados y en que se

realiza a dos temperaturas diferentes: 22 y 68 C, con objeto de diferenciar a las Micobacterias tuberculosas (M. tuberculosis, M. bovis y M. africanum), que presentan actividad catalsica nicamente a 22 C, del resto de las Micobacterias que, con alguna excepcin, muestran dicha actividad a ambas temperaturas. Reactivo Agua oxigenada al 30 por 100. Tween 80 al 10 por 100. Esterilizar en autoclave y conservar a 40 C. Si presenta sedimento, mezclar antes de usar. El Tween 80 (detergente) ayuda a separar a las Micobacterias agrupadas, en bacilos individuales, facilitando de esta forma la deteccin de la catalasa. En el momento de utilizar el reactivo, mezclar volmenes iguales de agua oxigenada al 30 por 100 y Tween 80 al 10 por 100. La mezcla es inestable, por lo que no es conveniente volver a usar las porciones que sobren. Mtodo Preparar dos tubos de hemlisis con 0,5 ml de agua destilada estril cada uno. Emulsionar un asa de colonias procedentes de un cultivo joven en cada uno de los tubos. Incubar uno de los tubos en un bao de agua a 68 C y el otro a 20 C durante veinte minutos. Retirar los tubos del bao y dejar enfriar a temperatura ambiente. Aadir 0,5 ml a 1 ml de reactivo a cada uno de los tubos. Interpretacin de los resultados Se considera como resultado positivo la formacin de burbujas. No se debe dar la prueba como negativa hasta transcurridos veinte minutos despus de aadir el reactivo. Al efectuar la lectura no se debe agitar el tubo, ya que la presencia de detergente (Tween 80) en la mezcla puede producir una falsa impresin de burbujas. Las Micobacterias del complejo tuberculoso darn la prueba positiva en el tubo mantenido a 20 C, y negativa en el sometido a 68 C. PRUEBA DEL CITRATO Determina la capacidad que poseen algunos microorganismos de utilizar como nica fuente de carbono el citrato, produciendo alcalinidad. Medio de cultivo El medio utilizado es el agar citratado de Simmons.

Frmula en g/l de agua destilada: Cloruro sdico: 5 g. Sulfato magnsico: 0,2 g. Fosfato monoamnico: 1g. Fosfato dipotsico: 1g. Citrato sdico: 2 g. Agar: 18 g. Azul de bromotimol: 0,08 g. pH: 6,9. Preparar el medio y repartir en tubos a razn de 45 ml por tubo. Esterilizar en autoclave y dejar enfriar en posicin inclinada, con el pico de flauta bastante largo. Inoculacin Inocular en estra, en el pico de flauta, empezando desde el fondo hasta la parte ms alta. Incubacin Incubar a 35-37 C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas. Interpretacin de los resultados Son dos los aspectos que confirman la positividad de la prueba: a) La observacin de crecimiento sobre el pico de flauta. b) La variacin de coloracin de verde a azul, debido a la alcalinizacin del medio, producida por la liberacin de sodio del citrato utilizado, sodio, que con las molculas de agua presentes formar (OH)Na. PRUEBA DE FORMACION DE CLAMIDOSPORAS Esta prueba se utiliza para la diferenciacin de ciertas levaduras del gnero Candida, en especial para la identificacin de Candida albicans que con la especie Candida stellatoidea y en ocasiones Candida tropicalis, son las nicas levaduras capaces de formar clamidosporas. Medio de cultivo La prueba se puede realizar en diferentes medios: agar Corn Meal con Tween 80, PCB, RAT. Corn Meal con Tween 80 Frmula en g/l de agua destilada: Infusin de harina de maz: 50 g. Agar: 15 g.

 pH:6. Preparar el medio calentando hasta completa disolucin, aadir 1 por 100 de Tween 80, autoclavar y repartir en placas. P.C.B. Frmula en g/l de agua destilada: Zanahorias (peladas y raspadas): 20 g. Patata: 20 g. Agar: 25 g. Bilis de buey: 150 ml. La bilis de buey favorece la produccin de clamidosporas. El medio PCB se encuentra comercializado en tubos. R.A.T. Frmula en g/l de agua destilada: Extracto de arroz: 2,5 g. Agar: 10 g. Tween 80:10 ml. pH: 6,6. El medio se encuentra comercializado en tubos. Licuar el contenido del tubo en bao Mara hirviente, homogeneizar y verter sobre placas Petri. Dejar solidificar. El Tween 80 de los medios RAT y Corn Meal fomenta la formacin de clamidosporas. Inoculacin En placa: RAT y Corn Meal. Inocular con aguja, realizando dos o tres lneas paralelas separadas unos milmetros entre s, y depositar un cubre estril sobre la zona inoculada, que conferir al cultivo condiciones ligeramente anaerbicas. En tubo: PCB. Inocular con aguja, realizando varias estras en el fondo del tubo, y una estra terminal menos profunda. Incubacin Incubar a 25-30 C durante veinticuatro-setenta y dos horas. Interpretacin de los resultados En placa: Llevar la placa al microscopio y observar por encima del cubre, o, si la placa es

