Biologa molecular

[NOVIEMBRE 2013]

TRANSFORMACIN BACTERIANA CON EL PLSMIDO pGLO

RESUMN Para desarrollar la transformacin bacteriana con el plsmido pGLO se hizo uso del kit de transformacin proporcionado por BIO-RAD. Este kit nos plantean los protocolos de una forma clara y secuencial para as poder obtener una transformacin exitosa. El desarrollo implica tres etapas; en la primera se realizo la preparacin del agar, la ampicilina y la arabinosa, rotulacin de las placas, se sirvi el medio y finalmente se almaceno, todos estos protocolos se realizaron de 3 a 7 das antes de la transformacin por parte del personal de laboratorio. La segunda etapa implico la rehidratacin de las bacterias (E. coli K-12 ), se sembr en las placas para obtener colonias aislada y finalmente se preparo el plsmido pGLO, todos estos protocolos se realizaron 24 -48 horas antes de la transformacin por parte del personal de laboratorio. Finalmente en la etapa tres se prepararon las alcuotas y se desarrollo la transformacin bacteriana, tomando el plsmido ya rehidratado y la bacteria rehidratada, preparando as un caldo bacteriano, el cual se sembr en las placas y se llevo a incubacin durante 24- 48 horas a 35 C. Paralelo a este protocolo se realizo un control de la transformacin que implico el sembrar el microorganismo en los medios sin haberle inoculado el plsmido. Al da siguiente se llevo a cabo la lectura y se observo las colonias transformadas.

Palabras clave: Plsmido pGLO, E. coli K-12, Transformacin.

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INTRODUCCION El proceso de transformacin es la alteracin de la composicin gentica de un organismo, involucra la captacin de material gentico extrao presente en el exterior de la clula, su reconocimiento y la expresin. La transformacin generalmente se hace en bacterias, pero cualquier organismo que cumpla con los requisitos (organismo competente) es susceptible a un cambio y apto para el proceso. De manera natural, la transformacin ocurre en algunos tipos de bacterias; el hombre ha logrado manipular bacterias competentes con protocolos especficos que involucran cambios de temperatura para dilatar las membranas de la clula y facilitar el ingreso del material gentico. En muchas ocasiones, la transformacin se evidencia fcilmente por cambios fenotpicos en el organismo; como es el caso de la incorporacin del plsmido pGLO a E. coli. Este plsmido contiene el gen responsable de la sntesis de la protena GFP (Green Fluorescent Protein) regulable con la adicin de arabinosa al medio de cultivo y un gen de resistencia al antibitico ampicilina. Los genes utilizados para la transformacin pueden ser extrados de plantas, animales, bacterias, hongos etc. y ser insertados en un organismo con caractersticas especficas o carecientes de ellas. Actualmente se utiliza la transformacin en bacterias para obtener metabolitos tiles en medicina como la inulina, la produccin de variedades de plantas resistentes a plagas, enfermedades y ambientes anegados; sin olvidar el sector industrial de produccin de alimentos, sustancias qumicas, materiales con propiedades especiales, etc. Debido a esto los objetivos de la prctica de laboratorio son conocer los principios bsicos y las aplicaciones de la transformacin bacteriana de E.. coli familiarizndonos con la tcnica que implica la transformacin de las clulas con cloruro de calcio ( Transformacin qumica) de tal forma que podamos analizar e interpretar los resultados experimentales y cualquier eficiencia de la transformacin.

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MATERIALES Y METODOS El desarrollo de la prctica de laboratorio conllevo tres etapas: Las etapas I y II son realizadas gentica y biologa molecular. por la asistente del laboratorio de

Etapa I [3 a 7 das antes de la transformacin] Preparacin del agar Para preparar el agar, se procedi a aadir 500 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer de 1 litro. Aadir el contenido del paquete de agar LB. Agitar el matraz para disolver el agar, y calentar hasta ebullicin en el microondas. Volver a agitar y calentar unas tres veces ms hasta que el agar se disuelva, teniendo cuidado de dejar enfriar el matraz antes de agitarlo, para evitar que el medio caliente salte a la mano. Este procedimiento realizarlo mnimo tres das antes de la transformacin, de los cuales los dos ltimos se deben llevar en refrigeracin. Preparar la arabinosa y la ampicilina La arabinosa se encuentra deshidratada en un pequeo vial. Con una pipeta estril, se aade 3 ml de la solucin de transformacin en el vial para rehidratar el azcar. Agita el vial con la ayuda de un vortex. Con otra pipeta estril, se aade 3 ml de la solucin de transformacin al vial para rehidratar el antibitico. Rotular las placas La rotulacin de las placas se realizo a 40 placas de agar, cerca del borde de la placa de la siguiente manera; 16 placas como LB, 16 como LB/amp y 8 como LB/amp/ara. Aadir el agar LB en las placas Luego de preparado el medio LB y de haber rotulado las placas se procede primero a, aadir el agar LB en las placas marcadas como LB, a

