FACULDADE DE FILOSOFIA, CINCIAS E LETRAS DO ALTO SO FRANCISCO CURSO DE QUMICA

AVALIAO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E CARACTERIZAO QUMICA DAS FRAES CROMATOGRFICAS E EXTRATO ETANLICO DAS FOLHAS DE Bauhinia longifolia (Bong.) Steudel

Autora: Alda Ernestina dos Santos Orientadora: Alessandra Duarte Co-Orientador: Wilton Jos Ferreira

Luz Minas Gerais Brasil Novembro de 2008

Alda Ernestina dos Santos

Avaliao do potencial antioxidante e caracterizao qumica das fraes cromatogrficas e extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia (Bong.) Steudel

Trabalho apresentado ao Departamento de Qumica da Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras do Alto So Francisco - FASF, como parte das exigncias do curso de Graduao em Qumica, para a obteno do ttulo de licenciado em Qumica.

rea de Concentrao: Qumica dos Produtos Naturais

Orientador Prof. Alessandra Duarte Co-Orientador Prof. Wilton Jos Ferreira

Luz Minas Gerais Brasil 2008

54 S237A Santos, Alda Ernestina dos. Avaliao do potencial antioxidante e caracterizao qumica das fraes cromatogrficas e extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia (Bong.) / Alda Ernestina dos Santos. Luz : FASF, 2008. 107 p. : il. ISBN 1. Qumica. 2. CG-EM. I. Ttulo. CDU: 54

 memria de minha av Ernestina s minhas tias Ftima e Perptua Ao meu pai Romeu minha prima Regina

AGRADECIMENTOS
toda minha famlia pela confiana e incentivo constante durante os quatro anos da graduao, em especial minha tia Ftima (Tia Cum), minha av Ernestina, meu Pai Romeu, minha tia Perptua e minha prima Regina, que foram minha base familiar e financeira.

Aos meus professores e orientadores Alessandra Duarte e Wilton Ferreira, pela orientao e apoio permanente, sem os quais a realizao deste trabalho seria impossvel.

Wilton Ferreira pela oportunidade de realizar os experimentos nos laboratrios da UFF e UFRJ, em especial pelas anlises de CG-EM.

Adriana Duarte por ter me recebido em sua casa no Rio de Janeiro durante a realizao dos experimentos, e frias tambm.

bioqumica Carmelita Gomes da Silva pela realizao dos ensaios antioxidantes.

Ao professor Dnis Coelho pela boa vontade em providenciar a identificao botnica da espcie estudada.

Aos meus companheiros de coleta das folhas de Pata-de-Vaca, amigos e sempre presentes Lucas Paolinelli e Vincius Paolinelli.

Ao meu tio Jos Maria pelo lanche dirio na faculdade e minha prima Mnica pelo apoio e amizade.

Aos meus amigos e companheiros de sala Amanda Couto, Gilmar Gonalves e Sandra Resende pela amizade incondicional.

s amigas sempre presentes Daiane Anglica, Gabriela Paulinelli, Luana Sousa e Mariana Pereira pela amizade.

todos aqueles que de maneira direta ou indireta contriburam para a realizao deste trabalho.

Deus por ter colocado todas essas pessoas maravilhosas em meu caminho.

O segredo no correr atrs das borboletas, e sim cuidar do jardim para que elas venham at voc.

Friedrich Nietzsche

Sumrio

1- INTRODUO.................................................................................................................1 1.1 - Objetivos.........................................................................................................................3 1.2 - Justificativa.....................................................................................................................4 2 - REFERENCIAL TERICO..........................................................................................5 2.1 - Os vegetais como fonte de compostos biologicamente ativos.......................................5 2.2 - Metabolismo secundrio vegetal....................................................................................9 2.2.1 - Flavonides................................................................................................................13 2.2.2 - Alcalides..................................................................................................................19 2.2.3 - leos Volteis............................................................................................................25 2.2.4 - Cumarinas, Cromonas e Xantonas.............................................................................28 2.2.5 Quinonas...................................................................................................................30 2.2.6 - Taninos......................................................................................................................31 2.2.7 - Saponinas...................................................................................................................33 2.2.8 - Ligninas e lignanas....................................................................................................35 2.2.9 - Compostos fenlicos simples e heterosdicos............................................................36 2.2.10 - Heterosdeos cardioativos........................................................................................37 2.2.11 - Compostos Sulfurados.............................................................................................38 2.3 - Anlise fitoqumica......................................................................................................40 2.3.1 - Tcnicas Instrumentais de emprego na anlise fitoqumica......................................43 2.3.1.1 - Cromatografia.........................................................................................................44 2.3.1.2 - Cromatografia Gasosa.............................................................................................45 2.3.1.3 - Cromatografia lquida em coluna...........................................................................46 2.3.1.4 - Cromatografia lquida de alta eficincia.................................................................47 2.3.1.5 - Cromatografia em camada delgada.........................................................................49 2.3.1.6 - Espectrometria de massa atmica...........................................................................50 2.3.1.7 - Espectroscopia no infravermelho...........................................................................51 2.3.1.8 - Espectroscopia no ultravioleta-visvel....................................................................52 2.3.1.9 - Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear..................................................54 2.4 Reviso de estudos com espcies do gnero Bauhinia................................................56

2.4.1 Estudos farmacolgicos............................................................................................56 2.4.2 Estudos fitoqumicos................................................................................................59 2.4.3 Estudos avaliando o potencial antioxidante..............................................................70 2.5 Estudos com Bauhinia longifolia.................................................................................73 3 METODOLOGIA.........................................................................................................74 3.1 - Identificao botnica e herborizao da espcie estudada........................................74 3.2 Coleta das Folhas de Bauhinia longifolia....................................................................74 3.3 Secagem e processamento das folhas de Bauhinia longifolia......................................74 3.4 Processo de extrao....................................................................................................75 3.5 Concentrao presso reduzida do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia...............................................................................................................................75 3.6 Cromatografia lquida em coluna.................................................................................75 3.7 Cromatografia em camada delgada..............................................................................75 3.8 Avaliao do potencial antioxidante das fraes cromatogrficas e extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia..........................................................................................76 3.9 Anlise por cromatografia em fase gasosa acoplada espectrometria de massa.........76 4 RESULTADOS E DISCUSSES................................................................................78 4.1 Aspectos botnicos.......................................................................................................78 4.2 Processo de extrao e fracionamento cromatogrfico................................................80 4.3 - Avaliao qualitativa da atividade antioxidante...........................................................82 4.4 - Caracterizao qumica por CG-EM das fraes ativas...............................................86 5 CONCLUSO...............................................................................................................92 6- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................93

Lista de Figuras

FIGURA 1: Estrutura da morfina, um alcalide....................................................................5 FIGURA 2: Estrutura do paclitaxel e da camptotecina.........................................................6 FIGURA 3: Origem biossinttica dos metablitos secundrios..........................................10 FIGURA 4: Fatores ambientais que interferem na produo de metablitos secundrios..12 FIGURA 5: Ncleo fundamental dos flavonides...............................................................13 FIGURA 6: Estrutura da 3-hidrxi-2-fenilcromona, apigenina e luteolina.........................14 FIGURA 7: Estrutura da vitexina........................................................................................14 FIGURA 8: Ncleo fundamental dos antocianos e estrutura da malvidina........................15 FIGURA 9: Ncleo fundamental das chalconas e estrutura da ocanina..............................15 FIGURA 10: Ncleo fundamental das auronas e estrutura da sulfuretina..........................16 FIGURA 11: Ncleo fundamental das flavanonas , flavanonis e di-hidrochalconas.......16 FIGURA 12: Estrutura bsica das isoflavonas, dos rotenides e dos pterocarpanos..........17 FIGURA 13: Estrutura bsica das 4-arilcumarinas, 3-arilbenzofuranos e dalbergionas.....17 FIGURA 14: Estrutura bsica das amentoflavonas e agatisflavonas..................................18 FIGURA 15: Estrutura da quercitrina , quercetina e 5,7,3-triidrxi-3,6,4-

trimetxiflavona....................................................................................................................19 FIGURA 16: Estrutura da galantamina................................................................................20 FIGURA 17: Estrutura da escopolamina e da cocana.........................................................23 FIGURA 18: Estrutura dos alcalides indlicos harmina, elipticina e iombina..................24 FIGURA 19: Estrutura do retronecanol, lasiocarpina e danaidona......................................24 FIGURA 20: Estrutura dos alcalides esteroidais solasodina, tomatidina e solanidina......25 FIGURA 21: Estrutura do cido cinmico, um fenilpropanide.........................................25 FIGURA 22 : Exemplos de terpenides: tujona, fenchona, cnfora, limoneno e mentol....28 FIGURA 23: Estruturas bsicas das cumarinas , cromonas e xantonas...............................28 FIGURA 24: Furanocumarina ligada base timina.............................................................29 FIGURA 25: Estrutura da furanocromona quelina..............................................................29 FIGURA 26: Estrutura bsica das benzoquinonas, naftoquinonas e antraquinonas............30 FIGURA 27: Estrutura da hipericina e da alizarina.............................................................31 FIGURA 28: Estrutura bsica dos taninos condensados.....................................................32

FIGURA 29: Estruturas do hamamelitanino e da pedunculagina........................................32 FIGURA 30: Ncleo dos tipos espirostano e lupeol............................................................34 FIGURA 31: Estrutura da glicirrizina..................................................................................34 FIGURA 32: Estrutura do pinoresinol e do cido nordi-hidroguaiartico...........................35 FIGURA 33 : Estrutura dos cidos benzico, glico e elgico............................................36 FIGURA 34 : Estrutura dos cidos p-cumrico, cafico e ferlico.....................................37 FIGURA 35 : Ncleo esteroidal tetracclico dos heterosdeos cardioativos........................38 FIGURA 36 : Estrutura da digoxina....................................................................................38 FIGURA 37 : Transformao da sinigrina em cido tiocinico..........................................39 FIGURA 38 : Estrutura da aliina e alicina...........................................................................40 FIGURA 39 : Principais solventes e classes de metablitos extradas................................42 FIGURA 40: Cromatograma obtido por cromatografia gasosa de uma mistura de friedelinol e friedelina isolados das folhas de Maytenus acanthophylla e seus respectivos padres..................................................................................................................................45 FIGURA 41 : Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.......................................46 FIGURA 42 : Cromatograma de padres dos flavonides, campferitrina, quercetina, canferol e 3,7-di-O--L-ramnopiranosil quercetina..............................................................48 FIGURA 43 : Cromatograma do extrato aquoso das folhas de Bauhinia

forficata.................................................................................................................................48 FIGURA 44: Placa de CCD antes e aps a eluio.............................................................49 FIGURA 45: Placa de CCD de extratos brutos vegetais.....................................................50 FIGURA 46: Cromatograma obtido por CLAE com detector UV para o extrato hidroetanlico das folhas de Bauhinia microstachya....................................................................53 FIGURA 47: Espectro de RMN de H1 da apigenina............................................................55 FIGURA 48: Espectro de RMN de C13 da apigenina..........................................................55 FIGURA 49: Estrutura do 5,6-dihidrxi-7-metxiflavona-6-O--D-xilopiranosdeo.........59 FIGURA 50: Estrutura da flavanona e dihidrodibenzoxepina isoladas das razes de Bauhinia variegata................................................................................................................60 FIGURA 51: Estrutura da luteolina 4-O--D-glucopiranosdeo e do cido indol-3-

carboxlico.............................................................................................................................60 FIGURA 52: Estrutura dos aminocidos metionina, leucina e prolina................................61

FIGURA 53: Estrutura dos flavonides canferol e 7-O--L-ramnopiranosilcanferol isolados das folhas e flores de Bauhinia forficata respectivamente.....................................61 FIGURA 54: Estrutura dos flavonis quercetina-3-arabinosdeo e isoramnetina-3glucosdeo isolados das folhas de Bauhinia ungulata e Bauhinia pentandra

respectivamente.....................................................................................................................62 FIGURA 55: Estrutura do galato de metila e hexatriacontano............................................62 FIGURA 56: Estrutura do monoterpeno -pineno e do sesquiterpeno -cariofileno..........63 FIGURA 57: Estrutura dos alcalides harmano e eleagnina...............................................63 FIGURA 58: Estrutura da campferitrina..............................................................................64 FIGURA 59: Estrutura dos flavonis 6,8-di-C-metilcanferol-3-metil ter e afzelina.........65 FIGURA 60: Estrutura do cido glico e da catequina........................................................66 FIGURA 61: Estrutura do estigmasterol e do cido glutmico...........................................66 FIGURA 62: Estrutura da bauhinoxepina e do bauhinol E.................................................67 FIGURA 63: Estrutura dos cidos linolico e palmtico.....................................................68 FIGURA 64: Estrutura da pacharina e da bauhiniastatina 1...............................................68 FIGURA 65: Estrutura do antociano delfinidina................................................................69 FIGURA 66: Estrutura do isoacteosdeo.............................................................................70 FIGURA 67: Estrutura do galactosdeo de quercetina e ramnosdeo de miricetina isolados das folhas de Bauhinia longifolia..........................................................................................73 FIGURA 68: Fluxograma da metodologia empregada........................................................77 FIGURA 69: Folha de Bauhinia longifolia.........................................................................78 FIGURA 70: Bauhinia longifolia em fase de florao........................................................79 FIGURA 71: Fraes cromatogrficas obtidas pelo agrupamento de acordo com o perfil cromatogrfico por CCD.......................................................................................................82 FIGURA 72: Anlise qualitativa da atividade antioxidante das amostras de 1 9.............83 FIGURA 73: Anlise qualitativa da atividade antioxidante das fraes 10 19................84 FIGURA 74: Cromatograma obtido para a frao nmero 3...............................................86 FIGURA 75: Espectro de massa do composto referente ao (+) espatulenol....................87 FIGURA 76: Cromatograma obtido para a frao nmero 5...............................................87 FIGURA 77: Espectro de massa do composto tocoferol...............................................88 FIGURA 78: Cromatograma obtido para a frao nmero 8...............................................89

FIGURA 79: Espectro de massa do diterpeno fitol.............................................................90 FIGURA 80: Cromatograma obtido para a frao nmero 12 ...........................................90 FIGURA 81: Espectro de massa do composto (22R,24S) - 22,24 dimetilcolesterol........91

Lista de Tabelas

TABELA 1: Intervalo de freqncia de absoro de alguns grupos funcionais no IV........52 TABELA 2: Rendimento dos processos de extrao e fracionamento cromatogrfico.......80 TABELA 3 : Massa e rendimento das fraes obtidas pelo fracionamento cromatogrfico do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia.........................................................81 TABELA 4: Resultados da anlise qualitativa da atividade antioxidante das fraes cromatogrficas e do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia...........................85 TABELA 5: Compostos majoritrios caracterizados por CG-EM das amostras com potencial antioxidante...........................................................................................................91

Lista de Quadros

QUADRO 1: Classes de alcalides derivados de aminocidos............................................21 QUADRO 2 : Classes de terpenides...................................................................................27

Lista de Abreviaturas, Siglas e Smbolos g/mL - Micrograma por Mililitro m - Micrmetro C - Graus Celsius ABS - Absorbncia AcOEt - Acetato de Etila BLC1FR - Frao obtida pelo fracionamento cromatogrfico do extrato bruto das folhas de Bauhinia longifolia BuOH - Butanol C6-C3 - Unidade Fenilpropnica C13 - Carbono com 13 prtons CaCO3 - Carbonato de Clcio CeSO4 - Sulfato Crico CI50 - Concentrao Inibitria 50 g/ml CCD - Cromatografia em Camada Delgada CG-EM - Cromatografia Gasosa acoplado Espectrometria de Massa CIT/SC - Centro de Informaes Toxicolgicas de Santa Catarina CLAE - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia CLAE-UV - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia acoplado Ultravioleta cm Centmetro COX Ciclooxigenase DCM Diclorometano DNA - cido Desoxirribonuclico DPPH - 1,1-diphenil-2-picrylhydrazil EBFBL - Extrato Bruto das Folhas de Bauhinia longifolia EEF - Extrato Etanlico das Folhas EtOH Etanol eV - Eltron volts g - Grama

H1 - Ncleo de Hidrognio HEX - Hexano HSCN - cido tiocinico ICB - Instituto de Cincias Biolgicas IV Infravermelho m - Metro m/z - Razo massa-carga mg/kg - Miligrama por Quilograma mL - Mililitro mm - Milimetro mM - Micro Molar MAO - Monoamino-oxidase MeOH Metanol Min - Minuto NCI - National Cancer Institute nm - Nanmetro OH- - on Hidroxila PAL - Phenilalanine Amonium Liase ppm - Partes por Milho pH - Potencial Hidrogeninico Rt Tempo de Reteno Rf - Fator de Reteno RMN - Ressonncia Magntica Nuclear RNA - cido Ribonuclico s - Segundo SNC - Sistema Nervoso Central SUS - Sistema nico de Sade UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais UV - Ultravioleta v/v - Volume por volume

Resumo: As espcies do gnero Bauhinia so de grande interesse teraputico, sendo vrias atividades biolgicas a elas atribudas. Bauhinia longifolia uma espcie com poucos estudos cientficos publicados. No presente trabalho o potencial antioxidante das fraes cromatogrficas e do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia foi avaliado frente ao radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH). Oito amostras apresentaram atividade antioxidante, a caracterizao qumica destas por CG-EM revelou a presena dos terpenos (+) espatulenol e fitol, o lipdio 22,24-dimetilcolesterol e o caroteno tocoferol, uma vitamina do complexo E, tal composto foi isolado. A atividade antioxidante de Bauhinia longifolia sobre o DPPH pode ser atribuda presena dos metablitos caracterizados, tal espcie mostrou-se uma interessante fonte de substncias antioxidantes.

Palavras-chave: Potencial antioxidante, Bauhinia longifolia, caracterizao qumica, CGEM.

Abstract: The species of the genus Bauhinia have a great therapeutic interest, being several biological activities attributed to them. Bauhinia longifolia is a specie with few scientific studies published. In the present work the antioxidant potential of the chromatographics fractions and of the ethanolic extract of the leaves of Bauhinia longifolia was evaluated on the 1,1-diphenil-2-picrylhydrazil (DPPH) radical. Eight samples presented antioxidant activity, the chemical characterization of these for GC-MS revealed the presence of the terpenos (+) spathulenol and phytol, the lipid 22,24-dimethylcholesterol and the carotene - tocopherol, a vitamin of the complex E, this compound was isolated. The antioxidant activity of Bauhinia longifolia on the DPPH can be attributed to the presence of the compounds characterized, such specie was shown an interesting source of antioxidant substances.

