Anlisis de flujo metablico de Escherichia coli en glucosa-limitado cultivo continuo. I.

Crecimiento de tasa-eficiencia metablica dependiente en estado estacionario La Escherichia coli K-12 cepa TG1 se hizo crecer a 28C aerbico en cultivos continuos de glucosa limitados en las tasas de dilucin que van desde 0,044 a 0,415 h-1. Las tasas de formacin de la biomasa , las tasas especficas de la captacin de glucosa , amonio y oxgeno y la velocidad de evolucin del dixido de carbono especfica aumentaron linealmente con la tasa de dilucin hasta 0,3 h-1 . A tasas de dilucin entre 0,3 h-1 y 0,4 h-1, una fuerte desviacin del incremento lineal para reducir el consumo de oxgeno especfico y tasas de evolucin de dixido de carbono producido. La tasa de formacin de la biomasa y las tasas especficas de absorcin de glucosa y de amonio no se apartan considerablemente de que el aumento lineal hasta tasas de dilucin de 0,4 h-1. Un porcentaje cada vez mayor de flujo de carbono hacia la biomasa de glucosa determinada por un equilibrio de masa del reactor y una disminucin concomitante de ATP especfica tasa de produccin con una disminucin carga de energa adenilato indica una mayor eficiencia energtica de la utilizacin de sustratos de carbono a mayores tasas de dilucin. Estimacin de los flujos metablicos por un modelo estequiomtrico revel un aumento de la actividad de la va de las pentosas fosfato y una actividad de ciclo del cido tricarboxlico disminuyendo con el aumento de las tasas de dilucin , indicativo de aumento de la NADPH y la demanda precursor para los propsitos anablicos a expensas de la formacin de ATP a travs de actividades catablicas. Por lo tanto, el aumento de las tasas de crecimiento primer resultado en un uso ms eficiente en energa del sustrato de carbono para la produccin de biomasa, es decir, una porcin inferior del sustrato de carbono se canaliza en el respiratoria, va de generacin de energa. En las tasas de dilucin por encima de 0,4 h-1, cerca del punto de salida de lavado , las tasas de respiracin se redujo drsticamente y no se observ acumulacin de glucosa y cido actico . La generacin de energa a travs de la formacin de etilo se obtiene menos ATP en comparacin con la oxidacin completa del sustrato de carbono de azcar , pero es el resultado de la generacin de energa maximizado en condiciones de restricciones en el ciclo del cido tricarboxlico o en la facturacin NADH respiratoria . Por lo tanto , los datos apoyan fuertemente la conclusin de que , en aerbicas cultivos continuos de glucosa- limitadas de E. coli TG1 , se producen dos limitaciones de carbono diferentes : en tasas bajas de dilucin , el crecimiento celular es limitada por el suministro de clulas de carbono y , a altas tasas de dilucin , por suministro de energa carbono. INTRODUCCIN Escherichia coli es el microorganismo ms comn usado para la produccin de diversos compuestos tales como protenas recombinantes heterlogas . Ofrece la ventaja de crecer a tasas de crecimiento predeterminados a altas densidades de clulas mediante tcnicas de alimentacin por lotes simples utilizando medios definidos con fuentes de carbono bajo costo, tales como glucosa o glicerol ( Riesenberg y col , 1991 ; . . Korz et al , 1995 ) . Dependiendo de las condiciones de cultivo , los rendimientos de crecimiento en estos sustratos de carbono pueden variar considerablemente , lo que refleja la eficiencia con que variables aerbica crecimiento E. coli genera energa a travs de a nivel de sustrato y la fosforilacin oxidativa y subsiguientemente utiliza esta energa para fines biosintticos . Los valores determinados experimentalmente de los requisitos de ATP para la biosntesis de material celular son en