de plstico, a travs de la base, colocndola invertida sobre la platina del microscopio, con objetivo seco de poco aumento. En tubo: Tomar un fragmento de agar, aplastarlo entre porta y cubre y observar al microscopio. Prueba positiva: Formacin de clamidosporas, es decir, esporas de 6 a 12 micras, de paredes gruesas, redondas u ovales, que pueden estar localizadas en posicin terminal o lateral. Prueba negativa: Ausencia de clamidosporas. PRUEBA DEL CNK Sirve para poner de manifiesto aquellas bacterias que son capaces de crecer en un medio que contiene cianuro potsico. Medio de cultivo Frmula en g/l de agua destilada: Peptona: 3 g. Fosfato monopotsico: 0,225 g. Fosfato disdico: 5,640 g. Cloruro sdico: 5 g. pH: 7,6. El medio bsico se esteriliza en autoclave y se deja enfriar. Se aaden 15 ml de solucin de cianuro potsico al 0,5 por 100 y se entuba a razn de 4 ml por tubo. Se recubren con 1 ml de aceite de parafina y se tapan hermticamente con tapones estriles. Inoculacin Sembrar un tubo con una gota de suspensin bacteriana diluida (con el fin de no enturbiar el lquido). Se inocula a la vez otro tubo control sin cianuro potsico. Incubacin Se incuban a 35-37 C durante cuatro das. Interpretacin de los resultados En caso positivo, ambos tubos presentan turbidez. Si slo est turbio el control, el resultado se considera negativo. PRUEBA DE LA COAGULASA Consiste en poner de manifiesto la enzima coagulasa que poseen algunos Staphylococcus. Estos grmenes, incluidos en la especie Staphylococcus aureus son considerados patgenos. Actualmente se sabe que hay Staphylococcus coagulasa negativos, virulentos y productores de cuadros clnicos, como endocarditis o infecciones

urinarias. Medio de cultivo La prueba puede hacerse partiendo directamente de una colonia obtenida en la placa de aislamiento, pero es mejor utilizar un crecimiento de dieciocho-veinticuatro horas obtenido en algn medio lquido enriquecido, como la infusin de cerebro-corazn (BHI). Reactivo Se utiliza plasma humano o de conejo. Debido a la facilidad con que todos los laboratorios disponen de plasma humano, recomendamos la utilizacin de este ltimo, conseguido de la siguiente manera: a) Recoger sangre humana obtenida en condiciones aspticas, e incluirla en un tubo estril que contenga anticoagulante (citrato sdico, EDTA o heparina). b) Dejar que los glbulos rojos sedimenten por s solos, o, si se tiene prisa, centrifugar a pocas revoluciones. c) Con una pipeta estril aspirar el sobrenadante, que se pasar a un tubo, tambin estril, y se guardar en nevera a 4 C. Se pueden seguir dos tipos de tcnicas: a) La prueba del portaobjetos, que pone de manifiesto la coagulasa ligada. b) La prueba del tubo de hemlisis, que pone de manifiesto la coagulasa ligada y la coagulasa libre. a) Prueba del portaobjetos. Depositar una gota de agua destilada estril sobre un porta. Homogeneizar sobre ella una gota de suspensin bacteriana de veinticuatro horas en BHI. Aadir una gota de plasma junto al homogeneizado anterior y mezclar bien. b) Prueba del tubo de hemlisis. Depositar 0,5 ml de plasma dentro de un tubo de hemlisis y aadirle 0,5 ml de un cultivo del germen en BHI. Mezclar suavemente por rotacin del tubo, sin agitar. Incubar a 37 C, preferiblemente en un bao de agua, observando el tubo cada treinta minutos, hasta las cuatro horas. Interpretacin de los resultados En la prueba del portaobjetos la reaccin positiva se observa entre los quince y veinte segundos con formacin de abundantes grumos de color blanco. Se considera negativa la prueba, si no hay aglutinacin en tres o cuatro minutos. En el caso del tubo de hemlisis se considera como prueba positiva la formacin de un cogulo, que se manifiesta al inclinar con cuidado el tubo. Los tubos se leen hasta las

