Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa

Imunologia 2012/2013

THE AIRWAY EPITHELIUM NUCLEOTIDE-BINDING DOMAIN AND LEUCINE-RICH REPEAT PROTEIN 3 INFLAMMASOME IS ACTIVATED BY URBAN PARTICULATE MATTER
J e r e m y A. H i r o t a , S i m o n A. H i r o t a , S t e p h a n i e M . Wa r n e r, D o r o t a S t e f a n o w i c z , F u r q u a n S h a h e e n , P a u l L . B e c k , J u s t i n A. M a c D o n a l d , T i l l i e - L o u i s e H a c k e t t , D o n D . S i n , S t e p h a n Va n E e d e n & D a r r y l A. K n i g h t 2 0 1 2 Am e r i c a n Ac a d e m y o f Al l e r g y, As h m a & I m m u n o l o g y

Docente: Margarida Telhada Discentes: Ana Catarina Menezes (35853), Cristiana Santos (38700)

INTRODUO

Inflamassoma NLRP3 um complexo proteico intracelular danger-sensing, o qual inclui a protena NLRP3 e o enzima caspase-1 inactivo. A activao do caspase-1 leva clivagem de pro-IL-1 imaturo a IL-1 maduro activo. Responde a sinais de perigo intracelulares, incluindo espcie reactivas de oxignio, ATP e cristais de cido rico, por autoclivagem do caspase-1. Pode desempenhar um papel importante na regulao da imunidade e resposta inflamatria Processo de inflamao:
Activao da caspase-1 por autoclivage m
Fig. 1 Inflamassoma NLRP3.

Ligao de sinais protena NLRP3

Clivagem de Pro-IL-1 na forma activa IL-1

Secreo de IL-1

Resposta inflamatria

INTRODUO

Matria particulada urbana (PM) consiste numa mistura complexa de partculas muito pequenas e gotculas lquidas que contribui para a morbidez cardiorespiratria, nomeadamente agravamentos de crises asmticas e doenas pulmonares obstrutivas crnicas.

PM como possvel activador do inflamassoma NLRP3: Contm uma grande variedade de hidrocarbonetos poliaromticos e metais de transio que induzem o stress oxidativo; Partculas suspensas partilham propriedades fsicas semelhantes s de activadores conhecidos do inflamassoma; Tem propriedades coadjuvantes que facilitam a sensibilizao alrgica e a induo de respostas imunes adaptativas.

HIPTESE EM ESTUDO

1.

2. 3.

4.

O epitlio das vias respiratrias a primeira linha de defesa contra PM e outros agentes externos inalados, respondendo atravs da produo de mediadores imunes inatos. Existem ainda clulas dendrticas intercaladas no epitlio que facilitam estas respostas imunes adaptativas. Os autores demonstraram, em estudos anteriores, que culturas primrias de clulas epiteliais respiratrias humanas so capazes de endocitar PM10, associada ao aumento de produo de IL-1. A partir de amostras de biopsias em pulmo humano foi descrita a expresso de IL-1 no epitlio das vias respiratrias (Sousa et al.).

PM

IL-1 Inflamassoma NLRP3

No epitlio respiratrio

DC

MTODOS E RESULTADOS

1. 2. 3. 4. 5.

O inflamassoma NLRP3 encontra-se presente no epitlio respiratrio humano; Caracterizao funcional do inflamassoma NLRP3 em resposta PM nas clulas epiteliais respiratrias; O inflamassoma NLRP3 necessrio para a produo de IL-1 induzida por PM in vivo; As PM10 e a expresso de IL-1 esto localizadas no epitlio respiratrio in vivo; O inflamassoma NLRP3 necessrio para as alteraes no fentipo das clulas dendrticas, induzidas por PM10.

O INFLAMASSOMA NLRP3 ENCONTRA -SE PRESENTE NO EPITLIO RESPIRATRIO HUMANO

1. Colorao de seces em srie de brnquio humano:

Fig. 2 Caracterizao da expresso do caspase-1 e do NLRP3 no epitlio respiratrio humano (histologia).

