Acta Farm.

Bonaerense 23 (1): 27-31 (2004)

Recibido el 6 de junio de 2003 Aceptado el 21 de septiembre de 2003

Trabajos originales

Influncia de Diferentes Sistemas de Solventes no Processo de Extrao de Calendula officinalis L. (Asteraceae)

Patrik Oening RODRIGUES, Tasi Citadin GONALVES & Wellington Barros da SILVA* Ncleo de Pesquisa em Desenvolvimento e Tecnologia Farmacutica (TECFARMA), Laboratrio de Farmacognosia, Curso de Farmcia, Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL), Av. Jos Accio Moreira, 787, 88704-900, Tubaro, SC, Brasil

RESUMO. A influncia de diferentes sistemas de solventes no processo extrativo de Calendula officinalis L. Asteraceae, foi investigada neste trabalho. As solues extrativas foram obtidas utilizando os seguintes sistemas de solventes: 1) gua:etanol (70:30 V/V) (SE-EtOH); 2) gua:etanol:propilenoglicol (70:30:10 V/V) (SE-PROPGL) e 3) gua:etanol:PEG 400 (70:30:10 V/V) (SE-PEG). Procedeu-se a avaliao dos parmetros fsico-qumicos dos extratos, bem como caracterizao fitoqumica para flavonides por CCD. A determinao quantitativa foi realizada por CLAE de fase reversa (RP-18) em sistema isocrtico, com fase mvel constituda por acetonitrila:gua:cido fosfrico (17:83:0,5 V/V). A partir da curva analtica do padro de rutina (r 2 = 0,99976), foi possvel calcular o TF(%), de SE-EtOH (0,29370,00657 CV% 2,24), SE-PROPGL (0,22930,00715 CV% 3,12) e SE-PEG (0,28290,01102 CV% 3,90). SUMMARY. Influence of the different solvent systems on the extractive procedures from Calendula officinalis L. (Asteraceae). The influence of different solvent systems on the extractive procedures from Calendula officinalis L. Asteraceae flowers was investigated. Plant extracts were prepared with 1) water:ethanol (70:30 v/v) (SEEtOH); 2) water:ethanol:propilenoglicol (70:30:10 v/v) (SE-PROPGL) and 3) water:ethanol:PEG 400 (70:30:10 v/v) (SE-PEG). The physico-chemical properties of the extract, as well its TLC characterization were carried out. Quantitation was performed by HPLC on a C18 columm with an isocratic mobile phase consisting of acetonitrile-water-phosphoric acid (17:83:0,5 v/v), using rutin as external standard. rutin calibration curve was linear (r 2 = 0,99976) and the flavonoid content showed the following results (%, w/w): SE-EtOH (0,29370,00657 CV% 2,24), SE-PROPGL (0,22930,00715 CV% 3,12) and SE-PEG (0,28290,01102 CV% 3,90).

INTRODUO Pertencente a famlia Asteraceae, a Calendula officinalis L. uma planta herbcea, originria do Mediterrneo. Extratos das flores so utilizados em numerosas preparaes de uso externo, como antiinflamatrio e cicatrizante, notadamente em cosmetologia, fazendo parte da composio de preparaes indicadas para o tratamento de eritemas solares, queimaduras e dermatoses secas. Os componentes principais so flavonides e saponinas 1. Nas flores foram descritas a presena de lcoois triterpnicos (2-5%), na forma livre ou esterificados com cidos graxos; carotenides (1,5%), responsveis pela colorao das flores; flavonides (0,2-0,9%), livres ou como

glicosdeos de quercetina e isorramnetina; cumarinas; cidos fenolcarboxlicos (0,1%), inclusive cido saliclico; leo voltil (0,2% nas flores secas); polissacardeos (10% de pectina e 15% de polissacar deos sol veis) e alanto na (at 0,7%) 2. Os flavonides so compostos biossintetizados a partir da via dos fenilpropanides presentes em abundncia entre os metablitos secundrios de vegetais. Representam um dos grupos fenlicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural. Dentre todas as classes de flavonides, a Calendula officinalis L. possui principalmente flavonis, representados na grande maioria pelos compostos quercetina e rutina.