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continuacin, aadir la ampicilina ya hidratada al agar LB sobrante en el matraz. Agitar el matraz brevemente para mezclarla. Rellenar las 16 placas rotuladas como LB/amp. Almacenar las placas Despus de dejar las placas dos das a temperatura ambiente se pueden utilizar o se pueden almacenar en columnas de hasta 20 placas de altura introducindolas en bolsas. Guardar las placas en la nevera de forma invertida y dentro de las bolsas hasta su uso. Etapa II [24 48 horas antes de la transformacin] Rehidratar las bacterias Con una pipeta estril, rehidratar el liofilizado de E. coli K-12 aadiendo 250 ml de la solucin de transformacin en el vial. Tapar el vial y dejar la suspensin 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar el vial antes de aadirlo a las placas de LB. Guardar la bacteria rehidratada en la nevera hasta el momento de su uso (en 24 horas a ser posible, y no ms de 3 das). Sembrar las placas para obtener colonias bacterianas aisladas Tomamos con un asa estril una muestra de las bacterias ya hidratadas y realizamos la siembra en las placas en forma masivas, con el fin de obtener algunas colonias aisladas, posteriormente se incuban a 37 C [Usarlas 24 36 horas siguientes para la transformacin]. Preparar el plsmido pGLO Con una nueva pipeta estril aadir 250 ml de la solucin de transformacin en el vial que contiene el plsmido pGLO liofilizado. Si es posible, guardar el ADN rehidratado en la nevera.

Etapa III [antes de la transformacin] Preparar alcuotas Aadir 1 ml de la solucin de transformacin (CaCl2) y 1 ml del caldo LB en los tubos Eppendorf de 2 ml del kit.

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Protocolo final Etiquetar los tubos Eppendorf cerrados, uno como +pGLO y otro como pGLO. Luego abrir los tubos y con una pipeta estril aadir 250 ml de la solucin de transformacin (CaCl2), para colocarlos finalmente en hielo. Posteriormente con la ayuda de un asa de siembra estril coger una colonia de la placa. Abrir el tubo +pGLO e introducir el asa en la solucin de transformacin. Girar el asa entre los dedos ndice y pulgar hasta que la colonia se disperse totalmente en la solucin de transformacin (sin que queden fragmentos flotantes). Dejar el tubo en la gradilla en hielo. Con otro asa estril repite la operacin con el tubo pGLO. Despus introducimos una nueva asa estril en el vial que contiene el plsmido y coger solucin plasmdico (como si cogiramos jabn para hacer pompas de jabn). Llevarlo al tubo +pGLO, cerrarlo y dejar el tubo en la gradilla en el hielo. Cerrar tambin el tubo pGLO, pero sin aadir el plsmido. Incubamos los tubos en hielo 10 minutos. Nos aseguramos de que el fondo de los tubos est en contacto con el hielo. Mientras que los tubos permanecen en el hielo etiquetamos las placas de agar en la base de la siguiente forma: una placa LB/amp y una LB/amp/ara como +pGLO, y otra LB/amp y otra LB/amp/ara como pGLO. Luego de la incubacin en hielo, realizamos un choque trmico, llevando los tubos en la gradilla al bao ya preparado a 42 C, e introducirlos all durante 50 segundos exactos. Pasados los 50 segundos, llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al bao y viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos. Posteriormente sacamos la gradilla del hielo y la dejamos en la mesa. Abrimos uno de los tubos, y con una nueva pipeta estril, aadimos 250 l de caldo LB al tubo y lo cerramos. Repetimos la operacin con otra pipeta estril en el otro tubo. Incubar los tubos 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente agitamos los tubos golpendolos con el dedo. Con una pipeta estril para cada tubo, pasamos 100 l de cada tubo a las placas correspondientes. Luego Usando un asa de siembra estril para cada tubo, extender el lquido por toda la superficie de la placa, haciendo

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estras en el agar en todas las direcciones, por ltimo se llevan las cajas a incubacin a 37C en posicin invertida. RESULTADOS
FIGURA 1. Imagen ilustrativa donde se ve el etiquetaje de las cajas con LB/amp y una LB/amp/ara como +pGLO, y otra LB/amp y otra LB/amp/ara como pGLO.

