HPLC Mecanismos de Retencin Adsorcion superficial: -La separacin se logra por las diferencias en solubilidad (en fase mvil)

y de retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos. -Slica (90%) y almina (10%) son las fases estacionariasms comunes. -Tanto las molculas de solutos como de disolvente sonatradas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria. - Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo (acetona, cloruro de metilo, etc.). Cromatografa de Particin:

La separacin se basa en el reparto o distribucin de los solutos entre una fase mvil lquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un slido inerte. La discriminacin se produce por diferencias de solubilidad. El mecanismo de actuacin es similar al de un modelo de extraccin en contracorriente. Las especies ms retenidas sern las que presenten mayor afinidad por la fase estacionaria que por la fase mvil (eluyente). La separacin de los solutos se basa en las diferencias en esta solubilidad relativa. Exiten dos tipo: Fase normal: fase estacionaria polaar y fase mvil apolar (estacionaria: silica gel)
Fase reversa: fase estacionaria apolar y fase mvil polar (por el caractar hidrofilico de las muestras) (estacionaria: C18)

Cromatografa intercambio Inico:

La CI est relacionado con los mtodos modernos y eficaces para la separacin y determinacin de iones que se basan en el uso de las resinas de intercambio inico.
La limitacin de estos detectores provena de la elevada concetracin de electrolitos que se requiere para eluir la gran mayora de los iones analito en un tiempo razonable. En consecuencia, la conductividad de los componentes tiende a enmascarar la de los analitos, y por ello se reduce considerablemente la sensibilidad del detector. El problema de la elevada conductividad se resuelve con l columna supresora de luyente inmediatamente despus de la columna analtica de intercambio inico.

La columna supresora est rellena con una segunda resina de intercambio inico que convierte eficazmente los iones del disolvente en especies moleculares poco onizadas sin alterar los iones del analito. ANIONES: Fosfatos, fluoruros, cloruros, bromuro, nitratos, nitritos, sulfatos. CATIONES: Litio , Sodio Amonio Potasio, Magnesio, Calcio RANGOS DE MEDIDA 20 Ul.

Deteccion UV(directa e indirecta) y deteccin electroqumica ) los ioenes a determinar sean susceptibles a oxidarse o re ducirse) Tanto fase estacionaria como fase mvil son de naturaleza inica. La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.

Cromatografia de exclusin Molecular :

Como fase estacionaria se emplea un material porosoinerte (gel) que permite la discriminacin entre los solutos segn su tamao. Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando con la fase mvil en el frente de la misma. Se muestra especialmente til para determinar el rango molecular de polmeros, protenas, etc

Caracteristicas de la FASE MOVIL Alta pureza (calidad HPLC). Inactividad frente a la fase estacionaria.

Baja viscosidad. Compatibles con la muestra. Facilitar la recuperacin de la muestra. Compatibilidad con el sistema de deteccin. Segn su composicin vare o no con el tiempo: Elucin isocrtica Elucin en gradiente

Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC. La desgasificacin reduce el riesgo de formacin de burbujas en la columna o en el detector. Posibilidades: Desplazamiento con un gas menos soluble (He) Aplicacin de vaco Sonicacin Calentamiento BOMBAS

Deben generarl altas presiones 400kg/cm2 Resistentes a la corrosin Deben manter un flojo libre de pulsaciones Genrar intervalos de volumens de solvente (0.1 a 10 ml/min) Permir un control y reproducibilidad del flujo del solvente.

Exixten bombas Mecanicas: reciprocas y de desplazamiento continuo, Neumaticas o de presin constante INYECTORES Se debe evitar la entrada de burbujaas PRECOLUMNAS

Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la muestra o de eluyente. Composicin de relleno debe ser similar a de la columna pero de partculas ms grandes

COLUMNAS

Administrar el relleno aumenta la eficiencia pero tambin la presin del trabajo Miden de 10 a 30 cm , son rectas, los dimetros de 4mm y 10mm Tamaa de partculas de relleno de 3,5 o 10 um o Fase normal: Silica, alumina, amino (-NH2), Ciano (-CN), Diol o Fase reversa: C-2 o RP-2, C-8 o RP-8, C-18 o RP-18 Vetajas de columnas cortas: o Tiempo de anlisis reducidos, mayor sensibilidad, menor consumo de disolventes, menor dispersin de los solutos a analizar, ahorro de costos

DETECTORES Sensibilidad, linealidad, confiabilidad, bajo volumen muerto y fcil de usar Principales detectores: Detector de absorbancia Uv/ visible:

Es el mas usado La seal es proporcional a la concentracin del soluto La fase mvil no debe interferir en la deteccin Se detectan alquenos compuestos aromticos y aquellos q tienen uniones mltiples de C,O,N y S Con lmparas de deuterio Ley de Beer, longitus especificas para el analito
Detector Fotodiodos:

La muestra es atravesada por luz blanca y el policromador dispersa en diversas longitudes de onda que la componen y las hacen incidir en la fila de fotodiodos a acada diodo incide una longitud de onda diferente y manda una informacin al sistema de anlisis. Solo se puede usa si la elucin es isocratica Responden casi a todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad. Son muy sensibles a los cambio de temperatura, deben estar termostatizados.

Detector de Fluorescencia

Para analitos fluorescentes por naturaleza El solvente no interfiere por no tener naturaleza fluorescente Son dealta sensibilidad

Detector de Conductividad:

Basados en una respuesta diferencial y no absoluta Empleados en fotometra de intercambio inico Tiene baja sensibilidad y sensible a los contaminantes de la fase mvil

Detector de dispersin de luz

Solutos q sean claramente menos voltiles q la fase mvil El eluyente es evaparado por una corriente de N2 dejando una nube de finas partculas solidad q entran a la zona de deteccin

Indice de polaridad Magnitud que permite cuantificar la polaridadrelativa de una mezcla de solventes quecomponen la fase mvil IPAB =(vol. relativo de A x IP de A) + (vol. relativo de B x IP de B) Tcnicas de Optimizacion de la cromatografa HPLC

Reducir la altura del plato Modificar la fase mvil Aumentar la velocidad de flujo Aumentar el dimetro de la columna

Que Tecnica aplicar:

Para pesos moleculares mayores a 10000 usar permeacion por geles y cromatografa reversa Para pesos menores a 10000 y especies inicas se utiliza cromatografa de Intercambio Inico Para especies no ionicas, polares y pequeas se utiliza la cromatografa de particin o reparto. Para especies no polarees e ismeros esetruccturales, hidrocarburos alifticos y alcoholes alifticos se utiliza cromatografa por adsorcin liquido-solido.

Ventajas del HPLC

Es caro pero sumamente efectivo Optimiza cientos de veces la velocidad de cromatografa en columna El altamente reproducible) siempre q se utilices las mismas condiciones de corrida)

FASE MOVIL

En cromatografa se pueden usar eluciones con un solo solvente (elucin isocraticas)o con diferentes solventes que varan sus concentraciones con el tiempo (elusin en gradiente) En esta segunda forma de suministrar solventes suele generar mejores separaciones Para es esto es necesario utilizar una computadora para promagamar la variacin de solvente en funcin del tiempo de corrida.

Propiedades q se puede variar: fuerza ionica, ph y constante dielctrica

MUESTRAS

Debe estar en estado liquido o en solucin Debe ser compatible tanto con la fase mvil con la fase estacionaria Generalmente se inyectan 5 a 10 uL

La preparacin del a muestra es totalmente diferente y puede consistir en hiperfiltracion, dilucin, preconcentracion, extraccin, etc .