Produo de Hidromel: efeito das condies de fermentao

Teresa Maria da Cruz Gomes

Dissertao apresentada Escola Superior Agrria de Bragana para obteno do Grau de Mestre em Biotecnologia

Orientado por Prof Doutora Maria Letcia Miranda Fernandes Estevinho Prof Doutora Elsa Cristina Dantas Ramalhosa

Bragana 2010

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Biologia e

Biotecnologia e de Agro-Indstrias do Departamento de Produo e Tecnologia Vegetal da Escola Superior Agrria de Bragana e contou com o apoio financeiro de uma bolsa de investigao concedida no mbito do Projecto PTDC/AGR-ALI/68284/2006 Optimizao das Condies de Produo de Hidromel, financiado pela Fundao para a Cincia e Tecnologia.

Agradecimentos
A elaborao deste trabalho s foi possvel graas colaborao e ao contributo de vrias pessoas, s quais gostaria de exprimir o meu agradecimento e profundo reconhecimento.

Em primeiro lugar, Professora Doutora Letcia Estevinho, pelo acompanhamento e orientao, transmitindo-me os melhores conhecimentos, contribuindo para o meu crescimento intelectual. Agradecer a dedicao, a disponibilidade e a simpatia com que sempre me recebeu.

Doutora Elsa Ramalhosa, pelo tempo que generosamente me dedicou, pelo apoio durante o processo de definio e orientao, pelos conhecimentos enriquecedores que me transmitiu, pela compreenso, ajuda e amizade.

Doutora Teresa Dias, ao Engenheiro Joo Verdial Andrade e ao Doutor Vasco Cadavez, pela disponibilidade e pelos conhecimentos cientficos transmitidos.

Ao Eng Jorge S Morais, pela disponibilidade, ajuda, pacincia e pela crtica construtiva.

Aos meus amigos, pelo incentivo, apoio e amizade, em especial Carlinha que me ajudou a tornar a realizao deste trabalho possvel. Obrigado pelos bons momentos passados que ajudaram a superar as dificuldades do trabalho.

s funcionrias e colegas do laboratrio de Microbiologia e do laboratrio de Agroindstrias, em especial Cu, pela disponibilidade, amizade e ajuda tcnica prestada ao longo do trabalho experimental.

Ao Mrcio, pela constante motivao, pacincia e carinho que me dedicou ao longo deste trabalho.

Aos meus pais e irmos, especialmente a ti me, pelo apoio incondicional, amor e incentivo nas horas mais difceis.

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ndice
RESUMO .................................................................................................................................... vi ABSTRACT ............................................................................................................................... vii NDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ viii NDICE DE TABELAS .............................................................................................................. x

Captulo I: Introduo ......................................................................................................... 11

1. 2. INTRODUO GERAL AO TEMA E PRINCIPAIS OBJECTIVOS DO TRABALHO 12 INTRODUO .................................................................................................................. 13 2.1. O MEL ........................................................................................................................ 13 Composio e propriedades fsico-qumicas ....................................................... 13

2.1.1 2.2

HIDROMEL ................................................................................................................ 14

2.2.1 Problemas inerentes ao processo de produo de hidromel ...................................... 15 2.3 OPTIMIZAO DAS CONDIES DE FERMENTAO ASSOCIADAS ELABORAO DE HIDROMEL ......................................................................................... 17

Captulo II: Material e Mtodos ......................................................................................... 20

3. DESCRIO GERAL DOS ESTUDOS REALIZADOS .................................................. 21 Estudo I) Produo de hidromel s escalas laboratorial e piloto ensaios preliminares ........ 21 I.1. I.2 I.3 I.4 Microrganismo utilizado e preparao dos mostos ................................................. 21 Fermentao do mosto escala laboratorial............................................................ 22 Fermentao do mosto escala piloto ..................................................................... 24 Quantificao de glucose, frutose, glicerol e cido actico..................................... 24

Estudo II) Anlise do processo de fermentao em relao aos factores, temperatura e concentrao de nutrientes adicionados ao mosto, para duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae atravs de um desenho experimental ............................................ 24 II.1 II.2 II.3 Microrganismos utilizados e preparao dos mostos .............................................. 25 Fermentaes ........................................................................................................... 25 Desenho experimental ............................................................................................. 25

Estudo III) Produo de hidromel escala piloto segundo as melhores condies determinadas no Estudo II) de forma a obter um hidromel doce e outro seco. ................ 28 III.1 III.2 III.3 III.4 III.5 Microrganismo ........................................................................................................ 28 Preparao dos mostos ............................................................................................ 28 Fermentaes escala piloto ................................................................................... 29 Provas organolpticas .............................................................................................. 31 Anlise estatstica .................................................................................................... 32

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Captulo III: Resultados e Discusso ................................................................................. 33

Estudo I) Produo de hidromel s escalas laboratorial e piloto ensaios preliminares ............ 34 I.1 I.2 Produo de hidromel escala laboratorial ................................................................. 34 Produo de hidromel escala piloto .......................................................................... 34

Estudo II) Anlise do processo de fermentao em relao aos factores, temperatura e concentrao de nutrientes adicionados ao mosto, para duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae atravs de um desenho experimental ............................................ 37 II.1 Desenho experimental ................................................................................................. 37

II.1.1 Evoluo das vrias fermentaes realizadas ao longo do tempo para as duas leveduras 38 II.1.2 Tratamento estatstico dos resultados ................................................................. 44

Estudo III) Produo de hidromel escala piloto segundo as melhores condies determinadas no Estudo II) de forma a obter um hidromel doce e outro seco. ................ 56 III.1 III.2. III.3 Produo de hidromel doce ..................................................................................... 57 Produo de hidromel seco .................................................................................. 58 Provas organolpticas Anlise Estatstica ............................................................ 60

Captulo IV: Concluses Finais .......................................................................................... 63

CONCLUSES FINAIS ............................................................................................................. 64

Captulo V: Referncias Bibliogrficas.............................................................................. 66 Captulo IV: Anexos ............................................................................................................ 72

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RESUMO
A regio de Trs-os-Montes uma das grandes produtoras de mel no pas. No entanto, existe dificuldade em escoar a produo surgindo o hidromel como uma alternativa possvel para ultrapassar este problema. Contudo, a produo artesanal do hidromel no tem sido bem sucedida, devido a problemas durante a fermentao e at mesmo aps a sua finalizao. Desse modo, necessria a optimizao do processo de fermentao de hidromel de forma a facilitar a sua produo, para que se obtenha uma bebida com graduao alcolica e doura com caractersticas sensoriais particulares e agradveis. Desta forma, este trabalho pretendeu dar um contributo nesse sentido. Realizaram-se trs estudos onde se pretendeu designadamente: I) avaliar o efeito da passagem da escala laboratorial piloto, II) avaliar o efeito da temperatura e concentrao de nutrientes, na produo de hidromel, com duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae, utilizando um desenho experimental e III) produzir hidromel com diferentes teores de acar e de lcool, os quais fossem avaliados por um painel de consumidores. Verificaram-se algumas diferenas ao nvel do rendimento em etanol relativamente aos acares consumidos e das concentraes finais de etanol e cido actico aquando da passagem da escala laboratorial para a escala piloto. Pelo desenho experimental verificou-se que na produo futura de hidromel, aconselha-se o uso da levedura Fermol Reims Champagne e uma temperatura entre os 24C e os 29C, bem como uma concentrao de sais entre 85 e 100 g/hL. Adicionalmente, verificou-se atravs de um painel de consumidores que o hidromel doce o mais apreciado em termos organolpticos, independentemente do seu teor alcolico.

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ABSTRACT
The region of Trs-os-Montes is one of most important for honey production; however, it is difficult to sell all of this production, being mead a possible alternative to overcome this problem. Nevertheless, handmade production of mead has not been successful due to problems during fermentations and even after its finishing. Thus, it is necessary to optimize the fermentation process of mead to facilitate their production in order to obtain a beverage with an alcohol and sweetness with particular sensory characteristics and enjoyable. Thus, this work aims to contribute to these aspects. Three studies were performed where it was intended to: I) Evaluate the effect of changing from laboratory scale to pilot scale; II) Evaluate the effect of temperature and concentration of nutrients in the production of mead, with two commercial strains of Saccharomyces cerevisiae, using a experimental design; and III) Perform mead production with different contents of sugar and alcohol, which were evaluated by a panel of consumers. There were some differences in the yield of ethanol in the case of sugar consumed and the final concentrations of ethanol and acetic acid during the changing transition from laboratory to pilot scale. For the experimental design it was verified that in the future production of mead, it is advisable to use the yeast Fermol Reims Champagne and temperatures between 24 and 29 C, and a salt concentration between 85 and 100 g/hL. Finally, it was verified by a consumer panel that the "sweet mead" is most appreciated in sensory terms, regardless of alcohol content.

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NDICE DE FIGURAS

Pg. Figura 1 Biorreactor onde decorreram as fermentaes escala laboratorial. Figura 2 Cubas de inox onde decorreram as fermentaes escala piloto. 23 29

Figura 3 Dados a ter em considerao no clculo da quantidade de aguardente a 30 adicionar s cubas de fermentao para obter um hidromel doce. Figura 4 Clculos realizados para determinar a quantidade de aguardente vnica a 31 adicionar s cubas de fermentao. Figura 5 Evoluo das fermentaes na produo de hidromel s escalas 35 laboratorial (A) e piloto (B). Figura 6 Fermentaes a diferentes temperaturas e concentraes de sais para a 40 levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (condies A, B, C, D e E). Figura 7 Fermentaes a diferentes temperaturas e concentraes de sais para a 41 levedura Saccharomyces cerevisiae ICVD47 (condies A, B, C, D e E). Figura 8 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da 50 massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na produo de etanol para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B). Figura 9 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da 51 massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na produo de cido actico para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B). Figura 10 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e 52 da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na produo de glicerol para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B). Figura 11 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e 53 da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na concentrao final de glucose para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B). Figura 12 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e 54 da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na concentrao final de frutose para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B).

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Figura 13 Desenvolvimento da fermentao na produo de hidromel doce. Figura 14 Desenvolvimento da fermentao na produo de hidromel seco.

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Figura 15 Representao grfica da apreciao global dos consumidores, 62 considerando o teor em acar e o teor alcolico do hidromel.

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NDICE DE TABELAS
Pg. Tabela 1- Variveis independentes utilizadas neste estudo. Tabela 2 Condies experimentais testadas na produo de hidromel. 27 27

Tabela 3 Parmetros determinados nas fermentaes alcolicas realizadas no 36 biorreactor de 1,5 L (escala laboratorial) e em cuba de inox de 20 L (escala piloto). Tabela 4 Concentraes finais (g/L) de glucose, frutose, etanol, cido actico e 43 glicerol, para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), determinadas nos diferentes ensaios do desenho experimental. Tabela 5 Concentraes finais (g/L) de glucose, frutose, etanol, cido actico e 44 glicerol, para a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47, determinadas nos diferentes ensaios do desenho experimental. Tabela 6 Coeficientes das regresses, nvel de significncia (p), R2 e valores F 47 dos modelos para predizer o etanol (y1, y1), o cido actico (y2, y2), o glicerol (y3, y3), a glucose (y4, y4), e a frutose (y5, y5), para as leveduras Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) e Saccharomyces cerevisiae ICVD47. Tabela 7 ANOVA para o modelo quadrtico da RSM. 48

Tabela 8 Comparao das produes de hidromel doce e seco em relao 60 a alguns parmetros especficos. Tabela 9 Mdias gerais dos parmetros sensoriais avaliados nas provas 61 organolpticas do hidromel. Tabela 10 Correlaes determinadas entre o lcool, apreciao global, aroma, 61 doura e sabor. Tabela 11 Efeito do teor alcolico e do teor em acar no aroma, doura, 62 sabor, lcool e apreciao global do hidromel.

