Quim. Nova, Vol. 26, No.

3, 428-438, 2003 INTRODUO A MODELAGEM MOLECULAR DE FRMACOS NO CURSO EXPERIMENTAL DE QUMICA FARMACUTICA Ivone Carvalho*, Mnica T. Pupo, urea D. L. Borges e Llian S. C. Bernardes Departamento de Cincias Farmacuticas, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Av. do Caf s/n, 14040-903 Ribeiro Preto - SP Recebido em 25/7/02; aceito em 11/9/02

Educao

INTRODUCTION TO MOLECULAR MODELING OF DRUGS IN THE MEDICINAL CHEMISTRY EXPERIMENTAL COURSE. Molecular Modeling is an important tool in drug design and it is very useful to predict biological activity from a library of compounds. A wide variety of computer programs and methods have been developed to visualize the tridimensional geometry and calculate physical properties of drugs. In this work, we describe a practical approach of molecular modeling as a powerful tool to study structure-activity relationships of drugs, including some antibacterials, hormones, cholinergic and adrenergic agents. At first, the students learn how to draw 3D structures and use them to perform conformational and molecular analysis. Thus, they compare drugs with similar pharmacological activity by superimposing one structure on the top of another and evaluate the geometry and physical properties. Keywords: molecular modeling; conformational analysis; structure-activity relationship.

INTRODUO O planejamento e seleo das atividades didticas no ensino de Qumica Farmacutica so tarefas constantes e necessrias para adaptao dos contedos programticos s novas exigncias de um mundo em permanente mudana. As transformaes devem favorecer o uso de novos recursos tecnolgicos e desenvolver o pensamento crtico do aluno. Frente s inovaes competitivas importante direcionar o curso de Qumica Farmacutica para gerar idias alternativas e desenvolver a atitude criativa dos alunos. Neste sentido, algumas estratgias metodolgicas devem ser incorporadas no ensino de Qumica Farmacutica para promoo do processo de ensinoaprendizagem1. Os estudos clssicos de relao estrutura-atividade (REA) exigiam a sntese de diversos anlogos, estruturalmente relacionados a um composto prottipo, e a realizao de sucessivos testes de atividade biolgica. Aps dcadas de investigaes de REA, foi possvel estabelecer algumas generalizaes sobre a influncia de mudanas estruturais especficas nos efeitos biolgicos, incluindo o tamanho e formato da cadeia carbnica, a natureza e o grau de substituio e a estereoqumica de um composto prottipo. As tcnicas tradicionais de modificao molecular e REA so, ainda, importantes na descoberta de novos frmacos, no entanto, so dispendiosas e requerem extenso perodo de investigao, eventualmente bem sucedido2. A disponibilidade de programas computacionais de qumica e os bancos de dados em rede so, atualmente, ferramentas fundamentais para a descoberta e planejamento de frmacos. Estas informaes permitem uma anlise rpida da atividade biolgica versus propriedades fsico-qumicas de uma srie de molculas de interesse. Novos agentes teraputicos podem ser desenvolvidos pela anlise de dados tericos de estrutura-atividade de forma tridimensional, obtidos por tcnicas recentes de modelagem molecular. Face ampla definio de Qumica Medicinal, envolvendo a inveno, descoberta, planejamento, identificao e preparao de compostos biologicamente ativos, com o estudo do seu metabolismo, a interpretao
*e-mail: carronal@usp.br

do seu modo de ao molecular e a construo das relaes entre estrutura e atividade, h uma grande necessidade de insero e abordagem de tpicos de modelagem molecular nos cursos de graduao de Qumica Farmacutica3. Modelagem molecular, segundo a IUPAC, a investigao das estruturas e das propriedades moleculares pelo uso de qumica computacional e tcnicas de visualizao grfica, visando fornecer uma representao tridimensional, sob um dado conjunto de circunstncias4. O planejamento de frmacos auxiliado por computador (CADD Computer-Assisted Drug Design) descrito em diversas pginas da Internet e auxilia, com tutoriais, a investigao das interaes qumicas de um ligante com o seu receptor e explorao dos fatores estruturais relacionados ao efeito biolgico5. Como conseqncia, a elucidao dos mecanismos envolvidos nas aes moleculares dos frmacos pode ser compreendida pela integrao de conhecimentos fundamentais de Qumica Orgnica, Bioqumica, Biologia Molecular e Farmacologia. O curso prtico de Qumica Farmacutica I (2 crditos, duas turmas) tem sido ministrado aos alunos do quinto perodo do curso de Farmcia da FCFRP-USP, paralelamente ao curso terico (4 crditos). Aps a anlise cuidadosa dos diferentes enfoques, as atividades prticas foram direcionadas ao estudo da geometria e das propriedades dos frmacos, no sentido de explorar as bases qumicas e moleculares envolvidas na interao frmaco-receptor, pelo emprego de tcnicas computacionais. De forma mais especfica, os objetivos podem ser descritos como: (i) proporcionar a visualizao tridimensional e realizar a anlise conformacional de frmacos; (ii) analisar o tamanho e formato do grupo farmacofrico; (iii)verificar a importncia da natureza e grau de substituio de grupos funcionais; (iv) observar os aspectos estereoqumicos dos frmacos e sua relao com a atividade biolgica; (v) relacionar a estrutura e as propriedades fsicas de uma mesma srie de frmacos; (vi) predizer os mecanismos moleculares envolvidos na ao dos frmacos.

Vol. 26, No. 3

Introduo a Modelagem Molecular de Frmacos

429

O trabalho apresenta, em sua parte inicial, os mtodos e recursos computacionais utilizados no desenho, representao estrutural correta e visualizao tridimensional de frmacos; em seguida, mostra o emprego de modelagem molecular na determinao terica das propriedades fsico-qumicas e comparao dos dados obtidos da classe de colinrgicos e adrenrgicos, com ao no sistema nervoso autnomo. Esta abordagem contempla, de forma significativa, a integrao de conhecimentos terico-prticos voltados ao estudo da relao estrutura-atividade de frmacos e procura contribuir na elaborao de tpicos para implementao de cursos prticos de Qumica Farmacutica. PARTE EXPERIMENTAL Desenho, anlise conformacional e molecular dos frmacos Desenho e visualizao tridimensional Diversos programas de desenho de molculas bidimensionais so disponveis e de fcil utilizao, como ChemWindow, Isis Draw e ChemDraw. Eles permitem a elaborao de figuras e diagramas com qualidade e exatido desejadas e facilitam o trabalho de documentao e comunicao cientfica. Os alunos apreendem os recursos disponveis no menu principal dos programas Chemdraw6 e Chem3D7 e a utilizao da barra de ferramentas e templates para desenhar estruturas qumicas. Os aspectos estereoqumicos so particularmente explorados e, com exerccios, os alunos so capazes de representar a estereoqumica correta dos carbonos assimtricos dos frmacos, como benzilpenicilina (1) e estramustina (2) (Figura 1). Eventualmente os desenhos podem ser realizados na forma de perspectiva, representando molculas nas diferentes projees de Fisher, Newman e Haworth. Alguns programas permitem o clculo e a representao de vrias propriedades moleculares, incluindo frmula e massa moleculares,
H H N O O H S N COOH