FIGURA 2. Imagen ilustrativa donde se observa cmo se alcuota los tubos Eppendorf con la solucin transformacin. La imagen de la izquierda corresponde a +pGLO, la imagen de la derecha a pGLO FIGURA 3. Imagen ilustrativa donde se ve la incubacin en hielo de los tubos Eppendorf

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FIGURA 4. Imagen ilustrativa donde se observa cmo se toma la colonia de E. coli. (Izquierda) y posteriormente de inocula el tubo Eppendorf (Derecha).

FIGURA 5. Imagen ilustrativa donde se observa la inoculacin de pGLO en la caja de petr (Izquierda) y posteriormente la siembra con el asa estril utilizando la tcnica de agotamiento (Derecha).

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FIGURA 6. Imagen ilustrativa donde se realiza la lectura usando el transiluminador. La imagen de la izquierda corresponde al medio LB/amp, la imagen de la derecha al medio LB/amp/ara. Ambas correspondientes a + pGLO

FIGURA 7. Imagen ilustrativa donde se realiza la lectura usando el transiluminador. La imagen de la izquierda corresponde al medio LB/amp, la imagen de la derecha al medio LB/amp/ara. Ambas correspondientes a - pGLO

DISCUSIONES Y CONCLUSIONES Destacamos la realizacin del protocolo completo que propone el Kit de transformacin bacteriana con pGLO de BIO-RAD, el cual se baso en tres etapas, de las cuales las dos primeras son llevadas a cabo por el personal del laboratorio y la etapa final se llevo a cabo por los estudiantes. Para poder forma: discutir los resultados los analizaremos en de la siguiente

La lectura de las cajas correspondes a + pGLO del medio LB/amp, y al medio LB/amp/ara. Nos muestran una contrariedad, para el primero se esperaba crecimiento bacteriano, pero no la caracterstica de fluorescencia, lo cual es corroborado con nuestros resultados, ya que esta caracterstica dada por el gen GFP es activada en presencia de arabinosa, y este medio la carencia, fenotpicamente se observo el crecimiento con un color crema, algunas colonias aisladas con forma redondeada y bordes lisos. [1] Para el segundo se esperaba crecimiento bacteriano y fluorescencia, pero en nuestros resultados se observo solo crecimiento bacteriano, la fluorescencia no fue activada, este resultado en si es contradictorio, ya que si la transformacin por el plsmido pGLO no

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hubiese sido exitosa no hubiese habido ni crecimiento ni fluorescencia, pero el caso es que E. coli K-12 fue modificada por el gen bla, ste le confiri la capacidad de crecer en un medio con antibitico ( ampicilina), pero el gen GFP no tuvo xito, probablemente el manejo de los tiempos en el choque trmico no fueron exactos, lo que no permiti la permeabilidad optima de la membrana celular , tambin se puede considerar la efectividad del kit de acuerdo al tiempo de uso, ya que se pudo haber degradado la muestra de ADN con el paso del tiempo, y ms an si consideramos las condiciones de conservacin ( estas deben ser precisas). La lectura de las cajas correspondes a - pGLO del medio LB/amp, y al medio LB. Para estos resultados podemos decir que son totalmente contradictorios, ya que en la primera caja no deba crecer debido a que el medio tena ampicilina y como la E. coli que se sembr en ese medio es susceptible a los antibiticos ( Lpez et al., 2009) no haba forma de que manifestara su crecimiento. Podemos correlacionarlo con aspecto tales como s; el primero es que la bacteria liofilizada que viene en el kitt no es pura, por lo cual manifiesta caractersticas no propias, que la ampicilina se ha degradado y ha perdido sus caractersticas como antibiticos o finalmente que hubo un error humano y le inoculo con + pGLO estos medios. Para el segundo es el control, lo que me significa que el crecimiento se debe dar de manera normal. Despus de considerar los resultados obtenidos, compararlos con los resultados idneos propuestos en el kit podemos inferir de manera general que: Es de vital importancia la concentracin de arabinosa agregada al medio para la produccin de fluorescencia. Se debe conservar en ptimas condiciones las cepas bacterianas que contengan pGLO para realizar extracciones y transformaciones exitosas. La temperatura en el choque trmico es de gran importancia para que se pueda dar la insercin del plsmido correctamente. Una transformacin exitosa depender de muchos factores, entre los cuales se encuentra el estado del plsmido, la insercin del mismo