general mucho ms alto que los valores determinados por los estudios tericos (por ejemplo, Farmer & Jones , 1976 ) , lo que indica un desacoplamiento parcial de conservacin de energa y la energa - la utilizacin de reacciones celulares. Como la sntesis de protenas, o ms especficamente la polimerizacin de aminocidos, es el ms grande proceso que consume energa en la clula , con ms de 50 % del consumo de ATP para los propsitos biosintticos ( Stouthamer , 1973 ) , la generacin de energa puede llegar a ser crtica en recombinante - clulas de protenas en exceso. Por ejemplo , la carga metablica de la produccin de protena recombinante se manifiesta en un aumento de la actividad respiratoria, es decir, en un aumento de la actividad de la va de generacin de energa (por ejemplo, Hoffmann & Rinas , 2001 ; . Weber et al , 2002 ). Para entender y controlar la clula que produce mejor, es importante tener un conocimiento ms profundo de cmo la pareja generacin de energa celular y de suministro de carbono en las vas catablicas con los requisitos anablicos en diferentes tasas de crecimiento en condiciones no productores. Parece razonable suponer que, en una equilibrada reacciones celulares , abastecimiento de combustible y biosntesis creciente son afinados de tal manera que las clulas crecen a la tasa ms alta posible en las condiciones dadas. Esta hiptesis es apoyada por el buen acuerdo de distribucin de flujo calculadas con los datos experimentales buscando maximizar el crecimiento, como una funcin objetivo en un entorno de programacin lineal (por ejemplo Varma y Palsson , 1993 ). "Maximizar el crecimiento" implica la generacin de energa ptimo en secuencias de reacciones catablicas y un drenaje ptimo de los precursores biosintticos de demandas anablicas. La informacin sobre los flujos metablicos puede obtenerse a partir de un modelo metablico y un conjunto de flujos medidos, tpicamente las tasas de absorcin de sustratos y las tasas de secrecin de metabolitos (Vallino y Stephanopoulos, 1990). El anlisis se basa en la estequiometra de las vas celulares , la demanda metablica de los principios de crecimiento y optimizacin de estimar el flujo de carbono intracelular dentro de la red definida. Estos modelos metablicos estequiomtricos basados se han aplicado a una variedad de organismos, incluyendo E. coli ( Varma y Palsson , 1993 ; Pramanik y Keasling , 1997 ). Las distribuciones de flujo calculado se basan en una hiptesis de un estado pseudoestacionario de metabolitos intracelulares, que se verifican mejor en el estado estable en cultivo continuo. En este estudio, se examin el efecto de la tasa de crecimiento en los flujos catablicos y anablicos y la eficiencia energtica de la E. coli K - 12 cepa TG1 de crecimiento en cultivo continuo de glucosa limitada aerbico. Por otra parte , el estado energtico de las clulas se analiz por medicin de la piscina de nucletidos adenosina intracelular . METODOS Micro - organismo y medio. La E. coli K - 12 cepa TG1 ( = DSM 6056 ) se cultiv en un medio definido con ( por litro ) 11 g de monohidrato de glucosa (que corresponde a 10 g de glucosa ), 8 g de (NH4)2SO4, 0,8 g de (NH4)2HPO4, 2,7 g KH2PO4, 0,35 g de cido ctrico monohidrato, 1 g MgSO4.7H2O, 12 mg de citrato frrico, 0,5 mg CoCl26H2O, 0,3 mg MnCl24H2O, 0,3 mg CuCl22H2O, 0,6 mg H3BO3, 0,5 mg Na2MoO42H2O, 1,6 mg Zn(CH3COO)22H2O, EDTA 1,7 mg y 4