massa exata e anlise terica elementar. Programas mais completos, como ChemDraw Ultra8, fornecem, adicionalmente, o nome qumico correto (IUPAC) dos compostos qumicos e podem predizer os correspondentes deslocamentos qumicos de RMN 1H e 13C, pontos de fuso e congelamento, log P, refratividade molar e calor de formao. A partir do menu principal do programa ChemDraw6, usando o comando Edit e Insert Name as Structure, os alunos so treinados a reconhecer quimicamente os diversos anis heterocclicos, freqentemente presentes nos frmacos. A introduo do nome (em ingls) de um anel na caixa de dilogo, como: oxazole, furane, tetrahydrofuran, pyridine, pyrrole, thiophene, piperazine, pyrazole, imidazole, 1,3-thiazole, benzodiazepine e piperidine permite a visualizao da estrutura correspondente na janela de desenho. Esta tarefa auxilia o aluno a correlacionar a estrutura qumica com a nomenclatura IUPAC e facilita a construo de molculas mais complexas. A visualizao tridimensional dos frmacos realizada pela construo das ligaes, passo a passo, no programa Chem3D7, observando as informaes sobre comprimento e ngulo de ligao, com ajuda do mouse. Molculas mais complexas so desenhadas alternando vrios recursos como o uso de ferramentas de desenho, subestruturas disponveis no programa e uso de caixa de dilogo, cujas frmulas representadas linearmente so digitadas. Paralelamente, so realizadas converses de molculas desenhadas em ChemDraw (copy), para o modelo tridimensional em Chem3D (paste), como exemplificado para sulfametoxazol (3) (Figura 2).

Figura 2. Converso da estrutura de sulfametoxazol (3) em 3D, na forma de ligaes cilndricas (Chemdraw Chem3D)

Benzilpenicilina (1) C16H18N2O4S Massa exata: 334,10 Massa molecular.: 334,39 C, 57,47; H, 5,43; N, 8,38; O, 19,14; S, 9,59

Nos programas de desenho 3D, as molculas podem ser representadas em uma grande diversidade de formatos, como arame, bastes, esferas e cilindros e space filling, construdas a partir de comprimentos e ngulos de ligao (geometria) padronizados (Figura 3).

CH3OPO3Na2 Cl O N O H H H

Cl

Fosfato sdico de estramustina (2) C23H30Cl2NNa2O6P Massa exata: 563,10 Massa molecular: 564,35 C, 48,95; H, 5,36; Cl, 12,56; N, 2,48; Na, 8,15; O, 17,01; P, 5,49

Figura 3. Diferentes representaes de sulfametoxazol, (3a) arame, (3b) cilindro e esfera, (3c) cilindro e (3d) space filling (Chem3D)

Figura 1. Desenho de frmacos com aspectos estereoqumicos relevantes (ChemDraw)

O desenho e a visualizao de frmacos 3D, com fatores estricos relevantes para a atividade biolgica, so importantes para anlise

430

Carvalho et al.

Quim. Nova

do tamanho, volume e formato das molculas. Estes exerccios podem ser feitos nos programas Chem 3D7 ou Molecular Modeling Pro9. Paralelamente aos desenhos, os alunos utilizam modelos 3D para construo das molculas, a fim de facilitar o entendimento e comparar as visualizaes obtidas com os desenhos correspondentes dos programas. As molculas de epinefrina (4) e propranolol (5) so usadas para ilustrar a importncia da estereoqumica para ao de frmacos no receptor beta-adrenrgico (Figura 4). Os compostos (4) e (5) podem ser facilmente desenhados nas suas configuraes ativas, R e S, respectivamente, girando as molculas nos eixos X, Y e Z e fazendo as atribuies de acordo com a regra clssica de Cahn-Ingold-Prelog. Aparentemente, as configuraes do carbono assimtrico da cadeia lateral destes compostos parecem opostas, devido nomenclatura R e S. No entanto, a comparao dos dois frmacos 3D mostra que a disposio e orientao espacial do grupo hidroxila so semelhantes, ou seja, ambos esto direcionados para a mesma face. A diferena de nomenclatura, R e S, devida regra relativa de prioridades, ou seja, o grupo ariloxi, introduzido no antagonista (5), passa a ter prioridade sobre o grupo metileno amino da cadeia lateral, o que no observado na molcula de epinefrina (4) 10.
Figura 5. Comparao do formato e distncias interatmicas do hormnio estradiol (7) e de seus anlogos trans-etilestilbestrol (ativo) (6) e cisetilestilbestrol (inativo) (8)

Figura 4. Configuraes de R-epinefrina (4) e S-propranolol (5), com nomenclatura distinta (regras de prioridade de Cahn-Ingold-Prelog), mas mesma disposio espacial do centro estereognico (Molecular Modeling Pro)

A importncia do formato e tamanho da molcula pode ser ilustrada com o frmaco trans-dietilestilbestrol (6), usado para mimetizar o hormnio natural estradiol (7) (Figura 5). A comparao das distncias interatmicas entre o hormnio natural e os produtos sintticos evidencia que apenas o ismero trans-dietilestilbestrol (6) possui as distncias interatmicas desejadas, entre os carbonos contendo grupos hidroxila laterais, em torno de 9,0 . O ismero geomtrico correspondente cis (8) apresenta a distncia de 5,9 , bem diferente da molcula de estradiol (7) original (8,6 ) 11. Anlise conformacional e minimizao de energia O programa Chem3D7 foi empregado nos estudos propostos, no entanto, outros programas como Molecular Modeling Pro, ChemSite, Alchemy, Sybyl, Hyperchem, ChemX, CAChe e Weblab Viewer so tambm disponveis.