Key-words: Antioxidant potencial, Bauhinia longifolia, chemical caracterization, GC-MS.

1 - INTRODUO
Os vegetais representam grande importncia, sendo a base da cadeia alimentar, alm de produtores do oxignio necessrio ao processo de respirao de todos os organismos aerbicos. Tanta importncia atribuda aos vegetais se deve a sua capacidade em realizar o processo de fotossntese (RAVEN et al., 2001). Algumas espcies vegetais so tambm de grande interesse teraputico, visto que produzem substncias que so biologicamente ativas, sendo por esse motivo empregadas no tratamento de diversas enfermidades (PEDROSA, YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Desde a antigidade as plantas vm sendo utilizadas como recurso teraputico, sendo em muitas das vezes o nico recurso disponvel populao, principalmente de pases subdesenvolvidos (PINTO et al., 2004). Apesar do grande desenvolvimento tecnolgico atual o qual tem permitido a sntese de frmacos cada vez mais eficazes, o uso de plantas medicinais (como so conhecidas popularmente) se faz ainda presente no cotidiano de vrias pessoas (VEIGA JUNIOR, PINTO & MACIEL, 2005). Dentre as atividades biolgicas atribudas a certas espcies vegetais e de interesse indstria farmacutica cita-se: hipoglicemiante, hipocolesterolemiante, analgsica e antioxidante, sendo esta ltima determinante no processo de evoluo de doenas como o diabetes e o cncer (DAMASCENO et al., 2002) sendo freqente a realizao de estudos cientficos nos quais o potencial antioxidante de espcies vegetais avaliado. A realizao de estudos com espcies vegetais de extrema importncia devido ao grande emprego destas, e permite validar e assegurar seu uso correto, sendo os conhecimentos cientfico e popular complementares (SIXEL & PECINALLI, 2005). Dentre as espcies vegetais largamente utilizadas com finalidade teraputica cita-se as espcies do gnero Bauhinia as quais so empregadas principalmente no tratamento do diabetes, sendo sua atividade hipoglicemiante comprovada em vrios estudos (da SILVA & CECHINEL-FILHO, 2002). Devido presena de flavonides em diversas espcies do gnero Bauhinia (PIZZOLATTI et al., 2003) e o potencial destes como antioxidantes, muitas destas esto sendo avaliadas em ensaios antioxidantes, tendo sido satisfatrios os resultados obtidos.

Bauhinia longifolia, uma espcie do gnero Bauhinia, foi foco do presente estudo no qual o potencial antioxidante das fraes cromatogrficas e do extrato etanlico de suas folhas foi avaliado.

1.1 - OBJETIVOS
Geral Avaliar o potencial antioxidante do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia, bem como das fraes obtidas pelo seu fracionamento cromatogrfico.

Especficos

I)

Fracionar o extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia utilizando a cromatografia lquida em coluna;

II) III)

Testar o potencial antioxidante do extrato etanlico e das fraes obtidas; Caracterizar as fraes que apresentarem atividade antioxidante, utilizando a

cromatografia em fase gasosa acoplada espectrometria de massa (CG-EM).

1.2 - JUSTIFICATIVA
Considera-se de grande importncia a realizao do presente estudo devido aos seguintes fatores:

I)

Grande interesse cientfico das espcies do gnero Bauhinia;

II)

Bauhinia longifolia ser uma espcie com poucos estudos cientficos publicados;

III)

A pequena quantidade de estudos que correlacionem os compostos qumicos isolados de espcies do gnero Bauhinia e suas respectivas atividades biolgicas;

IV)

A importncia da busca por substncias com potencial antioxidante.

2 REFERENCIAL TERICO

2.1 - Os vegetais como fonte de compostos biologicamente ativos Do metabolismo vegetal resulta uma variedade enorme de substncias que em muitas das vezes exercem alguma atividade biolgica sobre o organismo, como observado no caso da morfina (1) que um alcalide que atua sobre o sistema nervoso central provocando reaes alucingenas, alm de atuar como analgsico (PEREDAMIRANDA, TAKETA & VILLATORO-VERA, 2007). Segundo Nordari & Guerra (2007) devido grande diversidade vegetal grande a possibilidade de obteno de produtos de interesse teraputico. Substncias que atuam sobre o organismo causando algum tipo de reao so denominadas biologicamente ativas e so em muitos casos empregadas como recurso teraputico no tratamento de enfermidades diversas.

HO

O H HO
1
Fonte: Pereda-Miranda, Taketa & Villatoro-Vera, 2007.

N H H CH3

FIGURA 1 : Estrutura da morfina, um alcalide.

Devido essa variedade de substncias oriundas do metabolismo dos vegetais estes tm sido frequentemente utilizados como fonte de compostos biologicamente ativos, conforme apontado por da Silva & Cechinel-Filho (2002), cerca de 25% dos frmacos empregados na teraputica so de origem vegetal sendo o restante de origem sinttica e destes, 50% relacionados aos princpios isolados de vegetais.

Segundo Pedrosa, Yunes & Cechinel-Filho (2001) comumente compostos biologicamente ativos isolados de vegetais so empregados como prottipos para a sntese qumica de frmacos. Diversos so os princpios ativos isolados de vegetais que aps a sntese qumica e modificao estrutural passam a ser utilizados como frmacos, como exemplo cita-se o cido saliclico extrado do salgueiro (Salix alba) que atravs da modificao estrutural onde acrescentado um grupo acetil torna-se o cido acetil saliclico o primeiro frmaco sinttico e mais bem sucedido comercialmente. Mesmo com o grande avano de reas como a qumica orgnica e a biologia molecular que contribuem significativamente na sntese de frmacos, observa-se ainda vrios frmacos obtidos a partir de matrias-primas vegetais, dentre estes a digoxina obtida de Digitalis purpurea , a atropina obtida de Atropa belladonna e a vincristina e vimblastina obtidas de Catharanthus roseus (SCHENKEL, GOSMANN & PETROVICK, 2007). O interesse farmacutico dos vegetais enorme, sendo assim, estudos com espcies vegetais que possivelmente produzam compostos biologicamente ativos so muito freqentes, em especial os screenings, nos quais so avaliadas milhares de espcies, tais estudos contribuem para a descoberta de novos princpios ativos os quais podem vir a se tornar frmacos bem sucedidos, como exemplo cita-se o importante trabalho desenvolvido por pesquisadores do National Cancer Institute (NCI) dos Estados Unidos que descobriram duas substncias com potencial ao sobre o cncer, tais compostos foram denominados paclitaxel (2) e camptotecina (3) e foram isoladas das espcies Taxus brevifolia e

Camptotheca acuminata respectivamente (BARREIRO & FRAGA, 2008).

H 3C O O O N H OH O HO O O H 3C CH3 O CH3 H O O O O CH3 OH

O N N O H3C O OH

Fonte: Barreiro & Fraga, 2008.

FIGURA 2: Estrutura do paclitaxel e da camptotecina.

As plantas so largamente empregadas na medicina popular sendo em muitas das vezes o nico recurso teraputico do qual a populao dispe, o que se deve fcil obteno das mesmas, porm na maioria das vezes estas so empregadas

indiscriminadamente e com pouca ou nenhuma comprovao cientfica de sua atividade. O fato de os metablitos vegetais serem de origem natural leva a um equivocado pensamento de que os mesmos no so txicos ao organismo, no entanto a toxicidade de plantas medicinais um caso de sade pblica e deve ser encarado como tal, como exemplo da toxicidade provocada por vegetais cita-se o efeito hepatotxico e carcinognico causado pelo uso interno do confrei (Symphytum officinale) (VEIGA-JNIOR, PINTO & MACIEL, 2005). Casos de intoxicao com vegetais so mais freqentes do que se imagina, conforme apontado por Schenkel et al. (2007), entre o ms de maio do ano de 1984 ao ms de dezembro do ano de 1997 no Centro de Informaes Toxicolgicas de Santa Catarina (CIT/SC) foram registrados 691 casos de intoxicao com espcies vegetais, nmero que acredita-se ser bem maior, visto que muitos casos de intoxicaes no so levados aos hospitais, dentre as espcies envolvidas em casos de intoxicao as mais freqentes so as espcies do gnero Dieffenbachia conhecidas popularmente por comigoningum-pode. prtica na qual as plantas so utilizadas como recurso teraputico d-se o nome de fitoterapia, uma prtica teraputica complementar em expanso no Brasil sendo inclusive implantada no sistema pblico de sade de vrias cidades, Arujo (2002) cita a bem sucedida implantao da fitoterapia no Sistema nico de Sade (SUS) da cidade de Londrina no estado do Paran. O Brasil, pas com maior biodiversidade vegetal do mundo (DIAS, 1996) esperarse-ia que fosse um dos pases de maior destaque na produo de medicamentos base de vegetais (fitoterpicos), porm tal fato no observado segundo Pedrosa, Yunes & Cechinel Filho (2001) devido falta de incentivo poltico e financeiro, falta de interao de diferentes reas do conhecimento, que necessrio no desenvolvimento de pesquisas e a filosofia de algumas indstrias nacionais que visam primariamente o lucro imediato e no a competitividade nvel internacional, levando ao fraco desempenho do pas no mercado fitoterpico mundial.

O desempenho crtico do Brasil no mercado farmacutico mundial retratado por Bermudez (1995) que aponta que cerca de 84 % dos frmacos comercializados no pas so importados e que 78% da produo brasileira feita por multinacionais. Para que um fitoterpico seja bem utilizado necessrio ter sua eficcia, segurana e qualidade validadas, o que segundo Sixel & Pecinalli (2005) pode ser conseguido com a realizao de estudos farmacolgicos. Porm observa-se que o uso de fitoterpicos no Brasil se d predominantemente no uso popular das plantas medicinais que so frequentemente comercializadas sem o padro de qualidade exigido, principalmente em feiras e mercados populares, alm disso, a maioria das plantas utilizadas trata-se de espcies exticas as quais so desconhecidas dos povos ocidentais (VEIGA JUNIOR, PINTO & MACIEL, 2005; PEDROSA, YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Segundo Bara et al. (2006) comum o comrcio de espcies vegetais sob diferentes formas, desde p solues hidroalcolicas (tinturas), porm sem a devida padronizao, sendo freqente produtos que apresentam teores de princpios ativos abaixo do padro estabelecido, o que compromete sua eficcia, sendo assim a realizao da anlise do teor de princpios ativos de vegetais de grande importncia afim de validar sua segurana e eficincia enquanto produto farmacutico. O extrato padronizado de Ginkgo biloba o fitoterpico mais vendido no mundo (PINTO et al., 2004), tal espcie apresenta flavonides como princpio ativo, a anlise de 13 (treze) amostras comerciais desta espcie quanto ao teor de flavonides revelou que apenas 3 (trs) mostraram-se dentro do padro estabelecido, as amostras restantes mostraram um teor de flavonide abaixo do estabelecido pela legislao (BARA et al.; 2006). Dentre os fatores que interferem na qualidade das matrias-primas vegetais cita-se a incorreta realizao das etapas do processamento destas, etapas como a coleta, secagem e armazenamento dos vegetais devem ser realizadas seguindo-se alguns cuidados e orientaes, como exemplo cita-se a coleta de espcies ricas em leos volteis e alcalides que deve ser realizada no perodo da manh e espcies ricas em glicosdeos no perodo da tarde (REIS & MARIOT, 2000) e a secagem de espcies ricas em cumarinas que deve ser realizada sombra devido a fototoxicidade destas (KUSTER & ROCHA, 2007). A realizao incorreta de uma ou mais etapas do processamento do material vegetal pode levar ao comprometimento de sua qualidade e eficcia.

2.2 - Metabolismo Secundrio Vegetal Todas as espcies vegetais atravs do processo da fotossntese produzem substncias, como os carboidratos, as protenas, os cidos nuclicos e os lipdios , estas substncias so resultantes do metabolismo primrio e so necessrias sobrevivncia do vegetal. Alm das macromolculas sintetizadas pelos vegetais, h tambm uma gama de substncias as quais no esto diretamente ligadas sobrevivncia destes mas so de extrema importncia sendo responsveis pela interao ecolgica do vegetal com outros organismos, essas substncias so resultantes do chamado metabolismo secundrio e desempenham diferentes funes, desde a proteo contra o ataque de predadores at a atrao de organismos polinizadores e dispersores de sementes ( VON POSER & MENTZ, 2007). Do metabolismo secundrio vegetal resultam substncias pertencentes diferentes classes qumicas dentre as quais cita-se: flavonides, alcalides, taninos, cumarinas, terpenos, quinonas, dentre outras. Os metablitos secundrios so encontrados geralmente em pequenas concentraes no vegetal, e muitas das vezes so biologicamente ativos, exercendo algum tipo de atividade biolgica sobre o organismo humano, sendo assim o interesse farmacutico em tais substncias imenso, sendo vrias as espcies vegetais utilizadas popularmente como teraputicas (dos SANTOS, 2007). Antes acreditava-se que os metablitos secundrios eram meros subprodutos do metabolismo primrio. H uma diversidade muito grande de metablitos secundrios e as respectivas funes atribudas a estes, como exemplo cita-se os flavonides que atuam na proteo dos vegetais contra a radiao solar, os taninos que atuam como dissuadores alimentares e os terpenos e pigmentos como as antocianinas que atuam atraindo organismos polinizadores (VON POSER & MENTZ, 2007). Segundo dos Santos (2007) todos os metablitos so sintetizados a partir do metabolismo da glicose atravs de dois intermedirios biossintticos principais (Figura 3) o cido chiqumico e o acetato, o primeiro origina os aminocidos aromticos os quais so precursores de metablitos como as cumarinas, as lignanas, as ligninas alm de algumas classes de alcalides, a partir do acetato atravs de trs vias principais so produzidos metablitos como os terpenides, os esterides, algumas classes de alcalides, dentre

outros, h tambm metablitos que resultam da combinao desses dois intermedirios, como exemplo cita-se os flavonides, os taninos condensados e as antraquinonas.
Polissacardeos Glicose Heterosdeos

cido Chiqumico
O OH

Acetil CoA
O

Antraquinonas, Flavonides e Taninos Condensados

HO OH OH

HO CoAS O

Triptofano
O

OH

Fenilalanina/Tirosina
O OH NH2 O OH HO NH2

Via Mevalonato cido Glico

O OH

Condensao Ciclo do cido Ctrico

NH2 N H

HO OH

OH

c. Graxos e Acetogeninas Ornitina e Lisina

O

Isoprenides
OH

Protoalcalides, Iso e Benzil isoquinolnicos

cido Cinmico
H2N NH2

Taninos Hidrolisveis Fenilpropanides

O NH2 HO NH2

Lignanas, Ligninas e Cumarinas

Terpenides e Esterides

Alcalides pirrolidnicos, tropnicos, pirrolizidnicos, piperidnicos e quinolizidnicos

Fonte: Adaptado de dos Santos, 2007.

FIGURA 3 : Origem biossinttica dos metablitos secundrios.

Os metablitos secundrios so produzidos em determinados estgios de desenvolvimento e so caractersticos de cada espcie vegetal. Geralmente so sintetizados em uma determinada parte da planta e armazenado em outra, predominantemente dentro dos vacolos (RAVEN et al., 2001). As rotas metablicas dos metablitos secundrios talvez sejam ativadas somente em algumas fases do desenvolvimento e crescimento do vegetal ou em perodo de estresse, como a produo de taninos que em algumas espcies s ocorre at a fase de total desenvolvimento da semente, sendo depois extinta , e a sntese de flavonides que ativada principalmente quando a planta sofre um estresse devido ao excesso de radiao solar (MANN, 1987). De acordo com Robbers et al. (1996) a produo dos metablitos secundrios governada por genes sendo por isso diretamente influenciada pela hereditariedade, estgio de desenvolvimento e principalmente fatores ambientais. Um exemplo marcante da influncia de fatores externos sobre a produo de metablitos secundrios trata-se da enzima fenilalanina amonialiase (PAL) a qual essencial na produo do cido cinmico precursor de vrios metablitos fenlicos. A ao desta enzima est sob influncia de fatores como hormnios, disponibilidade nutricional, luz, infeco por fungos e leses, observa-se que quando o vegetal atacado por fungos a sntese da PAL aumentada resultando consequentemente no aumento da produo de compostos fenlicos (dos SANTOS, 2007). Dentre os fatores ambientais que interferem na produo de metablitos secundrios destaca-se : sazonalidade, altitude, radiao ultravioleta, ritmo circadiano, disponibilidade hdrica, ndice pluviomtrico, disponibilidade de nutrientes no solo, poluio atmosfrica, estmulos mecnicos e ataques por patgenos (Figura 4). Como exemplo cita-se a variao dos metablitos secundrios em uma mesma espcie cultivada em diferentes locais (sazonalidade), a maior produo de flavonides devido ao aumento da altitude, o aumento da sntese de flavonides devido ao aumento da incidncia de radiao ultravioleta (radiao solar), a concentrao de alguns leos volteis que varia nos diferentes perodos do dia (ritmo circadiano), o estresse causado pela falta de gua (disponibilidade hdrica) que pode levar ao aumento na sntese de flavonides, ataques por patgenos freqentemente levam a um aumento na sntese de metablitos utilizados como defesa pelo

vegetal. A composio qumica do solo e a disponibilidade de nutrientes tambm influem na composio e concentrao de metablitos secundrios, observa-se que quando h abundncia de nitrognio no solo h uma diminuio na produo de compostos fenlicos. Um fator no ambiental que influencia na produo e acmulo dos metablitos secundrios o estgio de desenvolvimento do vegetal, h metablitos que so produzidos somente em determinadas fases da vida do vegetal (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
Sazonalidade Altitude Radiao Solar

Disponibilidade de Nutrientes

Poluio Atmosfrica

Produo de Metablitos Secundrios

Ritmo Circadiano

Temperatura

ndice Pluviomtrico
Fonte: Gobbo-Neto & Lopes, 2007.