cuatro horas, pero no se da un resultado como negativo (ausencia de cogulo) hasta transcurridas veinticuatro horas. Algunos microorganismos que utilizan citrato pueden dar reacciones falsamente positivas cuando se usa dicho anticoagulante. PRUEBA DE CRECIMIENTO CON 1 POR 100 DE GLICINA Esta prueba sirve para comprobar la capacidad de crecimiento, en medios con 1 por 100 de glicina, que poseen determinadas especies de Campylobacter. Medio de cultivo Se utiliza caldo Brucella, adicionado de 0,16 por ciento de agar y 1 por 100 de glicina. Inoculacin Inocular el caldo con un cultivo joven. Incubacin Incubar a 42 C durante setenta y dos horas en condiciones microaeroflicas. Interpretacin de los resultados La presencia de turbidez en el medio se considera como prueba positiva. Es conveniente utilizar un tubo control. PRUEBA DEL CRECIMIENTO EN CALDO HIPERSALINO AL 6,5 POR 100 Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos de desarrollarse en medios de cultivo con una concentracin en cloruro sdico del 6,5 por ciento. Medio de cultivo El medio de cultivo utilizado es el caldo tripticasa de soja, adicionado del 6,5 por 100 de ClNa. Frmula en g/l de agua destilada: Triptosa: 17 g. Peptona de soja: 3 g. Cloruro sdico: 65 g. Fosfato bipotsico: 2,5 g. Glucosa: 2,5 g. pH: 7,3. Preparar el medio y distribuirlo en tubos. Esterilizar en autoclave. Inoculacin

Inocular el caldo con una o dos asas del cultivo problema. Incubacin Incubar a 35-37 C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas, esperando a las setenta y dos horas para darlo como negativo. Interpretacin de los resultados El crecimiento (tubidez) en el medio se considera como prueba positiva. Si no se observa crecimiento, diremos que la prueba es negativa. Existen otros medios de cultivo, utilizados tambin en taxonoma, que sirven para comprobar el crecimiento de determinadas bacterias. Estos medios incorporan concentraciones de cloruro sdico al 3,5 por ciento (Campylobacter); 7,5 por 100 (Staphylococcus); 8,5 por 100 (Vibrio), y 10 por 100 (Vibrio). CRECIMIENTO EN LOWENSTEIN CON UN 5 POR 100 de NaCI Las Micobacterias de crecimiento rpido son capaces de desarrollarse en medios con una concentracin de NaCI del 5 por 100, excepto el Mycobacterium chelonei subsp. chelonei. Del grupo de Micobacterias de crecimiento lento, las especies: Mycobacterium flavescens y Mycobacterium triviale pueden cultivarse en estas condiciones. Medio de cultivo Medio de Lwenstein con un 5 por 100 de NaCI: Medio base de Lwenstein: 37,2 g. Glicerol: 12 ml. Cloruro sdico: 80 g. Huevo homogeneizado: 1l. Agua destilada: 588 ml. Este medio est comercializado en tubos. Frmula del medio base de Lwenstein: Asparagina: 3,6 g. Fosfato monopotsico: 2,4 g. Sulfato de magnesio: 0,2 g. Citrato de magnesio: 0,6 g. Harina de patata: 30 g. Verde de malaquita: 0,4 g. Inoculacin Inocular 0,1 ml de suspensin bacteriana. Incubacin

Incubar a 35-37 C durante cuatro semanas. Interpretacin de los resultados Se considera la prueba positiva si hay crecimiento en el medio. Se debe utilizar como control un cultivo del mismo germen en Lwenstein sin cloruro sdico. CRECIMIENTO EN PRESENCIA DE TIONINA Y FUCSINA BASICA Esta prueba determina la capacidad de crecimiento de Brucella en medios que contengan tionina y fucsina bsica. Medio de cultivo Se utiliza el agar triptosa con las siguientes concentraciones de colorantes puros: tionina: 1/25.000 y 1/ 50.000; fucsina bsica, 1/50.000. Frmula en g/l de agua destilada: Triptosa: 20 g. Tiamina: 0,005 g. Cloruro sdico: 5 g. Glucosa: 1 g. Agar: 15 g pH: 6,8. Una vez preparado y autoclavado el medio, separar dos lotes, aadiendo a uno la tionina y, al otro, la fucsina bsica. Repartir en placas. Inoculacin Sembrar en estra de cada cultivo puro una placa de agar-triptosa-tionina y una placa de agar-triptosa- fucsina bsica. En cada placa se pueden probar varios cultivos. Incubacin Incubar a 35-37 C durante tres-cuatro das en atmsfera de 10 por 100 de C02. Interpretacin de los resultados Se considera la prueba positiva cuando se observa crecimiento. En caso de no observarlo daremos la prueba como negativa