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Captulo I

Introduo

1. INTRODUO GERAL AO TEMA E PRINCIPAIS OBJECTIVOS DO TRABALHO

A apicultura uma actividade com impactos significativos positivos, tanto sociais como econmicos. uma das actividades mais antigas e importantes do mundo, ligada produo de mel, geleia real, prpolis, cera e plen. O mel um produto natural utilizado pelo homem desde os tempos mais remotos, sendo actualmente o seu aproveitamento visto como uma possvel alternativa na produo de novos produtos. Trs-os-Montes uma das regies com maior produo de mel do pas. No entanto, a regio tem tido dificuldade em escoar a produo de mel devido concorrncia nacional e internacional. A apicultura uma das grandes opes para a agricultura transmontana, sendo uma oportunidade de aproveitamento da potencialidade natural do meio ambiente e da sua capacidade produtiva. Torna-se assim relevante encontrar alternativas para que a apicultura se torne ainda mais uma actividade vivel, valorizando-se o mel nacional e aumentando os proveitos da regio. A produo de hidromel poder ser uma das possibilidades, valorizando a regio e aumentando os ganhos dos apicultores. Contudo, apesar do hidromel ser uma das bebidas alcolicas mais antigas, no produzido de forma padronizada, mas sim de forma emprica e artesanal. Desse modo, essencial rentabilizar o seu processo de produo, analisando e encontrando solues para que a produo seja praticvel, e o produto final possua qualidade. Nesse sentido, este trabalho teve como principal objectivo dar um contributo para a resoluo desses problemas, pretendendo-se avaliar a forma como determinadas condies de produo afectaram a qualidade final do hidromel obtido.

Especificamente, com o presente trabalho pretendeu-se: 1. Avaliar o efeito da passagem da escala laboratorial escala piloto aquando do fabrico do hidromel, tanto a nvel da performance da fermentao, como em termos das caractersticas finais do hidromel obtido; 2. Avaliar o efeito da temperatura, da quantidade de nutrientes e das estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas na produo de hidromel, utilizando-se um desenho factorial;

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3. Produzir hidromel escala piloto segundo as melhores condies determinadas no estudo anterior, produzindo-se aps diferentes perodos de fermentao seguidos de aguardentao um hidromel doce e outro seco, com diferentes teores alcolicos e conhecer a opinio de um grupo de consumidores sobre a qualidade dos mesmos.

2. INTRODUO
2.1. O MEL
Inmeros estudos indicam que o mel j existe aproximadamente h 42 milhes de anos. H evidncias do seu uso na pr-histria, atravs de pinturas em rochas que retratam abelhas e favos. O mel um produto natural muito apreciado, sendo uma das formas concentrada de acar disponvel no mundo inteiro (FAO, 1996). Segundo o Decreto-Lei n 214/2003 de 18 de Setembro, o mel por definio uma substncia aucarada natural, produzida por abelhas produtoras de mel (Apis mellifera) a partir do nctar de plantas ou a partir de secrees de partes vivas de plantas ou secrees de insectos sugadores de plantas em partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam por combinao com substncias que elas prprias produzem, depositam, desidratam e armazenam nas colmeias para posterior maturao. O nctar pode provir de uma nica flor (mel monofloral) ou de vrias (mel multifloral), podendo o primeiro no ser rigorosamente monofloral devido presena de outro nctar em pequena quantidade, no interferindo apreciavelmente no seu aroma, cor e sabor. Devido ao seu alto teor de acar, o mel usado como conservante de alimentos (Cherbuliez and Domerego, 2003), sendo tambm uma excelente opo nutricional devido aos seus benefcios demonstrados para a sade (Cuevas-Glory et al., 2007), a nvel do efeito bactericida, anti-sptico, anti-reumtico, diurtico, digestivo, preveno de gripes e constipaes, etc. 2.1.1 Composio e propriedades fsico-qumicas

A composio do mel bastante varivel e depende primariamente da sua origem floral. No entanto, outros factores externos podem ter influncia, tais como factores sazonais, ambientais e de processamento (Anklam, 1998; Al-Mamary et al.,
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2002; Azeredo et al., 2003; Arrez-Romn et al., 2006; Baltruaityt et al., 2007; Kk et al., 2007). O mel constitudo por um elevado nmero de substncias (cerca de 181 compostos) (Arrez-Romn et al., 2006), sendo uma mistura complexa de carboidratos, dos quais os acares redutores, frutose e glucose, so os principais constituintes (8595%) (White, 1975). Outras substncias esto tambm presentes em pequenas quantidades, tais como, sais minerais, protenas, vitaminas, cidos orgnicos, flavonides, cidos fenlicos, enzimas e outros fitoqumicos (Alvarez-Suarez et al., 2010). Alguns destes compostos so conhecidos por terem propriedades antioxidantes (Gheldof et al., 2002). A proporo de glucose e frutose presente no mel depende particularmente da fonte de nctar, podendo influenciar o seu flavour, uma vez que a frutose mais doce do que a glucose, assim como a sua granulao, visto que a glucose menos solvel em gua do que a frutose (de Rodrguez et al., 2004; Finola et al., 2007). Os restantes hidratos de carbono incluem a maltose, a sacarose e outros carboidratos complexos. O pH do mel pode variar entre 3,4 e 6,1, sendo a mdia de 3,9. A sua cor varia entre quase incolor a castanhoescuro (Codex Alimentarius, 2001), dependendo da sua origem floral, processamento, armazenamento, factores climticos durante o fluxo do nctar e a temperatura qual o mel amadurece na colmeia (Smith, 1967). Alm disso, quanto mais escuro for o mel, mais rico ser em minerais. Contudo, geralmente este mais desvalorizado economicamente, uma vez que os mis claros so mais aceites no mercado mundial. O mel, quanto consistncia, pode ser fluido, viscoso, parcialmente ou completamente cristalizado, dependendo da composio, temperatura e teor em gua (AbuJdayil et al., 2002). A qualidade do mel principalmente determinada pelas caractersticas sensoriais, fsicas, qumicas e microbiolgicas. Os critrios de qualidade fsico-qumica do mel encontram-se bem definidos na Directiva CE n 2001/110 de 20 de Dezembro de 2001.

2.2 HIDROMEL
Estima-se que a produo mundial de mel seja superior a 1.200.000 toneladas por ano. A produo em Portugal abrange milhares de produtores, representando uma
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fatia importante na economia nacional e, principalmente, regional. No entanto, na regio Transmontana verifica-se um excesso de mel comercializado a preos abaixo dos custos de produo, sendo importante encontrar alternativas para que a apicultura se torne uma actividade vivel. A produo de hidromel uma das possveis solues para este problema. O hidromel uma bebida alcolica que contm entre 8-18% de lcool por volume, sendo produzido atravs da fermentao, realizada por leveduras (Navrtil et al., 2001), de uma soluo diluda de mel, obtida atravs da adio de uma quantidade de gua adequada. O hidromel pode ser classificado em seco, licoroso, doce e espumoso, segundo a sua tecnologia de fabrico. Esta produo depende do tempo de fermentao, da quantidade de mel utilizada e da graduao alcolica resultante da adio de aguardente vnica. Ao contrrio das uvas, que contm fermentos sua superfcie, no mel isso no ocorre com frequncia. Por isso, so adicionadas leveduras, para maior segurana e controle na produo de hidromel. As leveduras conferem aromas diversos bebida, mas tambm podem produzir diferentes teores alcolicos na bebida final e fermentar de forma diferenciada os acares, resultando da diferentes teores de acar residual. As leveduras utilizadas na produo de hidromel so normalmente estirpes de Saccharomyces cerevisiae, utilizadas na produo de vinho, cerveja e champagne. Estas leveduras actuam sobre acares como a glucose e a frutose, resultando na formao de etanol e dixido de carbono.

2.2.1 Problemas inerentes ao processo de produo de hidromel Devido ao elevado teor em acares, o processo fermentativo bastante moroso, sendo a variedade do mel, a estirpe da levedura, os nutrientes disponveis e o pH do meio (Navrtil et al., 2001), variveis importantes que afectam a produo e qualidade do produto final. Os atrasos e amuos nas fermentaes, bem como a produo de flavours indesejados, so alguns dos problemas encontrados na produo de hidromel, normalmente associados com a incapacidade de resposta das leveduras para se adaptar s condies de stress desfavorveis ao seu crescimento (Attfield, 1997; Bisson, 1999),

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causando efeitos negativos na comercializao do produto. Uma condio de stress qualquer factor ambiental que possa exercer um efeito adverso no crescimento celular (Ivorra et al., 1999). Alguns dos possveis factores de stress so o choque trmico (calor ou frio), as limitaes de nutrientes essenciais, o stress osmtico, o stress oxidativo, a privao de azoto e a toxicidade ao etanol (Bauer and Pretorius, 2000; Hohmann and Mager, 2003). As clulas devem detectar e responder a estes factores para que a fermentao no seja afectada negativamente (Zuzuarregui and del Olmo, 2004). Assim, a anlise da resistncia ao stress pode ser usada como critrio para a seleco de leveduras enolgicas, uma vez que existe uma relao entre o desempenho fermentativo das leveduras e a resistncia a essas condies (Zuzuarregui and del Olmo, 2004). Numa fermentao alcolica procura-se, tambm, uma produo reduzida de dixido de enxofre, de espuma, de sulfureto de hidrognio e de acidez voltil, bem como um bom perfil enzimtico (actividades elevadas de -glucosidase proteoltica), produo baixa de acetaldedo e ausncia de produo de aminas biognicas. Tal como mencionado anteriormente, os baixos nveis de substncias azotadas e de minerais presentes no mel, indispensveis para a multiplicao das leveduras e o pH cido do caldo fermentativo afectam negativamente a evoluo do processo. Assim, vantajoso um controlo rigoroso das condies de fermentao. De todos os nutrientes assimilados pelas leveduras durante a fermentao, os compostos azotados so quantitativamente os mais importantes, depois dos compostos carbonados, pois so essenciais para o crescimento e metabolismo das leveduras (Casellas, 2005). A quantidade de azoto disponvel para as leveduras depende das fontes de azoto assimilvel presentes no mosto e da concentrao de etanol, que afecta negativamente a assimilao do azoto. O aumento da concentrao de etanol e o uso progressivo das fontes de azoto pelas leveduras ao longo da fermentao, pode conduzir privao de azoto e consequentemente a condies de stress (Ivorra et al., 1999). Um fornecimento inadequado de azoto assimilvel no meio de fermentao pode levar ao crescimento deficiente da levedura, a fermentaes prolongadas, a taxas de crescimento reduzidas e consequentemente a um decrscimo da produtividade. Adicionalmente, a qualidade organolptica do produto pode deteriorar-se devido ao catabolismo de aminocidos e pptidos causando a formao de sulfureto de hidrognio (H2S), de determinados steres e de padres alterados de diacetil (OConnor-Cox and Ingledew, 1991). Os requisitos mnimos de azoto so ditados pela taxa de crescimento da levedura desejada nesse meio.

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Outro problema a falta de uniformidade no produto final, resultante de mudanas no teor de gua no mel produzido em diferentes anos. Segundo o Decreto-Lei n 214/2003 de 18 de Setembro, o mximo admissvel de 20% de teor de gua no mel, excepto para o mel Calluna, que de 23%. Logo, a quantidade de gua adicionada inicialmente tem que ser ajustada para se obter o teor alcolico pretendido no produto final. A diferena de teores entre os acares (glucose e frutose) tambm pode influenciar o processo de fermentao, j que as estirpes de Saccharomyces cerevisiae metabolizam preferencialmente a glucose, sendo consumida mais rapidamente, resultando numa predominncia de frutose no produto final (Fleet 1998; Berthels et al., 2004). No final da fermentao, quando as fontes de azoto so consumidas e as concentraes de etanol so elevadas, algumas estirpes tambm tem dificuldades em fermentar a frutose restante (Bauer and Pretorius, 2000). Esta falta de uniformidade pode induzir refermentaes no s por leveduras, mas tambm pela metabolizao do acar residual por bactrias acticas e bactrias lcticas. Isto aumenta a acidez voltil e a produo anormal de steres, alterando as caractersticas organolpticas e a qualidade do produto final (O Connor and Ingledew-Cox, 1991). Actualmente, o hidromel continua a ser elaborado de forma emprica, no sendo tidos em conta estes ajustes, obtendo-se bebidas muito distintas. Alm disso, em inmeras situaes verifica-se que misturas de mel com aguardente vnica do tipo licor, so vendidas sob o rtulo de hidromel. No entanto, essas bebidas no resultaram de qualquer tipo de fermentao. Adicionalmente, deve ser referido que as etapas de clarificao e filtrao desejveis no final da produo tornam o processo extremamente caro.