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en las clulas competentes ya sea por electroporacin o choque trmico, entre otras. CUESTIONARIO PROPUESTO POR EL KIT De revisin 1. En cul de las placas esperas encontrar bacterias ms similares a las colonias de E. coli no transformadas que observaste inicialmente? En los medios que tienen - pGLO, ya que no tiene el plsmido, por lo tanto no hay transformacin. 2. Si hay bacterias transformadas, En qu placa(s) aparecern? En las placas que tienen +pGLO, ya que ese es el plsmido que me transforma la bacteria. 3. Qu placas se deben comparar para determinar si se ha producido transformacin gentica? Por qu Las placas que tienen el plsmido [ +pGLO ] con las que no lo tienen [- pGLO ] Ya que las placas que tienen el plsmido van a expresar las caractersticas de los genes insertados como es la luminiscencia y el crecimiento en un medio con antibitico, frente a las que no tienen el plsmido, porque estas no van a tener luminiscencia y en un medio con presencia de antibiticos no va a haber crecimiento. 4. Qu se entiende por placa control? Placa control es una placa que no se le ha realizado ningn tratamiento o protocolo, esta tipo de placa control sirve para llevar a cabo una revisin y/o comparacin de mi tratamiento o protocolo realizado a otras placas frente a unas sin tratamiento con la finalidad de evaluar la eficiencia del tratamiento o protocolo. Recogida y anlisis de resultados A. Observa atentamente y dibuja lo que ves en cada placa. Pon tus dibujos en la tabla de resultados en la columna de la derecha. Apunta los resultados para poder comparar las observaciones de las clulas +pGLO con las observaciones de las clulas no transformadas.

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Se observa crecimiento a lo largo de la lnea de siembra, lo que representa el total de la caja, el color del crecimiento es blanco, caracterstico de E. coli. No se observan colonias aisladas.

Se observa crecimiento a lo largo de la lnea de siembra, la cual esta mucho ms definida el color del crecimiento es crema, caracterstico de E. coli. Se observan muy pocas colonias aisladas (15)

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Se observa crecimiento masivo, con un color crema. No se observan colonias aisladas.

Se observa crecimiento masivo, con un color crema. No se observan colonias aisladas.

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B. Qu caractersticas inicialmente observadas en E. coli haberse alterado? Caracterstica inicial Se observo una coloracin crema en el crecimiento de la bacteria. Observaciones

no parecen

Despus de la transformacin se observa el color del crecimiento bacteriano coincidiendo con un aspecto cremoso.

1. Si las clulas transformadas han adquirido la capacidad para crecer en presencia del antibitico ampicilina, qu puedes deducir acerca de los otros genes presentes en el plsmido utilizado para la transformacin? Que se han insertado exitosamente en el ADN bacteriano, lo cual significa que se va a expresar la caracterstica de estos. 2. Basndote en los resultados obtenidos, cmo puedes demostrar que los cambios producidos se deben al proceso realizado? Si nos basamos en los resultados habr mucha contradiccin, ya que no hubo luminiscencia, pero si resistencia al antibitico, usando + pGLO y pGLO. Pero bsicamente estos resultados se pueden demostrar comparndolos con la placa control, ya que esta no tiene pGLO. 3. Qu indica esta observacin sobre la fuente de fluorescencia? Que el plsmido pGLO tiene un gen ( GFP ) que me confiere esa caracterstica. 4. Describe qu evidencias indican si la transformacin gentica se ha realizado con xito o no. Consideramos que las evidencias son: El crecimiento de la bacteria en medio con ampicilina

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La fluorescencia de las bacterias en el transiluminador, dichas bacterias han crecido en medio con arabinosa. Interaccin entre genes y medio 1. Observas alguna colonia de E. coli en la placa LB que no contenga ampicilina y arabinosa? No, solo se ve crecimiento masivo. 2. Basndote en tus resultados, puedes decir si estas bacterias son resistentes a ampicilina observndolas en la placa LB? Como hemos mencionado nuestros resultados fueron contradictorios, pero si somos consecuentes con el protocolo podemos decir que no son resistentes, ya que no son modificadas con el gen que les confiera esa resistencia., 3. Cmo modificaras el medio (el agar en el que estn creciendo) para poder saber si son resistentes a ampicilina? Agregndole ese antibitico en la composicin del mismo 4. Muy a menudo las caractersticas de un organismo se deben a la combinacin de sus genes y del medio. Reflexiona sobre el color verde que viste en las bacterias transformadas a. Qu dos factores ambientales deben estar presentes para que puedas ver el color verde? El primero hacer referencia a un azcar, la arabinosa. El segundo hacer referencia a observar las bacterias en el transiluminador ( rayos UV ) b. Cul de los dos factores ambientales sealados en la pregunta anterior hacen a la bacteria transformada que aparezca verde? Consideramos que es ms importante la arabinosa, ya que este azcar activa el gen GFP, el cual permite ser fluorescentes (verdes) c. Qu ventajas tendr para un organismo el poder activar o desactivar determinados genes en respuesta a diferentes condiciones?

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La supervivencia en condiciones adversas, o frente a algunos depredadores de stos.