O controlo no possui colorao (controlo negativo). A presena de colorao castanha comprova a expresso do caspase-1 e do NLRP3 no epitlio das vias respiratrias.

O INFLAMASSOMA NLRP3 ENCONTRA -SE PRESENTE NO EPITLIO RESPIRATRIO HUMANO

2. Observao de clulas epiteliais das vias respiratrias humanas por microscopia confocal:

A colorao do caspase-1 e do NLRP3 apresenta-se como pontos no citoplasma. demonstrada a expresso e localizao do caspase-1 e do NLRP3 nas clulas epiteliais humanas (Figs. 3D e 3E, respectivamente). O padro de colorao em macrfagos THP-1 foi usado como controlo positivo (Figs. 3G-I).

Fig. 3 Caracterizao da expresso do caspase-1 e do NLRP3 no epitlio respiratrio humano, por microscopia confocal. Colorao positiva a vermelho e colorao negativa a azul (marcao nuclear).

O INFLAMASSOMA NLRP3 ENCONTRA -SE PRESENTE NO EPITLIO RESPIRATRIO HUMANO

3. Immunoblotting: Confirmao da expresso caspase-1 e do NLRP3. do 4. Expresso gnica:

Fig. 5 Expresso gnica do caspase-1, NLRP3 e IL-1 em clulas epiteliais normalizadas com macrfagos THP-1.

Fig. 4 Immunoblotting para a caspase-1 e para o NLRP3. As bandas correspondem ao peso molecular previsto para cada uma das espcies.

As clulas epiteliais das vias respiratrias tambm demonstram a expresso do gene do caspase-1, do NLRP3 e da IL-1.

CARACTERIZAO FUNCIONAL DO INFLAMASSOMA EM RESPOSTA A PM NO EPITLIO RESPIRATRIO

Para estes estudos utilizou-se: Glibenclamida (glyburide) inibidor no-selectivo do inflamassoma NLRP3 Z-YVAD-FMK inibidor selectivo da caspase-1 Ratinho wt fmea C57Bl/6 com cerca de 6/8 semanas de idade siRNA (small interfering RNA) interfere com a expresso de genes especficos com sequncias nucleotdicas complementares

1. Experincias com inibidores:

30min

Exposio a PM

CARACTERIZAO FUNCIONAL DO INFLAMASSOMA EM RESPOSTA A PM NO EPITLIO RESPIRATRIO

2. Estudos de intervenes farmacolgicas:
Dia 1 Glibenclamida Manh Noite Controlo Dia 2 Glibenclamida Controlo

Medies efectuadas 4h ou 24h depois

Exposio a PM10

3. Nveis de IL-1 em clulas epiteliais respiratrias humanas: Utilizao de kits de ELISA feitos para detectar IL-1 madura clivada Confirmao por immunoblotting 4. Experincias de knockout de Nlrp3 por siRNA: Transfeco siRNA

48h

Lavagem

Incubao em meio/PM10 (24h)

CARACTERIZAO FUNCIONAL DO INFLAMASSOMA EM RESPOSTA A PM NO EPITLIO RESPIRATRIO

Fig. 6 Produo de IL-1, activao de caspase-1 e expresso de NLRP3 em clulas epiteliais respiratrias aps incubao com 500 mg/mL PM10 durante 24h. A, produo de IL-1. B, razo entre a subunidade casp1-p20 clivada e procaspase-1. C, immunoblot da expresso do caspase-1 e NLRP3 aps exposio a PM10.

Clulas epiteliais respiratrias humanas expostas a PM10 produziram IL-1 significativamente.

A exposio a PM10 induziu a clivagem do caspase-1 e originou a subunidade casp1-p20.

No se observaram alteraes significativas na expresso do caspase-1 ou NLRP3, aps exposio a PM10.