A anlise conformacional de uma molcula realizada pela rotao de uma ligao, com mudana paralela dos ngulos torsionais ou didricos das ligaes, e clculos correspondentes de energia estrica, decorrente da sobreposio espacial de tomos no-ligados e barreiras torsionais de rotao. As molculas desenhadas de forma tridimensional no esto, necessariamente, na conformao mais estvel. Durante a gerao de uma determinada estrutura, ocorrem distores na molcula, com formao desfavorvel de comprimentos e ngulos de ligaes e ngulos didricos. tomos no-ligados tambm interagem em uma mesma regio do espao e provocam repulso estrica e eletrosttica. Para corrigir estas distores as molculas so otimizadas pelo processo de minimizao de energia, a partir de dois modelos matemticos (i) mecnica molecular ou (ii) mecnica quntica. Interaes no previsveis, relacionadas sobreposio de orbital molecular, distribuio de densidade eletrnica ou interferncias estricas podem ser solucionadas pelos mtodos computacionais. A minimizao de energia e a anlise conformacional so usadas interativamente para otimizar a geometria de uma molcula10. A escolha do mtodo de minimizao de energia depende de fatores relacionados ao tamanho da molcula, disponibilidade de parmetros e dados armazenados e recurso computacional. Os modelos moleculares gerados pelo computador so resultantes de equaes matemticas que estimam as posies e propriedades dos eltrons e ncleos; os clculos realizados exploram, de forma experimental, as caractersticas de uma estrutura, fornecendo uma molcula sob nova perspectiva. Mecnica molecular A energia calculada por comparao entre ngulos e distncias de ligao entre tomos que compem a molcula, com valores tabelados, pelo emprego do programa MM2. As equaes obtidas por mecnica molecular consideram apenas o ncleo dos tomos e no incluem os eltrons nos clculos. O programa determina as interaes moleculares resultantes do estiramento das ligaes, deformao angular, torsional e espacial e calcula a energia da molcula de par-

Vol. 26, No. 3

Introduo a Modelagem Molecular de Frmacos

431

tida de forma comparativa, com relao ao padro metano (1 KJ/ mol). O processo de mecnica molecular promove a modificao dos ngulos e comprimentos das ligaes dos tomos originais e fornece novas conformaes com os correspondentes clculos de energia. O programa reconhece as mudanas que conduzem a estruturas mais estveis, de menor energia estrica e os clculos so interrompidos quando as modificaes da estrutura mais estvel, em relao molcula original, no resultam em alterao considervel de energia. O objetivo da mecnica molecular predizer a energia associada com determinada conformao de uma molcula. Porm, a energia estrica, obtida por mecnica molecular, no expressa quantidades absolutas, apenas diferenas de energia entre duas ou mais conformaes10. Mecnica quntica Diferentemente do processo de mecnica molecular, a mecnica quntica usa as equaes de fsica quntica para calcular as propriedades de uma molcula, a partir das interaes entre os seus eltrons e ncleos. O movimento dos eltrons considerado mais rpido e independente do ncleo e, uma vez que os eltrons giram em torno do ncleo, possvel descrever a energia eletrnica separadamente da energia nuclear. Os clculos de mecnica quntica no so exatos, pois so feitas algumas aproximaes baseadas em dados empricos, e podem ser subdivididos em dois mtodos, ab initio e semi-emprico. Mtodo ab initio pode ser aplicado apenas a molculas pequenas e, apesar de mais preciso e no necessitar de dados armazenados, requer grande capacidade de memria e tempo de clculo do computador. O mtodo semi-emprico menos exato, porm mais rpido e pode ser utilizado na minimizao de energia e otimizao de molculas que variam de 10 a 120 tomos. A energia calculada utilizando a equao de Schrdinger, a partir de parmetros armazenados. MOPAC o mtodo semi-emprico freqentemente empregado e pode ser subdividido nos programas: AM1, MINDO/3, MNDO, MNDO-d e PM310. A Figura 6 mostra os frmacos clorpromazina (9) e indometacina (10), nos quais os aspectos conformacionais so importantes para a interao no receptor e gerao do efeito biolgico; visvel a diferena dos arranjos espaciais entre as formas no otimizadas (9b) e (10b) e as correspondentes (9c) e (10c) energeticamente otimizadas pelo programa MOPAC (AM1). O sistema tricclico do antipsictico clorpromazina (9a) parece no interagir na forma plana (9b) no receptor dopaminrgico, mas sim com ngulo de aproximadamente 25 na juno dos anis, que coincide com a estrutura (9c) 12. Por outro lado, a molcula de

indometacina (10a) apresenta diversos aspectos estruturais relevantes para a atividade antiinflamatria, entre eles a orientao do grupo N-p-clorobenzolico no-plana ou perpendicular ao sistema indlico13. A minimizao da estrutura (10b), relativamente plana, permite obter a estrutura ( 10c), mais prxima da conformao bioativa. As molculas 3D minimizadas podem ser movimentadas nos eixos X, Y e Z com o auxlio do mouse para visualizao mais detalhada. Dinmica molecular Os processos de minimizao de energia discutidos anteriormente fornecem uma conformao 3D estvel, que no representa, necessariamente, a estrutura mais estvel de determinada molcula. Na minimizao, os clculos de energia estrica so interrompidos quando a molcula atinge a primeira conformao estvel e levam a uma estrutura semelhante original, com energia mnima local. Nesta fase, a minimizao no continuada porque variaes na estrutura resultam em mudanas pequenas de energia. O Grfico 1 mostra que esta conformao estvel pode estar separada de outra, ainda mais estvel, por uma barreira de energia, que o programa de minimizao incapaz de sobrepujar. Neste caso, para identificar a conformao mais estvel, com uma energia mnima global, necessrio gerar vrias conformaes de uma molcula e comparar os valores de energias obtidos a cada modificao10,14.

Grfico 1. Energia mnima local e global obtidas, respectivamente, pelo processo de minimizao e dinmica molecular

Figura 6. Clorpromazina (9a) e suas estruturas 3D (9b) no otimizada e (9c) otimizada pelo programa MOPAC; indometacina (10a) e suas estruturas 3D (10b) no otimizada e (10c) otimizada pelo programa MOPAC (Chem3D)

O programa de dinmica molecular pode ser empregado para obteno da conformao mais estvel. Neste processo ocorrem estiramentos das ligaes e alteraes angulares, como se a molcula estivesse sendo aquecida e, desta forma, as barreiras de energia entre as conformaes so vencidas. Um exemplo da importncia deste procedimento a conformao barco distorcida de cicloexano, obtida quando o processo de minimizao empregado. Aquecendo a molcula pelo processo de dinmica molecular ocorre a gerao de novas conformaes, incluindo a mais estvel na forma de cadeira. O frmaco clonidina (11), usado para tratamento da hipertenso, pode ser usado para ilustrar as diferentes disposies espaciais da molcula quando convertidas do desenho 2D (11a), minimizada por mecnica molecular (MM2) (11b) e submetida ao processo de dinmica molecular (11c). importante notar a variao do ngulo didrico entre as possveis conformaes de (11). A estrutura (11c), obtida por dinmica molecular, apresenta o anel imidazolina mais prximo da orientao perpendicular ao grupo 2,6-diclorofenlico e contribui para mimetizar o neurotransmissor epinefrina nas interaes com o receptor 2 (Figura 7)15.