Clculo de la Tasa de transformacin

1. Determinacin del nmero total de colonias verde fluorescente que crecen en la placa LB/amp/ara. Sita tu placa LB/amp/ara bajo luz UV. Se supone que cada colonia de la placa procede de una nica clula, la cual, tras mltiples y sucesivas reproducciones, origina la colonia bacteriana. La manera ms sencilla de determinar el nmero total de colonias verde fluorescente es contar las colonias presentes en la placa. Nmero total de clulas =
0

2. Determinacin de la cantidad total de plsmido pGLO en las clulas bacterianas y presente en la placa LB/amp/ara. Para determinar la cantidad de ADN del plsmido pGLO que hay en las clulas bacterianas presentes en la placa LB/amp/ara necesitamos saber: (a) La cantidad de ADN con la que empezamos el experimento, y (b) qu fraccin del ADN (en la bacteria) realmente se aadi a las placas de LB/amp/ara. Una vez calculado estos dos factores, tendrs que multiplicar la cantidad total de plsmido pGLO usada en el experimento por la fraccin de ADN que aparece en las placas de LB/amp/ara. (a) Determinacin de la cantidad total de plsmido pGLO La cantidad total de ADN utilizada inicialmente es igual al producto de la concentracin y el volumen utilizados: ADN (mg) = Concentracin ADN (mg/ml) x Volumen ADN (ml) En este experimento utilizaste 10 ml de pGLO a la concentracin de 0.08 mg/ml. Es decir, que cada microlitro de la solucin contena 0.08 mg del ADN plasmdico pGLO. Calcula la cantidad total de ADN utilizada:
0,8 g

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Para qu te sirve este dato? Para calcular la cantidad de ADN plasmdico que hay en las clulas bacterianas. (b) Determinacin de la fraccin de ADN realmente transferido a la placa de LB/amp/ara. Dado que no todo el ADN aadido al cultivo bacteriano pasa a la placa de agar, necesitas saber cunto ADN pas realmente a la placa LB/amp/ara. Para calcularlo, divide el volumen de ADN que pusiste en la placa entre el volumen total que haba en el tubo que contena el ADN. La frmula a utilizar sera: Fraccin ADN utilizada = Volumen en la placa (l) / Volumen total tubo (l) Pasaste 100 l de la solucin de clulas que contenan el ADN, de un tubo con un volumen total de 510 l. Recuerdas por qu contena 510 l? Consulta el protocolo, anota los volmenes que aadiste en cada paso y suma las cantidades. Usa la siguiente frmula para calcular la fraccin de ADN plasmdico pGLO que pas a la placa LB/amp/ara. Fraccin de ADN = Para qu te sirve este dato? Para calcular la cantidad de ADN plasmdico que hay en las clulas bacterianas. Por tanto, cuntos microgramos de ADN del plsmido pGLO pasaste a las placas LB/amp/ara? Para contestar esta pregunta, debes multiplicar la cantidad total de ADN pGLO usada por la fraccin de ADN pGLO que pas a la placa de LB/amp/ara: ADN pGLO transferido (g) = cantidad total de ADN pGLO usada (g) x fraccin de ADN pGLO ADN pGLO (g) =
0.1568 0.196

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Qu te dice este dato? Mira todos los clculos hechos hasta ahora, y rellena la siguiente tabla: Este dato nos dice que hay o.1568 g de ADN del plsmido en las clulas bacterianas

0 0.1568

Ahora usa los datos de la tabla para calcular la tasa de transformacin: Tasa de transformacin = N total de clulas que crecen en la placa / Cantidad de ADN (mg) en la placa Tasa de Transformacin =
0

Anlisis La tasa de transformacin es un nmero muy elevado, por lo que los cientficos a menudo lo expresan en forma logartmica. Por ejemplo, si la tasa de transformacin es de 1.000 bacterias/mg de ADN, lo expresan as: 103 clulas transformadas/mg (10 3 es como 10 x 10x 10, o como 1.000) Cmo expresaran 10.000 clulas transformadas/g? 104 clulas transformadas/g Complicndolo un poco ms, imagina que los cientficos calculan una tasa de 5.000 bacterias/g ADN.