CARACTERIZAO FUNCIONAL DO INFLAMASSOMA EM RESPOSTA A PM NO EPITLIO RESPIRATRIO

Fig. 7 Produo de IL-1, activao de caspase-1 e expresso de NLRP3 em clulas epiteliais respiratrias aps incubao com 500 mg/mL PM10 durante 24h. D, produo de IL-1. E, razo entre a subunidade casp1-p20 clivada e procaspase-1. F, immunoblot da expresso do caspase-1 e NLRP3 aps exposio a PM10.

Ao contrrio da expresso proteica, a expresso gnica foi significativamente atenuada aps exposio a PM10.

Os estudos de intervenes farmacolgicas foram confirmados com experincias de knockout de Nlrp3 por siRNA.

CARACTERIZAO FUNCIONAL DO INFLAMASSOMA EM RESPOSTA A PM NO EPITLIO RESPIRATRIO

Ser que a EHC-93 PM10 utilizada nos estudos consegue levar a alteraes no estado redox? Para tal foi utilizado um corante sensvel ao estado redox permevel clula. Houve um aumento da intensidade da colorao/rea nas clulas tratadas com PM10.
Fig. 8 Alteraes in vitro induzidas por PM10 no estado oxidativo das clulas epiteliais respiratrias. A e B, imagens das clulas vivas tratadas com PBS (controlo) A, ou PM10 B. C, intensidade mdia da colorao por unidade de rea comparada com o controlo.

O INFLAMASSOMA NLRP3 NECESSRIO PRODUO IN VIVO DE IL-1 INDUZIDA POR PM 10

1. Exposio a PM - Knockout do gene Nlrp3

Fig. 9 Respostas inflamatrias induzidas por PM em pulmo de ratinhos wt (controlo) e em ratinhos com knockout do gene Nlrp3. A, Nveis de IL-1 em fludo BAL (pg/mL). B, Nmero total de clulas inflamatrias em fludo BAL. C, Nmero de neutrfilos em fludo BAL.

wt: aumento significativos nos nveis de IL-1 aumento do nmero de clulas inflamatrias Nlrp3-/-: o aumento dos nveis de IL-1 e do nmero de clulas inflamatrias no to significativo.
BAL: Bronchoalveolar lavage; SAL: soluo salina

O INFLAMASSOMA NLRP3 NECESSRIO PRODUO IN VIVO DE IL-1 INDUZIDA POR PM 10

1. Exposio a PM - Knockout do gene Nlrp3:

Fig. 10 Respostas inflamatrias induzidas por PM em pulmo de ratinhos wt (controlo) e em ratinhos com knockout do gene Nlrp3: nmero de macrfagos em fludo BAL.

Nlrp3-/-: o aumento significativo do nmero de macrfagos no est associado ao aumento dos nveis de IL-1.

BAL: Bronchoalveolar lavage; SAL: soluo salina

O INFLAMASSOMA NLRP3 NECESSRIO PRODUO IN VIVO DE IL-1 INDUZIDA POR PM 10

2. Tratamento de ratinhos wt C57Bl/6 com e sem glibenclamida antes da exposio a PM10:

Fig. 11 Respostas inflamatrias induzidas por PM e efeito do tratamento com glibenclamida em ratinhos wt C57Bl/6. A, Nveis de IL1 em fludo BAL (pg/mL). B, Nmero total de clulas inflamatrias em fludo BAL. C, Nmero de neutrfilos em fludo BAL.

A exposio a PM em ratinhos sem tratamento com glibenclamida resultou num aumento dos nveis de IL-1, do nmero de clulas inflamatrias e de neutrfilos. O tratamento com glibenclamida inibiu as respostas induzidas pela exposio a PM10.
BAL: Bronchoalveolar lavage; Vehicle: controlo; Glyburide: glibenclamida

PM 10 E A EXPRESSO DE IL-1 ESTO LOCALIZADAS NO EPITLIO RESPIRATRIO IN VIVO

1. Colorao com hematoxilina e eosina:

Fig. 12 Inflamao das vias respiratrias aps exposio a PM.