2.3 OPTIMIZAO DAS CONDIES DE FERMENTAO ASSOCIADAS ELABORAO DE HIDROMEL

As condies dos processos de fermentao comercial, tais como o pH, a temperatura e os componentes do meio, geralmente no so divulgados, mas sujeitos a sigilo absoluto (Zhang and Greasham, 1999). O "meio de fermentao ideal" no se encontra bem definido (Zabriskie et al., 1982) e o desenvolvimento do meio de fermentao uma mistura de arte e cincia. A optimizao do meio de fermentao representa um custo significativo e implica tempo para o desenvolvimento do bioprocesso (Kennedv et al., 1994). O objectivo da optimizao determinar as
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condies adequadas em termos de pH, temperatura, composio do meio, etc, de forma a maximizar ou minimizar econmica e tecnologicamente as variveis importantes do processo, tais como o rendimento do processo, a concentrao do produto e os custos. Os modelos matemticos utilizados na concepo de processos de optimizao e controle, so ferramentas bastante teis nesse domnio. De forma a ultrapassar os problemas associados elaborao do hidromel mencionados anteriormente, no processo de produo desta bebida poder ser vantajoso proceder optimizao de alguns parmetros, de forma a desenvolver-se uma fermentao eficiente. Uma vez estabelecidos os parmetros a ser optimizados, pode recorrer-se a uma metodologia que permita determinar as melhores condies do processo, prevenindo problemas que possam decorrer durante a fermentao. Recentemente, vrios mtodos estatsticos de desenho experimental tm sido empregues no desenvolvimento, melhoramento e optimizao de bioprocessos. O delineamento experimental (DE) conjuga conhecimentos tcnicos e estatsticos para planear um determinado ensaio ou uma srie de ensaios, cujas variveis em estudo afectem as caractersticas de um dado produto, tendo como objectivo determinar a magnitude das alteraes, detectar interaces e prever combinaes ptimas. Resumidamente, um ensaio com dois ou mais factores, tendo cada um valores ou nveis diferentes, e cujas unidades experimentais cobrem todas as possveis combinaes desses nveis de todos os factores. Este tipo de ensaio permite o estudo do efeito de cada factor sobre a varivel resposta, bem como o efeito das interaces entre factores sobre a dita varivel. A metodologia de superfcie de resposta ou em ingls Response surface methodology (RSM), originalmente descrita por Box and Wilson (1951), adequada para identificar o efeito de variveis individuais e procurar as melhores condies para um sistema multivarivel. A construo de modelos de superfcie de resposta um processo interativo. Quando um modelo aproximado obtido, um bom ajuste do mesmo determina se o resultado satisfatrio. Caso contrrio, o processo de aproximao reiniciado e mais ensaios so feitos, ou o modelo evolui com parmetros diferentes. A RSM importante na concepo, formulao, desenvolvimento e anlise de novos produtos e estudos cientficos, sendo tambm eficaz na melhoria dos j existentes. Basicamente, esta optimizao do processo envolve trs etapas principais: realizar ensaios planeados, estimar os coeficientes de um modelo matemtico, prever a resposta e verificar a adequao do modelo (Yu et al., 2009).
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A principal vantagem deste mtodo reduzir o nmero de experincias requeridas, mesmo quando um grande nmero de variveis est envolvido, sendo menos trabalhoso e demorado do que outros mtodos (Chung et al., 2000; Wu, 2002). Com a RSM possvel determinar as condies operacionais que favorecem a obteno de um alto rendimento e uma boa produtividade (Costa et al., 2001). Este mtodo tem sido aplicado na modelao e optimizao de processos bioqumicos e biotecnolgicos, relacionados com os sistemas de alimentao (Cacace and Mazza, 2003b; Parajo et al., 1995; Senanayake and Shahidi, 1999; Senanayake and Shahidi, 2002; Telez-Luis et al., 2003; Vasquez and Martin, 1998) e para determinar os efeitos de diversas variveis e optimizar as suas condies (Ginevra et al., 2002; Levigne et al., 2002; Li and Fu, 2005; Tanyildizi et al., 2005; Vohra e Satyanarayana, 2002; Ozer et al., 2006; Castro et al., 2000). Como exemplos prticos refira-se a optimizao da composio de meios de fermentao, (Mao et al., 2005; Wang and Lu, 2005), assim como os efeitos das variveis ambientais no crescimento de leveduras (D'Amato et al., 2006; Arroyo-Lpez et al., 2006), a obteno dos valores ptimos de parmetros, tais como, pH, temperatura, arejamento (Dennis and Webster, 1971), taxas de alimentao (Elad et al., 1982), condies de hidrlise enzimtica e processos de fabrico de alimentos (Mao et al., 2005), etc. Esta tcnica tambm tem sido empregue para optimizar a produo de enzimas por microrganismos (Ridout et al., 1986).

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Captulo II

Material e Mtodos

3.

DESCRIO GERAL DOS ESTUDOS REALIZADOS

De forma a adquirir conhecimentos teis para a produo de um hidromel de qualidade por pequenos produtores de mel que estejam interessados na elaborao desta bebida, no presente trabalho realizaram-se trs estudos designadamente: I. Produo de hidromel a diferentes escalas: escala laboratorial e

escala piloto. II. Anlise do processo de fermentao em relao aos factores,

temperatura e concentrao de nutrientes adicionados ao mosto, para duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae, atravs de um desenho experimental. III. Produo de hidromis escala piloto, segundo as melhores condies determinadas no estudo anterior de forma a obter um hidromel doce e outro seco.

Estudo I) Produo de hidromel s escalas laboratorial e piloto ensaios preliminares

Nesta primeira fase avaliou-se a produo de hidromel a diferentes escalas: escala laboratorial e escala piloto, de forma a determinar a sua importncia no processo de fermentao e na qualidade do produto final. I.1. Microrganismo utilizado e preparao dos mostos

A escolha da levedura a utilizar no presente trabalho teve em conta resultados obtidos num estudo anterior realizado por Pereira et al. (2009). Neste, algumas estirpes de Saccharomyces cerevisiae, designadamente, estirpes isoladas do mel, uma de referncia e uma comercial, foram avaliadas, comparando-se a sua resistncia ao: i) sulfuroso (uma vez que uma caracterstica desejvel nas estirpes de leveduras usadas em fermentaes, cujo objectivo seja a obteno de bebidas alcolicas); ii) etanol, considerando que a tolerncia das estirpes a este lcool um factor imprescindvel devido s concentraes elevadas que este lcool atinge durante a fermentao (Carrasco et al., 2001); iii) e stress osmtico, visto que uma condio adversa para as leveduras no incio da fermentao, e mais precisamente na produo de hidromel,

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tendo em conta que o mel tem um teor de acares elevado. Nesse mesmo estudo foram utilizados dois tipos de mel (um claro e um escuro) enriquecidos com um suplemento comercial. As estirpes de Saccharomyces cerevisiae isoladas do mel e a estirpe comercial deram resultados semelhantes, demonstrando todas serem adequadas para a produo de hidromel. Em relao ao tipo de mel, a utilizao de mel escuro forneceu melhores resultados comparativamente ao mel claro. Esta diferena pode ser devido a uma percentagem de plen mais reduzida no mel claro comparativamente ao mel escuro, uma vez que a maioria dos compostos azotados esto presentes no plen, podendo o teor em azoto ser o factor limitante da fermentao. Alm disso, o mel escuro tambm apresenta uma concentrao mais elevada de minerais, o que tambm poder ter um papel positivo na fermentao. Desta forma, em todos os ensaios do presente trabalho foi utilizado o mel escuro e a estirpe Saccharomyces cerevisiae, levedura enolgica comercial Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), recomendada para a produo de vinhos brancos, de forma a facilitar a sua futura aquisio pelos apicultores e h maior estabilidade da mesma face s estirpes isoladas do mel. Seguindo as instrues da embalagem, a levedura foi hidratada (30g/hL) em gua aucarada (50g/L) e colocada em banho maria a 35C durante vinte minutos. O mosto foi preparado atravs da diluio do mel (395g/L), enriquecido com nutrientes comerciais (Enovit) (60g/hL) e posterior adio de SO2 (8g/hL) a 6% (v/v) e cido tartrico (Sigma-Aldrich) at se obter um pH de 3,5. A escolha da diluio de mel utilizada no trabalho teve em conta que se pretendia obter uma bebida com 14% de etanol. Considerando que para se obter esta concentrao no mosto do mel deveriam estar presentes 252 g/L de acares e que no mel a sua concentrao ronda os 63,8% (m/m), a diluio a realizar seria aproximadamente de 790 g de mel em dois litros de gua. Em relao composio dos nutrientes comerciais refira-se que estes continham sulfato de amnio a 70% (m/m), fosfato de amnio dibsico a 19,80% (m/m), coadjuvante de filtrao a 10% (m/m) e vitamina B1 a 0,20% (m/m). I.2 Fermentao do mosto escala laboratorial

A fermentao escala laboratorial realizou-se num biorreactor de cinco litros, utilizando-se um volume de 1, 5 litros (Figura 1).
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Figura 1 Biorreactor onde decorreram as fermentaes escala laboratorial.

A levedura comercial depois de previamente hidratada foi adicionada ao meio de crescimento. Desta forma iniciou-se a fermentao que decorreu temperatura de 25C, com agitao suave (120 rpm) por trezentas e cinquenta horas. Durante a fermentao, o pH e a temperatura foram constantemente monotorizados atravs de um elctrodo de pH e sonda de temperatura, respectivamente. A biomassa foi determinada periodicamente por densidade ptica a 640 nm num espectrofotmetro de luz visvel (Jenway Genova). Quando necessrio procedeu-se diluio das amostras. Para as leituras da densidade ptica foi usado como branco, o meio de crescimento sem a inoculao da levedura. Para avaliar o desenrolar da fermentao, periodicamente retiraram-se 2 mL de amostra para quantificao da glucose, frutose, etanol, glicerol e cido actico, por cromatografia em fase lquida de alta performance e por deteco de ndice refractivo (HPLC-IR). As amostras foram filtradas atravs de uma seringa, com um filtro de nylon de porosidade 0,2 m (Whatman). Quando necessrio, o sobrenadante foi congelado a 18C (Templow P Selecta) para anlise posterior. Esta fermentao foi efectuada em duplicado.

23 | P g i n a

I.3

Fermentao do mosto escala piloto

Aps a produo de hidromel escala laboratorial procedeu-se produo de hidromel escala piloto, utilizando-se para tal uma cuba de inox de vinte e cinco litros, tendo sido o volume de trabalho de vinte litros. A estirpe comercial de Saccharomyces cerevisiae, anteriormente referida, foi a utilizada neste estudo. Depois de previamente hidratada, foi colocada no mosto de hidromel similarmente ao que se descreveu anteriormente. Ao longo da fermentao, o pH e a temperatura foram tambm determinados. A fermentao decorreu em torno dos 25C por 350 horas e determinaram-se os parmetros referidos no ponto anterior. Refira-se que esta cuba no apresentava manta ou camisa de aquecimento, ao contrrio do biorreactor anterior, sendo, por isso, mais difcil controlar a temperatura. No entanto, a temperatura da sala onde a cuba permaneceu manteve-se volta dos 25C por se tratar da poca de Vero. I.4 Quantificao de glucose, frutose, glicerol e cido actico

A glucose, frutose, etanol, glicerol e cido actico foram analisados num sistema HPLC Varian, equipado com um injector Rheodyne de 20 L e uma coluna da Supelco Gel C-610H (300 x 7,8 mm) a 35C, e acoplado a um detector de ndice refractivo, RI-4 da Varian. A fase mvel utilizada consistiu em cido fosfrico a 0,1% (v/v) com um caudal de 0,5 mL/min. Os dados foram gravados e integrados pelo sistema informtico Star Chromatography Workstation da Varian. A glucose, frutose, etanol, glicerol e cido actico foram quantificados com base na rea dos seus picos e pela comparao com curvas de calibrao obtidas com os padres correspondentes.