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Lo expresaran como: 5 x 103 clulas transformadas/mg (5 veces 1.000). Cmo expresaran 40.000 clulas transformadas/g? 4 * 10 4 clulas transformadas/g Un ltimo ejemplo: Si se calculara una transformadas/g, la notacin cientfica sera: tasa de 2.600 clulas

2,6 x 103 clulas transformadas/g (2,6 veces 1000) De la misma forma que en los siguientes ejemplos: 5.600 = 5,6 x 103 271.000 = 2,71 x 105 2.420.000 = 2,42 x 106 Cmo expresaras 960.000 clulas transformadas/g en notacin cientfica? 9,6 * 105 clulas transformadas/g

Expresa la tasa de transformacin obtenida en notacin cientfica: 0 clulas transformadas/g

Explica en una o dos frases lo que significa la tasa de transformacin que has calculado:

La tasa de transformacin es un nmero, que representa el nmero total de clulas bacterianas que expresan la protena GFP, entre la cantidad de ADN usada en el experimento. Nos indica el nmero total de clulas bacterianas transformadas por microgramo de ADN. Los biotecnlogos estiman que la tasa de transformacin que generalmente se obtiene con el protocolo que t has seguido se sita entre 8 x 102 y 7 x 103 clulas transformadas por microgramo de ADN. Cmo es tu tasa en comparacin con estos valores? Nuestra tasa de transformacin es nula ( 0 )

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En la siguiente tabla, anota la tasa de transformacin de los dems grupos del laboratorio:

2B 3B 4B

0 clulas transformadas/g 0 clulas transformadas/g 0 clulas transformadas/g

Cmo es tu tasa de transformacin en comparacin con la de los dems? Igual Calcula la tasa de transformacin que se obtendra en un experimento en el que se utilizara lo indicado en la siguiente lista: Concentracin ADN plasmdico: 0.08 g/l 250 l solucin transformacin CaCl2 10 l solucin plasmdico pGLO 250 l caldo LB 100 l clulas sembradas en cada placa de agar 227 colonias de clulas transformadas La tasa de transformacin es 1418,75o 1,42 * 103 clulas transformadas/g

Rellena el siguiente cuadro y ensale tus resultados al profesor:

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0.1568

0 clulas transformadas/g

Pregunta extra: Si la tasa de transformacin en un determinado experimento es de 3 x 103 bacterias/g de ADN, cuntas colonias de clulas transformadas creceran en la placa LB/amp/ara? Asume que las concentraciones de ADN y el volumen de clulas sembradas en la placa de LB son las mismas que utilizaste en tu protocolo. Se obtendran 470,4 470 colonias.

CUESTINARIO PROPUESTO EN LA GUIA 1. Puedo modificar genticamente un organismo? Qu organismo? Un organismo genticamente modificado es un ser vivo cuyo material gentico ha sido alterado usando tcnicas de ingeniera gentica. Actualmente los OGM incluyen bacterias, levaduras, algas, plantas, peces, reptiles y mamferos. El avance de las investigaciones en ingeniera gentica y las tecnologas que derivaron de ella, han permitido el desarrollo de organismos, vegetales y animales a los que se les ha modificado en parte su cdigo gentico, y que pueden ser utilizados tanto en la investigacin, la alimentacin, la industria, la medicina como en otros campos. En la evolucin de estos mtodos se llega hasta la hibridizacin interespecfica, es decir la reproduccin entre especies diferentes pero fitogenticamente cercanas, aunque en la naturaleza este intercambio de

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material gentico se ve entorpecido por diferentes tipos de barreras biolgicas o fsicas. Con la aplicacin de las tcnicas de la ingeniera gentica se ha cruzado esta barrera entre especies, provocando cambios no slo en el rea biolgica (nuevas especies, insectos, mamferos, peces, cultivos y otros), cientfica (nuevos desarrollos tecnolgicos) y ambiental (agua, suelo, aire, degradacin por uso intensivo de los recursos, nuevos agroqumicos), sino tambin en el aparato productivo de un pas (monocultivo, sistema de siembra directa, mayor tecnificacin del agro y la consecuente reduccin de mano de obra rural, concentracin econmica), el comercio internacional (empresas multinacionales oligoplicas, patentes y regalas), la poltica y la sociedad. 2. Desde hace dos dcadas se ha observado la introduccin de semillas, productos alimentarios o con fines farmacuticos de origen transgnico, obtenidos a travs de la biotecnologa. Para modificar genticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada clula del organismo qu organismo ser ms apropiado para ser modificado genticamente, uno pluricelular o uno unicelular? Organismo pluricelular estn compuestos por varios trillones de clulas (pluricelulares) y tienen alrededor de 21,000 genes en sus 23 pares de cromosomas en cada una de sus clulas. Tenemos alrededor de cien mil protenas diferentes codificadas por estos genes para llevar a cabo la mayora de nuestras funciones biolgicas. Las bacterias, organismos compuestos por una sola clula (unicelulares) tienen un solo cromosoma con alrededor de 4,000 genes que codifican para 4,000 protenas con las que viven y funcionan estos organismos (Avery et al. 1944, Watson y Crick 1953, Watson et al. 1988 y 1996, Bolvar 2007, Hayden 2011). Por lo que se considerara conveniente un organismo unicelular pues su manejo puede tener un mayor control sobre sus modificaciones y codificaciones de estos mismos. 3. Los cientficos a menudo quieren saber si los organismos modificados genticamente pueden pasar sus nuevas caractersticas a su descendencia y futuras generaciones. Para obtener esta informacin Qu organismo ser ms apropiado para el experiment? uno que