432

Carvalho et al.

Quim. Nova

Figura 7. Representao espacial da molcula de clonidina (11), com os correspondentes ngulos didricos (), estruturas (11a): desenhada no programa Chemdraw e convertida ao Chem3D; (11b) minimizada pelo processo de mecnica molecular MM2 e (11c) modificaes sistemticas pelo procedimento de dinmica molecular

No programa Chem3D possvel realizar o processo de dinmica molecular para anlise conformacional de determinada molcula, mas existe o risco de algumas conformaes no serem identificadas. Outro procedimento mais sistemtico e detalhado para realizar a anlise conformacional envolve a gerao, em etapas, de diferentes confrmeros, pela rotao de uma ligao central, de interesse, e alterao pr-fixada do ngulo correspondente pela projeo de Newman. A energia estrica de cada conformao determinada e representada em grfico de energia x ngulo, para visualizao das conformaes mais estveis10. Este procedimento, em etapas, mostrado e explorado no curso prtico, usando a molcula de acetilcolina (ACh) (12) como modelo. Trs tcnicas tm sido usadas para explorar as propriedades conformacionais de (12): cristalografia de raios X, ressonncia magntica nuclear e modelagem molecular. A acetilcolina (12) extremamente interessante devido sua capacidade de desencadear grande nmero de efeitos biolgicos, decorrentes de sua interao em diferentes receptores nicotnicos e muscarnicos do sistema nervoso autnomo. Muitas estruturas anlogas e rgidas de ACh (12) foram preparadas, no entanto, no foi possvel concluir, com exatido, qual a conformao ativa especfica que atua em cada receptor. Por outro lado, foi verificado que o grupo farmacofrico deve adotar arranjos espaciais distintos para interao nos receptores nicotnicos e muscarnicos colinrgicos. A versatilidade da molcula de (12) pode ser explicada pelas diferenas de distncia interatmica de 5,9 e 4,4 , observadas entre o grupo ster e o nitrognio quaternrio, respectivamente, para interao nos receptores nicotnico e muscarnico10. A distncia interatmica est diretamente relacionada conformao de ACh, ou seja ao arranjo dos ngulos didricos ou torsionais da molcula. Para facilitar o aprendizado das diferentes conformaes espaciais de (12), os alunos so treinados a realizar a projeo de Newman

dos tomos centrais de ACh, O(3)-C(4)-C(5)-N(6), no programa Chem3D7 e analisar os possveis ngulos torsionais da molcula, em um processo de anlise conformacional em etapas. O ngulo didrico ou torsional (-tau) pode ser considerado como o ngulo formado entre dois planos definidos como A-X-Y e X-Y-B de quatro tomos conectados na ordem, A-X-Y-B. A projeo permite visualizar a disposio espacial do grupo ster em relao ao amnio quaternrio. No menu principal view do programa Chem3D, possvel selecionar settings e ento movies para girar manualmente apenas a ligao C(4)-C(5), no eixo X-Y da projeo. A cada rotao, previamente estabelecida de 60, ocorre alterao do ngulo didrico e gerao de nova conformao, totalizando seis confrmeros diferentes. A cada mudana no ngulo didrico so calculadas as energias estricas correspondentes das formas anti-periplanar (estrelada), sinclinal (gauche), anticlinal (gauche) e sinplanar (eclipsada) geradas pelo programa MM2 (Tabela 1) 7. Neste experimento possvel determinar a energia mnima global estrica e prever a conformao preferencial mais estvel de ACh (12). As faces positiva (0-180) e negativa (180-0) de rotao so consideradas, na verdade, como uma movimentao completa de 360, no eixo X-Y, no sentido de facilitar a representao grfica e interpretao dos resultados. O grfico de energia x ngulo (Grfico 2) dos diferentes confrmeros de (12) pode ser construdo para interpretar e comparar o significado das propriedades conformacionais. Todos estes passos de mudana de ngulo e medida de energia podem ser gravados e visualizados na forma de animaes, observando as mudanas de ngulos didricos na tabela de medidas. Para completar a anlise conformacional, os alunos repetem a mesma tarefa para S-(+)metacolina (13) (Grfico 2), agonista muscarnico colinrgico, no sentido de verificar a influncia espacial do grupo metila, comparando os grficos de energia estrica x ngulos didricos obtidos. No exemplo de S-metacolina (13), a conformao mais estvel prxima sinclinal, com ngulo de 80. Por outro lado, para o ismero R(-)-metacolina, biologicamente inativo, a conformao mais estvel prxima a anticlinal (280). As dimenses moleculares de estruturas 3D de (12), relativas ao comprimento e ngulo de ligao e ngulo torsional (ou didrico), podem ser obtidas, adicionalmente, na forma de tabelas em uma janela adicional de medidas, e usadas para anlise conformacional e comparao entre compostos anlogos (Figura 8) 7. Propriedades moleculares O entendimento do mecanismo de ao e metabolismo de antibiticos -lactmicos depende, em grande extenso, da anlise da reatividade do frmaco. O principal objetivo prever a formao de

Tabela 1. Anlise conformacional da molcula de acetilcolina (12), visualizada atravs de projeo de Newman (Chem3D e Weblab Viewer)

ngulo Didrico Conformaes Energia (Kcal/mol)

58 Sinclinal (+) 23

118 Anticlinal (+) 18

178 Anti-periplanar 15

238 Anticlinal (-) 18

298 Sinclinal (-) 22

358 Sinplanar 37

Vol. 26, No. 3

Introduo a Modelagem Molecular de Frmacos

433

Figura 8. Molcula de acetilcolina (12) e as correspondentes medidas de comprimento e ngulo de ligao e ngulo torsional (Chem3D)

Grfico 2. Representao da variao de energia em funo do ngulo didrico das molculas de acetilcolina (12) e S-metacolina (13)

produtos de degradao, em determinado compartimento biolgico, e diferenas de espectro de ao em funo da presena de grupos polares adicionais na molcula. Um exemplo marcante a anlise de reatividade da molcula de benzilpenicilina (14), a qual, em meio cido, sofre reaes intramoleculares, iniciadas pelo oxignio nucleoflico (amida) da cadeia lateral (Esquema 1) 10.

