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PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA VEGETAL

PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRE PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO

1.

INTRODUCCIN
Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro":
-

Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como
macronutrientes
Vitaminas tales como Riboflavina, tiamina, piridoxina, cido nicotnico, cido pantotnico,
biotina, y cido flico.
Aminocidos tales como L-glutamina, asparragina y cistena
Hexitoles como mio-inositol
Hormonas y reguladores del crecimiento
Fuente de carbono
Agente gelificante
...

Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como
"soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentracin que
suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba
slo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la
exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que la pesada
que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de precisin.
Las soluciones madre se conservan en frigorfico y en bote topacio durante algunos meses,
desechndose ante cualquier seal de precipitacin.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos, hormonas, vitaminas
y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se
necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bin en solucin.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir
volmenes determinados y congelarlos en un frigorfico de 4 estrellas.
2.

OBJETIVO.

Preparar soluciones madre necesarias para la composicin de los medios de cultivo que se
emplearn en el conjunto de las prcticas de la asignatura.
3.

MATERIAL
Botes de cristal o de plstico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que
en algunos casos habrn de ser de color topacio para proteger de la luz determinados compuestos
que son fotosensibles
Granatario
Balanza de precisin
Esptulas de distinto tamao para pesar
Embudos de pesar
Agitador magntico
Imanes
Vasos de precipitados
Probetas
Matraces aforados
Eppendorf
Compuestos qumicos
Agua destilada

4.

METODOLOGA

Se prepararn soluciones madre de las sales minerales, vitaminas, aminocidos y hormonas


necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la composicin de cada uno de ellos:
Sales mineralesMS (Murashige and Skoog, 1962)

Sales minerales DKW modificado

(g/l)
(NH4 )NO3
KNO3

(g/l)
1.650
1.900

CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
KH2PO4
FeSO4.7H2O
Na2EDTA. 2H2O

0.440
0.370
0.170
0.0278
0.0372

MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Mioinositol
Tiamina HCl
Acido nicotnico
Piridoxina HCl
Glicina

0.0169
0.0086
0.0062
0.00083
0.00025
0.000025
0.000025
0.100
0.0001
0.0005
0.0005
0.002

(NH4)NO3

1.416

Ca (NO3)2 3H2O

1.811
(1.960 si es 4 H2O)
0.147

CaCl2 2H2O
MgSO4 7H2O
KH2PO4
FeSO4 7H2O
Na2 EDTA 2H2O
K2SO4
Mn SO4 H2O
Zn SO4 7H2O
BO3H3
KI
Na2MoO4 2H2O
Cu SO4 5H2O
Co Cl2 6H2O
Mioinositol
Tiamina H Cl
c. nicotnico
Piridoxina. HCl

0.74
0.258
0.00676
0.0908
1.56
0.0338
0.0212

Biotina D(+)
Glutamina (base libre )
L-Cystena H Cl
Pantotenato de Ca

0.0124
0.00166
0.0005
0.00005
0.00005
0.1
0.001
0.001
0.001
0.00001
0.001
0.001
0.1

Lo ms normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la


preparacin de la solucin final sea ms rpida y tenga menos margen de error.
Veamos la composicin de cada una de las soluciones madre de ambos medios
Soluciones madre del medio MS
(g/l)
MACRONUTRIENTES (10 X)
NH4NO3
16.5
KNO3
19
MgSO4.7H2O
3.7
KH2PO4
1.7

Soluciones madre del medio DKW modificado


(g/l)
A (10 X)
NH4NO3
14.16
CaCl2 2 H2O
1.47
Ca (NO3)2 3 H2O
18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )
B (10 X)
KH2PO4

2.58
2

Soluciones madre del medio MS


(g/l)
CALCIO, (10 X)
CaCl2.2H2O
4.4

Soluciones madre del medio DKW modificado


(g/l)
C(10 X)
K2SO4
15.6

MICRONUTRIENTES (100 X)
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O

1.69
0.86
0.62
0.083
0.025
0.0025
0.0025

D (10 X)
Mg SO4 7 H2O

HIERRO Y EDTA (10 X)