Estmulos Mecnicos e Ataque por Patgenos

Disponibilidade Hdrica

FIGURA 4 : Fatores ambientais que interferem na produo de metablitos secundrios. Compostos biologicamente ativos so predominantemente resultantes do

metabolismo secundrio, o que justifica o grande interesse teraputico destes, porm alguns metablitos primrios tem sido atribudo atividade biolgica, como as atividades antitumoral, anticoagulante, hipoglicemiante e imunoestimulante atribudas a alguns polissacardeos (VON POSER, 2007), bem como as atividades antioxidante, laxante e fungisttica apresentadas por determinados tipos de lipdios (MOYNA & HEINZEN, 2007).

2.2.1 Flavonides Os flavonides representam uma classe de metablitos secundrios vegetais com grande variedade estrutural, sendo conhecidos mais de 4200 flavonides, em sua maioria heterosdeos. So biossintetizados a partir da via dos fenilpropanides. No vegetal atuam principalmente na proteo contra a radiao ultravioleta (UV) , como antioxidantes, na atrao de polinizadores, na proteo contra predadores e na alelopatia (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007). Os flavonides so os compostos fenlicos de maior ocorrncia nos vegetais, muitos apresentam-se como pigmentos hidrossolveis. Devido colorao que conferem rgos como as flores atuam atraindo agentes polinizadores. Ocorrem na maioria das espcies vegetais lhes sendo de extrema importncia pois bloqueiam a radiao UV extrema a qual destri estruturas essenciais sua vida como os cidos nucleicos e as protenas (RAVEN et al., 2001). A figura 5 mostra o ncleo fundamental dos flavonides e sua numerao.

6'
O

B 2'

4'

A 5 10

C
O

2 3

Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

FIGURA 5: Ncleo fundamental dos flavonides.

Os flavonides ocorrem sob diversas formas estruturais (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007) as quais so apresentadas abaixo. Flavonas, flavonis e seus O-heterosdeos so os tipos de flavonides mais

abundantes no reino vegetal. As flavonas apresentam como estrutura bsica a 2fenilcromona (4) e so encontradas em quase todo o reino vegetal predominantemente sob a forma heterosdica (ligado um acar), as flavonas mais abundantes so a apigenina (6) e

luteolina (7). Os flavonis apresentam como estrutura bsica a 3-hidrxi-2-fenilcromona (5), sendo canferol, quercetina, miricetina seus representantes mais comumente encontrados nos vegetais. Os flavonides O-heterosdeos so aqueles nos quais as ligaes osdicas (ligao entre o acar e a aglicona) se d entre o carbono do acar e o oxignio das hidroxilas da aglicona.
OH

HO

O R

OH O
OH O

5
Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

(6) onde R=OH 7

FIGURA 6: Estrutura da 3-hidrxi-2-fenilcromona, apigenina e luteolina. Flavonides C-heterosdeos apresentam ligao osdica entre o primeiro carbono

do acar e os carbonos 6 e/ou 8 do anel A da aglicona, ao contrrio dos O-heterosdeos, quando hidrolisados em meio cido a ligao osdica no rompida. A figura 7 mostra a estrutura da vitexina (8) uma flavona C-heterosdica.
HO OH OH

O OH HO O

OH

OH

O 8

Fonte: Bianco & Santos, 2005

FIGURA 7: Estrutura da vitexina, um flavonide C-heterosdeo.

Antocianos representam um importante grupo de pigmentos ocorrentes em

diversas espcies vegetais conferindo cor caractersticas suas flores e frutos, atuando na atrao de agentes polinizadores e dispersores de sementes. Quando encontrados sob a forma de geninas (sem estar ligado acares) so denominados antocianidinas, porm so mais estveis sob a forma de heterosdeos, donde so denominados antocianosdeos. Muitos antocianos so empregados como aditivos alimentares. O ction flavlico (9) o ncleo fundamental dos antocianos, a malvidina (10), um antociano de grande ocorrncia na natureza.
OH HO O
+

OCH 3 OH HO O
+

OH OH

OCH 3 OH OH

9
Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

10

FIGURA 8: Ncleo fundamental dos antocianos e estrutura da malvidina.

Chalconas

apresentam o 1,3-diarilpropano (11) como ncleo fundamental,

apresentam como caracterstica a colorao amarela que em pH bsico torna-se vermelha. Assim como os antocianos as chalconas atuam na atrao de insetos e/ou pssaros que promovem a polinizao. So encontradas predominantemente nas flores embora possam ocorrer em outras partes do vegetal. comum sob certas condies as chalconas se isomerizarem em flavanonas. A ocanina (12) um exemplo de chalcona.
OH OH HO OH OH

11

Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

12

FIGURA 9: Ncleo fundamental das chalconas e estrutura da ocanina.

Auronas apresentam o 2-benzilidenocumaranona (13) como ncleo fundamental,

recebendo essa denominao devido colorao dourada caracterstica. Apresentam isomeria geomtrica, ocorrendo predominantemente sob a configurao Z donde so chamadas de Z-auronas. A sulfuretina (14) exemplifica uma aurona.
OH

OH HO

13
O

Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

14

FIGURA 10: Ncleo fundamental das auronas e estrutura da sulfuretina.

Di-hidroflavonides so representados pelas flavanonas (15), os flavanonis (16)

e as di-hidrochalconas (17). As flavanonas apresentam ncleo fundamental semelhante ao das flavonas (4) porm sem a ligao dupla entre os carbonos 2 e 3. Os flavanonis apresentam como ncleo fundamental a 3-hidrxiflavanona. As di-hidrochalconas apresentam um ncleo fundamental semelhante ao das chalconas (11), porm sem a ligao dupla entre os carbonos e , nos vegetais desempenham a funo de protetor contra doenas causadas por microorganismos, alm de dissuadores alimentares.

R O
(15) onde R=OH 15
Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

16

17

FIGURA 11: Ncleo fundamental das flavanonas, flavanonis e di-hidrochalconas.

Isoflavonides apresentam cadeias do tipo difenil-1,2-propano.Ocorrem

predominantemente em espcies vegetais da famlia Fabaceae, nos vegetais atuam principalmente como fitoalexinas (substncias que so produzidas pelos vegetais como resposta infeco causada por patgenos). Apresentam uma variedade estrutural muito grande, a figura 12 mostra a estrutura bsica das isoflavonas (18), dos rotenides (19) e dos pterocarpanos (20), exemplos de isoflavonides comuns.

O O

O
18
Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

O
19

O
20

FIGURA 12 : Estrutura bsica das isoflavonas, dos rotenides e dos pterocarpanos.

Neoflavonides apresentam 15 tomos de carbono em sua estrutura, ocorrem sob

pequena variedade estrutural, destacando-se as 4-arilcumarinas (21), os 3-arilbenzofuranos (22) e as dalbergionas (23).

O
O

H3CO

O
O

H3CO
O

HO CH3
21
Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

22

23

FIGURA 13 : Estrutura bsica das 4-arilcumarinas, 3-arilbenzofuranos e dalbergionas.

Biflavonides apresentam-se sob a forma de dmeros geralmente de flavonas e

flavanonas, ocorrendo predominantemente como geninas. Ocorrem com abundncia nos vegetais, acredita-se que atuando como antifngicos ou dissuadores alimentares. A figura 14 apresenta a estrutura bsica das amentoflavonas (24) e agatisflavonas (25), exemplos de biflavonides .
HO

OH OH HO O HO O

OH OH

OH

O OH O

HO

OH

24
Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

25

FIGURA 14: Estrutura bsica das amentoflavonas e agatisflavonas.

As caractersticas fsico-qumicas dos flavonides so dependente do seu tipo, as agliconas ocorrem sob a forma de cristais amarelos sendo preferencialmente solveis em solventes orgnicos apolares, os heterosdeos so na maioria das vezes hidrossolveis (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007). Vrias atividades biolgicas so atribudas aos flavonides, sendo assim diversas espcies vegetais ricas em tais metablitos secundrios tm sido empregadas como recurso teraputico, segundo Silva et al. (2007a) as principais fontes de flavonides so: frutas, sucos, vegetais, vinho tinto, chocolate e os chs verde e preto. Dentre as atividades biolgicas atribudas aos flavonides cita-se: atividade antioxidante, alguns flavonides atuam na proteo das clulas contra o estresse oxidativo, provocado por exemplo pela peroxidao de lipdios (de SOUZA et al., 2004), a atividade antioxidante atribuda aos flavonides provm principalmente da sua capacidade de doar eltrons aos radicais livres, causando a reduo destes (SILVA et al., 2005).

Estudos tm revelado a atividade antiinflamatria apresentada por certos flavonides, tal atividade atribuda principalmente inibio da enzima cicloxigenase (COX), dentre os flavonides com potencial antiinflamatrio cita-se a apigenina (6) e a quercetina (27). alguns flavonides tem sido atribudo atividade antitumoral, percebe-se uma estreita relao entre a incidncia de cncer de colo, tero e ovrio que menos frequente em pases da sia e da Europa, tal fato tem sido atribudo dieta alimentar rica em flavonides nestes pases. Alguns flavonides tm apresentado atividade sobre a permeabilidade capilar, sendo utilizados em casos de hipertenso (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007). A figura 15 apresenta a estrutura de flavonides biologicamente ativos, como a quercetina (27), que apresenta atividades antioxidante e antitumoral, a 5,7,3-triidrxi3,6,4-trimetxiflavona (28) que apresenta atividade antiinflamatria e a quercitrina (26) que apresenta atividade antiviral.
OH HO O OH Ramnose O OH O
H3CO OH O OCH 3 HO O OH OCH 3

(26) onde Ramnose = H 26

Fonte: Zuanazzi & Montanha, 2007.

27 Estrutura da quercitrina , quercetina e

28 5,7,3-triidrxi-3,6,4-

FIGURA

15:

trimetxiflavona.

2.2.2 Alcalides Dentre todas as classes de metablitos secundrios, os alcalides representam a classe de maior interesse farmacutico. Conforme apontado por Barreiro & Fraga (2008) tais metablitos apresentam atividades biolgicas diversas e por isso originaram diferentes frmacos, como o Taxol

e o Reminyl

originados dos alcalides paclitaxel (2) e

galantamina (29) respectivamente, sendo que o primeiro empregado no tratamento do cncer enquanto o segundo atua como inibidor da enzima acetilcolinesterase.
H3CO

N O

CH3

OH 29
Fonte: Barreiro & Fraga, 2008.

FIGURA 16: Estrutura da galantamina.

Os alcalides so compostos nitrogenados farmacologicamente ativos, empregados desde a antigidade para as mais diversas finalidades, inclusive como veneno em execues, como a do filsofo Scrates que foi executado pela ingesto de uma bebida contendo o alcalide coniina. Quando o tomo de nitrognio do alcalide encontra-se em um anel heterocclico estes so chamados de alcalides verdadeiros, por sua vez quando o tomo de nitrognio encontra-se fora do anel heterocclico so chamados protoalcalides, j os alcalides que no so derivados de aminocidos so chamados de pseudoalcalides (HENRIQUES et al., 2007). Os alcalides podem ser encontrados em qualquer parte do vegetal, em geral so produzidos em um determinado rgo e armazenado em outro, sendo armazenados predominantemente dentro de vacolos. Nos vegetais atuam principalmente na proteo contra predadores e patgenos. H vrios precursores de alcalides porm a maior parte destes so derivados de aminocidos (HENRIQUES et al., 2007). O quadro 1 apresenta as classes de alcalides derivados de aminocidos.

Classe
Quinolnico

Precursor
HO H

Exem plo/Nom e
H N

Triptofano
H3C

O N

Quinina

Indlico

Triptofano

Reserpinina
OH HO H

N H H O O

N H O

Pirrolizidnico

Ornitina
N
N CH3

Retronicina

Tropnico

Ornitina

Atropina
O
O H

OH
O

Fenantroindolizidnico

Ornitina
O O

Tiloforina

H O

Pirrolidnico

Ornitina
H O

Higrina

CH3

O H

Piridnico

Fenilalanina
N O H O

Telenina

Continuao do quadro 1.

Piperidnico

Lisina

Coniina
OH H

N H

Q uinolizidnico

Lisina
N

Lupinina

N Im idazlico Histidina Pilocarpina N

H N N
HO O H HO N

Piridnico

cido Asprtico

Nicotina

Diidroindlico

Tirosina

Betanidina
O O H N H

O O H

O N O H H H HN O O

Isoquinolnico

Tirosina

Em etina

Fonte: Henriques et al. 2007

QUADRO 1: Classes de alcalides derivados de aminocidos.

Dentre as diversas classes de alcalides destacam-se os alcalides tropnicos, indlicos, pirrolizidnicos e esteroidais, os quais so apresentados a seguir. Alcalides tropnicos apresentam o tropano 8-metil-8-azabiciclo [3,2,1] octano

como estrutura bsica, ocorrem principalmente nas famlias Solanaceae e Erythroxylaceae. Os alcalides trpanicos exercem ao principalmente sobre o sistema nervoso central (SNC), sendo em muitas das vezes txicos. Devido s propriedades biolgicas que exercem sobre o organismo, vrios alcalides tropnicos so empregados na teraputica principalmente como anestsicos locais e antdotos em casos de envenenamentos por substncias que atuam na inibio da acetilcolinesterase. Dentre os principais alcalides tropnicos cita-se a atropina (Quadro 1), a escopolamina (30) e a cocana (31) que um potente estimulante do SNC sendo por isso utilizada como alucingeno (BACCHI, 2007).

CH3

H 3C

O COCH3

O
O C O H

30
Fonte: Bacchi, 2007.

31

FIGURA 17: Estrutura da escopolamina e da cocana.

Alcalides indlicos apresentam em comum o ncleo indlico (Figura 18) so

classificados em dois tipos, alcalides indlicos monoterpnicos e os demais alcalides. So encontrados predominantemente nas famlias Apocynaceae, Rubiaceae e Loganaceae. Plantas nas quais so encontrados alcalides indlicos so na maioria das vezes consideradas txicas devido s atividades biolgicas apresentadas por estes. Dentre os alcalides indlicos biologicamente ativos destaca-se a harmina (32), empregada como alucingeno, a iombina (34) que age sobre o sistema cardiovascular, sendo utilizado em casos de impotncia sexual e a elipticina (33) que inibe a sntese de DNA, RNA e consequentemente das protenas (SCHRIPSEMA, DAGNINO & GOSMANN, 2007).

Dentre os alcalides indlicos empregados como frmacos destaca-se a vincristina e a vimblastina empregadas em casos de leucemia, sendo muito bem sucedidas comercialmente (BARREIRO & FRAGA, 2008).
CH 3
N H 3 CO N H CH 3

N N H

N N H H H H H 3 CO O OH

Ncleo indlico

CH 3

32
Fonte: Schripsema, Dagnino & Gosmann, 2007.

33

34

FIGURA 18: Estrutura dos alcalides indlicos harmina, elipticina e iombina.

Alcalides pirrolizidnicos apresentam o ncleo pirrolizidnico (Figura 19) como

estrutura bsica, vulgarmente chamado de necina. Ocorrem predominantemente em vegetais, podendo ser encontrados em diferentes rgos, no entanto so encontrados em algumas espcies animais tambm. Devido alta toxicidade apresentada pelos alcalides pirrolizidnicos estes no encontram grande aplicao na teraputica, acredita-se que tal toxicidade seja causada no pelos alcalides em si, mas sim pelos produtos de seu metabolismo no organismo, afetando principalmente o fgado (BAH & PEREDAMIRANDA, 2007). Os compostos retronecanol (35) , lasiocarpina (36) e danaidona (37) so exemplos de alcalides pirrolizidnicos.

H H3C Ncleo pirrolizidnico N CH3

H 3C

HO O

CH3

H
O

O
H O O H CH3 O

N
N

Fonte: Bah & Pereda-Miranda.

35

36

37

FIGURA 19: Estrutura do retronecanol, lasiocarpina e danaidona.

Alcalides esteroidais apresentam uma grande variedade estrutural ocorrendo sob

a forma livre (genina) e heterosdica donde so denominados glicoalcalides esteroidais. So encontrados tanto em vegetais quanto em animais, sendo na maioria das vezes muito txicos. Possuem em comum a estrutura caracterstica dos esterides (ncleo tetracclico). Nos vegetais a produo e acmulo de alcalides esteroidais tem sido relacionada proteo destes. Dentre as atividades biolgicas atribudas aos alcalides esteroidais cita-se : antibacteriana, antifngica, inseticida e praguicida. Os compostos solasodina (38), tomatidina (39) e solanidina (40) so exemplos de alcalides esteroidais (CHIESA & MOYNA, 2007).

H N

N O H

HO

H H

38
Fonte: Chiesa & Moyna, 2007.

39

40

FIGURA 20: Estrutura dos alcalides esteroidais solasodina, tomatidina e solanidina.

2.2.3 - leos Volteis Dentre as vrias classes de metablitos secundrios os leos volteis destacam-se devido sua grande ocorrncia e complexidade. Estes so resultantes de misturas complexas de substncias lipoflicas, em sua maioria derivados fenilpropanides ou terpenides, sendo que estes ltimos preponderam (SIMES & SPITZER, 2007).
OH O H
Fonte: dos Santos, 2007.

41

FIGURA 21: Estrutura do cido cinmico, um fenilpropanide.

Os terpenides so a maior classe de metablitos secundrios, abrangendo mais de 22.000 compostos diferentes, so resultantes da condensao de unidades de isopreno (cinco carbonos) que por sua vez resultante do metabolismo do acetato via cido mevalnico (ver figura 3 ), sendo classificados de acordo com o nmero de unidades isoprnicas pelo qual so formados (Quadro 2) , como exemplo cita-se os monoterpenos e os sesquiterpenos que so os compostos terpnicos mais abundantes nos leos volteis (RAVEN et al., 2001). Dentre as caractersticas dos leos volteis cita-se sua instabilidade frente luz e ao calor, tais fatores interferem na composio e concentrao de seus constituintes, como observado por Corra et al. (2004) que avaliou o rendimento do leo voltil das folhas de Vernonia polyanthes (assa-peixe) quando submetidas diferentes mtodos de secagem, observando que a secagem mista (sol e sombra) temperatura ambiente e a secagem realizada em estufa 35C causaram uma perda significativa na concentrao destes, provocando uma queda em seu rendimento. Todos os rgos do vegetal podem acumular leos volteis, mas a composio e concentrao destes pode variar segundo sua localizao. Dentre as funes dos leos volteis nos vegetais cita-se: inibio da germinao de sementes, proteo contra predadores e atrao de polinizadores. leos volteis so frequentemente utilizados como flavorizantes, na fabricao de perfumes e na aromaterapia. Na teraputica so empregados principalmente como anestsico local, carminativo, antiinflamatrio e anti-sptico. O uso teraputico dos leos volteis deve ser parcimonioso visto que grande parte destes apresenta toxicidade considervel sobre o organismo humano, causando principalmente reaes cutneas. Como exemplo de leos txicos cita-se os leos ricos em tujona (42), fenchona (43) e cnfora (44) os quais so neurotxicos. Como exemplo de plantas ricas em leos volteis cita-se o limo, rico em limoneno (45) , o hortel-pimenta rico em mentol (46) e o funcho rico em fenchona (SIMES & SPITZER, 2007).