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crezca y se reproduzca rpidamente, o uno que lo haga ms lentamente? Las propiedades celulares no tienen por qu ser constantes a lo largo del desarrollo de un organismo: evidentemente, el patrn de expresin de los genes vara en respuesta a estmulos externos, adems de factores endgenos. Un aspecto importante a controlar es la pluripotencialidad, caracterstica de algunas clulas que les permite dirigir su desarrollo hacia un abanico de posibles tipos celulares. En metazoos, la gentica subyacente a la determinacin del destino de una clula consiste en la expresin de determinados factores de transcripcin especficos del linaje celular al cual va a pertenecer, as como a modificaciones epigentica. Adems, la introduccin de otro tipo de factores de transcripcin mediante ingeniera gentica en clulas somticas basta para inducir la mencionada pluripotencialidad, luego este es uno de sus fundamentos moleculares. 4. La seguridad es otro factor importante al elegir el organismo Qu caractersticas debe tener o no tener el organismo para asegurarnos de que no nos daara ni a nosotros ni al medio ambiente? Caractersticas de flujo gnico, de introgresin del gen novedoso y resultados de la expresin, de conferir alguna ventaja competitiva. Cada GM y su inocuidad deben ser evaluados individualmente, y que no es posible hacer afirmaciones generales sobre la inocuidad de todos los GM, la prevencin de escape y diseminacin durante su manejo. Los riesgos
especficos corresponden a las recombinaciones genticas que podan conferir a las bacterias una nueva resistencia a los antibiticos, un nuevo poder patgeno, incluso un poder cancergeno (por clonacin del ADN de virus cancergenos).El

uso de este tipo de tecnologa conlleva tanto beneficios como riesgos, en el caso de los primeros, a travs de un uso responsable y sustentable del patrimonio gentico y los segundos, por la caracterstica de irreversibilidad de estas tecnologas. El Principio de Precaucin en cuestiones de nuevas tecnologas y sus posibles impactos ambientales tiene en cuenta: lo atinente a la proteccin del ambiente, previniendo daos a los ecosistemas y los intereses de las futuras generaciones, Si bien la biotecnologa responsable puede ofrecer grandes beneficios, las autoridades de regulacin y control, responsables de la evaluacin de los

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procedimientos deben actuar eficazmente en el mejoramiento y la bioseguridad de los productos y sus derivados. 5. Teniendo en cuenta las cuestiones anteriores cul ser la mejor opcin para realizar la modificacin gentica: una bacteria, una lombriz, un pez, o un ratn? En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse estos plsmidos para compartir sus genes beneficiosos o ventajosos. Este mecanismo permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El reciente incremento de la resistencia bacteriana se debe a la transmisin de plsmidos. Los objetivos que se persiguen son: utilizarlos para la expresin de genes que permitan la produccin de protenas forneas de inters farmacutico, los que seran tratados como frmacos con controles estrictos. En otros casos, lo que se busca es aumentar la eficiencia en produccin animal, como los peces con hormona de crecimiento. El caso de los organismos acuticos es delicado, ya que si se escapan al ambiente el efecto sera prcticamente irreversible, por lo que el riesgo potencial es alto ya que los animales son sumamente caros y requieren un alto nivel de control y cuidados. Ratones genticamente modificados se utilizan a menudo para estudiar las respuestas celulares y tejidos especficos a la enfermedad. Esto es posible puesto que los ratones pueden ser creados con las mismas mutaciones que se producen en los trastornos genticos humanos, la produccin de la enfermedad humana en estos ratones a continuacin, permite tratamientos a ensayar. 6. Qu son las clulas electrocompetentes? La transformacin bacteriana es un proceso natural, en el que las bacterias ingieren ADN extrao y luego amplifican o clonarlo. En el laboratorio, este proceso puede ser inducida artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo elctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana de la clula bacteriana, a travs del cual puede pasar el ADN plsmido. La electroporacin se refiere a este mtodo. La electroporacin hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporador. Normalmente las clulas se colocan en una cubeta de electroporacin, que tiene