Estudo II) Anlise do processo de fermentao em relao aos factores, temperatura e concentrao de nutrientes adicionados ao mosto, para duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae atravs de um desenho experimental
Apesar de no Estudo I) se verificar que as fermentaes conduzidas escala laboratorial deram resultados ligeiramente diferentes dos obtidos escala piloto, o presente estudo foi realizado escala laboratorial, pois em termos de custos de
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reagentes e material era o mais adequado e razovel, face ao nmero elevado de fermentaes que foram necessrias realizar e que se passam a descrever nas seces seguintes. II.1 Microrganismos utilizados e preparao dos mostos

Nos ensaios do desenho experimental utilizaram-se duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae, designadamente a Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (j utilizada no Estudo I) e a ICV D47, ambas adequadas para a produo de vinho branco. As leveduras foram hidratadas (30g/hL) em gua aucarada (50g/L) e colocadas em banho maria a 35C por vinte minutos. O mosto foi preparado atravs da diluio do mel em gua (395g/L), enriquecido com nutrientes comerciais (Enovit) e posterior adio de SO2 (8g/hL) a 6% (v/v) e cido tartrico (Sigma-Aldrich) at se obter um pH de 3,5. Como se pretendia avaliar o efeito da concentrao de nutrientes adicionados, prepararam-se diversos mostos com trs concentraes nestes sais, designadamente 60, 90 e 120g/hL. II.2 Fermentaes

As fermentaes decorreram em Erlenmeyers de 500 ml, utilizando-se um volume final de 250 ml. As leveduras comerciais depois de previamente hidratadas foram adicionadas aos mostos. Iniciaram-se as fermentaes que decorreram s temperaturas de 20, 25 e 30C, e com as concentraes de sais de 60, 90 e 120 g/hL, indicadas pelo desenho experimental. A durao das fermentaes foi de duzentas e dezasseis horas (aproximadamente 15 dias). Todas as fermentaes decorreram na incubadora SI50 Stuart Scientific. A determinao da biomassa e a quantificao de glucose, frutose, etanol, glicerol e cido actico, por HPLC, foram efectuados como mencionado anteriormente nas seces I.2 e I.4. Cada ensaio foi realizado em duplicado. II.3 Desenho experimental

Para estudar o efeito da temperatura e da concentrao de sais para cada uma das leveduras enolgicas utilizadas na produo de hidromel utilizou-se um desenho
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factorial 32. Os dados experimentais foram analisados pelo mtodo RSM, usando o software Minitab 15.0. Segundo esta metodologia a relao entre as variveis dependentes e as operacionais foi estabelecida atravs de um modelo que inclui termos lineares, interactivos e quadrticos do tipo: y = b0 + b1x1+ b2x2+ b12x1x2+ b11x12+ b22x22 onde y a varivel dependente; b corresponde aos coeficientes da regresso (calculados atravs dos dados experimentais por regresses mltiplas usando o mtodo dos mnimos quadrados), e o x corresponde s variveis independentes. Em relao ao parmetro b: i) b0 uma constante; ii) b1 e b2 so os coeficientes lineares; iii) b11 e b22 so os coeficientes quadrticos; e iv) b12 o coeficiente de interaco entre as variveis 1 e 2. As variveis independentes usadas neste estudo, temperatura e concentrao de nutrientes Sal Enovit, encontram-se descritas na Tabela 1. A escolha dos diferentes nveis de temperatura teve em conta que a Saccharomyces cerevisiae apresenta uma taxa de fermentao mais elevada para temperaturas entre os 20C e os 30C, sendo que abaixo de 15C a taxa fermentativa diminui significativamente e ocasiona longos tempos de fermentao. Para temperaturas acima de 30C a taxa de fermentao tambm diminui. A escolha das diferentes concentraes de nutrientes baseou-se no facto de as leveduras necessitarem da adio destes sais, de forma a que o processo fermentativo no seja moroso, mas mais rpido. Os nveis estabelecidos para esta varivel teve em considerao o facto de no Estudo I) se ter utilizado as 60g/hL e as fermentaes terem decorrido favoravelmente. Dessa forma, pareceu ser adequado o seu aumento para 90 e 120 g/hL, permitindo avaliar se este aumento seria ou no necessrio. Neste trabalho utilizou-se o central composite design e especificou-se que fosse igual a 1, de forma a que no fossem testados pontos axiais exteriores zona considerada como segura. De facto, conhecido que temperaturas inferiores a 20C ou superiores a 30C, no favorecem o bom desenvolvimento das fermentaes e que concentraes inferiores a 60g/hL de sais tambm acarretam amuos.

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Tabela 1- Variveis independentes utilizadas neste estudo. Varivel Temperatura Concentrao de Nutrientes Sal Enovit Nomenclatura T C Unidades C g/hL Nveis 20-25-30 60-90-120

Varivel codificada adimensional Temperatura Concentrao de Nutrientes Sal Enovit

Nomenclatura x1 x2

Definio (T-25)/5 (C-90)/30

Amplitude de variao (-1,1) (-1,1)

As variveis padronizadas adimensionais (codificadas), tendo limites de variao de (-1, 1), foram definidas como x1 (temperatura) e x2 (concentrao de nutrientes). A correspondncia entre as variveis codificadas e no codificadas foi estabelecida por equaes lineares deduzidas atravs das suas respectivas variaes limite (Tabela 1). A Tabela 2 mostra o conjunto de condies experimentais ensaiadas (expressas em termos de variveis codificadas). Tabela 2 Condies experimentais testadas na produo de hidromel. Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temperatura (C) 0 1 0 -1 1 -1 0 -1 1 0 0 0 Concentrao de Nutrientes Sal Enovit 1 -1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0

A sequncia foi estabelecida aleatoriamente para limitar a influncia dos erros sistemticos na interpretao de resultados. Refira-se que as experincias de 1 a 9,
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permitiram o clculo dos coeficientes de regresso, enquanto que os ensaios 10 a 12 so rplicas no ponto central do desenho experimental de forma a estimar a influncia do erro experimental. As variveis dependentes estudadas neste trabalho foram as que geralmente so consideradas como relevantes na produo de bebidas alcolicas, designadamente o etanol, o cido actico e o glicerol, bem como as concentraes finais de glucose e frutose.

Estudo III) Produo de hidromel escala piloto segundo as melhores condies determinadas no Estudo II) de forma a obter um hidromel doce e outro seco.
Aps a anlise dos resultados obtidos no desenho experimental, verificou-se que os melhores resultados em termos de etanol, cido actico, glicerol e acares, foram obtidos para concentraes de nutrientes entre 85 e 100 g/hL e temperaturas entre os 24C e os 29C. Em relao estirpe utilizada, a Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) forneceu melhores resultados, segundo os critrios de ajuste do desenho factorial, comparativamente ICVD47. Considerando que essas condies so as mais adequadas para a produo de hidromel, procedeu-se sua execuo escala piloto. Adicionalmente pretendeu-se produzir hidromis com diferentes teores alcolicos e nveis de doura, e avaliar os mesmos em termos organolpticos, recorrendo a um grupo de consumidores. III.1 Microrganismo

A estirpe de Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) foi hidratada (30g/hL) em gua aucarada (50g/L) e colocada em banho maria a 35C por vinte minutos. III.2 Preparao dos mostos

Na preparao dos mostos utilizou-se a metodologia descrita nas seces anteriores I.1 e II.1, com excepo da concentrao de nutrientes comerciais (Enovit) a 90g/hL.

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III.3

Fermentaes escala piloto

As fermentaes foram efectuadas em cubas de inox de 25 litros, usando um volume de trabalho de 20 litros (Figura 2).

Figura 2 Cubas de inox onde decorreram as fermentaes escala piloto.

Uma vez que a gama de temperaturas ptima, obtida a partir do desenho experimental, se situou entre os 24 e os 29C, pretendeu-se que as fermentaes decorressem nessa gama. Contudo, como as cubas no apresentavam mantas ou camisas de aquecimento/arrefecimento, e uma vez que as fermentaes foram realizadas no Vero, a temperatura manteve-se em torno dos 25C. Durante a fermentao, a temperatura foi periodicamente medida, bem como a densidade e os graus Baum do mosto atravs de um aremetro, em cada uma das cubas. As determinaes de biomassa, glucose, frutose, etanol, cido actico e glicerol foram realizadas de forma idntica mencionada anteriormente nas seces I.2 e I.4. Estas fermentaes foram efectuadas em triplicado. Para produzir os hidromis doce e seco procedeu-se da forma descrita seguidamente: Hidromel doce Para se produzir um hidromel doce, a fermentao foi interrompida prematuramente, de forma a no ocorrer o consumo total dos acares. Pretendeu-se obter uma bebida com cerca de 18 de lcool e uma doura correspondente a 8 Baum (valor de referncia na vinificao do vinho do Porto). Para se obter um hidromel com

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essas caractersticas, as fermentaes foram interrompidas pela adio de aguardente vnica, no momento em que a densidade era de aproximadamente 1060 g/cm3. A aguardente utilizada continha aproximadamente 77% (v/v) de lcool. A quantidade de aguardente adicionada foi determinada segundo o procedimento descrito por Pato (1982). De forma mais esquematizada, foi necessrio ter em considerao os dados indicados na Figura 3.
Grau inicial Quantidade de hidromel a aguardentar Grau pretendido Grau a juntar (de aguardente) Quantidade de aguardente

Figura 3 Dados a ter em considerao no clculo da quantidade de aguardente a adicionar s cubas de fermentao para obter um hidromel doce. . Quando as fermentaes foram interrompidas mediram-se, atravs de um aremetro, cerca de 8 de lcool nos mostos (Figura 4). Dessa forma, para se obter um hidromel com 17 de lcool (valor posteriormente corrigido para os teores alcolicos pretendidos), seria necessrio adicionar 9 litros de aguardente com lcool a 77% (v/v) a 60 litros de hidromel. Assim sendo, para se obter o hidromel doceem cada cuba foram retirados 3 litros de hidromel e adicionados 3 litros de aguardente vnica a 17 litros de hidromel, correspondendo a um volume total de 20 litros. Uma vez que o objectivo seria obter hidromis com diferentes teores alcolicos, este foi posteriormente dividido e corrigido para 18, 20 e 22 de lcool.

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77-17=60

17 77 9

60 L de hidromel _________ 9 L de aguardente 20 L de hidromel _________ = 3 L de aguardente Figura 4 Clculos realizados para determinar a quantidade de aguardente vnica a adicionar s cubas de fermentao.

Hidromel seco Os restantes 3 litros de mosto que se retiraram de cada uma das 3 cubas continuaram a fermentar em trs recipientes distintos, para que as leveduras continuassem a consumir os acares e a produzir etanol. A temperatura e a densidade foram novamente medidas periodicamente, e a biomassa determinada por densidade ptica como j se referiu anteriormente. Quando se atingiu uma densidade de cerca de 1020 g/cm3 foi efectuada a aguardentao. Seguindo o esquema anterior, determinou-se que para 3 litros de hidromel seria necessrio a adio de 360 ml de aguardente vnica, obtendo-se o hidromel seco. No caso do hidromel seco tambm se procedeu correco dos teores alcolicos, nos trs recipientes, para 18, 20 e 22 de lcool.

III.4

Provas organolpticas

Aps obteno dos hidromis doce e seco a 18, 20 e 22 de lcool efectuou-se uma anlise sensorial com a colaborao de potenciais consumidores alvo, de forma a conhecer e estudar as reaces e a aceitao do produto. Com este objectivo foram organizadas trs sesses com 36 pessoas numa sala especfica para provas, com cabines individualizadas, distribuindo-se 3 amostras de hidromel doce a 18, 20 e 22 de lcool e 3 amostras de hidromel seco tambm a

31 | P g i n a

18, 20 e 22 de lcool a cada provador. Estas amostras foram servidas de forma aleatria (Anexo 1). Foi pedido aos consumidores para avaliaram cada amostra (de A a F), numa escala de 1 (no gosto nada) a 10 (gosto muito), em relao aos seguintes parmetros: aroma, sabor, doura, teor alcolico e apreciao global (Anexo 2).

III.5

Anlise estatstica

Os dados obtidos da apreciao sensorial pelos consumidores, nas provas organolpticas realizadas aos hidromis produzidos com diferentes teores alcolicos e de doura, foram analisados com o software R. Efectuaram-se os clculos das estatsticas descritivas e dos coeficientes de correlao linear (r) entre as variveis em estudo. Os efeitos do teor em lcool e do teor em acar foram avaliados atravs do modelo misto seguinte: Yijk= + TAi + Dj + Pk + eijk onde: Yijk a apreciao sensorial do provador k para o hidromel com i teor alcolico e
j

teor em acar. a mdia geral, TAi o efeito fixo do teor alcolico (i=1, 2, 3), Dj o efeito fixo do teor em acar (j=1, 2). Pk o efeito aleatrio do provador k (k=1, 2, , 108). eijk o erro aleatrio com mdia zero e varincia 1.

Os efeitos da sesso e da interaco entre o teor alcolico e o teor em acar no apresentaram efeitos significativo (P > 0,05) nos parmetros sensoriais avaliados no hidromel. Desta forma, estes efeitos foram retirados do modelo.