PM 10 E A EXPRESSO DE IL-1 ESTO LOCALIZADAS NO EPITLIO RESPIRATRIO IN VIVO

1. Colorao com hematoxilina e eosina:

Fig. 13 Inflamao das vias respiratrias aps exposio a PM. As setas a vermelho apontam para a deposio e PM10 nas clulas do epitlio.

PM 10 E A EXPRESSO DE IL-1 ESTO LOCALIZADAS NO EPITLIO RESPIRATRIO IN VIVO

2. Imunohistoqumica contra-colorao com hematoxilina:

Fig. 14 Imunohistoqumica de IL-1 (marcada a castanho) no epitlio respiratrio, aps exposio a PM10. A produo in vivo de IL-1 encontra-se assinalada a vermelho.

O NLRP3 NECESSRIO PARA ALTERAES NO FENTIPO DAS CLULAS DENDRTICAS INDUZIDAS POR PM10
Alteraes no fentipo de clulas CD11c+hi/MHC class II+hi aps exposio a PM10 por citometria de fluxo:

Fig. 15 Quantificao das alteraes induzidas por PM10 na expresso do marcador de superfcie de clulas dendrticas em ndulos linfticos intratorxicos. A, 4h aps exposio. B, 24h aps exposio.

A exposio a PM10 de ratinhos wt no resultou em alteraes significativas no nmero de clulas CD11c+hi/MHC class II+hi, 4h depois. Neste caso observou-se uma induo significativa das clulas, 24h depois da exposio a PM10. Esta induo foi sensvel ao inflamassoma.

O NLRP3 NECESSRIO PARA ALTERAES NO FENTIPO DAS CLULAS DENDRTICAS INDUZIDAS POR PM10

Fig. 16 Quantificao das alteraes induzidas por PM10 na expresso do marcador de superfcie de clulas dendrticas em ndulos linfticos intratorxicos. C e D, histogramas representativos de 2 parmetros para identificar clulas CD11c+hi/MHC class II+hi aps 24 horas de tempo de exposio: C wild type em soluo salina; D wild type em PM10.

Estes resultados demonstram que a PM10 consegue induzir alteraes numa populao de clulas CD11c+hi/MHC class II+hi em ndulos linfticos regionais, num processo dependente da actividade do inflamassoma NLRP3.

CONCLUSES
No epitlio humano das vias respiratrias encontra-se presente e funcional o inflamassoma NLRP3, sendo activado por PM10 e produzindo IL-1. O inflamassoma NLRP3 contribui para o aumento de condies respiratrias e cardiovasculares existentes, provocado por respostas imunes exageradas associadas inalao de PM. O inflamassoma controla a inflamao neutroflica das vias respiratrias induzida por PM10. , ainda, necessrio para as alteraes induzidas por PM10 no fentipo de clulas dendrticas. A inibio do inflamassoma NLRP3 previne a inflamao das vias respiratrias induzida por PM10 Possvel teraputica para atenuar as consequncias adversas para a sade exposio a partculas urbanas (poluio).

O epitlio das vias respiratrias contribui para respostas imunes inatas ao PM10

VIA DE ACTIVAO DO INFLAMASSOMA NLRP3 RESUMO

Fig. 17 Representao da via de activao do inflamassoma NLRP3. (Imagem retirada de http://www.sciencemag.org/content/327/5963/-296/F1.expansion.html).

BIBLIOGRAFIA
Jin, Chengcheng; Flavell, Richard, Molecular Mechanism of NLRP3 Inflammasome Activation, J. Clin Immunol, 30:628-631 (2010) Leemans, Kaklien; Cassel, Suzanne; Sutterwala, Fayyaz, Sensing damage by the NLRP3 inflammasome, Immunological Reviews, vol. 243: 152 162 (2011)