FeSO4.7H2O
Na2EDTA.2H2O

0.278
0.372

VITAMINAS (20 X)
Mioinositol
Tiamina HCl
Acido nicotnico
Piridoxina HCl
Glicina

2
0.002
0.01
0.01
0.04

7.4

E (50 X)
Mn SO4 7H2O
Zn SO4 7H2O
BO3H3
KI
Na2MoO4 2H2O
Cu SO4 5 H2O
Co Cl2 6H2O

1.69
1.06
0.6.2
0.083
0.025
0.0025
0.0025

F1 (100 X)
Glutamina (base libre )
L-Cistena HCl

0.1
0.1

F2 (100 X)
Biotina D(+)
Tiamina H Cl
c. Nicotnico
Piridoxina
Pantotenato de Ca

0.001
0.1
0.1
0.1
0.1

G (10 X)
Mioinositol

H (10 X)
Fe SO4 7H2O
Na2 EDTA 2H2O

0.338
0.454

Hormonas (1000 X)
BAP
IBA

1
1

Se establecern 8 equipos de trabajo por cada grupo de prcticas (2 en cada lateral de una mesa).
Normas generales a la hora de pesar
-

Comprobar los clculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre estn
expresados para un litro

Leer las caractersticas del reactivo que se va a pesar. Algunos son txicos por inhalacin o en
contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.

Desde 0.01 g se utilizar el granatario. Para valores inferiores la balanza de precisin.

Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada. Nunca se debe
pesar directamente sobre el platillo de la balanza.

Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que
est limpia y seca. Es una precaucin que evita la contaminacin de los reactivos

Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que
en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tom.

Normas generales a la hora de preparar las disoluciones


-

Si la disolucin se va a remover con un agitador mecnico el mejor recipiente es un vaso de


precipitados. Si la agitacin es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.

Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen total de agua

Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno a uno y teniendo la
precaucin de no aadir uno hasta que el otro est totalmente disuelto.

Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de
precipitados o un erlenmeyer.

Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren
los siguientes datos:
-

Tipo de solucin. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc

Grado de concentracin. Ej 100 X (100 veces ms concentrada que la solucin final)

Componentes con frmula y peso en g/l

Fecha de preparacin

Equipo 1 Preparar 250 ml de la solucin de macronutrientes del medio MS.


Equipo 2 Preparar 250 ml de la solucin de Calcio MS y 250 ml de la solucin de Hierro y EDTA MS.
En este segundo caso, se deber poner en el recipiente donde se prepara la disolucin un
volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solucin de hierro.
Cuando se haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total
disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco topacio en
el frigorfico
Equipo 3 Preparar 250 ml de la solucin de micronutrientes del medio MS
Equipo 4 Preparar 250 ml de la solucin de vitaminas del medio MS
Equipo 5 Preparar 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A ,B, C y D del medio DKW
Equipo 6 Preparar 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del medio
DKW.
-

La solucin H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la


disolucin un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de
hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitacin las sales de EDTA
hasta su total disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en
frasco topacio en el frigorfico

Hormonas. Se prepararn 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se

proceder del siguiente modo: Se pesar la hormona en el un tubo aforado. Se le aaden unas
gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuacin se va aadiendo poco a poco y agitando,
agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf. Se rotulan
cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparar 250 ml de la solucin E
Equipo 8 Preparar 250 ml de la solucin F2. Primero se preparan 500 ml de la solucin de biotina. De
estos 500 ml, se toman 250ml y se les aade la cantidad correspondiente a 250 ml del resto de las
vitaminas.

5.

BIBLIOGRAFA
lvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prcticas de Biotecnologa

Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)


Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort.
Science, 19(4).
Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologa Plantarum, 15, 473-497.
Revilla Bahillo, ngeles y Ords, Ricardo. Guiones de prcticas de Biotecnologa Vegetal.
Universidad de Oviedo

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