mg de tiamina. La glucosa y el sulfato de magnesio se trataron en autoclave por separado . La tiamina se aadi mediante filtracin estril. Las condiciones de cultivo. Cultivos continuos se llevaron a cabo a 28 C, a una velocidad de agitacin de 800 rpm, y el pH se control a pH 6,6 con NaOH 2,5 mol l- 1. El 2 - l biorreactor ( modelo SGI 7F - Set 2 ; Setric ) estaba equipado con unidades de control (temperatura, pH, oxgeno disuelto, velocidad de agitacin) y de medicin estndar. Una tasa de aireacin constante de 1,33 v.v.m. se logr mediante un controlador de flujo de masa (Brooks). El cultivo continuo se realiz durante al menos ocho tiempos de residencia a una velocidad de dilucin dada; condiciones de estado estacionario se verificaron mediante densidad ptica constante y velocidad de transferencia de oxgeno y de dixido de carbono. A excepcin de la glucosa, todos los dems sustratos eran en exceso. La concentracin de oxgeno disuelto se mantuvo siempre por encima de 20 % de saturacin de aire. Las tcnicas analticas. Lquido de cultivo se retir del biorreactor en un vaso de precipitados enfriado con hielo. Masa seca de clulas se determin gravimtricamente despus de la centrifugacin de un volumen de muestra conocida. El sedimento se lav dos veces con NaCl al 0,9% w/v y se sec a 40C bajo vaco durante 48 h. Composicin de la biomasa Elemental ha sido analizada con un PE 2400 II analizador elemental (Perkin Elmer). La glucosa se midi enzimticamente mediante un analizador de glucosa YSI (modelo 2700; Yellow Springs Instrument Co.). Los cidos orgnicos , es decir, cido actico, cido frmico, cido lctico y cido pirvico, se analizaron por HPLC usando una columna de exclusin inica Aminex HPX 87H ( Bio-Rad ). La columna , conectado a un detector de UV (l = 210 nm) y detector de RI , se eluy a 50C con 5 mmol H2SO4 l-1 a un caudal de 0,5 ml min-1 . Concentraciones de amonio fueron analizados por un electrodo de amonio (modelo Orion 9512 ; Colora) . Las concentraciones de oxgeno y dixido de carbono en el gas de escape se midieron por los sistemas de anlisis de gases de infrarrojos , respectivamente ( Maihak ) y paramagntico . Para la determinacin de los nucletidos de adenosina AMP , ADP y ATP , 3-5 ml de suspensin celular fue tomada desde el biorreactor utilizando un dispositivo de muestreo rpido (descrito en Theobald et al . , 1997). Desde volumen de negocios de la piscina de nucletidos de adenosina se produce en unos pocos segundos (Nielsen y Villadsen , 1994 ; . . P 55ss ), una tcnica de muestreo rpido era necesario para inactivar las actividades metablicas de inmediato. Brevemente, las muestras se retiraron del biorreactor a travs de una aguja capilar en tubos de muestra evacuados que contienen perlas de vidrio previamente enfriados en 5 moles de cido perclrico l-1 (-25 C) para la inactivacin inmediata del metabolismo celular. Se llev a cabo un ciclo de congelacin -descongelacin entre 0 y -25 C. El extracto se neutraliz en hielo mediante la adicin cuidadosa de 2 moles de KOH l-1 y los restos celulares insoluble se separ por centrifugacin (14 000 rpm, 15 s; Eppendorf modelo 5417) y posterior filtracin por membrana (tamao de poro 0,45 m) . Neutralizados muestras se analizaron por par inico de HPLC , utilizando una columna de fase inversa (Supelcosil LC - 18T ; Supelco) con hidrogenosulfato de tetrabutilamonio como agente de emparejamiento y la elucin gradiente de pH metanol (Ryll y Wagner , 1991).

Los balances de masa , clculos y anlisis de flujo . Volumtrica de oxgeno y las tasas de transferencia de dixido de carbono ( OTR y CTR , respectivamente) se calcula a partir del balance de masa de la fase gaseosa de la siguiente manera :

donde MO2 y MCO2 son la masa molecular de oxgeno y de dixido de carbono (g mol-1) en condiciones estndar, FGin es el flujo de aire volumtrico, V(t ) el volumen de trabajo de la bio del reactor ( l ), el volumen VM mol del gas ideal (l mol-1) en condiciones estndar , xinO2 (t) y xinCO2 (t) las fracciones molares de oxgeno y dixido de carbono (mol mol-1), respectivamente , en el aire de entrada, y xoutO2 (t) y xoutCO2 (t) las fracciones molares de oxgeno y dixido de carbono (moles mol-1), respectivamente, en el aire de salida del biorreactor. Para el clculo de las tasas especficas, se descuida el flujo convectivo de oxgeno y dixido de carbono y la transferencia volumtrica tasas de OTR y el CTR se considera que es idntica a la absorcin volumtrica de oxgeno y las tasas de evolucin de dixido de carbono, respectivamente. Las tasas especficas se calcularon dividiendo las tasas volumtricas, por la concentracin de clulas. Carbono (Crec) y nitrgeno (Nrec) recuperaciones condiciones de estado estacionario se determinaron a partir de la masa del reactor equilibra acuerdo con las siguientes ecuaciones:

donde ij es la fraccin de masa del elemento i en el compuesto j (g g-1), la tasa de dilucin D (h-1), Cj la concentracin de compuesto J en el biorreactor y C0j la concentracin del compuesto j en la solucin de alimentacin. Para el clculo de CBiomass y NBiomass, la composicin elemental de la biomasa se determin como CH1,85O0,574N0,22 ms el 12% de cenizas. La composicin elemental de la biomasa no cambi con la tasa de dilucin (datos no mostrados). La carga de energa ciclasa (AEC) se calcula a partir de la medicin de adenosina piscina de nucletidos de acuerdo con la definicin dada por Atkinson (1968):

donde CATP, CADP y CAMP representan, respectivamente, las concentraciones intracelulares de los nucletidos de adenosina ATP, ADP y AMP. Balances de masa derivadas estequiomtricamente se utilizaron para estimar el flujo de carbono a travs de las vas metablicas centrales (Vallino y Stephanopoulos, 1990; van Gulik y Heijnen, 1995). Las reacciones bioqumicas y considerados metabolitos forman un conjunto de ecuaciones lineales que pueden ser expresados en notacin matricial como: A.x=r con la matriz estequiomtrica A, el vector de flujos desconocido x y el vector r de las tasas de acumulacin. Suponiendo estado pseudo-estacionario de los metabolitos intracelulares, las respectivas tasas de acumulacin pueden ser puestos a cero. La red biorreaccin generada fue insuficientemente determinada (nmero de reacciones mayor que el nmero de metabolitos). Debido a que existen mltiples soluciones para las redes de indeterminados , se utiliz la programacin lineal (optimizacin) para determinar la distribucin de flujo (para detalles del mtodo de ver Varma y Palsson, 1994; van Gulik y Heijnen, 1995; Pramanik y Keasling, 1997). Los valores numricos de los flujos desconocidos se obtuvieron con las siguientes limitaciones: (i ) la fijacin de la tasa de consumo de glucosa especfico, ( ii ) que especifica la direccin de la reaccin de acuerdo con su termodinmico pro-perty, especificando los parmetros energticos relacin P/O , YX/ATP y mATP como se describe en la seccin Resultados y Discusin y mediante la definicin de una funcin objetivo . La funcin objetivo se defini como "maximizar el crecimiento:

La programacin lineal se llev a cabo utilizando un algoritmo simple de dos fases (MATLAB, versin 4.2c.1; The MathWorks). La red metablica se construy sobre la base de la E. coli EcoCyc base de datos (Karp et al, 1999;. Http://BioCyc.org/ecocyc/); reacciones anablicas para la sntesis de la biomasa, incluida la polimerizacin, la biosntesis, reacciones de abastecimiento de combustible y el transporte se basan en los datos dados por Ingraham et al. (1983). La red contiene 102 reacciones y 90 metabolitos y est incluido en el Apndice. Incluye reacciones de las rutas metablicas centrales , es decir, la ruta de Embden - Meyerhof Parnas (EMP), el cido tricarboxlico (TCA) ciclo, la pentosa fosfato (PP) va, la va de metilglioxal (MG) y la gluconeognesis. Vas anaplerticas detectado en E. coli incluyen reacciones catalizadas por (PEP) fosfoenolpiruvato carboxilasa, PEP carboxiquinasa, una enzima NAD y NADP - malato especfica e isocitrato liasa y malato sintasa del shunt glioxilato. En E. coli, dos tipos diferentes de piridina dinucletido trans - hidrogenasa existen para la interconversin de NADPH y NADH: un dependiente de la energa unida a la membrana transhidrogenasa (Bragg et al , 1972 ; Rydstro M , 1977) y un transhidrogenasa citoplasmtica soluble involucrados en la transferencia de energa independiente de la de hidruro de NADPH