N de U nid ad es de Iso pre no

E sq ue leto C a rb n ic o

C lasse

Iso pre no

M onoterpeno

S esquiterpeno

D iterpeno

S esterpeno

T riterpeno

T etraterpeno

n n
Fonte: Simes & Spitzer, 2007.

P oliisopreno

QUADRO 2 : Classes de terpenos.

CH3 O

CH3 O CH3

CH3

CH3

CH3

O
OH

H3C 42

CH3 43
Fonte: Simes & Spitzer, 2007.

CH3
44

H3C
45

CH2

H 3C

CH3

46

FIGURA 22 : Exemplos de terpenides: tujona, fenchona, cnfora, limoneno e mentol.

2.2.4 - Cumarinas, Cromonas e Xantonas Cumarinas, cromonas e xantonas so classes de metablitos secundrios de grande importncia teraputica, as primeiras apresentam como estrutura bsica a 1,2- benzopirona (47), as segundas so ismeros das primeiras, apresentando a 5H-1-benzopiran-5-onas (48) como estrutura bsica, e as ltimas apresentam como estrutura bsica a dibenzo--pirona (49) (KUSTER & ROCHA, 2007).

O
47

O 48

O 49

Fonte: Kuster & Rocha, 2007.

FIGURA 23 : Estruturas bsicas das cumarinas, cromonas e xantonas. Segundo Kuster & Rocha (2007) as cumarinas so de grande ocorrncia em vegetais , podendo ser encontradas tambm em fungos e bactrias. So derivadas do cido cinmico e consequentemente da fenilalanina. So de ocorrncia principal em angiospermas, podendo ser encontradas em qualquer parte da planta. So eficientes potenciais farmacolgicos e ao mesmo tempo pouco txicas para os mamferos. Dentre os principais tipos de cumarinas encontra-se as furanocumarinas e as piranocumarinas as quais apresentam toxicidade considervel, as furanocumarinas so fototxicas, quando expostas

radiao tornam-se reativas podendo ligar-se bases pirimidnicas do DNA provocando mutaes. A figura 24 mostra a estrutura de uma furanocumarina ligada timina.

H N O N H

O CH3

O H3C

H N NH

O
50
Fonte: Kuster & Rocha, 2007.

51

FIGURA 24 : Furanocumarina ligada base timina. As cromonas so ismeros das cumarinas, apresentando pequena variedade estrutural, a quelina (52) uma furanocromona que apresenta atividades vasodilatadora e broncodilatadora. As xantonas recebem essa denominao devido colorao amarela advinda da absoro de luz visvel no comprimento de onda de 400 nm, essa classe de metablitos so atribudas diversas atividades biolgicas, desde antimicrobiana antileucmica, sendo tambm utilizadas no tratamento da depresso, acredita-se que atuando na inibio da enzima monoamino-oxidase (MAO) (KUSTER & ROCHA, 2007).
H 3C O O

O O H 3C

CH 3

52
Fonte: Kuster & Rocha, 2007.

FIGURA 25 : Estrutura da furanocromona quelina.

2.2.5 - Quinonas As quinonas so metablitos secundrios considerados como produtos da oxidao de fenis. Quando compostas por um nico anel benznico so denominadas benzoquinonas (53), quando apresentam dois anis benznicos recebem a denominao de naftoquinonas (54), enquanto quinonas que apresentam trs anis benznicos em sua estrutura so denominadas antraquinonas (55), sendo muitas vezes chamadas tambm de derivados antracnicos (FALKENBERG, 2007).
O

53
O
54

O
55

Fonte: Falkenberg, 2007.

FIGURA 26: Estrutura bsica das benzoquinonas, naftoquinonas e antraquinonas.

As quinonas so de ocorrncia principal em vegetais podendo no entanto serem encontradas em fungos, bactrias e lquens. So na maioria das vezes encontradas sob a forma de heterosdeos, as antraquinonas apresentam-se predominantemente sob a forma de O-glicosdeos. As quinonas hidroxiladas, quando em meio alcalino apresentam colorao prpura violeta sendo tal caracterstica utilizada em sua identificao (FALKENBERG, 2007). H vrias quinonas biologicamente ativas, estas so empregadas principalmente como laxantes, porm outras atividades lhes tm sido atribudas, como a atividade antidepressiva apresentada pela hipericina (56) substncia isolada de Hypericum perforatum sendo bastante utilizada na Europa e nos Estados Unidos no tratamento de distrbios psquicos (PEDROSA, YUNES & CECHINEL-FILHO, 2001). Nos vegetais acredita-se que as quinonas atuam na proteo contra predadores e patgenos, alm de agir como substncias alelopticas protegendo o vegetal contra competidores intra e/ou interespecficos. Devido colorao que apresentam muitas

quinonas so empregadas na indstria como corantes, dentre elas a alizarina (57). O uso abusivo e prolongado de quinonas pode causar a perda de eletrlitos alm de alteraes morfolgicas do colo e do reto havendo casos que necessitam de interveno cirrgica, (FALKENBERG, 2007).
OH O OH

O
HO HO CH 3 CH 3

OH OH

O
OH
Fonte: Falkenberg, 2007.

OH

56

57

FIGURA 27 : Estrutura da hipericina, uma naftodiantrona e da alizarina, uma naftoquinona.

2.2.6 - Taninos Compostos fenlicos conhecidos por taninos representam uma importante e extensa classe de metablitos secundrios, que apresenta como caractersticas principais solubilidade em gua e precipitao na presena de protenas. No vegetal atuam principalmente na proteo contra predadores, funcionando como dissuadores alimentares, sendo responsvel pela adstringncia de muitos frutos (MONTEIRO et al., 2005). Os taninos so tidos como fatores antinutricionais pois reduzem a digesto de fibras e protenas atravs da inibio de enzimas digestivas (GUIMARES-BELLEN et al., 2006). So classificados em dois tipos principais: hidrolisveis e condensados, os primeiros so esteres dos cidos glico e elgico, enquanto os segundos resultam da condensao de unidades de flavan-3-ol e flavan-3,4-diol sendo denominados por proantocianidinas. (SANTOS & de MELLO, 2007). A figura 28 apresenta a estrutura bsica dos taninos condensados.

OH HO O

OH OH

OH HO O

OH

n
OH OH OH HO O OH OH OH O OH

58
Fonte: Santos & de Mello, 2007.

FIGURA 28 : Estrutura bsica dos taninos condensados.

Os taninos podem ser produzidos e armazenados nos cloroplastos, amiloplastos, parede celular e espaos intercelulares. Os taninos hidrolisveis formados pelo cido glico so denominados galotaninos, enquanto os formados pelo cido elgico so denominados elagitaninos (MONTEIRO et al., 2005). O hamamelitanino (59) um galotanino e constituinte principal das cascas de Hamamelis virginiana, e a pedunculagina (60) um elagitanino.
OH HO HO OH O HO O O O
HO OH HO OH O

O OH

HO HO

O O O O O O O OH

OH OH OH

59

HO HO OH HO OH

OH

Fonte: Santos & de Mello, 2007.

60

FIGURA 29 : Estruturas do hamamelitanino e da pedunculagina.

Devido complexao com protenas os taninos apresentam atividade bactericida e fungicida. Apresentando tambm atividades antioxidante e cicatrizante, sendo esta ltima resultado da camada protetora que formada graas complexao do tanino com as protenas da derme (MONTEIRO et al., 2005). Acredita-se que os taninos atuam protegendo os vegetais contra o ataque de predadores herbvoros atravs da diminuio da palatabilidade, reduo da digestibilidade e da formao de produtos txicos resultantes de sua hidrlise no trato digestivo do herbvoro (SANTOS & de MELLO, 2007).

2.2.7 - Saponinas

As saponinas so metablitos secundrios que ocorrem como glicosdeos de estrides ou terpenos policclicos e apresentam elevada solubilidade em gua, alm de provocarem a ruptura de clulas sangneas (hemlise). Por serem constitudas de uma parte hidrofbica (ncleo esteroidal ou terpnico) e uma parte hidroflica (parte osdica) apresentam propriedades semelhantes s dos sabes, atuando na reduo da tenso superficial da gua alm de produzirem espuma quando sob agitao, sendo esta persistente mesmo na presena de cidos diludos. O termo saponina provm de sua semelhana com os sabes (SCHENKEL, GOSMANN & ATHAYDE , 2007). As saponinas quanto ao ncleo da aglicona so classificadas em esteroidais e terpnicas, quanto ao nmero de cadeias de acar presentes, so classificadas em monodesmosdicas, bidesmosdicas, tridesmosdicas e assim por diante, quanto ao carter em soluo so classificadas em cidas, neutras e bsicas, sendo caracterstico destas ltimas a presena de nitrognio em sua estrutura (SCHENKEL, GOSMANN & ATHAYDE , 2007). A figura 30 mostra o ncleo fundamental do espirostano (61), um tipo de saponina esteroidal, e o ncleo fundamental do lupeol (62), uma saponina terpnica.

RO

HO

61
Fonte: Schenkel, Gosmann & Athayde , 2007.

62

FIGURA 30: Ncleo dos tipos espirostano e lupeol.

Vrias atividades biolgicas so atribudas s saponinas, as quais so devidas sua capacidade de complexao com esterides, protenas e fosfolipdios. Dentre as atividades biolgicas apresentadas por estes metablitos secundrios destaca-se as atividades hemoltica, molusquicida, anti-helmntica, espermicida, hipocolesterolemiante e

antiinflamatria, como exemplo de espcies ricas em saponinas cita-se: o alcauz (Glycyrrhiza glabra), ginseng (Panax ginseng) e a calndula (Calendula officinalis) (SCHENKEL, GOSMANN & ATHAYDE , 2007). A figura 31 mostra a estrutura da glicirrizina (63), a saponina majoritria do alcauz, a qual apresenta atividade antiinflamatria.
COOH

O H

RO

63
Fonte: Schenkel, Gosmann & Athayde , 2007.

FIGURA 31: Estrutura da glicirrizina.

2.2.8 - Ligninas e lignanas

As ligninas e lignanas representam uma importante e abrangente classe de metablitos secundrios. Sendo amplamente encontradas no reino vegetal. Destacando-se as ligninas, que so depositadas na parede da clula vegetal lhe conferindo rigidez, sendo o segundo maior constituinte existente, atrs apenas dos carboidratos (RAVEN et al., 2001). Segundo Barbosa Filho (2007) os lignides so micromolculas formadas pelo esqueleto fenilpropnico (C6-C3)n sendo n restrito a poucas unidades. Os principais tipos de lignides so as lignanas, as ligninas, as neolignanas, as alolignanas, as norlignanas, os oligolignides e os heterolignides, sendo que os dois primeiros so os de maior ocorrncia. As lignanas so dmeros resultantes do acoplamento oxidativo de lcoois cinamlicos entre si ou com cidos cinmicos. As ligninas so macromolculas formadas pela condensao polimrica de unidades fenilpropnicas (C6-C3). A figura 32 apresenta a estrutura do pinoresinol (64) uma lignana e do cido nordihidroguaiartico (65) uma neolignana.
OH
HO

O O CH3

HO

H3C

O
OH

OH

HO

64
Fonte: Barbosa-Filho, 2007.

65

FIGURA 32: Estrutura do pinoresinol, uma lignana e cido nordi-hidroguaiartico uma neolignana.

Dentre as funes das lignanas nos vegetais cita-se a proteo contra insetos. Observa-se um maior acmulo de neolignanas quando o vegetal atacado por organismos patgenos e/ou lesionado por estmulos mecnicos. Diversas atividades biolgicas como antitumoral, antifngica, antioxidante, dentre outras tm sido atribudas a lignanas, o cido nordi-hidroguaiartico uma neolignana que apresenta estas trs atividades biolgicas (BARBOSA FILHO, 2007).

2.2.9 - Compostos fenlicos simples e heterosdicos

Os metablitos secundrios so em sua maioria compostos fenlicos ou seja apresentam em sua estrutura pelo menos um anel aromtico ao qual encontra-se ligado um ou mais grupos hidroxila (OH-). Exemplos de classes de compostos fenlicos oriundos do metabolismo secundrio vegetal so: os taninos, os flavonides, as lignanas, as antraquinonas, dentre outras. Tais classes so compostos fenlicos complexos e apresentam uma grande variedade estrutural (dos SANTOS, 2007). Os metablitos secundrios conhecidos por compostos fenlicos simples so derivados do cido benzico (66) dentre eles os cidos glico (67) e elgico (68) que so constituintes dos taninos hidrolisveis, e os derivados do cido cinmico (41) como os cidos p-cumrico (69), cafico (70) e ferlico (71) (CARVALHO, GOSMANN & SCHENKEL, 2007).
HO O

OH

O O OH

HO

OH

HO OH

OH
HO O O

66
Fonte: Carvalho, Gosmann & Schenkel, 2007.

67

68

FIGURA 33 : Estrutura dos cidos benzico, glico e elgico.

HO

OH

R'

R=R=H 69
Fonte: Carvalho, Gosmann & Schenkel, 2007

R=OH e R=H 70

R=OCH3 e R=H 71

FIGURA 34: Estrutura dos cidos p-cumrico, cafico e ferlico.

Os compostos fenlicos podem ocorrer sob a forma simples ou heterosdica (ligado unidades de acares) ou ainda sob a forma de steres, ocorrendo predominantemente sob as duas ltimas formas. Nos vegetais desempenham funes diversas como: proteo contra predadores, inibio da germinao de sementes e inibio do crescimento de outras espcies (alelopatia). Dentre as atividades biolgicas atribudas a estes compostos cita-se antioxidante, antibacteriana e antiviral (CARVALHO, GOSMANN & SCHENKEL, 2007).

2.2.10 - Heterosdeos cardioativos

Os heterosdeos cardioativos so esterides que ocorrem sob a forma de heterosdeos e que exercem ao sobre o msculo cardaco. Nos vegetais apresentam ocorrncia restrita s angiospermas donde ocorrem em pequena concentrao, podendo no entanto ser encontrados em determinadas espcies animais. Apresentam um ncleo esteroidal tetracclico (72) ao qual encontra-se ligadas as unidades de acares (RATES & BRIDI, 2007).

C A
Fonte: Rates & Bridi, 2007.

B
72

FIGURA 35: Ncleo esteroidal tetracclico dos heterosdeos cardioativos.

Os heterosdeos em geral so mais ativos que suas respectivas agliconas (forma livre), apesar dessas serem as responsveis pela atividade cardiotnica a parte osdica (acar) lhe confere maior solubilidade aumentando sua absoro pelo organismo (FRAGA & BARREIRO, 1996). A digoxina (73) o heterosdeo cardioativo mais empregado na teraputica sendo prescrita principalmente em casos de insuficincia cardaca congestiva, tal substncia isolada de algumas espcies do gnero Digitalis (RATES & BRIDI, 2007).
O HO O

OH Resduos de Acares O H

73
Fonte: Rates & Bridi, 2007.

FIGURA 36: Estrutura da digoxina.

2.2.11 - Compostos Sulfurados

Os metablitos sulfurados so aqueles que apresentam enxofre em sua estrutura, so todos derivados dos aminocidos metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano, so produzidos principalmente por espcies utilizadas como condimentares, como o alho e a cebola. Quando sob a forma de glicosdeos so denominados glicosinolatos, que aps

hidrlise enzimtica produzem isotiocianato que por sua vez pode gerar cido tiocinico (HSCN) extremamente txico (HEINZMANN, 2007). A figura 37 mostra a transformao do glicosinolato sinigrina em cido tiocinico.
N H
5C 3

O C
6H

SO O

3X

O M iro s in a s e H
5C 3

SO C

3X

N S
6 H 11

11

p H 6 -7

H 2O

5C 3

HS

5C 3

Fonte: Heinzmann, 2007.

FIGURA 37: Transformao da sinigrina em cido tiocinico.

As espcies que produzem glicosinolatos tambm produzem as enzimas necessrias para sua degradao, enzimas estas que ficam armazenadas em compartimentos isolados dos glicosinolatos entrando em contato com estes somente quando os tecidos do vegetal so lesados (dos SANTOS, 2007). Dentre as atividades biolgicas apresentadas por esta classe de metablito cita-se : antimicrobiana, repelente de insetos e antimictica. Muitos glicosinolatos so biologicamente ativos porm em grande parte das vezes os compostos com atividade biolgica resultam de sua hidrlise enzimtica. Como exemplo de espcies ricas em metablitos sulfurados tem-se a mostarda (Brassica nigra) e o alho (Allium sativum) (HEINZMANN, 2007). Nos bulbos do alho encontra-se a aliina (74) sem odor caracterstico, quando o tecido do bulbo lesionado mecanicamente, amassado por exemplo, a aliinase enzima responsvel pela degradao da aliina (75) entra em contato com esta transformando-a em alicina, substncia que confere o odor caracterstico do alho (HEINZMANN, 2007).

O
S

NH

O
S S

COOH

74
Fonte: Heinzmann, 2007.

75

FIGURA 38: Estrutura da aliina e alicina.