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Captulo III

Resultados e Discusso

Estudo I) Produo de hidromel s escalas laboratorial e piloto ensaios preliminares

I.1 Produo de hidromel escala laboratorial

A evoluo das fermentaes do hidromel ao longo do tempo durante a produo escala laboratorial encontra-se apresentada na Figura 5A. Em relao biomassa, no foi observada fase lag, tendo a fase exponencial uma durao de cerca de 90 horas. Aps isso, observou-se a fase estacionria. Em relao aos teores de glucose e frutose, ambos os acares foram metabolizados pelas leveduras durante as fases exponencial e estacionria. Os teores de glucose diminuram de 101 para 5,13 g/L e de frutose de 125 para 11,1 g/L. Estes resultados indicam que ambos os acares foram quase totalmente consumidos. Adicionalmente, a taxa de consumo de glucose foi maior do que a de frutose, como observado pela inclinao das curvas, mostrando um consumo preferencial do primeiro acar face ao segundo. A concentrao final de etanol foi de 99,40,9 g/L. O glicerol e o cido actico tambm foram produzidos ao longo da fermentao, obtendo-se no final do processo os seguintes valores: 6,420,03 e 0,600,05 g/L, respectivamente. I.2 Produo de hidromel escala piloto A evoluo da fermentao durante a produo escala piloto encontra-se apresentada na Figura 5B. Em termos gerais, algumas diferenas foram detectadas quando se comparam estes resultados com os obtidos anteriormente na produo escala laboratorial. Em relao biomassa, observou-se uma fase lag com uma durao de cerca de 28 horas. A fase exponencial teve uma durao total de cerca de 60 horas. Verificou-se que s 125 horas aps a inoculao, a biomassa diminuiu. Isto pde ter sido devido a dois fenmenos: i) Dificuldades em promover a agitao desejvel do meio aquando da colheita de amostras; ii) Sedimentao das clulas, uma vez que a cuba utilizada no tinha qualquer sistema mecnico de agitao. Em termos de glucose e frutose, tambm ambos os acares foram metabolizados pelas leveduras. Os teores de glucose diminuram de 121 para 5,09 g/L e de frutose de 137 para 36,4 g/L. Ao comparar estes valores finais com os obtidos no

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ensaio anterior, os resultados obtidos para a glucose foram semelhantes. Em relao frutose verificaram-se concentraes finais mais altas na produo escala piloto. Tambm nestas condies foi observada uma maior taxa de consumo de glucose em relao de frutose. A concentrao final de etanol foi superior obtida no ensaio escala laboratorial (124 g/L). O glicerol e o cido actico aumentaram progressivamente ao longo de fermentao, atingindo os valores finais: 6,84 e 0,94 g/L, respectivamente.
14 12 D.O. ( 640 nm) 160 140 120 100 80 60 40 20 0

10
8 6 4 2 0 0 50 100 150 200 250 300 350

Tempo (horas)

14 12 D.O.(640 nm) 10 8

160

140 120 100 80 Concentrao (g/L)

6
4 2

60 40 20

0
0 50 D.O. 100 Etanol 150 200 250 Glucose 300 Frutose 350 Tempo(horas) Glicerol cido actico

Figura 5 - Evoluo das fermentaes na produo de hidromel s escalas laboratorial (A) e piloto (B). A fim de facilitar a comparao das escalas de produo, determinaram-se ainda os seguintes parmetros: concentraes totais de acares (glucose+frutose)

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Concentrao (g/L)

consumidos, produes finais de etanol, concentraes finais de glicerol e cido actico e o rendimento de etanol (Yetanol/acares) (Tabela 3). Tabela 3 Parmetros determinados nas fermentaes alcolicas realizadas no biorreactor de 1,5 L (escala laboratorial) e em cuba de inox de 20 L (escala piloto).
Parmetro
Tempo total da fermentao (h) Acares consumidos (g/L)* Etanol (%) YEtanol/Acares (%) Glicerol (g/L) cido actico (g/L)

Biorreactor (1,5L) 315+22 218+16 9,69+0.02 35,3+2,2 6,36+0,09 0,56+0,02

Cuba inox (20L) 334 216 12,4 45,5 6,84 0,94

*Determinado como (Glucose+Frutose). Nota: os valores apresentados correspondem mdia+amplitude/2

Em relao aos acares consumidos, os valores obtidos em ambos os ensaios foram comparveis. Relativamente ao etanol, observou-se uma maior concentrao final escala piloto, resultando num maior rendimento (45,5 versus 35,3%). Outro aspecto importante que deve ser referido o comportamento incomum da produo de etanol. De facto, este um metabolito primrio que se espera ser produzido ao longo da fase exponencial. No entanto, como constatado anteriormente por Pereira et al. (2009), a produo de etanol no hidromel pode ainda ser observada ao longo da fase estacionria. Neste trabalho este comportamento ocorreu em ambas as escalas de produo. Tendo em conta as concentraes de glicerol indicadas na literatura para vinhos, as concentraes obtidas em ambos os ensaios para este composto esto de acordo com os referenciados. Rankine and Bridson (1971), por exemplo, referem que em vinhos australianos o intervalo da concentrao de glicerol dever situar-se entre as 1,4 e 9,9 g/L. O glicerol, de natureza no voltil, um produto importante da fermentao alcolica. Embora no contribua para o aroma do vinho, promove a sua maciez e viscosidade, aumentando a suavidade do mesmo quando produzido em maiores quantidades, melhorando a qualidade do produto final (Karasau and zbas, 2003; Noble and Bursick, 1984). No presente trabalho obteve-se um valor de glicerol ligeiramente

36 | P g i n a

superior na fermentao em cuba de inox em relao aos determinados no biorreactor. No entanto, os valores foram idnticos para ambos os ensaios. Em relao ao cido actico, a concentrao mais elevada foi obtida na produo escala piloto (20L), tendo sido determinada uma concentrao prxima do dobro da mdia observada escala laboratorial. Contudo, em ambas as escalas de produo os valores finais foram inferiores ao limite legal, o qual deve ser inferior a 18 meq/L correspondente 1,1 g/L (Regulamento (CE) N 1493/1999, Anexo VB-1b).

Estudo II) Anlise do processo de fermentao em relao aos factores, temperatura e concentrao de nutrientes adicionados ao mosto, para duas estirpes comerciais de Saccharomyces cerevisiae atravs de um desenho experimental

II.1

Desenho experimental

Para se alcanar uma fermentao bem sucedida necessrio ter em ateno diversos factores que a podem afectar. Tal como j foi referido anteriormente, na produo de hidromel podem existir dificuldades que acarretam, por exemplo, amuos na fermentao. Estes problemas podem resultar do facto do mel ser pobre em determinados compostos, os quais podem ser essenciais s leveduras. Dessa forma de extrema importncia determinar a gama de concentraes de sais a adicionar ao mosto que permita o desenvolvimento de uma fermentao adequada. Alm disso, como a produo de hidromel surge como uma possvel alternativa aos produtores de mel da regio de Trs-os-Montes, e tendo em conta que nesta regio a amplitude de temperaturas elevada, esta varivel (temperatura) poder tambm ter um papel importante na fermentao. Tendo em conta estes factores, pretendeu-se nesta parte do trabalho investigar o efeito dessas duas variveis independentes (concentrao de nutrientes e temperatura) a trs nveis (-1,0,1) sobre as variveis dependentes: etanol, glicerol e cido actico. Adicionalmente, tambm se avaliou o seu efeito sobre a concentrao residual de acares, designadamente da glucose e frutose. Neste trabalho utilizaram-se duas leveduras enolgicas, efectuando-se estudos idnticos para cada uma das leveduras. Para tal, foram realizados 12 ensaios
37 | P g i n a

experimentais com diferentes combinaes dos dois factores (Tabela 2) para cada uma das leveduras. Devido ao nmero significativo de fermentaes realizado, para simplificar e facilitar a interpretao dos resultados optou-se por apresentar o desenvolvimento das fermentaes s para cinco situaes concretas, designadamente:

A) T=20C (nvel -1) + Concentrao de sais = 120 g/hL (nvel 1) B) T=20C (nvel -1) + Concentrao de sais = 60 g/hL (nvel -1) C) T=30C (nvel 1) + Concentrao de sais = 120 g/hL (nvel 1) D) T=30C (nvel 1) + Concentrao de sais = 60 g/hL (nvel -1) E) T=25C (nvel 0) + Concentrao de sais = 90 g/hL (nvel 0)
Condio central Condies extremas

II.1.1 Evoluo das vrias fermentaes realizadas ao longo do tempo para as duas leveduras Os resultados obtidos para a estirpe Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) encontram-se representados nas Figuras 6A a 6E, consoante a temperatura e concentrao de nutrientes. Em relao biomassa, verificou-se que, em termos gerais, as maiores concentraes foram obtidas nos ensaios 6A, 6C e 6E, obtendo-se idnticas taxas mximas especficas de crescimento. Estas experincias decorreram s temperaturas de 30C (A e C) e 25C (E) na gama de concentraes de sais entre 60 e 120 g/hL. Pelo contrrio, os ensaios B e D decorreram a uma temperatura de 20C, originando concentraes de biomassa ligeiramente inferiores s dos ensaios anteriores e tendo para o ensaio B sido observada uma menor taxa mxima especfica de crescimento. Em termos de durao da fase exponencial, verificou-se que na maioria das situaes, a fase estacionria teve incio aps aproximadamente 70 horas, com excepo dos ensaios C e D que iniciaram por volta das 50 horas. Relativamente ao etanol, as concentraes finais determinadas foram da mesma ordem de grandeza em todos os ensaios, sendo iguais a 91,40,06, 1070,02, 1130,03, 1150,22 e 1190,43 g/L para os casos A, B, C, D e E, respectivamente. Verificou-se, portanto, que a concentrao mais baixa foi obtida no ensaio A, correspondente a uma temperatura de 30C e uma concentrao de sais de 60 g/hL.

38 | P g i n a

Em relao aos acares, observou-se que em todos os ensaios, tanto a frutose como a glucose foram consumidas ao longo das fermentaes. Geralmente, a taxa de consumo de glucose foi ligeiramente superior (como por exemplo, no ensaio 6C) ou idntica (ensaio 6A) de frutose. O glicerol e o cido actico tambm foram produzidos ao longo da fermentao. Em termos gerais, a sua produo no diferiu significativamente nas diferentes situaes estudadas. O desenvolvimento das fermentaes realizadas com a levedura ICVD47 encontram-se representadas nas Figuras 7A a 7E. Verificou-se que maiores concentraes de biomassa foram obtidas para o ensaio A (temperatura a 30C e concentrao de sais de 60g/hL). Visualizando os grficos, foi novamente no ensaio B que se verificou a menor taxa mxima especfica de crescimento. De forma idntica levedura anterior, a fase estacionria teve incio entre as 70 e as 80 horas para a maioria dos ensaios, observando-se um comportamento diferente para o ensaio D. Neste, a fase estacionria iniciou aproximadamente s 50 horas. As concentraes finais de etanol foram iguais a 88,30,37, 106,81,17, 1150,08, 1130,04 e 124,70,10 g/L para os casos A, B, C, D e E, respectivamente, observando-se uma amplitude maior face aos da levedura anterior. Em relao aos teores de acar, a glucose e a frutose foram ambas consumidas. Pela anlise da Figura 7D, observa-se que neste ensaio a taxa de consumo de glucose foi superior de frutose. Pelo contrrio, na Figuras 7 A, B, C e E, constata-se que as taxas de consumo de glucose e frutose foram semelhantes, no se detectando o consumo preferencial de glucose. O glicerol e o cido actico tambm foram produzidos ao longo da fermentao, no tendo a sua produo diferido significativamente nas diferentes situaes estudadas.

39 | P g i n a

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 40 80 120 160 Tempo (horas)

A
200 240

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Biomassa

Etanol Glicerol

cido actico

Glucose

Frutose

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 40
Etanol

160 140 120 100 80 60 40 20 0 240

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
0 40 80 120 160 200 Tempo (horas)
cido actico

Concentrao (g/L)

Concentrao (g/L)

240
Frutose

D.O. (640 nm)

Biomassa

Etanol Glicerol

Glucose

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 40
Etanol

Concentrao (g/L)

D.O. (640 nm)

D.O. (640 nm)

160 140 120 100 80 60 40 20 0 240

Biomassa

Glicerol

cido actico

Glucose

Frutose

80

120 160 Tempo (horas)

cido Actico

200

0
Biomassa

40
Etanol

80

120 160 Tempo (horas)

cido actico

200

240
Frutose

Biomassa

Glicerol

Glucose

Frutose

Glicerol

Glucose

Figura 6 Fermentaes a diferentes temperaturas e concentraes de sais para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (Condies A, B, C, D e E).

40 | P g i n a

Concentrao (g/L)

80 120 160 Tempo (horas)

200

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Concentrao (g/L)

160 140 120 100 80 60 40 20 0

D.O. (640 nm)

D.O. (640 nm)

D.O. (640 nm)

0
Biomassa

40
Etanol

80 120 160 Tempo (horas)

Glicerol cido actico

200

240
Frutose

Concentrao (g/L)

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Glucose

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 40
Etanol

160 140 120 100 80 60 40 20 0 240

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 40
Etanol

Concentrao (g/L)

80

120 160 200 Tempo (horas)

cdido actico

240
Frutose

Biomassa

Glicerol

Glucose

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
0 40
Etanol

Concentrao (g/L)

160 140 120 100 80 60 40 20 0

200 240

80

120 160 Tempo (horas)

200

D.O. (640nm)

D.O. (640 nm)

Biomassa

Glicerol

cido actico

Glucose

Frutose

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 40
Etanol

160 140 120 100 80 60 40 20 0

80

120 160 Tempo (horas)

cido Actico

80
Glicerol

120

160

200

240
Frutose

Tempo (horas)
Frutose Biomassa cido Actico Glucose

Biomassa

Glicerol

Glucose

Figura 7 Fermentaes a diferentes temperaturas e concentraes de sais para a levedura Saccharomyces cerevisiae ICVD47 (Condies A, B, C, D e E).