PALAVRAS CHAVE: Calendula officinalis L., CLAE, Flavonides, Mtodos extrativos. KEY WORDS: Calendula officinalis L., Extractive methods, Flavonoids, HPLC.
Autor a quem dirigir a correspondncia. E-mail: wbarros@unisul.br

ISSN 0326-2383

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Rodrigues, P.O., T.C. Gonalves & W.B. da Silva

MATERIAS E MTODOS Obteno dos extratos Flores de Calendula officinalis L. (10 g) foram submetidas extrao sob refluxo em balo de fundo redondo (20 minutos sob ebulio) com 200,0 mL dos seguintes sistemas de solventes: 1) gua:etanol (70:30 V/V) (SE-EtOH); 2) gua:etanol:propilenoglicol (70:30:10 V/V) (SEPROPGL ) e 3) gua:etanol:PEG 400 (70:30:10 V/V) (SE-PEG). Caracterizao das solues extrativas Determinao do pH das solues extrativas O potencimetro foi calibrado a 25 C, com solues tampo de fosfato e acetato, a pH 7,0 e 4,0 respectivamente 3. Determinao da Densidade Relativa Verificou-se a densidade relativa das solues extrativas em picnmetro de 25,0 mL em temperatura ambiente (25 C). A densidade foi calculada pelo quociente entre a massa da soluo extrativa e massa de gua contidas no picnmetro, sendo o resultado expresso pela mdia de trs determinaes 3. Determinao do Resduo Seco Alquotas de 20,0 mL das solues extrativas foram levadas a resduo seco por aquecimento a 120 C em balana de infra-vermelho, por um perodo de 180 minutos. Este ensaio foi realizado em triplicata para cada soluo extrativa. Reaes cromognicas para caracterizao de flavonides 4, 5 Reao com cloreto frrico As solues extrativas foram diludas na proporo de 1:9 (V/V) com etanol. Cada SE foi dividida em duas aliquotas de 5,0 mL e transferidas para tubos de ensaio ento o extrato diludo em 2 tubos de ensaio. A um dos tubos adicionase 1 gota de soluo metanlica de cloreto frrico 2,0%, sendo o segundo o branco. A presena de compostos flavonocos favorece a colorao variante entre azul e verde. Reao da Cianidina Transferiu-se 5,0 mL de soluo extrativa para um tubo de ensaio, adicionando em seguida pequenos fragmentos de magnsio metlico e 1,0 mL de cido clordrico R. Quando em presena de agliconas flavonodicas esta reao desenvolve colorao vermelha. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Foi desenvolvido estudo preliminar para ca28

racterizao do perfil cromatogrfico das amostras por cromatografia em camada delgada. Utilizou-se como suporte cromatofolhas de gel de slica 60 F254 e como substncias de referncia solu es metan licas de cido clorog nico, quercetina e rutina na concentra o de 1 mg/mL. Utilizou-se como sistema eluente: acetato de etila: cido frmico: cido actico glacial: gua (100:11:11:27 V/V) 6. Aps secagem temperatura ambiente procedeu-se a observao sob luz UV em 366 nm, antes e depois de borrifar a placa com soluo reveladora contendo cido c trico: cido b rico:metanol (12:12:76 p/V). Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) As anlises foram realizadas nas seguintes condies cromatogrficas: sistema isocrtico, fase mvel constituda por acetonitrila:gua:cido fosfrico (17:83:0,5 V/V). Pr-coluna: CLC-G ODS; coluna cromatogrfica: CLC-ODS RP-18 (25cm x 4,6mm x 5(m). Fluxo: 1,2 mL/minuto; temperatura do forno: 30 C; detector de UV/ VIS em 340 nm. Diluiu-se os extratos com metanol (1:5 V/V). Cerca de 20(L de amostra foi injetada no cromatgrafo para o desenvolvimento do fingerprint e determinao analtica 7, 8. RESULTADOS E DISCUSSO Os resultados obtidos para a caracterizao das solues extrativas so apresentadas a seguir. As reaes cromognicas de carter qualitativo identificaram a presena de flavonides em todas as solues extrativas em anlise (Tabela 1).
Teste da cianidina Reao com FeCl 3

Amostras

SE-EtOH SE-PROPGL SE-PEG

Laranja Laranja Laranja

Verde musgo Verge musgo Verde musgo

Tabela 1. Reaes cromognicas para identificao de flavonides nas amostras de Calendula officinalis L.

A determinao do resduo seco demonstrou no haver diferena significativa entre as solues extrativas SE-EtOH e SE-PROPGL (Teste t, (= 0,5). Os resultados da amostra SE-PEG ficaram comprometidos na medida em que no obteve-se a evaporao total do polietilenoglicol na temperatura estabelecida para o teste (120 C) (Tabela 2).