2.3 - Anlise fitoqumica Dentre os estudos cientficos realizados com espcies vegetais de interesse, destacam-se os estudos fitoqumicos, os quais permitem identificar e/ou avaliar a presena de constituintes qumicos dos vegetais, tais estudos tm tornado possvel a identificao de compostos de grande interesse teraputico. Quando no se conhece a natureza dos metablitos presentes na espcie estudada realiza-se a anlise fitoqumica preliminar, que permite caracterizar as classes de metablitos e posteriormente adotar a metodologia adequada para seu estudo (FALKENBERG, dos SANTOS & SIMES, 2007). A anlise fitoqumica envolve vrias etapas, as quais so apresentadas a seguir. I) Escolha da espcie vegetal a ser estudada segundo Maciel et al. (2002) a espcie vegetal a ser estudada em geral escolhida seguindo a abordagem randmica, a abordagem quimiotaxonmica ou filogentica ou a abordagem etnofarmacolgica, na primeira a escolhe-se a espcie ao acaso, considerando-se apenas sua disponibilidade, na segunda considera-se a presena de uma dada classe de metablito em um gnero ou famlia botnica como determinante para a escolha, no ltimo caso a espcie selecionada considerando-se seu emprego farmacutico por um determinado grupo tnico, sendo esta a abordagem mais frequentemente utilizada. II) Coleta nesta etapa retira-se de seu hbitat natural amostras da espcie vegetal a ser estudada, algumas precaues devem ser tomadas como: coletar espcimes em bom estado de conservao (sem partes afetadas), tomar o cuidado de no coletar amostras que no sejam da espcie a ser estudada, registrar o local, a data e o horrio da coleta (MENTZ & BORDIGNON, 2007).

III) Identificao e Herborizao para que os resultados do estudo fitoqumico sejam validados a espcie estudada deve ser corretamente identificada e uma amostra desta adicionada a um herbrio, para caso posteriormente houver necessidade de se comprovar sua classificao botnica (MENTZ & BORDIGNON, 2007). IV) Preparo do material vegetal a anlise fitoqumica pode ser realizada com o vegetal fresco ou seco, deve-se utilizar o vegetal fresco somente quando a anlise for imediata coleta. Geralmente a anlise fitoqumica realizada com o vegetal seco devido sua maior estabilidade qumica, nesse caso deve-se realizar a secagem do material vegetal, que tem a finalidade de retirar a gua do vegetal, impedindo assim possveis reaes de hidrlise e o crescimento microbiano (FALKENBERG, dos SANTOS & SIMES, 2007). A secagem pode ser realizada ao sol, sombra ou em estufa com circulao de ar, sendo o primeiro caso desaconselhvel devido possibilidade de fotlise dos metablitos vegetais (MACIEL et al., 2002). Aps o processo de secagem procede-se ao processo de moagem do material vegetal, tal etapa tem como finalidade tornar o processo de extrao mais eficiente atravs do aumento da superfcie de contato entre o vegetal e o solvente, a moagem alm de aumentar a eficincia, diminui o tempo do processo de extrao (MENTZ & BORDIGNON, 2007). V) Extrao segundo Falkenberg, dos Santos & Simes (2007) no processo de extrao as substncias contidas no material vegetal so extradas por um ou uma mistura de solventes extratores, o solvente a ser empregado deve apresentar alta seletividade, a fim de que somente as classes de metablitos de interesse sejam extradas. De acordo com Cechinel-Filho & Yunes (1998) quando no se conhece as classes de metablitos contidos no vegetal, a extrao com uma mistura hidroalcolica 50% (gua/etanol 1:1) a mais indicada. O processo de extrao pode ser realizado quente ou a frio sendo que no primeiro o processo mais rpido devido ao aumento da solubilidade dos metablitos, os metablitos so extrados de acordo com sua afinidade pelo solvente empregado, em geral solventes apolares extraem preferencialmente metablitos com carter apolar, enquanto metablitos polares so extrados por solventes de maior polaridade (FALKENBERG, dos SANTOS & SIMES, 2007).

Material Vegetal

Eter de petrleo, hexano

Extrao

EtOH e MeOH

Tolueno, Clorofrmio e DCM

AcOEt e n- BuOH Lipdios e furanocumarinas Heterosdeos em geral leos volteis, glicosdeos cardioativos, alcalides e antraquinonas livres

Flavonides e cumarinas simples

DCM = Diclorometano; AcOEt = Acetato de Etila; n-BuOH = n- Butanol; MeOH = metanol; EtOH = Etanol.
Fonte: Falkenberg, dos Santos & Simes, 2007.

FIGURA 39: Principais solventes e classes de metablitos extradas.

VI) Fracionamento, isolamento e purificao de substncias nesta etapa os metablitos vegetais so fracionados, isolados e purificados para posteriormente terem suas estruturas elucidadas. O fracionamento geralmente realizado pela partio com solventes orgnicos de polaridade crescente, tal processo trata-se de um mtodo de extrao lquidolquido, no qual os metablitos so extrados de acordo com sua solubilidade nos solventes empregados. O isolamento e purificao dos metablitos em geral realizado atravs de mtodos cromatogrficos em suas mais diversas variaes como cromatografia gasosa, cromatografia lquida de alta eficincia, cromatografia em camada delgada, dentre outras (FALKENBERG, dos SANTOS & SIMES, 2007). VII) Elucidao estrutural a elucidao estrutural a ltima etapa da anlise fitoqumica. Segundo Falkenberg, dos Santos & Simes (2007) os dados obtidos pelo emprego principalmente de tcnicas como as espectroscopias UV-visvel, infravermelho, e de ressonncia magntica nuclear alm da espectrometria de massa possibilitam a proposio da estrutura qumica dos metablitos isolados da espcie vegetal estudada.

2.3.1 - Tcnicas Instrumentais de emprego na anlise fitoqumica A anlise fitoqumica envolve vrias etapas, dentre as quais o fracionamento, isolamento e elucidao estrutural dos compostos oriundos do metabolismo vegetal merecem destaque. Os qumicos orgnicos, em especial, os fitoqumicos atualmente dispem de poderosas tcnicas instrumentais que aliadas sua experincia tm permitido o avano da fitoqumica enquanto cincia. Dentre as principais tcnicas instrumentais de uso corrente na anlise fitoqumica destaca-se : a cromatografia, a espectrometria de massa, a ressonncia magntica nuclear e as espectroscopias no ultravioleta-visvel e no infravermelho. importante considerar que na anlise de metablitos vegetais qualquer uma destas tcnicas empregadas isoladamente no suficiente por si s para permitir a elucidao correta destes, mas sim o emprego delas em conjunto (FALKENBERG, dos SANTOS & SIMES, 2007).

2.3.1.1 - Cromatografia A cromatografia uma poderosa tcnica de separao de misturas. Foi criada pelo botnico russo Mikhail Tswett que ao passar solues de pigmentos vegetais em uma coluna de vidro contendo carbonato de clcio (CaCO3) observou que estas substncias quando separadas apareciam como bandas coloridas na coluna, da o nome da tcnica (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). Em todos os tipos de cromatografia h a fase mvel e a fase estacionria, a fase estacionria como o prprio nome sugere a fase fixa a qual o analito percorre levado pela fase mvel, o que determinar a separao das substncias do analito ser a afinidade destas pela fase estacionria, pois cada substncia presente na mistura apresentar uma afinidade prpria por esta, quanto maior essa afinidade maior ser sua reteno e menor ser sua velocidade de deslocamento (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). Atualmente h diversos tipos de cromatografia, todos de grande utilidade na anlise fitoqumica, quanto ao meio fsico dividem-se em dois tipos: planar e em coluna; quanto ao estado fsico da fase mvel dividem-se em trs tipos: lquida, gasosa e com fluido supercrtico. Segundo Skoog, Holler & Nieman (2002) a cromatografia pode ser empregada tanto em anlises qualitativas quanto quantitativas, na primeira o tempo de reteno das substncias da mistura utilizado como varivel para sua identificao, no segundo avaliase a altura ou a rea sob o pico apresentado pela substncia no cromatograma o que permite quantific-la. Porm a importncia desta tcnica instrumental deve-se principalmente ao seu emprego na separao de substncias a serem posteriormente analisadas por mtodos espectroscpicos. As tcnicas cromatogrficas so de grande emprego na anlise fitoqumica visto que os metablitos vegetais apresentam-se como misturas, necessitando portanto de serem separados a fim de serem analisados. Dentre os diversos tipos de cromatografia disponveis e utilizados na anlise fitoqumica destaca-se: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida, cromatografia lquida de alta eficincia e a cromatografia em camada delgada, as quais so brevemente discutidas a seguir (FALKENBERG, DOS SANTOS & SIMES, 2007).

2.3.1.2 - Cromatografia Gasosa Como o prprio nome sugere, na cromatografia gasosa (CG) a fase mvel uma substncia no estado gasoso, mais precisamente um gs inerte, geralmente hlio, nitrognio ou hidrognio. Neste tipo de cromatografia a amostra vaporizada e injetada no topo de uma coluna sendo em seguida arrastada pela fase mvel e de acordo com sua afinidade pela coluna (fase estacionria) deslocar mais rapidamente ou mais lentamente ao longo desta, acoplado ao cromatgrafo gasoso h sempre um detector o qual fornece um grfico (cromatograma) que pode ser interpretado e comparado com cromatogramas existentes em uma biblioteca eletrnica, possibilitando a identificao dos compostos separados (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). A figura 40 mostra o cromatograma de uma mistura de -friedelinol e friedelina, obtido por cromatografia gasosa.

Fonte: Heleno et al., 2007.

FIGURA 40: Cromatograma obtido por cromatografia gasosa de uma mistura de friedelinol e friedelina isolados das folhas de Maytenus acanthophylla e seus respectivos padres.

A cromatografia gasosa devido ao fato de exigir que o analito seja vaporizado s aplicvel amostras passveis de volatilizao, o que limita seu emprego. frequente o acoplamento de um espectrmetro de massa ao cromatgrafo gasoso constituindo-se ento numa tcnica hifenizada (CG-EM) bastante utilizada na separao e identificao de metablitos secundrios dentre eles os leos volteis (FALKENBERG, dos SANTOS & SIMES, 2007). A figura abaixo mostra os componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.

Fonte: Skoog, Holler & Nieman, 2002.

FIGURA 41: Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.

2.3.1.3 - Cromatografia lquida em coluna

Neste tipo de cromatografia a fase estacionria mantida em um tubo (coluna) no qual a fase mvel forada pela ao da gravidade a deslocar-se sobre a fase estacionria. O processo de eluio de uma coluna cromatogrfica refere-se passagem da fase mvel ao longo da fase estacionria transportando consigo as substncias presentes na mistura, o que provoca a separao destas devido sua afinidade pela fase estacionria (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002).

A cromatografia lquida em coluna uma tcnica simples, eficiente e relativamente barata (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002), sendo bastante empregada na separao de metablitos vegetais, inclusive metablitos primrios como os lipdios (MOYNA & HEINZEN, 2007). Na cromatografia lquida em coluna a fase estacionria geralmente constituda por slica gel, sephadex LH-20 ou poliamida, as fases estacionria e mvel devem ser escolhidas de acordo com a natureza da mistura a ser separada, geralmente emprega-se como fase mvel uma combinao de solventes de polaridade crescente como por exemplo no caso do fracionamento de taninos onde emprega-se o sistema etanol (EtOH), metanol (MeOH) e etanol/metanol (EtOH/MeOH) como fase mvel (SANTOS & DE MELLO, 2007).

2.3.1.4 - Cromatografia lquida de alta eficincia

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) uma das tcnicas cromatogrficas mais empregadas, devido sua eficcia e versatilidade, neste tipo de cromatografia a fase estacionria constituda por partculas muito pequenas, sendo necessrio alta presso para a eluio da coluna, portanto uma bomba fora a passagem da fase mvel ao longo da coluna. Quando a fase estacionria polar e a fase mvel apolar denomina-se cromatografia em fase normal, quando por sua vez a fase estacionria apolar e a fase mvel polar denomina-se cromatografia em fase reversa (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2000). A CLAE largamente empregada na separao de metablitos secundrios, diferentes tipos de cumarinas por exemplo, podem ser rapidamente detectados sem a necessidade de serem previamente isoladas (KUSTER & ROCHA, 2007). A CLAE permite a caracterizao dos compostos contidos em uma mistura, pode-se injetar substncias padres e comparar seus cromatogramas com o cromatograma da mistura em separao, os compostos presentes na mistura se forem idnticos aos padres injetados, apresentaro picos idnticos no cromatograma. A CLAE ao contrrio da cromatografia gasosa pode ser empregada na separao de misturas contendo compostos de alto peso molecular (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002) .

Na figura 42 mostrado o cromatograma obtido por CLAE pela injeo de padres de quatro flavonides. A figura 43 apresenta o cromatograma obtido pela a injeo do extrato aquoso das folhas de Bauhinia forficata.

Fonte: Pinheiro et al., 2006.

FIGURA 42: Cromatograma de padres dos flavonides (1) 3,7- di-O--Lramnopiranosilquercetina, (2) campferitrina, (3) quercetina, (4) canferol.

Fonte: Pinheiro et al., 2006.

FIGURA 43: Cromatograma do extrato aquoso das folhas de Bauhinia forficata.

2.3.1.5 - Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) trata-se de um tipo de cromatografia planar, no qual a fase estacionria encontra-se espalhada sobre uma superfcie plana (placa), que eluda pela fase mvel (solvente) em um recipiente fechado denominado cuba, as substncias presentes na amostra percorrem a placa de acordo com sua afinidade pela fase estacionria (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2000). A figura 44 mostra o esquema de uma placa de CCD antes eluio e aps a eluio, cada ponto colorido na placa representa uma substncia diferente, mostrado tambm o valor do fator de reteno (Rf), observa-se que quanto mais prximo da base uma substncia estiver, menor seu Rf e maior sua afinidade pela fase estacionria.

Rf = 0,95 Rf = 0,86

Rf = 0,63

Rf = 0,27

Rf = 0,07

Fonte: ChemDraw Ultra 8.0

FIGURA 44: Placa de CCD antes e aps a eluio.

A CCD pode ser utilizada tanto em anlises qualitativas quanto quantitativas, na primeira analisa-se o fator de reteno (Rf) dos compostos na placa comparando-os com os Rf de padres, no segundo observa-se o tamanho da rea da mancha das substncias do analito, comparando-o com o tamanho da rea de padres. Geralmente a CCD empregada em anlises prvias cromatografia em coluna (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). A figura 45 mostra uma placa de CCD de extratos brutos vegetais diversos no qual avaliou-se a presena de glicolipdios.

Fonte: Mendes, Machado & Falkenberg, 2006.

FIGURA 45: Placa de CCD de extratos brutos vegetais.

A CCD uma tcnica bastante empregada na anlise fitoqumica, sendo empregada na anlise de diversas classes de metablitos como os flavonides os quais podem ser detectados pela exposio da placa eluda luz ultravioleta, manchas fluorescentes na placa evidenciam a presena destes (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007).

2.3.1.6 - Espectrometria de massa atmica

A espectrometria de massa atmica (EM) uma tcnica instrumental bastante utilizada em diversas reas, sendo empregada principalmente na determinao e quantificao de agrotxicos no meio ambiente, caracterizao de produtos sintticos e pesquisa de produtos de origem natural (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002).

A espectrometria de massa fornece informaes importantes sobre o analito como sua massa molecular e consequentemente sua frmula molecular. A tcnica baseia-se no princpio de que as molculas de uma amostra quando bombardeadas em fase gasosa por um feixe de eltrons, fragmentam-se em pedaos menores, que so separados de acordo com sua razo massa/carga (m/z) e o resultado plotado em um grfico (espectro) que permite a anlise do peso molecular da amostra (FORTES, 2006). Os fragmentos gerados pelo bombardeamento das molculas do analito aparecem como picos no espectro, o pico que apresenta maior razo massa/carga (m/z) corresponde molcula antes de ser fragmentada, ao pico que apresenta a segunda maior massa d-se o nome de on molecular, o qual representa o maior fragmento resultante da fragmentao da molcula . Cada composto tem sua maneira prpria de fragmentar, observando-se o padro de fragmentao de um composto muitas das vezes possvel predizer algo sobre sua estrutura (ALLINGER et al., 1976). A espectrometria de massa bastante empregada na anlise fitoqumica sendo frequente seu acoplamento cromatografia gasosa constituindo a tcnica hifenizada CGEM que utilizada na caracterizao de metablitos como os leos volteis, a identificao feita geralmente atravs da comparao do espetro obtido com os espectros fornecidos por uma biblioteca eletrnica (SIMES & SPITZER, 2007).

2.3.1.7 - Espectroscopia no infravermelho

A espectroscopia no infravermelho (IV) a tcnica que utiliza a radiao da regio do infravermelho do espectro eletromagntico na excitao das molculas. Na espectroscopia IV as molculas do analito so atravessadas pela radiao infravermelha absorvendo parte desta, a quantidade absorvida depende do tipo da molcula, sendo assim possvel identificar o (s) grupo (s) funcional (is) presente (s) na molcula ( SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). Quando uma molcula absorve radiao infravermelha esta provoca sua vibrao, e parte desta radiao passa pela molcula sem ser absorvida, um espectro de IV relaciona a freqncia da onda com a quantidade de radiao que passa pela amostra sem ser absorvida (transmitncia). O tipo de grupo funcional presente na molcula que determinar a que

freqncia a radiao ser absorvida, observa-se por exemplo que molculas que apresentam a funo cetona apresentam forte absoro na freqncia de 1715 cm-1, enquanto ligaes simples (alcanos) apresentam fraca absoro na faixa entre 2850 e 2970 cm-1 (ALLINGER et al., 1976). A tabela 1 apresenta os intervalos de freqncia de absoro de alguns grupos funcionais. TABELA 1: Intervalo de freqncia de absoro de alguns grupos funcionais no IV. Grupo Funcional Alcanos Alcenos lcoois e Fenis Monomericos Aldedos, Cetonas e c. Carboxlicos Aminas e Amidas
Fonte: Skoog, Holler & Nieman, 2002.

Intervalo de Freqncia de Absoro (cm-1) 2850 2970 3010 3095 3590 3650 1690 1760 3300 3500

A espectroscopia IV bastante empregada na anlise fitoqumica pois possibilita a identificao dos grupos funcionais presentes e a conseqente determinao da classe do metablito analisado. As quinonas por exemplo apresentam forte absoro na faixa de 1630 1700 cm-1 o que pode ser utilizado em sua caracterizao (FALKENBERG, 2007), a espectroscopia IV tambm empregada na determinao da configurao (cis ou trans) de alguns tipos de lipdios (MOYNA & HEINZEN, 2007).