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electrodos en cada lado que hacen contacto elctrico con la mquina una vez insertado. Las clulas bacterianas mezcladas con ADN se cargan en la cubeta de electroporacin y un campo elctrico en el orden de un 1,000 a 10,000 volts por centmetro se aplica durante unos milisegundos. Esto hace que el voltaje a travs de la membrana para llegar a 0,5-1 voltios, que se cree que dar lugar a un reordenamiento de la bicapa de fosfolpido que comprende la membrana celular de tal manera que se forman poros. En este ADN plsmido estado pasar a travs de la membrana y cuando pulsante se complete la bicapa se repararse a s mismo. Habiendo asumido el plsmido, las bacterias entonces pueden crecer en placas de Agar que contienen antibiticos. Una alternativa a la electroporacin es la transformacin de choque trmico, que se basa en la exposicin de las bacterias a tanto cloruro de calcio y el calor con el fin de introducir ADN en las clulas. En general, los de choque trmico es ms suave en la bacteria de la electroporacin y no requiere baja en sal. Reacciones de ligacin, los que implican la insercin de su gen diana en el plsmido, se pueden utilizar directamente en la transformacin de choque trmico. Transformacin de choque trmico es ms barato que la electroporacin y no se basa en equipos o cubetas caras. Por otro lado, choque trmico conduce a menores eficacias de transformacin que electroporacin y toma ms tiempo. Tambin est limitado a bacterias, levaduras y protoplastos de la planta, mientras que la electroporacin se puede aplicar a clulas de mamfero. Aqu puede ver fibroblastos embrionarios de ratn que se cargan en una cubeta de electroporacin. Una vez que la electroporacin es completa, eficacias de transformacin se pueden determinar mediante la observacin de la medida en que las clulas producen una protena de fluorescencia verde codificada por el plsmido. La transfeccin es el trmino dado a la transformacin de clulas de mamfero, que requiere tpicamente ms bajas intensidades de campo que las clulas bacterianas y mayores constantes de tiempo. La electroporacin tambin se puede realizar en animales enteros como el embrin de pollo en desarrollo que ver aqu. El ADN del plsmido se inyecta en el cerebro del polluelo y luego una sonda de electroporacin se utiliza para aplicar un campo elctrico para el tejido cerebral. Despus de un da o dos, protenas fluorescentes verdes y rojos - codificada por el plsmido - se hacen por las neuronas, y los cientficos pueden observar los cambios estructurales en el desarrollo del cerebro de pollo.

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7. Cules son las ventajas de la electroporacion comparada con la trasformacin con calcio. Uno de los mtodos ms baratos (y fiables) es la transfeccin mediante fosfato de calcio, originalmente descubierta por F. L. Graham y A. J. van der Eb en 1973. Una solucin salina tamponada con HEPES y que contiene iones fosfato se combina con una solucin de cloruro de calcio que contiene el DNA a transfectar. Cuando ambas se combinan, se forma un precipitado fino formado por el calcio cargado positivamente y el fosfato cargado negativamente, que el DNA en su superficie. Esta suspensin se aade a las clulas que se quieren transfectar (normalmente un cultivo celular en monocapa). Mediante un proceso no comprendido completamente, las clulas toman parte del precipitado, y junto con l, el DNA. En biologa molecular, el proceso de electroporacin se usa habitualmente para la transformacin de bacterias, levaduras yprotoplastos vegetales. Adems de membranas lipdicas, las bacterias tambin tienen una pared celular compuesta de peptidoglicano y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por naturaleza y slo actan como corazas que protegen a la clula de impactos ambientales severos. Si se mezclan bacterias y plsmidos, stos pueden transferirse al interior de las clulas durante la electroporacin. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de varios milmetros. A continuacin, las clulas deben manipularse cuidadosamente hasta que tengan la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas clulas que contendrn copias del plsmido. Este proceso es aproximadamente diez veces ms eficaz que la transformacin por mtodos qumicos.

Referencias [1] Kit de transformacin bacteriana con el plsmido pGLO (ADN fingerprint), bio-rad, Biotechnology Explorer. Puerta, C y Urea, C. 2002. Prcticas de biologa molecular. Editorial Pontificia Universidad Javeriana. Colombia. 55p.

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Segal, A y Ortega, G. 2005. Manual de prcticas de biologa molecular de la clula I. Las prensas de ciencias. Mxico. 85p. Enlaces web:
http://www.uam.mx/librosbiotec/uso_responsable_ogm/uso_responsable_ogm/files/assets/ downloads/files/uso_responsable_OGM.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Electroporaci%C3%B3n http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/398/baruch.html http://www.biblioteca.unp.edu.ar/bcentral/Doc_digitales/Organismos%20Geneticamente%20 Modificados%20_OGM_%20Usos%20Alimentarios.PDF https://www.jove.com/science-education/5060/transformacin-bacteriana-laelectroporacin?language=Spanish http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/398/baruch.html