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1.
INTRODUCCIN
Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro":
-
Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como
macronutrientes
Vitaminas tales como Riboflavina, tiamina, piridoxina, cido nicotnico, cido pantotnico,
biotina, y cido flico.
Aminocidos tales como L-glutamina, asparragina y cistena
Hexitoles como mio-inositol
Hormonas y reguladores del crecimiento
Fuente de carbono
Agente gelificante
...
Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como
"soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentracin que
suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba
slo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la
exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que la pesada
que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de precisin.
Las soluciones madre se conservan en frigorfico y en bote topacio durante algunos meses,
desechndose ante cualquier seal de precipitacin.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos, hormonas, vitaminas
y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se
necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bin en solucin.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir
volmenes determinados y congelarlos en un frigorfico de 4 estrellas.
2.
OBJETIVO.
Preparar soluciones madre necesarias para la composicin de los medios de cultivo que se
emplearn en el conjunto de las prcticas de la asignatura.
3.
MATERIAL
Botes de cristal o de plstico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que
en algunos casos habrn de ser de color topacio para proteger de la luz determinados compuestos
que son fotosensibles
Granatario
Balanza de precisin
Esptulas de distinto tamao para pesar
Embudos de pesar
Agitador magntico
Imanes
Vasos de precipitados
Probetas
Matraces aforados
Eppendorf
Compuestos qumicos
Agua destilada
4.
METODOLOGA
(g/l)
(NH4 )NO3
KNO3
(g/l)
1.650
1.900
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
KH2PO4
FeSO4.7H2O
Na2EDTA. 2H2O
0.440
0.370
0.170
0.0278
0.0372
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Mioinositol
Tiamina HCl
Acido nicotnico
Piridoxina HCl
Glicina
0.0169
0.0086
0.0062
0.00083
0.00025
0.000025
0.000025
0.100
0.0001
0.0005
0.0005
0.002
(NH4)NO3
1.416
Ca (NO3)2 3H2O
1.811
(1.960 si es 4 H2O)
0.147
CaCl2 2H2O
MgSO4 7H2O
KH2PO4
FeSO4 7H2O
Na2 EDTA 2H2O
K2SO4
Mn SO4 H2O
Zn SO4 7H2O
BO3H3
KI
Na2MoO4 2H2O
Cu SO4 5H2O
Co Cl2 6H2O
Mioinositol
Tiamina H Cl
c. nicotnico
Piridoxina. HCl
0.74
0.258
0.00676
0.0908
1.56
0.0338
0.0212
Biotina D(+)
Glutamina (base libre )
L-Cystena H Cl
Pantotenato de Ca
0.0124
0.00166
0.0005
0.00005
0.00005
0.1
0.001
0.001
0.001
0.00001
0.001
0.001
0.1
2.58
2
MICRONUTRIENTES (100 X)
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
1.69
0.86
0.62
0.083
0.025
0.0025
0.0025
D (10 X)
Mg SO4 7 H2O
0.278
0.372
VITAMINAS (20 X)
Mioinositol
Tiamina HCl
Acido nicotnico
Piridoxina HCl
Glicina
2
0.002
0.01
0.01
0.04
7.4
E (50 X)
Mn SO4 7H2O
Zn SO4 7H2O
BO3H3
KI
Na2MoO4 2H2O
Cu SO4 5 H2O
Co Cl2 6H2O
1.69
1.06
0.6.2
0.083
0.025
0.0025
0.0025
F1 (100 X)
Glutamina (base libre )
L-Cistena HCl
0.1
0.1
F2 (100 X)
Biotina D(+)
Tiamina H Cl
c. Nicotnico
Piridoxina
Pantotenato de Ca
0.001
0.1
0.1
0.1
0.1
G (10 X)
Mioinositol
H (10 X)
Fe SO4 7H2O
Na2 EDTA 2H2O
0.338
0.454
Hormonas (1000 X)
BAP
IBA
1
1
Se establecern 8 equipos de trabajo por cada grupo de prcticas (2 en cada lateral de una mesa).
Normas generales a la hora de pesar
-
Comprobar los clculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre estn
expresados para un litro
Leer las caractersticas del reactivo que se va a pesar. Algunos son txicos por inhalacin o en
contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.
Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada. Nunca se debe
pesar directamente sobre el platillo de la balanza.
Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que
est limpia y seca. Es una precaucin que evita la contaminacin de los reactivos
Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que
en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tom.
Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen total de agua
Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno a uno y teniendo la
precaucin de no aadir uno hasta que el otro est totalmente disuelto.
Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de
precipitados o un erlenmeyer.
Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren
los siguientes datos:
-
Fecha de preparacin
Hormonas. Se prepararn 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se
proceder del siguiente modo: Se pesar la hormona en el un tubo aforado. Se le aaden unas
gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuacin se va aadiendo poco a poco y agitando,
agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf. Se rotulan
cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparar 250 ml de la solucin E
Equipo 8 Preparar 250 ml de la solucin F2. Primero se preparan 500 ml de la solucin de biotina. De
estos 500 ml, se toman 250ml y se les aade la cantidad correspondiente a 250 ml del resto de las
vitaminas.
5.
BIBLIOGRAFA
lvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prcticas de Biotecnologa