2.3.1.8 - Espectroscopia no ultravioleta-visvel

A espectroscopia na regio do ultravioleta e visvel (UV-Visvel) do espectro eletromagntico uma tcnica instrumental de grande utilidade que permite a identificao da presena de ligaes insaturadas nas molculas do composto analisado, alm de certos tipos de grupos funcionais. Baseia-se no princpio de que as molculas de um composto quando atingidas por radiao UV-Visvel absorvem parte desta e tem seus eltrons excitados a um nvel mais alto de energia, a energia envolvida caracterstica do tipo de excitao que a molcula sofre, a qual dependente de seu tipo, sendo assim molculas que apresentam diferentes grupos funcionais, ligaes duplas ou simples por exemplo

apresentaro absoro em comprimentos de onda diferentes (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). A espectroscopia UV-Visvel em muitas das vezes utilizada acoplada cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), sendo bastante empregada na anlise fitoqumica de metablitos secundrios como as cumarinas, as quais apresentam espectro UV-Visvel caractersticos (KUSTER & ROCHA, 2007). A figura 46 mostra o cromatograma obtido por CLAE-UV do extrato hidroetanlico das folhas de Bauhinia microstachya, analisado a 270nm.

Fonte: da Silva et al., 2007.

FIGURA 46 : Cromatograma obtido por CLAE com detector UV para o extrato hidroetanlico das folhas de Bauhinia microstachya. A espectroscopia UV-Visvel a principal tcnica utilizada na deteco de flavonides, visto que estes apresentam espectros caractersticos devido presena de grupos prprios de cada tipo de flavonide, os flavonis por exemplo, apresentam forte banda de absoro no intervalo de comprimento de onda de 352 385 nm (ZUANAZZI & MONTANHA, 2007).

2.3.1.9 - Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear

A espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN) uma das tcnicas mais poderosas na determinao da estrutura de compostos orgnicos, sendo empregada em diversas reas. Tal tcnica utiliza a energia eletromagntica na regio de radiofreqncia para estimular ncleos atmicos, sendo aplicvel todos os elementos que apresentam nmero mpar de eltrons, porm predomina a espectroscopia de C13 e H1 onde o ltimo prepondera (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). Um espectro de RMN retrata a relao entre a freqncia de campo na qual um ncleo absorve e o seu deslocamento qumico, este ltimo depende do ambiente qumico no qual o ncleo est inserido, em geral ncleos que encontram-se prximos de elementos eletronegativos absorvem em campos mais baixos, portanto a intensidade do campo no qual um ncleo de H ligado ao oxignio ser diferente daquela apresentada por um ncleo de H ligado ao carbono, o que pode ser utilizado para diferenciar o ambiente qumico do ncleo analisado (ALLINGER et al., 1976). Segundo Skoog, Holler & Nieman (2002) alm da influncia dos elementos diretamente ligado ao ncleo observado H1 ou C13, devido uma interao denominada spin-spin este sofre tambm influncia de H1 e C13 adjacentes, aparecendo como picos mltiplos no espectro, sendo o nmero de picos representados por n + 1, onde n refere-se a quantidade de ncleos adjacentes, portanto no espectro de RMN de H1 a observao de um triplete (trs picos) por exemplo indica a presena de dois H1 adjacentes ao ncleo analisado. A espectroscopia de RMN de C13 apresenta a vantagem de fornecer informaes sobre o esqueleto da molcula, ao contrrio da RMN de H1 que fornece informaes sobre a periferia dos tomos de hidrognio, porem limitada devido pequena abundncia de C13 (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 2002). Enfim, a partir da anlise de um espectro de RMN pode-se obter informaes como: o ambiente qumico do ncleo (a partir da anlise do deslocamento qumico ) , a quantidade de ncleos vizinhos (a partir da observao da multiplicidade) e a quantidade de ncleos envolvidos (a partir da anlise da rea sob os picos do espectro), tais informaes

juntamente com as obtidas por outros mtodos instrumentais permitem inferir com certeza a estrutura de um composto orgnico (ALLINGER et al., 1976). A figura 47 mostra o espectro de RMN de H1 da apigenina, uma flavona, os nmeros apresentados na estrutura do composto referem-se aos deslocamentos qumicos atribudos aos respectivos tomos de hidrognio. A figura 48 mostra o espectro de RMN de C13 para o mesmo composto.

6.68 7.13 5.0

OH

5.0

HO

5.95

6.68

O
7.13

5.95

H OH
5.0

6.71

O
2 1 0

4 PPM

Fonte: ChemDraw Ultra 8.0

FIGURA 47: Espectro de RMN de H1 da apigenina

115.8 127.8

157.7 OH

HO
166.4 98.3

98.0 160.1 O 123.0 163.7 127.8

115.8

163.9

105.5

104.5 182.2

OH
200 180 160 140 120 100 PPM 80 60

O
40 20 0

Fonte: ChemDraw Ultra 8.0

FIGURA 48: Espectro de RMN de C13 da apigenina.

2.4 - Reviso de estudos com espcies do gnero Bauhinia

Dentre as espcies vegetais de interesse teraputico destacam-se as espcies do gnero Bauhinia as quais so bastante empregadas na medicina popular principalmente no tratamento do diabetes (ALMEIDA et al., 2006), sendo utilizadas em vrias regies dos continentes africano, asitico e das Amricas Central e do Sul (da SILVA & CECHINELFILHO, 2002). O gnero Bauhinia compreende cerca de 300 (trezentos) espcies das quais 64 (sessenta e quatro) so nativas do Brasil (VAZ & TOZZI, 2005). Diversas espcies foram introduzidas com fins ornamentais, adaptaram-se bem ao clima brasileiro e podem hoje ser encontradas em vrias regies do pas, sendo conhecidas popularmente por pata-de-vaca devido ao formato bilobado de suas folhas que lembra o rastro da pata dos bovinos (LORENZI & MATOS, 2002). Segundo da Silva & Cechinel-Filho (2002) devido ao grande interesse teraputico das espcies do gnero Bauhinia essas so foco de vrios estudos principalmente fitoqumicos e farmacolgicos os quais tm permitido comprovar cientificamente as atividades biolgicas lhes atribudas. Apesar das diversas atividades biolgicas apresentadas pelas espcies do gnero Bauhinia a atividade hipoglicemiante a mais avaliada, devido ao emprego popular destas como hipoglicemiantes.

2.4.1 Estudos farmacolgicos

Oliveira et al. (2005) avaliando a atividade antidiabtica do extrato alcolico das folhas de Bauhinia sacra sobre aves (Gallus domesticus) com diabetes induzido pelo aloxano, uma droga diabetognica, observaram que aps um perodo de 30 (trinta) dias de tratamento as aves tratadas apresentaram reduo de 133% (cento e trinta e trs por cento) na glicemia, tornando-se esta menor que a apresentada pelo grupo de aves normais, tal fato foi atribudo ao aumento do nmero de ilhotas pancreticas as quais so responsveis pela produo de insulina, que provoca a diminuio do nvel glicmico.

A administrao do extrato metanlico das folhas de Bauhinia cheilandra ratos diabticos induzido pelo aloxano causou uma reduo de aproximadamente 55% (cinqenta e cinco por cento) no nvel glicmico, alm de inibir o aumento da glicemia aps a administrao de soluo de glicose (ALMEIDA et al., 2006). Menezes et al. (2007) avaliaram o potencial hipoglicemiante dos extratos aquosos das espcies Bauhinia forficata e Bauhinia monandra sobre ratos normoglicmicos e observaram que o extrato de ambas as espcies apresentou atividade hipoglicemiante mesmo depois de 8 horas aps sua administrao. A administrao do decocto das folhas frescas de Bauhinia forficata por um perodo de 33 (trinta e trs) dias ratos diabticos induzidos pela estreptozotocina no causou toxicidade estes (PEPATO et al., 2004). A administrao do decocto das folhas secas de Bauhinia forficata ratas diabticas prenhes no interferiu em seu nvel glicmico, porm diminuiu a ocorrncia de malformaes fetais e as taxas de cido rico (DAMASCENO et al., 2004). Fuentes, Arancibia-Avila & Alarcn (2004) administraram o extrato metanlico das folhas de Bauhinia candicans bem como as fraes hexnica, butanlica e de acetato de etila deste coelhos normais e diabticos observando que o extrato metanlico e todas as fraes testadas reduziram significativamente o nvel glicmico dos coelhos diabticos, sendo a frao butanlica a mais ativa. Pepato et al. (2002) avaliaram o potencial antidiabtico do decocto das folhas de Bauhinia forficata sobre ratos diabticos induzidos pela estreptozotocina, e observaram que o grupo tratado apresentou reduo significativa nos nveis de glicose sangnea e urinria. Boonphong et al. (2007) avaliaram as atividades antimalrica, antimicobacteriana, antifngica, antiinflamatria e citotxica de 18 (dezoito) metablitos isolados das razes de Bauhinia purpurea onde observaram que 15 (quinze) destes apresentaram potencial antimicobacteriano, 4 (quatro) apresentaram atividade antimalrica, 5 (cinco) apresentaram atividade antifngica, 2 (dois) exerceram potente ao inibitria da enzima ciclooxigenase2 (COX-2) apresentando consequentemente atividade antiinflamatria, e 7 (sete) metablitos apresentaram atividade citotxica considervel. Silva et al. (2002) avaliaram o efeito sub-agudo da administrao da frao nbutanlica das folhas de Bauhinia forficata sobre ratos normoglicmicos e diabticos

induzidos pelo aloxano. A administrao da frao nas doses 500 e 600 mg/kg provocou a reduo dos nveis glicmicos dos ratos normais. A maior reduo foi observada no grupo dos ratos diabticos quando a estes foi administrado a frao na dose de 800 mg/kg sendo a atividade hipoglicemiante mantida por 3 horas. Volpato (2001) observou que a administrao do extrato aquoso das folhas de Bauhinia forficata ratas diabticas prenhes no reduziu os nveis glicmicos, nem o ganho de peso e no afetou o desenvolvimento fetal, porm causou queda na ocorrncia de anomalias esquelticas e malformaes viscerais. Bauhinia kalbreyeri bastante utilizada como hipoglicemiante na Colmbia, observou-se que o extrato aquoso das folhas desta espcie nas concentraes de 250, 500 e 1000 mg/kg no impediu o aumento da glicose sangnea em ratos aps a administrao de soluo de glicose, alm de apresentar reduo no nvel glicmico de ratos diabticos apenas 5 (cinco) horas aps sua administrao (MURILO et al., 2006). Lino et al. (2004) avaliaram o potencial hipoglicemiante dos extratos aquoso, hexnico e etanlico das folhas de Bauhinia forficata e constataram que a administrao desses extratos causou uma reduo significante na glicemia de ratos diabticos, sendo o extrato aquoso na concentrao de 400 mg/kg o mais ativo causando uma reduo de 64% (sessenta e quatro por cento) reduo maior que a apresentada pela glibenclamida, droga utilizada como padro. A administrao dos extratos tambm causou reduo nos nveis de colesterol total. A administrao do flavonide campferitrina isolado das folhas de Bauhinia forficata ratos diabticos nas doses 50, 100 e 200 mg/kg provocou a reduo dos nveis glicmicos destes, quando administrada ratos normais observou-se que a atividade hipoglicemiante deste flavonide dose- dependente (SOUSA et al., 2004). Soares, Costa & Cecim (2000) realizaram um estudo no qual avaliaram a influncia da administrao do infuso das folhas de Bauhinia candicans sobre os nveis de colesterol e glicose sangneos de ratos diabticos e concluram que a administrao do infuso no exerceu efeito sobre a hiperglicemia e hipercolesterolemia destes. Pettit et al. (2006) avaliaram a atividade de metablitos isolados das folhas, cascas e vagens de Bauhinia purpurea na inibio do desenvolvimento de clulas cancergenas, e

constataram que de um total de cinco metablitos isolados quatro causaram a inibio do desenvolvimento de tais clulas. A mistura 10% dos extratos etanlico bruto e de acetato de etila das folhas de Bauhinia rufa causou em um perodo de 24 horas 100% de mortalidade sobre as larvas do mosquito Culex quinquefasciatus (RIBEIRO-NETO et al., 2007). Kumar et al. (2005) avaliaram o potencial antimicrobiano do extrato metanlico do caule de Bauhinia racemosa e observaram que este apresentou potente atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de bactrias e fungos, como Salmonella typhi, Sthaphylococcus aureus, Escherichia coli, dentre outras.

2.4.2 Estudos fitoqumicos

Das cascas de Bauhinia purpurea foi isolado o flavonide 5,6-dihidrxi-7metxiflavona-6-O--D-xilopiranosdeo (75) sendo indito nesta espcie, a estrutura de tal composto foi proposta baseando-se em dados obtidos pelo emprego de tcnicas de espectroscopias de IV, UV e RMN H1 e C13, alm da espectrometria de massa (YADAVA & TRIPATHI, 2000).
H3CO O

O O OH HO OH OH O

75 Fonte: Yadava & Tripathi, 2000. FIGURA 49: Estrutura do 5,6-dihidrxi-7-metxiflavona-6-O--D-xilopiranosdeo.

Reddy et al. (2003) isolaram das razes de Bauhinia variegata uma flavanona e uma dihidrodibenzoxepina ambas inditas, alm de mais trs flavonides j conhecidos. A flavanona e a dihidrodibenzoxepina foram identificadas como (2S) 5,7-dimetxi-3,4metilenodixiflavanona e 5,6-dihidro-1,7-dihidrxi-3,4-dimetxi-2-metildibenz[b,f]oxepina

respectivamente, dos trs flavonides isolados dois so derivados de canferol e um de quercetina. A figura 50 apresenta a estrutura dos dois metablitos inditos isolados.
O H3CO O O HO O OCH3

CH3

OCH3 O

HO

OCH3

76
Fonte: Reddy et al., 2003.

77

FIGURA 50: Estrutura da flavanona e dihidrodibenzoxepina isoladas das razes de Bauhinia variegata.

Bauhinia tarapotensis trata-se de uma espcie nativa do Equador a qual do extrato metanlico de suas folhas foram isolados sete metablitos, sendo dois inditos nesta espcie. Dentre os metablitos isolados cita-se o flavonide luteolina 4-O--Dglucopiranosdeo (78) e o alcalide cido indol-3-carboxlico (79) (BRACA et al., 2001).

O O HO HO O OH

CH2OH OH OH

COOH

OH

O
78 79

N H

Fonte: Braca et al., 2001

FIGURA 51: Estrutura carboxlico.

da luteolina 4-O--D-glucopiranosdeo e do cido indol-3-

Sharanabasappa et al. (2007) realizaram um estudo fitoqumico com as folhas e sementes de Bauhinia racemosa e Bauhinia purpurea e verificaram a presena de protenas flavonides, glicosdeos, saponinas, taninos e leos volteis e a ausncia de alcalides. Em relao ao teor de flavonides observou-se que os mesmos so mais abundantes nas sementes que nas folhas, sendo Bauhinia purpurea a espcie mais rica em tais compostos. Bauhinia racemosa apresentou maior quantidade de fenis totais e maior quantidade de protenas em suas folhas, Bauhinia purpurea apresentou maior quantidade de protenas em suas sementes. Em Bauhinia racemosa foi detectada a presena dos aminocidos fenilalanina (ver figura 3), metionina (80) e leucina (81), em Bauhinia purpurea observouse a presena do aminocido prolina (82). As sementes de Bauhinia purpurea apresentaram teor de leo cerca de trs vezes maior que o apresentado por Bauhinia racemosa.
OH S O NH2 80 CH3
O NH
2

O H CH CH 81
3 3

OH H N O 82

Fonte: Sharanabasappa et al., 2007.

FIGURA 52: Estrutura dos aminocidos metionina, leucina e prolina. comum o acmulo de flavonides livres e heterosdicos em espcies do gnero Bauhinia (MAIA-NETO et al., 2008) o que foi comprovado por Pizzolatti et al. (2003) que isolaram das folhas de Bauhinia forficata alm do canferol (83), trs flavonides glicosilados derivados deste e um derivado da quercetina. Das flores foi isolado um nico flavonide que foi identificado como 7-O--L-ramnopiranosilcanferol (84).
OH OH OH HO O OH OH OH OH OH O O HO O O O

83

84

Fonte: Pizzolatti et al., 2003.

FIGURA 53: Estrutura dos flavonides canferol e 7-O--L-ramnopiranosilcanferol isolados das folhas e flores de Bauhinia forficata respectivamente.

SALATINO et al. (1999) realizaram a anlise de flavonides das folhas de nove espcies do gnero Bauhinia encontrando heterosdeos derivados dos flavonis canferol, quercetina, isoramnetina e miricetina, como a quercetina-3-arabinosdeo (85) e a isoramnetina-3-glucosdeo (86) isolados das folhas de Bauhinia ungulata e Bauhinia pentandra respectivamente.
OH HO O OH O - Arabinose OH O

OH HO O CH3 O - Glucose OH O

85
Fonte: Salatino et al., 1999.

86

FIGURA 54: Estrutura dos flavonis quercetina-3-arabinosdeo e isoramnetina-3glucosdeo isolados das folhas de Bauhinia ungulata e Bauhinia pentandra

respectivamente.

Das folhas de Bauhinia microstachya foram isolados e identificados trs metablitos: galato de metila (87), hexatriacontano (88) e a flavona vitexina (8), sendo os dois ltimos isolados pela primeira vez nesta espcie (BIANCO & SANTOS, 2005).
O O CH3

HO OH 87

OH

(CH2)20

88

Fonte: Bianco & Santos, 2005.

FIGURA 55: Estrutura do galato de metila e hexatriacontano.

Duarte-Almeida, Negri & Salatino (2004) avaliaram a presena e o teor de leos volteis nas folhas de nove espcies do gnero Bauhinia sendo sete destas pertencentes ao subgnero Bauhinia e as outras duas ao subgnero Phanera, e observaram que apenas as espcies pertencentes ao primeiro apresentaram leos volteis em suas folhas, sendo estes constitudos predominantemente por monoterpenos e sesquiterpenos dentre eles o -pineno (89) e o -cariofileno (90). Bauhinia brevipes e Bauhinia rufa foram as espcies que apresentaram maior teor de leo voltil 0,25 e 0,30% respectivamente.

CH3

CH3

CH2
89
Fonte: Duarte-Almeida, Negri & Salatino, 2004.