A sensibilidade de (14) em meio cido causada por trs fatores: a tenso torsional do anel -lactmico, a alta reatividade do carbono carbonlico -lactmico e a influncia do grupo acila (amida) da cadeia lateral, que atua pela reao de participao do grupo vizinho10. Por outro lado, no antibitico ampicilina (17a), o grupo amino carbonila (amida) da cadeia lateral, retira eltrons do grupo amida vizinho e, conseqentemente, diminui o ataque junto ao anel lactmico. Neste caso, o antibitico (17a) pode ser usado pela via oral, porque o meio cido estomacal no produzir os metablitos, cidos penicilnico (15) e penlico (16), entre outros. Adicionalmente, o grupo amino polar de ampicilina (17a) capaz de se ionizar e, desta forma, atravessar os canais de porina (hidroflicos) da parede celular bacteriana com maior facilidade, permitindo que o antibitico atue nas bactrias gram-negativas10. A visualizao da carga parcial dos tomos dos antibiticos lactmicos permite avaliar a reatividade geral da molcula e sugerir reaes de degradao, como a observada durante a hidrlise cida (Esquema 1). A nuvem eletrnica de uma molcula no est fixa em um tomo especfico, mas pode se mover em torno da molcula. Existe maior probabilidade de encontrar os eltrons mais prximos a tomos eletronegativos do que eletropositivos e, por esta razo, a distribuio de carga na molcula no uniforme. Os valores de carga parcial podem ser quantificados e representam a mdia da carga parcial de cada tomo, subtrada do nmero de prtons presentes. Geralmente, quanto maior a grandeza de uma carga atmica, maior ser a probabilidade de ocorrer a formao de ligaes com outros

Esquema 1. Degradao parcial da molcula de benzilpenicilina (14) em meio cido

434

Carvalho et al.

Quim. Nova

tomos, cuja carga parcial possui sinal oposto. O mtodo de Hckel Estendido envolve clculos de orbital molecular mecnico-quntico semi-emprico no programa Chem3D e pode ser usado para visualizao da carga parcial de cada tomo. As cargas parciais podem ser representadas de trs formas em uma molcula 3D: variao de colorao dos tomos (negativo: azul e positivo: vermelho); tamanho das esferas dos tomos e tamanho da superfcie representada por dots. Na visualizao por dots o tamanho de cada nuvem representa a quantidade de carga de cada tomo, mais negativo (vermelho) ou positivo (azul). Na Figura 9, benzilpenicilina (14) representada pelas estruturas (14a) e (14b) e ampicilina por (17a) e (17b, forma ionizada), sendo a carga parcial representada em (a) por colorao dos tomos e (b) por dots 7.

Figura 10. Representao da distribuio de carga nas molculas de benzilpenicilina (14c) e ampicilina (17c); azul escuro, bastante positivos; azul claro, levemente positivos; marrom, bastante negativos; vermelho, levemente negativos e branco, neutro (Molecular Modeling Pro)

Figura 9. Diferentes representaes da distribuio de carga parcial nas molculas de benzilpenicilina (14a) e (14b) e ampicilina (17a) e (17b, forma ionizada); as estruturas (14a) e (17a) so representadas por diferentes coloraes das cargas parciais (negativo: azul e positivo: vermelho) e as estruturas (14b) e (17b, forma ionizada) por dots (mais negativo: vermelho ou positivo: azul), (Chem3D)

acesso ao solvente. Por exemplo, possvel representar a molcula de sulfametoxazol (3) por superfcie de densidade total de carga, destacando as cargas parciais presentes (Figura 11).

As diferenas de carga dos correspondentes tomos de oxignio (carbonlico) da amida lateral de penicilina (14) (-0,33) e ampicilina protonada (17) (-0,26) podem ser visualizadas pelo emprego do mtodo CNDO, Molecular Modeling Pro9. A presena do grupo amino protonado, adicional em ampicilina (17), diminui a carga negativa do tomo de oxignio da amida lateral, tornando-o menos reativo para realizar ataque nucleoflico no carbono carbonlico do anel -lactmico em meio cido. As cargas dos tomos de carbono e nitrognio da funo amida de (17) so alterados em menor proporo, tornando-se, respectivamente, menos eletroflica e nucleoflica. Na Figura 10 so mostrados os valores de carga parcial dos tomos das molculas de benzilpenicilina (14c) e ampicilina (17c), calculados no programa Molecular Modeling Pro9. Os valores de carga parcial e momento dipolar podem ser calculados por diversos mtodos computacionais, como Teoria de Hckel Estendido, que considera a combinao linear dos orbitais atmicos; CNDO, envolvendo processo de qumica quntica semi-emprico ou Del Re, completamente emprico. O mtodo CNDO bastante empregado para anlise da geometria e propriedades moleculares e os clculos de Hckel Estendido so mais aplicados a sistemas aromticos. Assim, os dados de carga parcial, mostrados na Figura 10, foram obtidos pelo mtodo CNDO, disponvel no menu principal (tools) do programa Molecular Modeling Pro9. Outras visualizaes ainda so possveis como a superfcie de orbital molecular, potencial eletrosttico molecular e superfcie de

Figura 11. Estrutura de sulfametoxazol (3) com densidade de carga total representada por ( 3e ) dots; (3f ) nuvem transparente e (3g ) arame (Chem3D)

Modelagem molecular Os tpicos de modelagem molecular foram centralizados na explorao das diferenas eletrnicas, estricas e hidrofbicas entre frmacos agonistas e antagonistas dentro de uma mesma classe teraputica. Os programas Molecular Modeling Pro9 e ChemSite16 (ChemSW) foram usados nos estudos de modelagem molecular e todas as molculas analisadas foram previamente submetidas minimizao de energia estrica, pelo processo de mecnica molecular MM2 e AMBER e, posteriormente, salvas em um mesmo diretrio para clculo simultneo das propriedades desejadas. Algumas propriedades fsicas no dependem da geometria da molcula, no entanto, a otimizao da geometria necessria para clculos de volume e comprimento moleculares, rea de superfcie, densidade e momento dipolar. No programa Molecular Modeling Pro, a anlise conformacional em etapas, descrita no item anterior, pode ser realizada de forma automtica e rpida, com a possibilidade de girar duas ligaes em uma mesma anlise. Em poucos segundos o programa fornece os