41 | P g i n a

Concentrao (g/L)

Concentrao (g/L)

160 140 120 100 80 60 40 20 0

D.O. (640 nm)

D .O.(640 nm)

Tendo em conta os resultados obtidos nos 12 ensaios realizados para cada uma das estirpes (Tabelas 4 e 5) constatou-se que para a estirpe Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) a produo de etanol variou entre 91,40,06 (correspondente ao ensaio a 20C e 120g/hL), resultando no menor rendimento (36,25%), e 123,6 0,10 g/L (correspondente ao ensaio a 25C e 90 g/hL), resultando num maior rendimento (49,05%). Comparativamente segunda estirpe, Saccharomyces cerevisiae ICV D47, a gama de valores obtida em relao primeira foi maior. Com a segunda estirpe obteve-se a menor concentrao de etanol (88,3 0,37 g/L), resultando no menor rendimento (35,02%), mas tambm a maior (125,9 0,10 g/L), resultando no maior rendimento (49,96%). No caso da produo do cido actico, este atingiu o valor mnimo de 0,120,06 g/L e o valor mximo de 0,780,003 g/L durante as fermentaes com a primeira estirpe. Para a segunda estirpe os valores variaram menos, entre 0,190,03 e 0,630,05 g/L. No entanto, realce-se o facto de os valores continuarem a ser inferiores ao limite legal (inferior a 18 meq/L que corresponde a cerca de 1,1 g/L) (Regulamento (CE) N 1493/1999, Anexo VB-1b). O glicerol tambm foi produzido ao longo das fermentaes, atingindo valores que variaram entre 5,400,04 e 7,040,05 g/L para a primeira levedura. No caso da segunda levedura os teores de glicerol obtidos oscilaram entre 5,450,18 e 7,510,13 g/L, gama idntica obtida para a primeira levedura. Em ambas as situaes, os valores obtidos esto de acordo com os valores publicados na literatura para vinhos. Rankine e Bridson (1971) referem que em vinhos australianos o intervalo da concentrao de glicerol dever situar-se entre 1,4 e 9,9 g/L. Em relao aos acares, e como anteriormente referido, tanto a glucose como a frutose foram metabolizadas pelas leveduras. Os valores iniciais de acar foram de aproximadamente 252 g/L, sendo a glucose consumida durante a fermentao at valores finais de 2,550,50 a 5,110,11 g/L para a primeira levedura e de 2,300,17 a 4,730,07g/L para a segunda levedura, sugerindo um comportamento idntico para ambas as estirpes de Saccharomyces cerevisiae. No caso da frutose, esta tambm foi metabolizada durante a fermentao at valores finais de 1,510,31 a 27,610,16 g/L para a primeira levedura e de 1,350,07 a 3,240,04 g/L para a segunda levedura. Estes resultados indicam uma diferena acentuada na metabolizao da frutose por parte das duas estirpes, concluindo-se que a segunda levedura utilizou os dois acares com maior eficincia do que a primeira. Estes resultados vm de encontro aos reportados em
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estudos anteriores de fermentao do vinho (Fleet, 1998; Berthels et al., 2004), os quais indicam que embora a glucose e a frutose sejam consumidas ao longo do processo de fermentao, as estirpes de Saccharomyces cerevisiae tm preferncia pela glucose, sendo esta consumida mais rapidamente, resultando numa possvel preponderncia de frutose no final da fermentao.

Tabela 4 Concentraes finais (g/L) de glucose, frutose, etanol, cido actico e glicerol, para a estirpe Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), determinadas nos diferentes ensaios do desenho experimental.
Ensaio Glucose
Caso

Frutose
2,270,01 5,401,74 7,851,41 27,610,16 9,130,0008 1,510,31 4,240,18 4,510,39 5,830,07 4,430,11 4,240,08 4,060,07

Etanol
114,8 0,03 115,3 0,22 110,6 0,08 107,1 0,02 113,3 0,03 91,4 0,06 119,2 0,43 122,8 0,19 121,9 0,005 114,8 0,20 119,2 0,05 123,6 0,10

cido actico
0,580,05 0,570,02 0,480,02 0,530,004 0,450,40 0,120,06 0,580,04 0,550,03 0,780,003 0,530,03 0,580,05 0,620,02

Glicerol
5,420,001 6,030,35 5,710,01 5,870,05 7,040,05 5,400,04 6,350,14 6,680,02 6,890,01 6,210,07 6,350,10 6,500,08

Yetanol/acar
45,55% 45,75% 43,88% 42,49% 44,95% 36,25% 47,31% 48,34% 47,96% 45,55% 47,30% 49,05%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B C A E D

2,880,23 3,040,06 2,590,22 5,110,11 3,380,13 3,050,13 3,080,52 3,290,29 4,320,03 3,610,30 3,080,40 2,550,50

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Tabela 5 Concentraes finais (g/L) de glucose, frutose, etanol, cido actico e glicerol, para a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47, determinadas nos diferentes ensaios do desenho experimental.
Ensaio
Caso

Glucose
3,100,18

Frutose
2,650,02 2,630,19 1,920,008 3,200,48 3,240,04 1,350,07 2,510,04 2,160,005 2,870,05 2,470,05 2,510,10 2,560,07

Etanol
114,9 0,15 108,7 0,04 113,4 0,02 106,8 1,17 115,1 0,08 88,3 0,37 124,7 0,13 122,4 0,03 122,6 0,14 123,4 0,20 124,7 0,10 125,9 0,10

cido actico
0,540,04 0,510,03 0,540,002 0,480,03 0,580,02 0,190,03 0,590,006 0,590,008 0,630,05 0,600,11 0,590,05 0,590,05

Glicerol
6,080,12 6,130,03 6,160,03 5,690,63 7,470,21 5,450,18 7,140,01 7,030,10 7,510,13 7,130,03 7,140,12 7,150,02

Yetanol/acar
45,59% 43,14% 44,99% 42,37% 45,67% 35,02% 49,48% 48,18% 48,24% 48,97% 49,48% 49,96%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B C A E D

3,000,13 2,960,01 3,110,32 3,020,09 2,300,17 3,930,07 3,890,07 4,730,07 3,380,11 3,930,12 4,010,07

II.1.2 Tratamento estatstico dos resultados

Tal como referido anteriormente os dados experimentais foram analisados pelo mtodo RSM. Dessa forma pretendeu-se desenvolver modelos empricos que descrevessem as relaes existentes entre as variveis operacionais (temperatura e concentrao de nutrientes) e as experimentais (dependentes), designadamente, as concentraes finais de etanol, cido actico, glicerol, glucose e frutose. Na Tabela 6 encontram-se descritos os coeficientes de regresso e os respectivos significados estatsticos para os modelos calculados, bem como os parmetros, R2 e F, que permitem avaliar o ajuste em termos gerais. Desta forma testa-se a hiptese das diferenas encontradas entre os dados experimentais e os calculados pelos modelos no serem significativas. Todos os modelos (etanol, cido actico, glicerol, glucose, frutose) deram significativos (p<0,05) para ambas as leveduras. Os valores de F variaram entre 3,99
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(etanol) e 16,73 (glucose) para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), e 7,79 (cido actico) e 24,32 (glicerol) para a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47. Os valores de R2 dos modelos variaram entre 0,646 (glucose) e 0,913 (cido actico) para a primeira levedura e entre 0,771 (frutose) e 0,946 (glicerol) para a segunda levedura. Contudo, constatou-se que para esta ltima levedura o ajuste do modelo no foi to adequado como o da levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech). De facto, o lack-of-fit (Tabela 7) foi significativo (p<0,05) nos cinco modelos, ao contrrio do observado com a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) para o caso do etanol, cido actico, e glicerol (p>0,05). Isto significa que os ajustes determinados para a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47, em relao aos modelos matemticos desenvolvidos, no foram to adequados como os determinados para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) para os trs parmetros anteriormente referidos. Em relao s fermentaes conduzidas pela estirpe Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (Tabela 6), observou-se que a adio de sais s originou pequenos efeitos nas variveis estudadas, tal como pde ser constatado pelos baixos valores absolutos dos correspondentes coeficientes de regresso (B1). Observou-se uma excepo relativamente frutose, uma vez que a sua quantidade final diminui significativamente medida que se aumenta a concentrao de sais (p <0,05). Em relao ao termo quadrtico relativo concentrao de sal enovit (B11), o mesmo foi significativo para a produo de etanol, cido actico e glicerol, demonstrando, contudo, que o aumento da concentrao de nutrientes influencia negativamente o teor destes produtos ao longo da fermentao alcolica. A temperatura causou um efeito positivo significativo (p<0,05) na produo de cido actico e glicerol, tal como demonstrado pelos valores dos coeficientes B2 (linear) (ambos os parmetros) e B22(quadrtico) (glicerol). Este ltimo parmetro foi tambm significativo para a glucose. Quanto ao termo interactivo referente concentrao de Sais Enovit e a temperatura, verificou-se que este foi significativo para o cido actico, glicerol e frutose. Durante as fermentaes da estirpe Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (Tabela 6), observou-se que a concentrao de sais Enovit teve um efeito linear significativo sobre a produo de cido actico (p<0,05) e efeitos quadrticos muito significativos sob o teor de etanol, glicerol e de consumo de glucose (p<0,01). Em relao temperatura, esta teve efeitos lineares significativos na produo de etanol (p<0,05),
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glicerol (p<0,01) e na metabolizao da glucose e frutose (ambos com p<0,05). Analisando os resultados do termo quadrtico relativo temperatura, verificou-se que o mesmo no foi significativo para nenhum dos parmetros estudados. Quanto ao termo interactivo referente concentrao de Sais Enovit e a temperatura, verificou-se ser significativo para o etanol, cido actico, glicerol e frutose.

46 | P g i n a

Tabela 6 Coeficientes das regresses, nvel de significncia (p), R2 e valores F dos modelos para predizer o etanol (y1, y1), o cido actico (y2, y2), o glicerol (y3, y3), a glucose (y4, y4), e a frutose (y5, y5), para as leveduras Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47.
Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) cido Glicerol Glucose p (y1) Actico p (y2) p (y3) p (y4) y3 y4 y2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,603276 6,3723 2,9676 0,382 0,856 0,657 0,360 -0,005 0,04117 -0,236 0,015 0,034 0,001 0,587 -0,102966 -0,76271 -0,2022 0,081 0,000 0,007 0,643 0,166667 0,33717 -0,1167 0,654 0,453 0,010 0,044 0,031034 0,45829 0,8688 0,284 0,001 0,011 0,081 0,1695 0,37125 0,6012 0,913 0,899 0,646 0,049 0,001 0,002 0,001 14,67 12,41 16,73 p (y1) Saccharomyces cerevisiae ICV D47 cido p (y2) Glicerol p (y3) Glucose Actico y3 y4 y2
0,45640 -0,78930 0,43490 -0,67680 0,50440 1,21750 0,848 7,79 0,189 0,038 0,371 0,065 0,304 0,015 0,009 7,1523 0,1778 -1,0661 0,4882 0,1099 0,3930 0,946 24,32 0,000 0,073 0,000 0,001 0,406 0,007 0,000 4,0267 -0,1082 -1,1789 0,2405 0,1061 0,2068 0,923 12,90

Ensaio B0 B1 B11 B2 B22 B12 R2 F

Etanol y1 12,1214 -0,2233 -1,1348 0,4867 -0,1648 0,3400 0,741 3,99

Frutose y5 3,5390 -4,6590 3,2120 -3,3210 2,2100 7,4570 0,902 4,70

p (y5)
0,017 0,004 0,090 0,087 0,082 0,001 0,033

Ensaio

Etanol y1
12,5886 -0,1750 -1,4102 0,4817 -0,5802 0,6275 0,911 14,29

p (y4)

Frutose y5
2,4818 -0,0860 -0,0809 0,3372 0,1526 0,6155 0,771 10,28

p (y5)

B0 B1 B11 B2 B22 B12 R2 F

0,000 0,343 0,001 0,027 0,056 0,021 0,001

0,000 0,306 0,000 0,044 0,486 0,128 0,002

0,000 0,523 0,681 0,034 0,445 0,006 0,004

B0= constante; B1= Sal Enovit (termo linear); B2= Temperatura (termo linear); B11= Sal Enovit2 (termo quadrtico); B22= Temperatura2 (termo quadrtico); B12= Sal Enovit*Temperatura (termo interactivo);

47 | P g i n a

Tabela 7 ANOVA para o modelo quadrtico da RSM.

Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech)
Fonte DF Sum of squares (SS) 6,8849 1,7189 4,7047 0,4612 2,4133 1,8724 0,5409 9,2983 Mean square Valor- F Etanol Valor-p Fonte

Saccharomyces cerevisiae ICV D47

DF Sum of squares (SS) 12,6864 1,5675 9,5538 1,5650 1,2426 1,1993 0,0433 13,9289 Sum of squares (SS) 0,128798 0,042210 0,054582 0,032005 0,023158 0,023058 0,000101 0,151956 Sum of squares (SS) 5,57922 1,60196 3,35879 0,61846 0,32118 0,32071 0,00046 5,90040 Mean square Valor- F Valor-p

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total Fonte

5 2 2 1 7 3 4 12 D F 5 2 2 1 7 3 4 12 DF

1,3770 0,8595 2,3524 0,4612 0,3448 0,6241 0,1352

3,99 2,49 6,82 1,34 4,62

0,049 0,152 0,023 0,285 0,087

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total

5 2 2 1 7 3 4 12 DF

2,53727 0,78376 4,77692 1,56500 0,17751 0,39975 0,01082

14,29 4,42 26,91 8,82 36,93

0,001 0,057 0,001 0,021 0,002

Sum of squares (SS) 0,311397 0,166719 0,029519 0,115158 0,029711 0,024640 0,005071 0,341108 Sum of squares (SS) 2,94210 0,69208 1,69812 0,55190 0,33184 0,27182 0,06002 3,27393

Mean square

Valor- F

cido actico Valor-p Fonte

Mean square

Valor- F

Valor-p

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total Fonte

0,062279 0,083359 0,014760 0,115158 0,004244 0,008213 0,001268

14,67 19,64 3,48 27,13 6,48

Mean square

Valor- F

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual 0,051 Lack-of-fit Erro puro Total Glicerol Valor-p Fonte

0,001 0,001 0,089 0,001

5 2 2 1 7 3 4 12 DF

0,025760 0,021105 0,027291 0,032005 0,003308 0,007686 0,000025

7,79 6,38 8,25 9,67 305,00

0,009 0,026 0,014 0,017 0,000

Mean square

Valor- F

Valor-p

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total

5 2 2 1 7 3 4 12

0,58842 0,34604 0,84906 0,55190 0,04741 0,09061 0,01501

12,41 7,30 17,91 11,64 6,04

0,002 0,019 0,002 0,011 0,058

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total

5 2 2 1 7 3 4 12

1,11584 0,80098 1,67940 0,61846 0,04588 0,10690 0,00012

24,32 17,46 36,60 13,48 920,46

0,000 0,002 0,000 0,008 0,000

48 | P g i n a

Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech)

Fonte Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total Fonte Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total DF 5 2 2 1 7 3 4 12 DF 5 2 2 1 7 3 4 12 Sum of squares (SS) 4,80805 0,41724 4,21999 0,17082 0,40226 0,38774 0,01452 5,21031 Mean square 0,96161 0,20862 2,10999 0,17082 0,05747 0,12925 0,00363 Valor- F 16,73 3,63 36,72 2,97 Glucose Valor-p Fonte 0,001 0,083 0,000 0,128 Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro

Saccharomyces cerevisiae ICV D47

DF 5 2 2 1 7 3 4 12 DF 5 2 2 1 7 3 4 12 Sum of squares (SS) 477,220 159,571 95,219 222,430 51,795 51,700 0,095 529,015 Sum of squares (SS) 549,242 176,343 112,794 260,104 74,817 73,193 1,624 624,059 Mean square 95,444 79,786 47,609 222,430 7,399 17,233 0,024 723,51 0,000 Valor- F 12,90 10,78 6,43 30,06 Valor-p 0,002 0,007 0,026 0,001

35,62

0,002 Total Frutose Valor-p Fonte 0,033 0,080 0,725 0,006

Sum of squares (SS) 2,30877 0,72696 0,06608 1,51573 0,68705 0,68176 0,00529 2,99581

Mean square 0,46175 0,36348 0,03304 1,51573 0,09815 0,22725 0,00132

Valor- F 4,70 3,70 0,34 15,44

Mean square 109,848 88,171 56,397 260,104 10,688 24,398 0,406

Valor- F 10,28 8,25 5,28 24,34

Valor-p 0,004 0,014 0,040 0,002

Regresso Linear Quadrtica Interaco Erro Residual Lack-of-fit Erro puro Total

171,96

0,000

60,08

0,001

Mean square = SS/DF

49 | P g i n a

Os efeitos da temperatura e concentrao de sais sobre as variveis dependentes analisadas para as duas leveduras testadas, encontram-se ilustrados nos grficos de contorno (Contour Plot), representados nas Figuras 8 a 12.

Ethanol - yeast 1
30

A
Etanol lev1 < 10,0 10,0 10,5 10,5 11,0 11,0 11,5 11,5 12,0 > 12,0

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Ethanol - Yeast 2
30

B
Etanol lev1_1 < 10,0 10,0 10,5 10,5 11,0 11,0 11,5 11,5 12,0 > 12,0

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Figura 8 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na produo de etanol para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B).
50 | P g i n a

Acetic acid- Yeast 1

30

A
c act lev 1 < 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 > 0,8

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Acetic acid- Yeast 2

30

B
c act lev1_1 < 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 > 0,8

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Figura 9 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na produo de cido actico para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B).

51 | P g i n a

Glycerol - Yeast 1
30

A
Glicerol lev1 < 5,5 5,5 6,0 6,0 6,5 6,5 7,0 7,0 7,5 > 7,5

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Glycerol - Yeast 2
30

B
Glicerol lev 1_1 < 5,5 5,5 6,0 6,0 6,5 6,5 7,0 7,0 7,5 > 7,5

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Figura 10 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na produo de glicerol para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B).

52 | P g i n a

Glucose - Yeast 1
30

A
Glucose lev1 < 2,5 2,5 3,0 3,0 3,5 3,5 4,0 4,0 4,5 > 4,5

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Glucose - Yeast 2
30

B
Glucose lev1_1 < 2,5 2,5 3,0 3,0 3,5 3,5 4,0 4,0 4,5 > 4,5

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Figura 11 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na concentrao final de glucose para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B).

53 | P g i n a

Fructose - Yeast 1
30

A
Frutose lev 1 < 2 2 4 4 6 6 8 8 10 > 10

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Fructose - Yeast 2
30

B
Frutose lev 1_1 < 1,5 1,5 2,0 2,0 2,5 2,5 3,0 3,0 3,5 > 3,5

28

Temperature

26

24

22

20

0,8

0,9

1,0

60 g/hL (0,6 g/L)

1,1 1,2 Enovit salt

1,3

1,4

1,5

120 g/hL (1,2 g/L)

Figura 12 Representao da interaco entre os diversos nveis de temperatura e da massa de nutrientes (sais Enovit) por 1,25 L, na concentrao final de frutose para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) (A) e Saccharomyces cerevisiae ICV D47 (B).

Em relao ao etanol e tal como previsto pelos baixos valores absolutos dos coeficientes de regresso determinados pelo modelo anterior, as gamas de temperaturas e de concentrao de sais testadas pouco influenciaram a produo de etanol (Figura 8), uma vez que esta varia previsivelmente entre 10 e 12,5%, na maioria das situaes. Este
54 | P g i n a

comportamento foi semelhante para as duas leveduras, parecendo, contudo, que a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47 pudesse originar um maior teor de etanol numa maior gama de temperaturas (> 22C) e de concentrao de sais (0,68 a 1,04 g/L). No entanto, tal como foi referido anteriormente, o ajuste obtido para esta levedura no foi to adequado como o da anterior, devendo essa diferena na produo de etanol ser analisada com alguma reserva. Relativamente ao cido actico verificou-se que temperaturas acima dos 25C e concentraes de nutrientes entre 0,68 e 1,2 g/L, para a levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), e dos 24C e concentraes de nutrientes entre 0,72 e 1,12 g/L, para a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47, poder acarretar uma maior produo deste composto. No entanto, os resultados apontam que valores superiores a 0,8 g/L so difceis de obter, no se correndo o risco de ultrapassar o valor mximo admissvel. Em termos de glicerol, os grficos de contorno obtidos para as duas leveduras foram semelhantes. No entanto, com a levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47 obtiveram-se maiores valores de glicerol quando se comparam condies de fermentao idnticas (mesmos valores de temperatura e de concentrao de sais). Para ambas as leveduras, medida que se aumentou a temperatura, a concentrao de glicerol foi favorecida. Contudo, deve reduzir-se a gama de concentrao de sais a ser utilizada. Foi na glucose e frutose que se observaram as maiores diferenas entre as leveduras. De forma a evitar refermentaes desejvel que os teores de glucose e de frutose no final sejam baixos. Em termos da levedura Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), concentraes elevadas de sal Enovit em conjunto com temperaturas inferiores a 27C, favorecem o consumo desses acares. Pelo contrrio, nveis baixos de sal (<0,6) e temperaturas inferiores a 25C podem originar concentraes finais de glucose e frutose superiores a 3,5 e 10 g/L, respectivamente, o que indesejvel. No caso da levedura Saccharomyces cerevisiae ICV D47 verificou-se que as maiores concentraes finais de glucose (>0,4 g/L) foram obtidas para temperaturas superiores a 24C e uma concentrao de sais de 0,7 e 1,0 g/L. Em relao frutose, as maiores concentraes foram observadas para temperaturas superiores a 25C e concentraes de sais superiores a 0,72 g/L ou para temperaturas inferiores a 25C e concentraes de sais inferiores a aproximadamente 0,76 g/L. Contudo, deve ser
55 | P g i n a

referido que na maior parte das situaes, a concentrao residual de frutose para esta levedura mais baixa do que para a Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech). No entanto, relembre-se que os modelos desenvolvidos para os dois acares no foram to adequados como para os restantes parmetros. Em termos gerais, estes resultados apontam que para ambas as leveduras, as gamas de temperatura e a concentrao de sais estudadas no influenciaram muito a produo de etanol, variando entre 10 e 12,5%. Contudo, um aumento da temperatura acima dos 24C e uma concentrao de sais entre 0,70 e 1,15 g/L podem causar uma maior produo de glicerol, bem como de cido actico. No entanto, em todos os casos a concentrao em cido actico foi inferior a 0,8 g/L, o qual apresenta 1,1 g/L como valor mximo admissvel. Uma vez que os modelos desenvolvidos para a levedura Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech) foram mais adequados e a sua performance satisfatria, recomenda-se o uso desta levedura na produo futura de hidromel. Alm disso, de forma a no se correr o risco de ultrapassar o limite legal do cido actico, a favorecer a produo de etanol, glicerol, e a obter baixas concentraes de frutose no final da fermentao (<4g/L) para evitar refermentaes, recomenda-se operar com essa levedura a uma temperatura entre os 24 e os 29C e uma concentrao de sais entre os 0,85 e 1,0 g/L.