90

FIGURA 56: Estrutura do monoterpeno -pineno e do sesquiterpeno -cariofileno.

A anlise fitoqumica preliminar do extrato etanlico do caule de Bauhinia macrostachya revelou a presena de alcalides, taninos, flavonides e esterides, sendo tambm isolada uma frao identificada como D-pinitol (MATOS, MATOS & MEDEIROS, 1986). Apesar da rara ocorrncia de alcalides em espcies do gnero Bauhinia Maia-Neto et al. (2008) isolaram das folhas de Bauhinia ungulata os alcalides harmano (91) e eleagnina (92) alm dos flavonides quercetina (27), quercitrina (26) e quercetina arabinosdeo.

N N H 91
Fonte: Maia-Neto et al., 2008.

NH N H 92 CH 3

CH 3

FIGURA 57: Estrutura dos alcalides harmano e eleagnina.

Como o teor e a composio dos metablitos secundrios podem ser influenciados por fatores ambientais (GOBBO-NETO & LOPES, 2007), Pinheiro et al. (2006) avaliaram a influncia da sazonalidade sobre o flavonide campferitrina (93) nos extratos aquoso e hidroalcolico das folhas de Bauhinia forficata coletadas em duas diferentes regies de Santa Catarina, e puderam observar que houve diferenas significativas no teor de campferitrina entre as duas regies, observaram tambm que o teor de flavonides do extrato hidroalcolico cerca de trs vezes maior que o apresentado pelo extrato aquoso, ambos apresentaram flavonides heterosdicos de canferol e quercetina.
OH HO O OH OH O O HO O OH O O OH HO

93
Fonte: Pinheiro et al., 2006.

FIGURA 58: Estrutura da campferitrina.

Silva et al. (2007a) analisaram o teor de fenis e flavonides totais nos extratos de diferentes partes de 15 (quinze) espcies vegetais da regio amaznica, dentre elas as espcies Bauhinia forficata e Bauhinia macrostachya onde observaram que entre as duas espcies analisadas a casca de B. macrostachya apresentou o maior teor de fenis e flavonides totais. No sendo detectado a presena de flavonides na casca de B. forficata.

Bauhinia malabarica uma espcie bastante utilizada na medicina popular tailandesa, do extrato metanlico de suas folhas foram isolados sete flavonis dos quais cinco inditos nesta espcie. Os flavonis isolados apresentaram-se tanto sob a forma livre como as agliconas 6,8-di-C-metilcanferol-3-metil ter (94), canferol e quercetina, quanto sob a forma heterosdica como a afzelina (95) (ramnosdeo de canferol), a isoquercitrina, quercitrina e hiperosdeo (KAEWAMATAWONG et al., 2008).
OH CH 3 O O OH

H 3C OH O

OCH 3 OH O

O - Ramnose

94
Fonte: Kaewamatawong et al., 2008.

95

FIGURA 59: Estrutura dos flavonis 6,8-di-C-metilcanferol-3-metil ter e afzelina. Da Silva et al. (2007) avaliaram o teor de compostos fenlicos nos extratos aquoso e hidroalcolico das folhas de Bauhinia microstachya e verificaram que o segundo apresentou teor 27,3% maior que o primeiro, os extratos mostraram perfil cromatogrfico diferente quando analisados por CLAE, que revelou tambm que o extrato aquoso apresentou maior variedade de substncias que o extrato hidroalcolico, sendo estas de maior carter polar. Ambos extratos mostraram como componente majoritrio um composto com tempo de reteno idntico ao do cido glico (96), alm da presena de catequina (97).

OH

OH HO O OH

HO OH

OH

OH OH

96
Fonte: da Silva et al., 2007.

97

FIGURA 60: Estrutura do cido glico e da catequina.

Menezes et al. (2007) isolaram do extrato aquoso das folhas de Bauhinia forficata os flavonides campferitrina e 3,7-di-O--ramnopiranosilquercetina, sendo este ltimo tambm isolado do extrato aquoso das folhas de Bauhinia monandra. Paula et al. (2002) analisaram a presena de metablitos secundrios em folhas jovens de Bauhinia forficata e detectaram a presena de dois flavonides glicosilados derivados do canferol um diglicosdeo e o outro triglicosdeo, observaram a ausncia de taninos e alcalides, o que pode ser justificado pelo acmulo preferencial destes em vegetais em fase avanada de desenvolvimento. Bauhinia variegata uma espcie bastante empregada nas culturas popular e indgena da ndia, de suas cascas foram isoladas a saponina lupeol (62) e o fitoesterol estigmasterol (98) alm dos aminocidos cidos glutmico (99) e asprtico (MALI et al., 2007).

OH O NH2 O

HO

98
Fonte: Mali et al., 2007.

99

FIGURA 61: Estrutura do estigmasterol e do cido glutmico.

Das razes de Bauhinia purpurea foram isolados 18 (dezoito) metablitos secundrios sendo onze destes inditos nesta espcie, dentre eles o 5,6-dihidro-1,7dihidrxi-3-metxi-2-metildibenz[b,f]oxepina denominada vulgarmente bauhinoxepina (100) e o 5-[2-(2-hidrxifenil)etil]-3-metxi-2-metilfenol denominado bauhinol E (101). Foram isoladas duas flavanonas, seis bibenzils, oito dihidrodibenzoxepinas, um dihidrobenzofurano e um espirocromano (BOONPHONG et al., 2007).
HO CH 3 O OCH HO
3

OH OH CH 3

OCH

101
Fonte: Boonphong et al., 2007.

102

FIGURA 62: Estrutura da bauhinoxepina e do bauhinol E.

Ramadan et al. (2006) realizaram a caracterizao qumica do leo das sementes de Bauhinia purpurea e observaram que este constitudo predominantemente por lipdios pertencentes diferentes classes dentre elas esteris, glicolipdios, gliceris e cidos graxos. A espcie apresentou abundncia em cidos graxos, sendo o cido linolico (103) predominante, foi detectado a presena do composto tocoferol ao qual atribuda atividade antioxidante. Pinto et al. (2005) realizaram a caracterizao qumica e bioqumica das sementes de Bauhinia variegata e verificaram que estas apresentam alto valor protico e energtico, dentre os cidos graxos detectados prevaleceram os cidos linolico (103) e palmtico (104). A protena predominante a globulina que apresentou uma potente atividade hemaglutinante.

O H 3C
H 3C O

OH
OH

103
Fonte: Pinto et al., 2005.

104

FIGURA 63: Estrutura dos cidos linolico e palmtico.

Silva et al. (2007b) isolaram uma lectina (glicoprotena) das sementes de Bauhinia variegata e determinaram sua seqncia de aminocidos, observando a prevalncia de serina, glicina, treonina, cido asprtico e cido glutmico. A lectina isolada no exerceu atividade hemaglutinante sobre eritrcitos humanos. A lectina apresentou elevada massa molecular, 32.838 Da. A ocorrncia de derivados de oxepinas rara na natureza, porm um estudo fitoqumico com as folhas, cascas e vagens de Bauhinia purpurea levou ao isolamento de cinco dibenz[b,f]oxepinas, sendo quatro delas inditas nesta espcie. Os metablitos isolados so conhecidos por pacharina (105) e bauhiniastatina 1 (106) , 2, 3 e 4 (PETTIT et al., 2006). OH H3C O
H 3C O O

H3CO 105
Fonte: Pettit et al., 2006.

OH

H 3 CO O

OH

106

FIGURA 64: Estrutura da pacharina e da bauhiniastatina 1.

As

espcies

do

gnero

Bauhinia

muitas

vezes

apresentam

atividade

hipoglicemiante, mas quase sempre seu mecanismo de ao no so determinados,

Azevedo et al. (2006) isolaram insulina das folhas de Bauhinia variegata e observaram que esta apresenta massa molecular similar da insulina bovina, e que exerceu potente atividade hipoglicemiante. A insulina foi localizada nos cloroplastos, onde tambm foram encontrados cristais de oxalato de clcio. A presena de insulina em vegetais por si s j um indcio de uma possvel atividade hipoglicemiante. Bauhinia forficata uma espcie bastante comercializada, Engel et al. (2008) realizaram um estudo de controle de qualidade de amostras comerciais de Bauhinia forficata e observaram alto ndice de reprovao, num total de seis amostras analisadas verificou-se que apenas duas so realmente a espcie indicada, dentre as irregularidades apresentadas pelas amostras destaca-se a presena de material estranho bem como ausncia do princpio ativo campferitrina (93). Guimares-Beelen et al. (2006) avaliaram o teor de taninos das folhas de Bauhinia cheilantha em trs fases de seu ciclo fenolgico, observando que tal espcie demonstrou baixo rendimento (7%) de taninos purificados, apresentando maior concentrao de taninos no perodo da florao, porm o perodo de frutificao apresentou menor carter adstringente devido reduo no teor de delfinidina (107).

OH OH HO O
+

OH OH 107
Fonte: Guimares-Beelen et al., 2006.

FIGURA 65: Estrutura do antociano delfinidina. Mendes, Machado e Falkenberg (2006) realizaram uma triagem de glicolpdios em oito espcies vegetais de uso medicinal dentre elas Bauhinia forficata, observando nesta a presena dos lipdios mono, di, tri e tetra galactosildiacilglicerol. A anlise fitoqumica das folhas de Bauhinia kalbreyeri revelou abundncia em flavonides, lactonas triterpnicas e alcalides. Quinonas, taninos e cumarinas foram

detectadas em pequenas concentraes, no foi detectado a presena de saponinas (MURILO et al., 2006). 2.4.3 - Estudos avaliando o potencial antioxidante

Espcies reativas de oxignio so radicais livres gerados como produtos do metabolismo normal dos organismos aerbicos, devido presena de um ou mais eltrons desemparelhados, so espcies altamente reativas que danificam as clulas e esto diretamente ligados ao surgimento de diversas doenas dentre elas cncer e diabetes (da SILVA, 2007) o prprio organismo possui enzimas que atuam na reduo destes radicais, porm quando estes so produzidos excessivamente gerado um estresse oxidativo que atinge diretamente as clulas causando inclusive a ruptura de sua membrana (DAMASCENO et al., 2002). Segundo de Souza et al. (2004) cerca de 200 doenas diferentes so relacionadas produo e acmulo excessivo de radicais livres. alguns compostos polifenlicos tm sido atribudo atividade antioxidante em especial os flavonides, como muitas espcies vegetais produzem tais compostos estas tm despertado grande interesse cientfico sendo frequente os estudos que avaliam o potencial antioxidante de espcies vegetais. Braca et al. (2001) avaliaram o potencial antioxidante das fraes, do extrato metanlico e de sete compostos isolados das folhas de Bauhinia tarapotensis, observando que o extrato metanlico e outras trs fraes testadas apresentaram potente atividade antioxidante, porm menor que a apresentada pelo composto isoacteosdeo (108) o mais ativo de todos.

OH COOCH
O H 3C HO HO OH O OH
2

O OCH 2 CH 2

OH

108
Fonte: Braca et al., 2001.

FIGURA 66: Estrutura do isoacteosdeo.

Kumar et al. (2005) avaliaram o potencial antioxidante do extrato metanlico das folhas de Bauhinia racemosa utilizando diferentes metodologias e puderam observar que em todas elas tal extrato apresentou potente atividade antioxidante, a qual foi associada alta abundncia de compostos fenlicos. A atividade antioxidante mostrou-se dosedependente, sendo tanto maior quanto maior a concentrao do extrato. Murilo et al. (2006) avaliaram o potencial antioxidante dos extratos aquoso e etanlico das folhas e cascas de Bauhinia kalbreyeri , observando que o primeiro apresentou atividade mxima na concentrao de 60 g/ml enquanto a atividade mxima do segundo foi observada na dose de 40 g/ml. O extrato etanlico das cascas mostrou-se mais ativo que o das folhas. Os extratos de diferentes partes de 15 espcies vegetais da regio Amaznica foram testados quanto sua possvel atividade antioxidante, dentre estes destaca-se os extratos das cascas, folhas e razes de Bauhinia macrostachya e Bauhinia forficata, foram empregadas diferentes metodologias. Ambas as espcies apresentaram atividade antioxidante porm a atividade de Bauhinia macrostachya foi mais pronunciada, o potencial antioxidante das duas espcies pode ser atribudo ao alto teor de compostos fenlicos apresentados por estas. Das quinze espcies testadas onze dentre elas Bauhinia macrostachya mostraram-se interessantes fontes de compostos antioxidantes ( SILVA et al., 2007a). Da Silva et al. (2007) avaliaram a atividade antioxidante dos extratos aquoso e hidroalcolico das folhas de Bauhinia microstachya empregando diferentes metodologias e puderam observar que em todos os testes realizados o extrato hidroalcolico mostrou-se mais ativo que o extrato aquoso, o que foi atribudo ao maior teor de compostos fenlicos apresentado por este. Os extratos etanlico de partes areas das espcies Bauhinia forficata, B. variegata e B. candida exibiram atividade antioxidante sobre o radical DPPH (1,1-diphenil-2picrylhydrazil) sendo que para o primeiro e o segundo foi observada atividade antioxidante maior que o extrato de Ginkgo biloba, utilizado como padro. Porm no teste da ao protetora sobre Saccharomyces cerevisiae tais extratos mostraram-se inativos. s espcies do gnero Bauhinia comumente apresentam flavonides os quais so derivados da via do chiquimato, aos metablitos desta via associada atividade antioxidante, no entanto metablitos derivados da via do acetato atuariam na proteo das clulas de S. cerevisiae, o

fato dos extratos de Bauhinia apresentarem atividade antioxidante sobre o DPPH e serem inativas na proteo de S. cerevisiae pode ser atribudo predominncia de compostos derivados da via do chiquimato em tais espcies (da SILVA et al., 2005). ARGOLO et al. (2004) avaliaram o potencial antioxidante dos extratos aquoso, etanlico, clorofrmico, hexnico e de acetato de etila das folhas de Bauhinia monandra sobre o radical DPPH e observaram que destes apenas o extrato hexnico no apresentou atividade antioxidante, no entanto o extrato clorofrmico foi o mais ativo de todos o que pode ser atribudo dois compostos presentes neste extrato um com Rf = 0,40 e outro com Rf = 0,88.

2.5 Estudos com Bauhinia longifolia

Salatino et al. (1999) analisaram a ocorrncia de flavonides nas folhas de Bauhinia longifolia, observando a presena de heterosdeos derivados de canferol, quercetina e miricetina, sendo estes ltimos raramente encontrados em espcies do gnero Bauhinia. Dentre os compostos identificados encontra-se um arabinosdeo do canferol , um galactosdeo de quercetina (109) e um ramnosdeo de miricetina (110).
OH HO O OH O OH O Galactose
O OH O HO O OH Ramnose OH OH

109
Fonte: Salatino et al., 1999.

110

FIGURA 67: Estrutura do galactosdeo de quercetina e ramnosdeo de miricetina isolados das folhas de Bauhinia longifolia.

Duarte-Almeida et al. (2004) realizaram um estudo avaliando a ocorrncia de leo voltil nas folhas de Bauhinia longifolia e constataram que o leo voltil encontrado constitudo de sesquiterpenos, sendo o espatulenol o composto majoritrio seguido pelo cariofileno (90), e em menor quantidade germacreno D, biciclogermacreno,

aromadendreno, isoespatulenol e -cadineno.

3- METODOLOGIA
3.1 - Identificao botnica e herborizao da espcie estudada

Realizou-se no ms de agosto de 2007 a coleta de amostras da espcie vegetal estudada, todas estas apresentando estruturas reprodutivas como flores e frutos. Aps a coleta realizou-se o preparo das exsicatas, que foram obtidas pela prensagem em madeira das amostras coletadas, envolvidas em folhas de jornal e secas em estufa 35C durante o perodo de uma semana. As exsicatas foram enviadas ao Instituto de Cincias Biolgicas (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), onde foram identificadas como tratando-se da espcie Bauhinia longifolia (Bong.) Steudel, uma exsicata foi adicionada ao herbrio da instituio sendo registrada por BHCB 18778.

3.2 Coleta das Folhas de Bauhinia longifolia

Realizou-se no ms de julho de 2008, no perodo da manh, a coleta das folhas da espcie vegetal previamente identificada como Bauhinia longifolia, a coleta foi realizada em uma rea do cerrado de propriedade particular na cidade de Luz-MG. Foram coletadas folhas inteiras, sadias e de tamanho varivel.

3.3 Secagem e processamento das folhas de Bauhinia longifolia

Aps a coleta das folhas de Bauhinia longifolia foi realizado o processo de secagem das mesmas, sombra e temperatura ambiente por um perodo de trs dias. Terminado o processo de secagem realizou-se o processamento das folhas secas, sendo este realizado em processador de alimentos.

3.4 Processo de extrao

O processo de extrao foi realizado pela macerao temperatura ambiente das folhas secas e processadas de Bauhinia longifolia em lcool etlico P.A. (Tedia ), pelo perodo de vinte e quatro horas.

3.5 Concentrao presso reduzida do extrato etanlico das folhas (EEF) de Bauhinia longifolia

O extrato obtido pela macerao das folhas de Bauhinia longifolia foi concentrado presso reduzida em aparelho rotaevaporador, 45C.

3.6 Cromatografia em coluna

Em uma coluna de vidro realizou-se o processo de separao cromatogrfica do EEF (25,9963 g) de Bauhinia longifolia, utilizando-se slica gel 60 PF254 (Merck ) de 70230 mesh como fase estacionria, e hexano (HEX), metanol (MeOH) e acetato de etila (AcOEt) todos de grau analtico pertencentes marca Quimex, e diclorometano (DCM) P.A. (Synth ) como eluentes. A eluio foi realizada com a mistura de solventes em ordem crescente de polaridade empregando-se 100 ml dos seguintes sistemas diferentes propores (v/v) : HEX, HEX/DCM, DCM, DCM-AcOEt, AcOEt e MeOH. As fraes foram coletadas em vials com capacidade para 40 ml cada.

3.7 Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada atravs da eluio em placa cromatogrfica de Slica Gel 60 PF
254

70-230 mesh (Merck ) das fraes obtidas

por cromatografia em coluna do EEF de Bauhinia longifolia utilizando como fase mvel HEX/DCM 1:1 e DCM/AcOEt 1:1. A revelao das placas foi realizada utilizando-se soluo de Sulfato Crico (CeSO4 0,1 %) e expondo-se as placas radiao UV. Aps a eluio, as amostras com perfis cromatogrficos semelhantes foram reunidas.