Vol. 26, No. 3

Introduo a Modelagem Molecular de Frmacos

435

grficos de energia x ngulo, as tabelas correspondentes e a representao de trs das estruturas mais estveis obtidas9. Nesta etapa do curso, os estudos de introduo a modelagem foram direcionados na anlise das diferenas e semelhanas estruturais entre compostos agonistas e antagonistas de uma mesma classe teraputica, pela sobreposio molecular de grupos funcionais comuns e determinao de parmetros fsicos, possivelmente relevantes para a atividade biolgica. A melhor sobreposio foi obtida aps o alinhamento dos diversos compostos no eixo x-y, realizada de acordo com as instrues do manual do programa9. Os substratos foram mantidos fixos (acetilcolina e epinefrina) e os frmacos foram arranjados, prximos aos substratos correspondentes, com auxlio das ferramentas de rotao. As diferenas e semelhanas estruturais podem ser destacadas de vrias formas e coloraes; na Figura 12, acetilcolina (12) representada na forma de ligaes cilndricas e esferas, enquanto os frmacos (13, 18-21) so mostrados como bastes.

momento dipolar, entre outros. O programa realiza o clculo simultneo das propriedades de todas as molculas salvas em um mesmo diretrio, apresentando os dados desejados na forma de tabela9. A Tabela 2 mostra alguns dos parmetros obtidos na anlise comparativa entre os frmacos que atuam no sistema colinrgico. A interpretao destes dados contribui para o entendimento do curso terico, pois mostra as distncias interatmicas e ngulos torsionais entre o oxignio do grupo ster e o nitrognio quaternrio (O-C-C-N), ou tercirio (atropina), bastante semelhantes entre agonistas e antagonistas. Outro fator interessante a diferena das medidas de volume e comprimento moleculares entre as duas classes, caracterizando, quantitativamente, a presena de grupo volumoso e de maior comprimento molecular nos antagonistas, tambm visualizado no processo de sobreposio. As mesmas comparaes e medidas foram realizadas para anlise estrutural dos frmacos da classe dos adrenrgicos, empregando epinefrina (22) como o substrato de referncia para as visualizaes por sobreposio. Para facilitar a comparao, epinefrina (22) representada na forma de esfera e cilindro e os frmacos (23-26) na forma de basto (Figura 13).

Figura 12. Sobreposio de frmacos colinrgicos com ACh (12), destacando as semelhanas (distncias intermoleculares e ngulo didrico) e diferenas (volumes moleculares) existentes. ACh (12) representada por esferas e cilindros e os frmacos (13, 18-21) apenas por bastes (Molecular Modeling Pro)

A sobreposio do substrato ACh com os frmacos, mostrados na Figura 12, evidencia algumas semelhanas entre os agonistas, metacolina (13) e betanecol (18), e antagonistas, atropina (19), propantelina (20) e suxametnio (21), como distncia interatmica e o ngulo didrico entre o oxignio ster e o grupo amino lateral. Por outro lado, so bastante visveis as diferenas do tamanho molecular, destacando a presena de grupos volumosos adicionais nos antagonistas. Diversos parmetros fsico-qumicos de interesse podem ser medidos na forma de tabela pela aplicao do programa Molecular Modeling Pro, incluindo distncias interatmicas, ngulos didricos, volume, comprimento e peso moleculares, coeficiente de partio (logP), polaridade, ligao de hidrognio, conectividade molecular,

Figura 13. Sobreposio de frmacos adrenrgicos com epinefrina (22), destacando as semelhanas (distncias intermoleculares e ngulo didrico) e diferenas (volumes moleculares) existentes. Epinefrina (22) representada por esferas e cilindros e os frmacos (23-26) apenas por bastes (Molecular Modeling Pro)

De forma semelhante aos frmacos colinrgicos, so realizadas as observaes da geometria dos compostos agonistas, dopamina (23) e efedrina (24) e antagonistas, propranolol (25) e atenolol (26), no sentido de estabelecer as semelhanas e diferenas mais relevantes. Nesta classe de ligantes adrenrgicos, as semelhanas esto relacionadas cadeia lateral etilamina ou etanolamina nos agonistas e oxipropanolamina nos antagonistas, enquanto que o volume molecular , novamente, uma diferena marcante entre estes frmacos (Tabela 3).

Tabela 2. Parmetros fsicos obtidos na anlise comparativa dos frmacos do sistema colinrgico Classe dos colinrgicos Acetilcolina S-Metacolina S-Betanecol S-Atropina Propantelina Succinilcolina Frmula C7H17NO2 C8H19NO2 C7H18N2O2 C17H25NO3 C3H33NO3 C14H32N2O4 volume molecular (cm3/mol) 94,30 104,32 101,15 168,55 223,66 182,05 comprimento molecular () 10,38 10,72 10,81 11,05 14,92 18,94 Log P 0,87 1,18 0,33 1,52 4,63 1,05 momento dipolar (Debyes) 1,34 1,53 2,88 2,28 2,06 0,07 distncia interatmica () 3,78 3,76 3,77 4,03 3,84 3,75 ngulo didrico 180,04 149,02 150,56 302,10 174,83 179,99

436

Carvalho et al.

Quim. Nova

Tabela 3. Parmetros fsicos obtidos na anlise comparativa dos frmacos do sistema adrenrgico Classe dos Adrenrgicos R-Adrenalina Dopamina D-(-)-Efedrina S-Propranolol S-Atenolol Frmula C9H13N O3 C8H11NO2 C10H15NO C15H21NO2 C14H22N2O3 volume molecular (cm3/mol) 102,66 87,19 101,66 146,09 155,78 comprimento molecular () 12,22 10,85 8,05 12,92 17,12 Log P -0,60 0,09 1,03 2,74 -0,15 momento dipolar (Debyes) 1,39 1,47 0,66 2,02 2,79 distncia interatmica () 3,84 3,83 2,96 3,90 3,85 ngulo didrico 181,66 177,31 55,47 179,62 181,55

A importncia da sobreposio dos frmacos no se restringe apenas comparao geomtrica com o substrato correspondente, mas pode tambm ser usada para anlise comparativa de lipofilicidade e distribuio de carga parcial. A Figura 14 mostra dois exemplos caractersticos de diferenas de lipofilicidade, acetilcolina (12) versus atropina (19) e epinefrina (22) versus propranolol (25). A colorao azul indica regio lipoflica e marrom e vermelho, regio hidroflica. possvel observar como os antagonistas se destacam em termos de lipossolubilidade em relao aos respectivos substratos.

Figura 14. Anlise da lipofilicidade comparativa de frmacos, em funo das diferentes coloraes: azul escuro, regio muito lipoflica; azul claro, pouco lipoflico; preto, neutro; vermelho, pouco hidroflica e marron, muito hidroflica (Molecular Modeling Pro)

A distribuio de carga tambm pode ser analisada comparativamente durante a sobreposio. A Figura 15 mostra as diferenas de carga parcial entre acetilcolina (12) versus atropina (19) e epinefrina (22) versus propranolol (25) devido s diferenas de colorao entre os tomos. Colorao azul escuro indica tomos com carga parcial positiva, azul claro: pouco positivo, vermelho: pouco negativo e marrom: negativo.