a NAD+ (Boonstra et al . , 1999). La fosforilacin oxidativa se explica por una energa y no energtico ligado NADH deshidrogenasa, una FADH reductasa y una reaccin de formato deshidrogenasa. Algunas de las reacciones en las rutas metablicas lineales se agrupan, es decir, reacciones anablicas sobre el metabolismo de nucletidos y de los lpidos y la sntesis de varios aminocidos. La ecuacin de la biomasa fue adaptado a la composicin macromolecular de E. coli. Los valores de 3,1 % de ADN , 9,1 % de lpidos , 3,4 % lipopolisacrido, 2,5 % peptidoglicano y 2,5 % glucgeno (% w/w) se tomaron de Ingraham et al . ( 1983 ). Los valores de protena , 62 % , y el ARN , 11,5 % , se obtuvieron a partir de nuestras propias mediciones de acuerdo con los mtodos descritos por Herbert et al . ( 1971 ) y Benthin et al . ( 1991 ), respectivamente. Los flujos metablicos se calcularon en base molar y de la biomasa que se han considerado las cantidades necesarias para la formacin de 100 g de biomasa. Los stoichio - metries utilizados en la ecuacin biomasa agrupado ( R93 , vase el Apndice , modelo detallado estequiomtrica ) se ajustaron en consecuencia. De esta manera, para la comodidad de modelado, que prcticamente considera una "masa molecular de la biomasa' correspondiente a 100 g mol-1. A pesar de los cambios en la composicin de biomasa macromoleculares con la tasa de crecimiento (Shahab et al, 1996 ), se consider constante como el impacto de estos cambios en las distribuciones de flujo intracelular es insignificante, ya que se ha demostrado mediante un anlisis de sensibilidad (datos no presentados; Daae y Ison , 1999). RESULTADOS Y DISCUSIN Rendimientos de crecimiento y de la energtica : el enfoque clsico con un modelo estequiomtrico sencillo Culturas en estado estacionario continuo de la glucosa - limitados aerbicos con tasas de dilucin que van desde D = 0 ,044 - 0,415 h-1 se utilizaron para determinar los parmetros de crecimiento de E. coli TG1. Las concentraciones de biomasa, glucosa y de etilo y el CTR volumtrica como una funcin de la tasa de dilucin se muestran en la figura . 1 (tambin se resumen en la Tabla 1). En las tasas de dilucin por encima de 0,4 h-1, las concentraciones de glucosa y acetato aumentaron considerablemente concomitante con una fuerte disminucin en la concentracin de biomasa y el CTR volumtrica, que muestra claramente que el crecimiento en estas tasas de dilucin estaba cerca del punto de lavado. Todos los datos obtenidos a partir de cultivos de estado estacionario se ensayaron para determinar la consistencia mediante la aplicacin de un balance de masa del reactor para los elementos carbono y nitrgeno (Tabla 1). La recuperacin de nitrgeno fue siempre superior al 97 %, una recuperacin satisfactoria de carbono , sin embargo, slo se obtuvo para las tasas de dilucin de hasta 0,4 h-1, que nos llev a omitir los datos de los dos estados estables en las tasas de dilucin por encima de 0,4 h1 ( el rea sombreada en la figura . 1 ) a partir de los clculos posteriores .

De acuerdo con el modelo de mantenimiento de Pirt (1965), las tasas especficas rj de captacin de sustrato y formacin de producto se pueden expresar como funciones lineales de la tasa de dilucin (que es igual a la tasa de crecimiento especfica m en estado de equilibrio) por atribuir el consumo de un determinado sustrato (o la formacin de un producto) a un crecimiento asociada y un proceso de no-crecimiento asociada a:

donde YtrueJ es el coeficiente de rendimiento real (g g-1) No considerando todos los procesos de mantenimiento asociados y mj el trmino de mantenimiento (g g-1 h-1) . En las tasas de dilucin por debajo de 0,3 h-1, las tasas de absorcin especficos para la glucosa, de amonio y de oxgeno y la tasa de desprendimiento de dixido de carbono especfico aument linealmente con la velocidad de dilucin, mientras que no se observ la formacin de etilo (Fig. 2 , vase tambin los datos en la Tabla 2). En las tasas de dilucin entre 0,3 h-1 y 0,4 h-1, una fuerte desviacin del aumento lineal para reducir la absorcin de oxgeno se produjeron especfica y las tasas de evolucin de dixido de carbono (fig. 2a). Esta fuerte desviacin del aumento lineal a tasas ms bajas no se observ para la tasa de formacin de la biomasa y las tasas de absorcin especficas de la glucosa y amonio (Fig. 2a y b, respectivamente). En contraste, la formacin de la biomasa (Fig. 2a) y la absorcin de amonio especfica (Fig. 2b) revelaron tasas incluso una pequea desviacin desde el aumento lineal hacia tasas ms altas, mientras que la tasa de captacin de glucosa especfica (Fig. 2b) revel un ligero descenso desviacin del aumento lineal con el aumento de las tasas de dilucin. En resumen, estos resultados apuntan a una mayor eficiencia del nitrgeno y la incorporacin de carbono en la biomasa, es decir, la utilizacin de sustratos ms eficaz para el crecimiento, a tasas de dilucin entre 0,3 h-1 y 0,4 h-1. Desde el intervalo lineal de la tasa de captacin de glucosa especfico como una funcin de la tasa de dilucin ( rGlucose , D = 0 0,347 H-1), el

crecimiento asociada a la estequiomtrica rendimiento verdadero coeficiente de Yverdadero y el mantenimiento no - crecimiento asociada a la co - Glucosa eficiente mGlucose fueron determinados de acuerdo a la ecuacin 8 como 0,57 g g-1 y 0,02 g g-1 h-1, respectivamente . Los niveles detectables de etilo se observaron primero a una tasa de crecimiento de 0,375 H-1 (50 mg l-1, la fig. 1) y entre D = 0,375 h-1 y 0,4 h-1 tasas de formacin de acetato aument ligeramente con el aumento de la tasa de dilucin (Fig. 2b). Se observ acumulacin pronunciada de etilo para las tasas de dilucin por encima de 0 ? 4 h21 (fig. 1). Para el clculo del porcentaje de flujo de carbono hacia la glucosa biomasa, dixido de carbono y de etilo, se expresaron los datos del balance de masa del reactor (Tabla 1) sobre una base molar de tomos de carbono , es decir, porcentaje de tomos de carbono a partir de glucosa convertida a la biomasa, carbn dixido de carbono y acetato de (fig. 3). Este anlisis corrobor adicionalmente el flujo decreciente de la glucosa de carbono hacia dio- xido de carbono y un flujo creciente hacia la biomasa, lo que sugiere una utilizacin ms eficiente en energa del sustrato de carbono para la formacin de la biomasa con el aumento de las tasas de crecimiento. La tendencia de disminucin de la recuperacin de carbono con el aumento de las tasas de crecimiento teniendo en cuenta slo la formacin de la biomasa, dixido de carbono y acetato podra ser causada por la formacin de un subproducto no identificado (s). En analoga con el modelo de mantenimiento de Pirt ( 1965 ) ( ecuacin 8 ) , la energtica de crecimiento se pueden describir mediante el equilibrio de la formacin y el consumo de ATP ( Bauchop y Elsden , 1960 ; Stouthamer y Bettenhaussen , 1973 ) :

Una vez ms , el consumo de ATP se atribuye a los procesos de crecimiento y no crecimiento asociada , con YX/ATP como el parmetro que describe los requisitos de ATP asociadas a crecimiento (g mol-1) y MATP como el trmino de mantenimiento describir requisito de ATP en la ausencia de crecimiento (mol g-1 h-1). Se utiliz un modelo estequiomtrico sencillo que incluye reacciones catablicas y anablicas que se enumeran en el Apndice para determinar los parmetros energticos YX/ATP (ecuacin 12) y mATP (ecuacin 13 ) . Para la relacin P/S, se supuso un valor de 1,75 como se determina para las enterobacterias (Zeng et al . , 1990). Adems, los valores para el crecimiento asociada a la estequiomtrica rendimiento verdadero coeficiente de Y verdadero y la no - X = crecimiento asociada a la glucosa mantenimiento coeficiente de mGlucose determinado de la gama lineal de la tasa de absorcin de glucosa como se describe anteriormente fueron utilizados como parmetros de entrada ( vase Apndice ) . Sobre la base de este modelo estequiomtrica simple, el consumo de ATP para los requisitos de mantenimiento en la ausencia de MATP crecimiento se determin como 2,81 mmol g-1 h-1 y el crecimiento asociada a consumo de energa YX / ATP como 11,6 g mol-1 . Los valores anteriores estn en el rango de los valores reportados previamente determinados a partir de aerbicas limitadas - glucosa chemostat culturas de crecimiento asociada a ATP requisitos YX / ATP ( 13,9 g mol-1 30 C ; ? Farmer & Jones , 1976 ) y el consumo de ATP para el mantenimiento m de las clulas que no crecen ( 2 mmol g -1 h-1 y 30 Jones , 1976).