3.8 Avaliao do potencial antioxidante das fraes e EEF das folhas de Bauhinia longifolia

A anlise preliminar da atividade antioxidante das fraes cromatogrficas e do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia foi realizada com base no mtodo do DPPH que um radical livre estvel temperatura ambiente apresentando colorao violeta. Quando este radical entra em contato com uma substncia capaz de reduzi-lo, a colorao alterada de violeta para amarelo. Desta forma cada amostra foi solubilizada em placa de toque, sendo considerado como controle a amostra solubilizada e reao a mistura da amostra com trs gotas de soluo etanlica de DPPH. Aps a solubilizao (no caso do controle) e a mistura da amostra com a soluo de DPPH (no caso da reao) deixou-se a reao ocorrer temperatura ambiente, observando-se em seguida a colorao.

3.9 Anlise por Cromatografia em fase Gasosa acoplada Espectrometria de Massa (CG-EM)

As fraes que apresentaram atividade antioxidante foram analisadas por CG-EM para tanto empregou-se um cromatgrafo gs de alta resoluo HP 6890 (Hewlett Packard) com coluna capilar HP-1 (1% fenil metil siloxano), apresentando 0,25 mm de dimetro interno, 30 m de comprimento, com espessura de fase de 0,25 m, empregando-se o hlio como gs de arraste com presso constante de 8 psi, sendo a temperatura do injetor 240 C. O modelo do espectrmetro de massa utilizado foi o Agilent 5973 Network Mass Selective Detector com sistema de injeo sem diviso de fluxo (splitless), com 30 s de tempo de vlvula fechada. O espectro foi obtido por impacto de eltrons (70eV), a uma temperatura de 230 C, utilizou-se a biblioteca eletrnica Wiley 275 para comparao dos espectros obtidos.

Botnico

ICB - UFMG BHCB 18778

Identificao Botnica

Coleta

Herborizao
Perodo Matutino

Temperatura Ambiente por 72 hs

Secagem

Processamento

Processador de Alimentos

Etanol por 24 hs

Extrao

Cromatografia

Coluna de Slica Gel

Placa Cromatogrfica de Slica Gel

CCD

Ensaio Antioxidante

Teste do DPPH

Anlise por CG-EM

Caracterizao das Fraes Ativas

Fonte: Dados da autora, 2008.

FIGURA 68: Fluxograma da metodologia empregada

4 RESULTADOS E DISCUSSES

4.1 Aspectos botnicos Ao longo da realizao do presente estudo pde-se perceber que so escassas as informaes sobre os aspectos botnicos de Bauhinia longifolia. Atravs da observao dos caracteres botnicos da espcie estuda foi possvel observar que Bauhinia longifolia trata-se de uma angiosperma tipo leguminosa, possuindo frutos do tipo vagem, folhas com formato bilobado (Figura 69), apresentando geralmente nove nervuras que partem da base da folha at sua parte superior. Devido semelhana entre o formato de suas folhas e o formato da pata de bovinos, Bauhinia longifolia conhecida popularmente como pata-de-vaca sendo empregada na regio principalmente no tratamento do diabetes.

Fonte: Autora, 2007.

FIGURA 69: Folha de Bauhinia longifolia.

As flores de Bauhinia longifolia so brancas e apresentam grande quantidade de nctar. Conforme Raven et al. (2001) espcies que apresentam flores com colorao pouca vistosa, grande produo de nctar e odor forte so geralmente polinizadas por morcegos, tais caractersticas foram observadas em Bauhinia longifolia, somado grande ocorrncia de morcegos na rea onde foi realizada a coleta sugere-se que Bauhinia longifolia apresente polinizao quiropterfila. A figura 70 mostra um espcime de Bauhinia longifolia em fase de florao, tal fotografia foi tirada no ms de novembro do ano de 2007 sugerindo que a florao de Bauhinia longifolia ocorra na primavera.

Fonte: Autora, 2007.

FIGURA 70: Bauhinia longifolia em fase de florao.

4.2 Processo de extrao e fracionamento cromatogrfico O processo de extrao das folhas secas de Bauhinia longifolia em etanol levou obteno de 61,8638 gramas de extrato bruto (Tabela 2) um baixo rendimento era esperado visto que segundo dos Santos (2007) os metablitos secundrios ocorrem em pequenas quantidades nos vegetais. TABELA 2: Rendimento dos processos de extrao e fracionamento cromatogrfico. Processo Extrao Cromatografia Massa Inicial (g) 1148,7000 21,0927 Massa Final (g) 61,8638 2,7922 Rendimento (%) 5,38 13,24

Fonte: Dados da autora, 2008.

O fracionamento cromatogrfico do extrato bruto em coluna de slica gel forneceu um total de 64 fraes (Tabela 3) resultando em uma massa total de 2,7922 gramas. Como a eluio da coluna foi realizada com solventes em escala crescente de polaridade o baixo rendimento das primeiras 17 fraes pode ser atribudo baixa concentrao de compostos de carter altamente apolar, pois de acordo com Falkenberg, dos Santos & Simes (2007) o etanol extrai preferencialmente metablitos sob a forma de heterosdeos (ver figura 39), os quais so geralmente polares, apresentando consequentemente pouca solubilidade em solventes apolares. O maior rendimento foi observado para as fraes 42 49 juntamente com a frao 64, por terem sido obtidas pela eluio com solventes mais polares, possivelmente so constitudas por metablitos com carter polar, tais como os heterosdeos.

TABELA 3 : Massa e rendimento das fraes obtidas pelo fracionamento cromatogrfico do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia. Frao 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Massa (mg) Rendimento (%) Frao 2,40 0,50 0,80 0,80 0,60 3,90 6,80 4,00 3,20 2,30 11,5 14,2 16,5 16,6 17,2 15,6 13,7 19,0 25,7 25,7 21,9 29,7 26,8 22,9 21,1 17,2 31,7 37,3 47,4 39,2 34,8 30,8 0,08 0,02 0,03 0,03 0,02 0,14 0,24 0,14 0,11 0,08 0,41 0,51 0,59 0,59 0,62 0,56 0,49 0,68 0,92 0,92 0,78 1,06 0,96 0,82 0,76 0,62 1,14 1,34 1,70 1,40 1,25 1,10 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 Massa (mg) 29,1 31,5 27,3 28,5 30,7 27,7 21,1 21,3 45,1 284,8 246,2 239,3 108,0 83,8 95,5 86,5 140,6 60,4 34,7 34,4 32,1 31,6 33,5 36,9 33,3 23,2 32,0 57,1 55,3 66,8 53,7 98,4 Rendimento (%) 1,04 1,13 0,98 1,02 1,10 0,99 0,75 0,76 1,62 10,2 8,82 8,57 3,87 3,00 3,42 3,10 5,04 2,16 1,24 1,23 1,15 1,13 1,20 1,32 1,19 0,83 1,15 2,04 1,98 2,39 1,92 3,52

Fonte: Dados da autora, 2008.

As fraes cromatogrficas foram monitoradas por CCD e agrupadas de acordo com seu perfil cromatogrfico, fornecendo um total de 14 fraes (Figura 71), das quais quatro apresentaram fluorescncia sob luz ultravioleta que segundo Zuanazzi & Montanha (2007) caracterstico de flavonides.

Fonte: Autora, 2008.

FIGURA 71: Fraes cromatogrficas obtidas pelo agrupamento de acordo com o perfil cromatogrfico por CCD.

4.3 Avaliao qualitativa da atividade antioxidante

Segundo da Silva (2007) espcies antioxidantes atuam provocando a reduo do DPPH atravs da doao de hidrognio formando o DPPH-H, sua forma reduzida, tal reduo acompanha por uma mudana na colorao da soluo etanlica deste radical que passa de violeta amarelo, essas espcies podem agir tambm pela captura de tais radicais. Apesar de terem sido obtidas 14 fraes cromatogrficas e o extrato bruto das folhas de Bauhinia longifolia, 19 (dezenove) amostras foram analisadas sendo trs destas o extrato bruto e duas fraes repetidas. A anlise preliminar da atividade antioxidante de tais amostras revelou que oito destas demonstraram uma provvel atividade antioxidante,

conforme observado a mudana de colorao de violeta para amarelo apresentada pela mistura de cada uma dessas amostras com a soluo de DPPH. As amostras de nmero 5 e 6 aps a mistura com a soluo de DPPH apresentaram colorao amarelo claro, enquanto as amostras 3, 7 e 9 devido ao fato de apresentarem colorao amarela mesmo antes de serem misturadas com a soluo de DPPH tornou a anlise complexa, sendo difcil concluir se tais amostras apresentam realmente atividade antioxidante. A figura 72 mostra o resultado da anlise qualitativa da atividade antioxidante das primeiras nove amostras, onde controle refere-se amostra solubilizada e reao mistura entre a amostra e a soluo de DPPH.

Fonte: Carmelita Gomes da Silva, 2008.

FIGURA 72: Anlise qualitativa da atividade antioxidante das amostras de 1 9.

Conforme pode ser observado na figura 73 as amostras 14, 15 e 18 apresentaram colorao amarela intensa aps reao com soluo etanlica de DPPH, e provavelmente apresentam atividade antioxidante.

Fonte: Carmelita Gomes da Silva, 2008.

FIGURA 73: Anlise qualitativa da atividade antioxidante das fraes 10 19.

As amostras 9 e 18 apresentaram fluorescncia sob luz UV o que caracterstico de flavonides, tais metablitos segundo Silva et al. (2007a) so as mais eficientes molculas antioxidantes, caso tais amostras apresentem flavonides sua atividade antioxidante pode ser atribuda presena destes. O extrato bruto das folhas de Bauhinia longifolia (amostras 1, 2 e 8) no apresentou atividade antioxidante, o fato de algumas fraes obtidas por seu fracionamento cromatogrfico terem apresentado atividade antioxidante sugere a ocorrncia do fenmeno antagonismo, onde uma ou mais substncias presentes no extrato bruto inibem a atividade de um ou mais compostos ativos, segundo Sixel & Pecinalli (2005) tal fenmeno dificulta a interpretao dos resultados, devido ao mascaramento dos efeitos do extrato bruto.

A tabela 4 apresenta o resultado da anlise qualitativa da atividade antioxidante das fraes cromatogrficas e do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia bem como a relao entre a numerao das fraes e a numerao utilizada no ensaio antioxidante.

Legenda BLC1FR01 BLC1FR02 BLC1FR03 BLC1FR04 BLC1FR05 BLC1FR06 BLC1FR07 BLC1FR08 BLC1FR09 BLC1FR10 BLC1FR11 BLC1FR12 BLC1FR13 BLC1FR14 BLC1FR15 BLC1FR16 EBFBL 01 EBFBL 02 EBFBL 08

Fraes 28 11 16 17 26 27 29 30 40 41, 43 e 45 42 46 47 e 49 48 50 52 53 54 59 54 59 A 60 64 60 64 A Extrato Bruto Extrato Bruto Extrato Bruto

Nmero 17 19 18 12 09 16 13 06 04 11 10 03 07 05 15 14 01 02 08

Amostras Ativas

X X X X X

BLC1FR: Frao obtida pelo fracionamento cromatogrfico do extrato bruto das folhas de Bauhinia longifolia ; EBFBL = Extrato Bruto das Folhas de Bauhinia longifolia.
Fonte: Dados da autora, 2008.

TABELA 4: Resultados da anlise qualitativa da atividade antioxidante das fraes cromatogrficas e do extrato etanlico das folhas de Bauhinia longifolia.

4.4 Caracterizao qumica por CG-EM das fraes ativas

A anlise por CG-EM da frao nmero 3 (fraes 17-26) conforme pode ser observado na figura 74 revelou a presena de dois compostos majoritrios com tempos de reteno de 12,95 e 29,78 minutos respectivamente.

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 74: Cromatograma obtido para a frao nmero 3.

O espectro de massa (Figura 75) obtido para o composto com tempo de reteno de 12,95 minutos revelou que o mesmo apresenta massa molecular de 220,18 g e que 96 % de probabilidade equivale ao sesquiterpeno (+) - espatulenol. Duarte-Almeida et al. (2004) observaram que tal sesquiterpeno o composto majoritrio do leo voltil obtido das folhas de Bauhinia longifolia.

HO

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 75: Espectro de massa do composto referente ao sesquiterpeno (+) - espatulenol.

Na frao nmero 5 (fraes 30-40) foi isolado um composto com tempo de reteno de 17,71 minutos. Conforme pode ser observado na figura 76, tal composto apresentou quase 90 % de abundncia, demonstrando a eficincia do processo de separao cromatogrfica.

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 76: Cromatograma obtido para a frao nmero 5.

O espectro de massa do composto com Rt = 17,665 minutos, revelou que o mesmo apresenta massa molecular de 430,38 g e que 96 % de probabilidade equivale ao caroteno tocoferol. Como pode ser observado o espectro de massa de tal composto apresentou como fragmentos principais ons com m/z 430, 207 e 165, sendo este ltimo o de maior abundncia. A fim de confirmar a identidade de tal composto realizar-se- futuramente uma anlise por RMN H1.

CH3 HO H3C O CH3 CH3 H3C H3C CH3

H3C

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 77: Espectro de massa do composto tocoferol.

O tocoferol uma das oito vitaminas do complexo E, nos vegetais atua na proteo contra danos causados pela radiao UV e pelos radicais livres (de SIQUEIRA et al., 2003). Segundo Arceo (2004) o tocoferol considerado um dos mais eficientes compostos antioxidantes, tal composto atua na inibio da peroxidao lipdica, consequentemente diminuindo a produo e acmulo de radicais livres, protegendo a clula do estresse oxidativo (de OLIVEIRA, 2005).

A anlise por CG-EM da frao nmero 8 (frao 46) revelou a presena de trs compostos majoritrios com tempos de reteno de 12,96 , 17,99 e 22,56 minutos respectivamente (Figura 78). O composto com Rt = 12,96 minutos probabilidade de 99% equivale ao (+) espatulenol.

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 78: Cromatograma obtido para a frao nmero 8.

O espectro de massa do composto com Rt = 22,56 minutos (Figura 79) revelou que tal composto apresenta massa molecular de 296,31 gramas e frmula molecular C20H40O, e que 91% de probabilidade equivale ao 3,7,11,15 tetrametil - 2 - hexadecen -1- ol diterpeno conhecido vulgarmente por fitol. Neste espectro o pico correspondente ao on molecular (m/z = 296) apresentou-se em pequena abundncia, sendo os fragmentos com m/z 71 e 123 os mais abundantes. Segundo de Siqueira et al. (2003) o fitol um diterpeno de grande ocorrncia em vegetais, que por se tratar de um constituinte na molcula de clorofila est presente em todas as espcies clorofiladas.

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 79: Espectro de massa do diterpeno fitol.

A anlise da frao nmero 12 (frao 53) revelou a presena de um composto majoritrio com tempo de reteno de 35,55 minutos (Figura 80) apresentando aproximadamente 50% de abundncia.

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 80: Cromatograma obtido para a frao nmero 12 .

O espectro de massa do composto com Rt = 35,55 minutos, revelou que o mesmo apresenta massa molecular igual 414,39 gramas e frmula molecular C29H50O sendo 99% de probabilidade equivalente ao (22R,24S) - 22,24 dimetilcolesterol. O espectro revelou que os principais fragmentos foram os ons com m/z 414, 55 e 43.

H H HO H

Fonte: Wilton Jos Ferreira, 2008.

FIGURA 81: Espectro de massa do composto (22R,24S) - 22,24 dimetilcolesterol.

A tabela 5 mostra os compostos majoritrios caracterizados nas amostras com potencial antioxidante, utilizando-se a biblioteca eletrnica Wiley 275.

TABELA 5: Compostos majoritrios caracterizados por CG-EM das amostras com potencial antioxidante.

Tempo de Reteno (min) 12.95 12.96 17.71 22.56 35.55

ons Principais (m/z) 205, 91, 41 205, 91, 41 430, 207, 165 123 , 71 414, 55, 43

Composto (Probabilidade%) (+) - espatulenol (96) (+) - espatulenol (99) tocoferol (96) fitol (91) 22,24-dimetilcolesterol (99)

Frao 03 08 05 08 12

Fonte: Dados da autora, 2008.

5 CONCLUSO

Bauhinia longifolia apresenta florao no perodo da primavera e aparentemente polinizao quiropterfila, sendo de grande ocorrncia nas reas de cerrado da cidade de Luz-MG. Os processos de extrao das folhas de Bauhinia longifolia em etanol e o fracionamento cromatogrfico do extrato bruto apresentaram rendimento de 5,38 e 13,24% respectivamente. Bauhinia longifolia demonstrou-se uma interessante fonte de substncias com potencial antioxidante sobre o radical DPPH, porm o extrato bruto de suas folhas foi inativo, sugerindo a ocorrncia de antagonismo. A anlise por CG-EM das fraes com potencial antioxidante revelou que as mesmas so constitudas por: terpenos como o (+) - espatulenol e o fitol, o lipdio 22,24 dimetilcolesterol e o caroteno - tocoferol, um dos mais eficientes compostos antioxidantes existentes. A busca por substncias com potencial antioxidante de extrema importncia em especial quando se tratando de substncias de origem natural. Bauhinia longifolia demonstrou-se uma promissora fonte de substncias antioxidantes. Visto que por motivo de fora maior no foi possvel realizar a anlise por CG-EM das amostras de nmero 7 e 15 e do extrato bruto das folhas de Bauhinia longifolia torna-se indispensvel a posterior realizao desta. Considerando-se que foi realizado somente a anlise qualitativa e um fracionamento cromatogrfico, uma futura avaliao quantitativa da atividade antioxidante bem como o subfracionamento cromatogrfico das fraes ativas e posterior anlise qumica por mtodos como RMN H1 e RMN C
13

sero futuramente realizados a fim de se comprovar

quantitativamente o potencial antioxidante de tais fraes, obter compostos mais puros e elucidar suas estruturas, respectivamente. Um objetivo futuro trata-se de publicar em literatura especializada os resultados do presente estudo a fim de aumentar as referncias sobre Bauhinia longifolia as quais so bastante escassas.

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