Figura 15 . Anlise da distribuio de carga parcial comparativa de frmacos, em funo das diferentes coloraes: azul escuro indica carga parcial positiva; azul claro, pouco positivo; vermelho, pouco negativo e marrom, negativo (Molecular Modeling Pro)

conhecimentos fundamentais de Qumica Orgnica, como estereoqumica, reatividade e nomenclatura, para entendimento da relao estrutura-atividade de frmacos. Os processos de minimizao de energia e dinmica molecular foram explorados visando obteno de estruturas mais estveis, no sentido de corrigir eventuais distores moleculares, decorrentes da gerao de ligaes com comprimentos, ngulos e ngulos didricos desfavorveis. As interaes de repulso estrica e eletrosttica, observadas em tomos no-ligados foram, paralelamente, corrigidas nesta etapa10. O estudo da variao de energia estrica em funo da mudana do ngulo didrico da molcula de acetilcolina permitiu realizar a anlise conformacional detalhada, inclusive proporcionando a visualizao grfica dos resultados. A ausncia de centro estereognico em ACh fornece um grfico com curva simtrica, diferente de S-metacolina. O grfico permitiu concluir qual a conformao mais estvel de ACh e a correspondente alterao do perfil de energia estrica, aps a introduo de grupo metila na cadeia principal, gerando a molcula de S-(+)-metacolina, com reconhecida ao muscarnica seletiva. A projeo de Newman da molcula de ACh [(CH3)3+N-C-COC(O)CH3], com rotao da ligao covalente C-C central, permitiu visualizar, na conformao antiperiplanar, a maior distncia e menor repulso entre os grupos funcionais substituintes, (CH 3) 3N+ e OC(O)CH3, representando a estrutura de maior estabilidade, com energia estrica de 15,4 Kcal. Em contrapartida, os resultados obtidos para S-metacolina foram distintos e a conformao mais estvel obtida foi prxima a forma sinclinal (80), com energia estrica de 16,7 Kcal. Em associao com as aulas tericas, os alunos concluem que existe grande probabilidade dos frmacos agirem em seu alvo na conformao termodinamicamente mais estvel, no entanto, outros fatores podem interferir na disposio espacial da estrutura final. A molcula de ACh um exemplo caracterstico, que, no compartimento biolgico age, provavelmente, na forma antiperiplanar (180) no receptor nicotnico e sinclinal (~80)17 ou anticlinal (~120)18 no receptor muscarnico, sendo esta ltima interao devido, provavelmente, interao eletrosttica entre os grupos (CH3)3N+ e OC(O)CH3 da molcula. Este dado est em acordo com a forma observada para o agonista muscarnico seletivo, S-metacolina, cuja conformao bioativa prxima sinclinal (80). Modelagem molecular

RESULTADOS E DISCUSSO Desenho, anlise conformacional e molecular de frmacos A representao estrutural tridimensional dos frmacos nos programas computacionais e a construo de modelos moleculares foram importantes para o aprendizado das caractersticas geomtricas e moleculares essenciais para a atividade biolgica de algumas classes de frmacos. Esta primeira etapa de atividade procurou reunir As atividades prticas de modelagem molecular envolveram o uso de qumica computacional como ferramenta direcionada ao estudo das caractersticas e propriedades dos frmacos colinrgicos e adrenrgicos. Nas duas classes de frmacos os alunos foram capazes de entender e memorizar as semelhanas estruturais entre os frmacos agonistas e antagonistas necessrias para a afinidade no receptor correspondente, assim como as diferenas estruturais fundamentais, que, freqentemente, convertem um substrato em um inibidor com-

Vol. 26, No. 3

Introduo a Modelagem Molecular de Frmacos

437

petitivo. Os estudos tericos de relao estrutura-atividade e explorao do grupo farmacofrico de frmacos do sistema nervoso autnomo foram complementados realizando comparao estrutural do substrato com seus correspondentes agonistas e antagonistas nos programas de modelagem molecular (Figuras 12 e 13) 9,16. A sobreposio dos compostos e as medidas de volume e comprimento moleculares comparativas entre os agonistas e antagonistas mostraram a manuteno de certas propriedades estruturais para interao complementar no receptor e a presena marcante de grupos volumosos nos antagonistas, contribuindo para interaes hidrofbicas adicionais em regies prximas ao receptor. Nestes exerccios os alunos concluram que, na classe dos frmacos do sistema nervoso autnomo, o maior volume molecular dos frmacos antagonistas promove maior impedimento estrico e bloqueia o receptor para interao com o substrato correspondente. As distncias interatmicas apresentadas pelos frmacos agonistas e antagonistas colinrgicos, calculadas entre o tomo de oxignio da funo ster e o grupo de amnio quaternrio (ou tercirio), foram entre 3,7 a 4,0 , confirmando a necessidade de manuteno desta caracterstica estrutural em ambas as classes para maior afinidade com o receptor. A distncia obtida pode, ainda, ser interpretada como a distncia complementar existente entre os aminocidos dos stios de ligao no receptor, necessrias para interao com o ligante. Os aminocidos de Thr192 (treonina) e Asn382 (asparagina) que realizam interao hidrofbica e ligao de hidrognio com o grupo ster de ACh e os aminocidos de Asp105 (aspartato), Trp378 (triptofano) e Tyr381 (tirosina), que interagem com o grupo amnio quaternrio (ou tercirio protonado) atravs de interao inica e ction , devem estar separados pela mesma ordem de grandeza (Figura 16)18.