Fig. 3. Carbon mass balance during glucose-limited continuous culture of E. coli TG1. The percentage of glucose carbon ow towards biomass (& ), carbon dioxide ($ ) and acetate (m) as functions of the dilution rate D. Data from dilution rates above 0? 4 h 1 were omitted from these calculations.

Fig. 2. Substrate uptake and biomass and product formation rates during glucose-limited continuous culture of E. coli TG1. (a) The biomass formation rate RBiomass ($ ) and the specic oxygen uptake r O2 (% ) and carbon dioxide evolution rate r CO 2 (& ) and (b) the specic uptake rate of glucose rGlucose (% ) and ammonium r NH4 (& ) and the specic formation rate of acetate rAcetate (m) were calculated as functions of the dilution rate D. Data from dilution rates above 0? 4 h 1 were omitted from these calculations.

slightly with the increase in the dilution rate (Fig. 2b). Pronounced accumulation of acetate was observed for dilution rates above 0? 4 h2 1 (Fig. 1). For calculation of the percentage of glucose carbon ow towardsbiomass, carbon dioxide and acetate, the data from the reactor mass balance (Table 1) were expressed on a molar basis of carbon atoms, i.e. percentage of carbon atoms from glucose converted to biomass, carbon dioxide and acetate (Fig. 3). Thisanalysisadditionally corroborated the decreasing ux of glucose carbon towards carbon dioxide and an increasing ux towards biomass, suggesting a

Table 2. Biomass formation rate and the specic rates of glucose uptake, carbon dioxide evolution, oxygen uptake, acetate formation and ammonium uptake during steady-state growth of E. coli TG1 at various dilution rates in glucose-limited continuous cultures
RBiomass, Biomass formation rate; rGlucose, glucose uptake rate; r CO2 , carbon dioxide evolution rate; r O2 , oxygen uptake rate; rAcetate, acetate formation rate; r NH 4 , ammonium uptake rate. D (h 1) 0? 044 0? 066 0? 134 0? 150 0? 170 0? 203 0? 265 0? 280 0? 300 0? 347 0? 375 0? 388 0? 397 RBiomass (g l 1 h 1) 0? 223 0? 333 0? 709 0? 785 0? 889 1? 098 1? 399 1? 548 1? 659 1? 945 2? 132 2? 281 2? 092 r Glucose (g g 1 h 1) 0? 087 0? 131 0? 253 0? 287 0? 325 0? 375 0? 502 0? 506 0? 542 0? 605 0? 640 0? 643 0? 723 r CO2 (g g 1 h 1) 0? 056 0? 087 0? 175 0? 175 0? 213 0? 236 0? 291 0? 303 0? 325 0? 340 0? 332 0? 335 0? 382 r O2 (g g 1 h 1) 0? 0437 0? 0570 0? 1089 0? 1175 0? 1713 0? 1757 0? 1978 0? 2216 0? 2372 0? 2421 0? 2415 0? 2438 0? 2633 r Acetate (g g 1 h 1) 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0000 0? 0032 0? 0034 0? 0047 r NH 4 (g g 1 h 1) 0? 0060 0? 0093 0? 0190 0? 0215 0? 0242 0? 0289 0? 0385 0? 0395 0? 0427 0? 0485 0? 0534 0? 0557 0? 0577

http:/ / mic.sgmjournals.org 697 Energtica del crecimiento y la distribucin de flujo metablico : un enfoque de programacin lineal utilizando un modelo detallado estequiomtrica