Estudo III) Produo de hidromel escala piloto segundo as melhores condies determinadas no Estudo II) de forma a obter um hidromel doce e outro seco.
Tendo em conta que os resultados obtidos para o etanol, cido actico e glicerol foram da mesma ordem de grandeza para as duas leveduras, que os ajustes dos modelos matemticos desenvolvidos para a Saccharomyces cerevisiae Fermol Reims Champagne (Pascal Biotech), foram mais adequados e que esta levedura, em termos gerais, mostrou um comportamento mais reprodutvel e estvel, optou-se por utiliz-la no Estudo III, relativo produo de hidromel escala piloto. Em termos de condies utilizadas na fermentao optou-se por uma temperatura de 25C e uma concentrao de sais de 90 g/hL. Deve ser referido que em relao temperatura, a mesma oscilou entre os 25 e os 27C, uma vez que as cubas utilizadas no apresentavam qualquer manta ou camisa de aquecimento/arrefecimento, situao que simulava a condio mais provvel

56 | P g i n a

de encontrar no futuro, aquando da produo de hidromel por parte dos produtores de mel. De referir que estas fermentaes decorreram no Vero. Especificamente, neste estudo pretendeu-se obter produtos com diferentes teores alcolicos e de doura, para que os mesmos fossem avaliados por um grupo de consumidores, aos quais se pediu que opinassem sobre o hidromel que gostavam mais em termos organolpticos. III.1 Produo de hidromel doce

Tal como explicado na parte experimental, para se produzir a bebida doce, interrompeu-se a fermentao quando o mosto apresentava 8 Baum, adicionando aguardente vnica para impedir a utilizao dos acares pelas leveduras. O desenvolvimento da fermentao durante a produo de hidromel doce, escala piloto, encontra-se apresentado na Figura 13. Esta fermentao alcolica foi interrompida s 79 horas, procedendo-se posteriormente sua aguardentao. Relativamente biomassa, foi observada uma fase lag durante cerca de 10 horas, sugerindo que possivelmente as leveduras, devido alta concentrao de acares e baixa concentrao de oxignio no meio de crescimento, estavam sob condies de stress. Aps este perodo, iniciou-se a fase exponencial com uma durao total de cerca de 45 horas. Em termos de glucose e frutose, tambm ambos os acares foram metabolizados pelas leveduras. A quantidade inicial de acares calculada foi de aproximadamente 252 g/L, sendo a glucose metabolizada at concentraes de 274,2 g/L e a frutose at concentraes de 489,6g/L. A concentrao de etanol determinada foi igual a 59,50,43 g/L, a qual subiu para 149,80,47 g/L, aps aguardentao. O glicerol e o cido actico tambm foram produzidos durante a fermentao, atingindo os seguintes valores: 5,070,54 e 0,460,08 g/L, respectivamente.

57 | P g i n a

14 12

250

200 10 8 6 4 50 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tempo (horas) Biomassa Etanol Glicerol cido actico 0 150 Concentrao (g/L) D.O. (640 nm)

100

Aguardentao Glucose Frutose

Figura 13 Desenvolvimento da fermentao na produo de hidromel doce. III.2. Produo de hidromel seco Tal como referido anteriormente, a produo do hidromel seco foi efectuada com os 9 litros sobrantes da fermentao das cubas de inox. Neste caso a fermentao foi completa, pois era importante a metabolizao dos acares pelas leveduras. Na Figura 14 encontra-se representado o desenvolvimento da fermentao para produzir o hidromel seco. Observou-se igualmente uma fase lag de 10 horas, seguida de uma fase exponencial de aproximadamente 40 horas.

58 | P g i n a

14 12 D.O. (640 nm) 10 8 6 4

250 200 150 100 50

2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Tempo (horas) Biomassa Etanol Glicerol cido actico Aguardentao Glucose Frutose 0

Figura 14 Desenvolvimento da fermentao na produo de hidromel seco.

Verificou-se uma diminuio da biomassa a partir das 90 h, a qual ter sido devida h dificuldade em homogenizar convenientemente o contedo da cuba de fermentao, aquando da recolha da amostra. Em termos de glucose e frutose, ambos os acares foram metabolizados pelas leveduras, tendo sido a taxa de consumo do primeiro acar superior do segundo. A concentrao final de etanol foi igual a 106,81,4 g/L. O glicerol e cido actico tambm foram produzidos ao longo da fermentao, atingindo os seguintes valores: 5,960,95 e 0,570,09 g/L, respectivamente. A fim de comparar as duas produes, determinaram-se os seguintes parmetros: produo de etanol aquando da paragem da fermentao em termos de concentrao e rendimento, e as concentraes finais de glicerol e cido actico (Tabela 8).

59 | P g i n a

Concentrao (g/L)

Tabela 8 Comparao das produes de hidromel doce e seco em relao a alguns parmetros especficos.
Parmetro
Tempo total da fermentao (h) Etanol (g/L) YEtanol/Acares (%) Glicerol (g/L) cido actico (g/L)

Hidromel doce

Hidromel seco

79 59,5+0,42 23,6 5,07+0,53 0,46+0.08

211,5 106,8+1,38 42,4 5,96+0,95 0,57+0,09

*Determinado como (Glucose+Frutose). Os valores apresentados correspondem a mdias+desvios-padro

Como seria de esperar, a quantidade de etanol produzida foi menor s 79 horas (situao relativa produo de hidromel doce), uma vez que houve menor consumo de acares. Deve ser novamente referido que, mais uma vez foi visvel o comportamento incomum de produo de etanol. Apesar de ser um metabolito primrio que se espera ver produzido ao longo da fase exponencial, a sua produo foi tambm observada ao longo da fase estacionria. Este comportamento foi idntico ao j referido anteriormente por Pereira et al. (2009). As concentraes de glicerol finais obtidas em ambos os ensaios foram semelhantes e esto de acordo com os valores publicados na literatura para os vinhos por Rankine and Bridson (1971). Em relao ao cido actico, resultados similares foram obtidos nos dois tipos de produo, continuando os valores a ser menores que o limite legal (inferior a cerca de 1,1 g/L) (Regulamento (CE) N 1493/1999, Anexo VB1b). III.3 Provas organolpticas Anlise Estatstica

Depois de avaliados os parmetros sensoriais pelos consumidores, calcularam-se as mdias gerais (Tabela 9), as correlaes (Tabela 10) e o efeito do teor alcolico e do teor em acar na aceitabilidade das bebidas produzidas em relao ao aroma, doura, sabor, teor alcolico e apreciao global (Tabela 11).

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Tabela 9 Mdias gerais dos parmetros sensoriais avaliados nas provas organolpticas do hidromel Mdia SD 4,22,21 4,12,76 4,52,41 3,82,59 3,92,70

Teor Alcolico Apreciao global Aroma Doura Sabor

Na Tabela 10 encontram-se as correlaes determinadas entre o lcool, a apreciao global o aroma, a doura, e o sabor do hidromel. De uma forma geral, os parmetros sensoriais apresentaram entre si correlaes positivas e estatisticamente significativas (P<0,05) que variaram entre 0,40 a 0,82. de salientar as correlaes elevadas e positivas observadas entre a apreciao global e o sabor (0,82; P<0,05) e a doura (0,76; P<0,05), assim como entre o sabor (0,79; P<0,05) e a doura do hidromel. Estes resultados indicam um efeito elevado do teor em acar na aceitao do hidromel pelos consumidores, ao contrrio do que foi demonstrado em estudos anteriores por Penha et al. (2003), quando analisaram o licor de acerola. Tabela 10 Correlaes determinadas entre o lcool, apreciao global, aroma, doura e sabor.
lcool lcool Apreciao global Aroma Doura Sabor 1,00 0,69 0,40 0,65 0,62 1,00 0,44 0,76 0,82 1,00 0,45 0,52 1,00 0,79 1,00 Apreciao global Aroma Doura Sabor

Na Tabela 11 apresentam-se os efeitos do teor alcolico e do teor em acar no aroma, doura, sabor, lcool e apreciao global dos hidromis analisados pelo painel de consumidores. O teor alcolico no afectou (P>0,05) os parmetros sensoriais do hidromel. Pelo contrrio, as amostras com maior teor em acar apresentaram, em todos os parmetros sensoriais estudados, maior (P<0,05) classificao pelos consumidores (entre 4,9 e 5,4). Assim, as amostras com maior teor em acar foram as que o painel de consumidores mais gostou, apresentando uma apreciao global em torno dos 5,4.
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Tendo em conta este valor, o hidromel doce surge assim como uma bebida razovel para os consumidores, ao contrrio do hidromel seco.

Tabela 11 - Efeito do teor alcolico e do teor em acar no aroma, doura, sabor, lcool e apreciao global do hidromel.
Aroma Teor alcolico 18 20 22 Acar Doce Seco Doura Sabor lcool Apreciao global

4,42,41a 4,32,43a 4,72,39a 4,92,46a 4,02,27b

3,82,57a 3,92,56a 3,82,70a 5,22,42b 2,52,02a

3,82,61a 4,02,63a 3,92,84a 5,12,63b 2,72,18a

4,02,54a 4,22,37a 4,42,61a 5,02,36b 3,42,39a

4,12,83a 4,12,70a 4,02,77a 5,42,56b 2,72,23a

A interaco entre o teor alcolico e o teor em acar no foi estatisticamente significativa (P>0,05), o que conjugado com a ausncia de efeito do teor alcolico, mostra que os hidromis com maior teor em acar foram os mais apreciados independentemente do teor alcolico (Figura 15).

Figura 15 Representao grfica da apreciao global dos consumidores, considerando o teor em acar e o teor alcolico do hidromel.

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Captulo IV

Concluses Finais

CONCLUSES FINAIS
Aps a realizao de trs estudos com vista a avaliar o efeito das condies de produo na qualidade final do hidromel obtido, verificou-se que em termos gerais ao passar da escala laboratorial para a escala piloto, algumas diferenas ao nvel do rendimento do etanol em relao aos acares consumidos e das concentraes finais de etanol e cido actico, podem ser observadas. Ao avaliar o efeito da temperatura e da concentrao de nutrientes sobre a produo de hidromel, usando-se duas leveduras comerciais, verificou-se atravs de um desenho experimental que estes parmetros no influenciam de forma muito significativa a produo de etanol. Contudo, o aumento da temperatura acima dos 24C e uma concentrao de sais entre 0,70 e 1,15 g/L pode acarretar uma maior produo de cido actico e de glicerol. No entanto, em nenhum dos casos se obtiveram, para o cido actico, valores superiores a 0,8 g/L, no se correndo o risco de ultrapassar o valor mximo admissvel (1,1 g/L). Relativamente aos acares, foi na glucose e frutose que se observaram as maiores diferenas entre as leveduras. No entanto, os modelos desenvolvidos para os dois acares no foram to adequados como para os restantes parmetros. Contudo, nveis baixos de sal e temperaturas inferiores a 25C apontam para elevadas concentraes finais de ambos os acares, situao indesejvel quando se utiliza a levedura Fermol Reims Champagne. Para o caso da Saccharomyces
cerevisiae ICV D47, maiores concentraes finais de glucose podem ser obtidas para

temperaturas superiores a 24C e uma concentrao de sais de 0,8 a 1,04 g/L. Em relao frutose, as maiores concentraes foram observadas a temperaturas superiores a 25C e concentraes de sais superiores a 0,72 g/L ou temperaturas inferiores a 25C e concentraes de sais inferiores a 0,76 g/L. Tendo em conta as taxas especficas mximas de crescimento, a levedura ICV D47 mostrou um comportamento mais irregular e menos reprodutvel, explicando em parte, os resultados da menor adequabilidade dos ajustes obtidos para os modelos matemticos desenvolvidos para esta levedura. Alm disso, os modelos matemticos desenvolvidos para a levedura ICV D47 tambm no foram to adequados como os obtidos para a Fermol Reims Champagne. Dessa forma, aconselha-se o uso desta ltima na produo futura de hidromel, e de uma temperatura entre os 24C e os 29C e uma concentrao de sais entre 85 e 100 g/hL. Com estas condies a produo de etanol e de glicerol, bem como

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a obteno de concentraes baixas de acares no final da fermentao, sero favorecidas. Por fim, produziu-se hidromel escala piloto, segundo as condies anteriores com diferentes teores de doura e de lcool. Aps anlise por um painel de consumidores, verificou-se que o mais apreciado em termos organolpticos foi o doce, independentemente do seu teor alcolico.

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Captulo V

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Captulo IV

Anexos

Provador 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Provador 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Copo A 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 Copo A 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3

Copo B Doce 5 5 5 6 6 6 6 6 6 4 4 4 5 5 5 4 4 4 Copo B Seco 2 2 2 3 3 3 3 3 3 1 1 1 2 2 2 1 1 1

Copo C 6 6 6 5 5 5 4 4 4 6 6 6 4 4 4 5 5 5 Copo C 3 3 3 2 2 2 1 1 1 3 3 3 1 1 1 2 2 2

Copo D 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 Copo D 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6

Copo E Seco 2 2 2 2 2 2 3 3 3 1 1 1 2 2 2 1 1 1 Copo E Doce 5 5 5 5 5 5 6 6 6 4 4 4 5 5 5 4 4 4

Copo F 3 3 3 3 3 3 1 1 1 3 3 3 1 1 1 2 2 2 Copo F 6 6 6 6 6 6 4 4 4 6 6 6 4 4 4 5 5 5

1= Seco a 18; 2= Seco a 20; 3= Seco a 22; 4=Doce a 18; 5=Doce a 20; 6=Doce a 22 de lcool.

Anexo 1 Distribuio das seis amostras de hidromel pelos provadores.

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Nome ___________________________________________

Cdigo: _________

Sexo:
Feminino Masculino

Idade: ___

Aroma

Sabor

Doura

Teor alcolico

Apreciao global

Observaes

Anexo 2 Ficha de prova

Gosto muito

No gosto nada