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Soluo extrativa

mdia

sd

CV%

SE-EtOH SE-PROPGL SE-PEG

0,947 0,857 12,133

0,0416 0,0493 0,1528

4,40 5,76 1,26

Tabela 2. Resduo seco das formas extrativas de Calendula officinalis L.

Na caracterizao de solues extrativas, a determinao do pH e da densidade relativa constituem parmetros fsicos importantes para a avaliao da estabilidade e qualidade da preparao. As Tabelas 3 e 4 apresentam os resultados obtidos para as amostras analisadas.
Soluo extrativa mdia sd CV%

SE-EtOH SE-PROPGL SE-PEG

6,04 6,06 6,28

8,429E-08 8,429E-08 0

1,3956E-06 1,3910E-06 0

Figura 1. Cromatograma (CCD) das solues extrativas de Calendula officinalis L.; (1) rutina, (2) c. clorognico, (3) quercetina, (4) SE-PEG, (5) SE-PROPGL, (6) SE-EtOH.

Tabela 3. Resultado da avaliao de pH das formas extrativas de Calendula officinalis L.

Soluo extrativa mdia sd CV%

SE-EtOH SE-PROPGL SE-PEG

0,9024 0,9160 0,9270

0,00129 0,00069 0,00081

0,14 0,08 0,09

Tabela 4. Densidade relativa das formas extrativas de Calendula officinalis L.

A caracterizao de flavonides por CCD demonstrou no haver diferenas significativas no perfil cromatogrfico entre as amostras nas condies experimentais estipuladas, sendo detectada a presena em todas as amostras de uma mancha caracter stica de colora o amarelolimo que apresentou Rf coincidente com o Rf da substncia marcadora (rutina) (Figura 1). A determinao espectrofotomtrica do teor de flavon ides em drogas vegetais e preparaes extrativas tem sido descrita classicamente na literatura e corresponde a metodologia inscrita em algumas farmacopias 9-11. No entanto vrios trabalhos tm demonstrado a aplicabilidade da cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) no doseamento de compostos fenlicos, inclusive flavonides, em extratos vegetais 12-14. A metodologia por CLAE apresenta como principais vantagens a resoluo, exatido e preciso do mtodo, bem como boa sensibilidade e reprodutibilidade, tornando a tcnica adequada para a anlise de matrizes complexas como as formas extrativas vegetais.

Em relao ao procedimento analtico por CLAE, a comparao entre os fingerprints, desenvolvidos para as amostras das solues extrativas de Calendula officinalis L. demonstrou boa resoluo e reprodutibilidade dos tempos de reteno da substncia em anlise (Figuras 2, 3 e 4). No desenvolvimento da metodologia foi confirmada a condio de linearidade do mtodo(r 2 = 0,99976), segundo descrito em trabalhos anteriores 7,8 (Figura 5). O teor de flavonides, expressos por rutina, foi semelhante em todas as amostras, corroborando com os relatos da literatura 2 (Tabela 5). Desta forma o mtodo de doseamento por CLAE demonstrou-se adequado para a determinao de flavonides em preparaes extrativas de Calendula officinalis L.
Amostras TF g% (rutina) sd CV%

SE-EtOH SE-PROPGL SE-PEG

0,2937 0,2293 0,2829

0,00657 0,00715 0,01102

2,24 3,12 3,90

Tabela 5. Teor de flavonide (calculado como rutina) das formas extrativas de Calendula officinalis L.

A utilizao de poliolefinas como co-solventes no processo de obteno de formas extrativas, apesar de aparentemente no ter aumentado o rendimento da extrao, constitui uma alternativa promissora no desenvolvimento de extratos vegetais, principalmente como uma alternativa a substituio ou reduo no teor de lcool na soluo extrativa.
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Figura 2. Cromatograma por CLAE da amostra SE-EtOH.

Figura 3. Cromatograma por CLAE da amostra SE-PROPGL

Figura 4. Cromatograma por CLAE da amostra SE-PEG.

Figura 5. Curva analtica da rutina, segundo metodologia desenvolvida por Pavei & Cardoso 8.

A utilizao de propores maiores de gua a fim de aumentar a polaridade da soluo extrativa, poderia otimizar a extrao de flavonides e outros compostos fenlicos, diminuindo a concentrao de interferentes lipoflicos no extrato.

Na seqncia deste trabalho, est prevista a realizao de um experimento fatorial considerando diversas propores de polmeros como co-solventes, a fim de estabelecer a sua proporo mais adequada no sistema extrator.

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