Figura 17. Receptor hipottico adrenrgico e as interaes em regies hidrofbicas, aninica e de ligao de hidrognio com epinefrina

Figura 16. Receptor hipottico muscarnico e as interaes em regies hidrofbicas, aninica e de ligao de hidrognio com o neurotransmissor ACh

Com exceo da molcula de efedrina ( 24 ), as distncias interatmicas observadas para a classe dos frmacos adrenrgicos variaram entre 3,8 a 3,9 , relativas s distncias entre os grupos amino da cadeia lateral e o tomo de carbono do anel aromtico, diretamente ligado cadeia lateral etilamina (dopamina, 23 ), etanolamina (epinefrina 22) ou oxipropanolamina (propranolol, 25 e atenolol, 26). A presena de grupo metila em efedrina (24) causa grande distoro da cadeia lateral, mas para a maioria dos compostos agonistas e antagonistas existe grande similaridade geomtrica das cadeias laterais. Aparentemente, no receptor adrenrgico, as distncias entre o resduo Asp113 (aspartato), que interage por ligao inica com o grupo amino protonado do substrato, e o aminocido Phe290 (fenilalanina), responsvel pela interao hidrofbica com o anel aromtico do ligante, apresentam distncias interatmicas similares (Figura 17) 10. Com relao aos frmacos antagonistas anticolinrgicos, propantelina (20) e suxametnio (21), os ngulos didricos observados entre os tomos O-C-C-N foram semelhantes em relao ao substrato

ACh, na sua conformao antiperiplanar (em torno de 180), mais estvel. Por outro lado, os agonistas, S-metacolina (13) e S-betanecol (18), com grupo metila na cadeia principal, apresentam uma conformao diferente com ngulo didrico em torno de 150, de menor energia estrica. A diferena obtida (80) nos estudos de anlise conformacional indica que os resultados de ngulo, obtidos na Tabela 2, podem estar relacionados conformao de energia mnima local, obtida durante o processo de minimizao MM2. Os frmacos da classe dos adrenrgicos, com cadeia lateral flexvel ligada ao anel aromtico, apresentaram, na maioria dos exemplos, ngulo didrico prximo a 180 entre o oxignio hidroxlico e a funo amino (O-CC-N) da cadeia lateral. O momento dipolar, calculado para os frmacos colinrgicos e adrenrgicos, traduz o carter polar das diversas molculas, uma vez que representa a somatria de vetores das foras de polarizao exercida pelos grupos funcionais presentes. Diversos mtodos de clculo terico do momento dipolar esto disponveis no programa Molecular Modeling Pro, como Del Re modificado que considera a contribuio adicional de ligao pi, PEOE (Partial equalization of orbital electronegativity), capaz de considerar as contribuies das ligaes sigma e pi e MPEOE, relacionado ao mtodo PEOE melhorado. Os valores mostrados na Tabela 2 correspondem aos clculos obtidos com o mtodo MPEOE. Na classe dos compostos do sistema colinrgico foi possvel comprovar o maior carter polar de suxametnio (21), antagonista colinrgico nicotnico, em relao atropina (19) e propantelina (20), antagonistas colinrgicos muscarnicos. Os frmacos agonistas metacolina (13) e acetilcolina (12) apresentaram polaridades semelhantes, com valores intermedirios em relao s duas classes de antagonistas. Os valores de log P ou coeficiente de partio leo/gua, determinados para os fragmentos presentes na molcula, foram caractersticos para os frmacos colinrgicos. Os grupos volumosos adicionais dos antagonistas muscarnicos determinam maior solubilidade em lipdio, fornecendo maiores valores de log P para atropina (19) e, especialmente, para propantelina (20). O agonista betanecol (18), com grupo carbamato, apresentou o menor valor de log P, indicando sua maior solubilidade em gua. Os frmacos adrenrgicos apresentaram valores de log P sem uma correlao aparente com o efeito agonista ou antagonista; propranolol (25) e efedrina (24) foram mais lipossolveis que os frmacos correspondentes atenolol (26) e dopamina (23). CONCLUSES As atividades prticas envolvendo Modelagem Molecular foram executadas com xito pelos alunos. No incio dos trabalhos propostos os recursos dos programas (Chemdraw6, Chem3D7, Molecular

438

Carvalho et al.

Quim. Nova

Modeling Pro9 e ChemSite16) foram demonstrados com tutoriais e folhetos explicativos. Em um primeiro momento houve certa dificuldade em correlacionar os dados obtidos com a atividade biolgica, no entanto, a integrao do curso terico com o prtico proporcionou melhor entendimento dos tpicos de relao estrutura-atividade de frmacos. Os relatrios apresentados durante o curso demonstraram certo amadurecimento, com maior sedimentao dos conhecimentos e melhor comunicao cientfica. Na avaliao interna do curso prtico, 86% dos alunos responderam que os programas usados foram convenientes para o seu aprendizado; quando questionados sobre o grau de dificuldade dos trabalhos, 53% acreditaram que este foi compatvel com o contedo apresentado e 28% responderam que apenas parcialmente. REFERNCIAS
1. Vasconcelos, M. L.; A Formao do Professor de Terceiro Grau, Pioneira: So Paulo, 1988. 2. Thomas, G.; Medicinal Chemistry: An Introduction, Wiley: Chichester, 2000. 3. Wermuth, G.; Ganellin, C. R.; Lindberg, P.; Mitscher, L. A.; Pure Appl. Chem. 1998, 70, 1129. 4. Santt Anna, C. M. R.; Quim. Nova 2002, 25, 505. 5. http://www.chem.ox.ac.uk/course/cache, acessada em Junho 2002; http:// www.chem.swin.edu.au/modules, acessada em Junho 2002.

6. Cambridge Soft Corporation; CS ChemDraw 5.0, Chemical Strutucture Drawing Standard; Cambridge, 1998. 7. Cambridge Soft Corporation; CS Chem3D 5.0, Molecular Modeling and Analysis; Cambridge, 1998. 8. Cambridge Soft Corporation; CS Chem3D Ultra 5.0, Ultimate Modeling, Visualization and Analysis; Cambridge, 1998. 9. ChemSW Inc.; Molecular Modeling ProTM4.0, Computational Chemistry Program; Fairfield, 2001. 10. Patrick, G. L.; An Introduction to Medicinal Chemistry, 2nd ed., Oxford University Press: Oxford, 2001. 11. Gringauz, A.; Introduction to Medicinal Chemistry: How Drugs Act and Why, Wiley-VCH: New York, 1997. 12. Nieforth, K. A.; Gianutsos, G. Em Principles of Medicinal Chemistry; Foye, W. O.; Lemke, T. L.; Williams, D. A., eds.; 4th ed., Williams & Wilkins: Baltimore, 1995, cap. 15. 13. Borne, R. F. Ref. 12, cap. 25. 14. Kumosinski, T.; Liebman, M. N.; Molecular Modeling: From Virtual Tools to Real Problems, ACS Symp. Ser. 576: Denver, 1994. 15. Wermuth, C. G. Em The Practice of Medicinal Chemistry; Wermuth, C. G. ed.; Academic Press: San Diego, 1996, cap. 17. 16. ChemSW Inc.; ChemSite: Interative 3D Molecular Modeling; Fairfield, 2001. 17. Cocolas, G. H. Em Wilson and Gisvolds Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry; Delgado, J. N.; Remers, W. A., eds.; 10th ed., Lippincott-Raven: Philadelphia, 1998, cap. 17. 18. Nordval, G.; Hacksell, U.; J. Med. Chem. 1993, 36, 967.