El modelo estequiomtrico sencillo puede dar una estimacin aproximada de la energtica de crecimiento en el rango lineal de las tasas de captacin de glucosa , sin tener en cuenta cualquier cambio en la eficiencia energtica de las variaciones de la tasa de crecimiento que dependen de las necesidades de energa para la formacin de la biomasa. Por otra parte , hay que sealar que la relacin P/S, YX / ATP y MATP no pueden medirse directamente ni se evalan de forma independiente . Un enfoque viable para hacer frente a este problema es la creacin de dos de estas variables como constantes y ajustar el tercero para satisfacer datos determinados experimentalmente. Por lo tanto , la relacin P / S se considera constante como P / S = 1,75 ( Zeng et al . , 1990 ) y MATP se defini como el requerimiento de energa para el mantenimiento en la ausencia de crecimiento y determina como MATP = 2,81 mmol g- 1 h- 1 (modelo estequiomtrico sencillo, este estudio) . Los valores de YX / ATP se calcularon mediante el ajuste de sus valores para llegar a la experimentalmente determinada biomasa rendimiento YX / glucosa ( Tabla 3 ) utilizando el modelo estequiomtrico detallada ( vase el Apndice ) construido para la estimacin de la distribucin intracelular de flujo de carbono . Por lo tanto , sobre la base de la tasa de absorcin de glucosa , los flujos intracelulares se calcularon mediante la programacin lineal con ' maximizar el crecimiento ' como la funcin objetivo , manteniendo los parmetros energticos P / O y MATP constante y el ajuste de la tercera Y parmetro energtico ( presente en la formacin de la biomasa reaccin ; R97 ) para que sea compatible con el rendimiento de biomasa determinado experimentalmente Y X / glucosa ( Tabla 3). La determinacin de YX / ATP a diferentes tasas de dilucin utilizando el modelo detallado estequiomtrica revel el aumento de los valores de YX / ATP con el aumento de las tasas de dilucin ( Tabla 3 ) , lo que indica la formacin de biomasa ms eficiente en energa a tasas de crecimiento ms altas , es decir, menos consumo de ATP para la generacin de biomasa , presumiblemente causado por menor en bicicleta intil , las fugas y el mantenimiento del crecimiento asociado. Con valores conocidos de YX / ATP , la tasa de produccin de ATP especfica se calcul de acuerdo con la ecuacin 9 . Una vez ms , la desviacin de la tasa de produccin de ATP a partir del incremento lineal a valores ms bajos en las tasas de dilucin por encima de 0,3 h-1 ilustra la utilizacin de ATP ms eficiente a mayores tasas de crecimiento (Fig. 4 ) . El estado de energtico de las clulas fue investigado adems por determinacin de la AEC . Los resultados revelaron un AEC disminuyendo con el aumento de la tasa de crecimiento especfica (Fig. 4 ) . Por encima de D = 0,3 h-1 hubo una fuerte disminucin de la AEC , que se mantuvo casi constante a 0,7 an ms con el aumento de las tasas de dilucin . El AEC juega un papel regulador en el equilibrio de l reacciones formadoras de energa y la utilizacin de la energa - ; una carga baja energa ms probable es que reprimir reacciones que consumen ATP , por ejemplo, bicicleta intil , que permite metablicos actividades adaptarse con mayor eficacia a las demandas anablicos. En conjunto , los resultados anteriores sugieren fuertemente que el metabolismo de la clula se somete a diferentes tipos de limitacin de carbono con el aumento de las tasas de dilucin en una cultura quimio - stat glucosa - limitado . El aumento de las tasas de crecimiento en el primer resultado un uso ms eficiente del sustrato de carbono para la produccin de biomasa , es decir, una porcin ms grande del sustrato de carbono es incorpo - rados en biomasa y una parte ms pequea se utiliza en los sistemas respiratorio, va de generacin de energa , concomitante con un estado energtico ms bajo de las clulas se refleja en una baja AEC .

Basado en el modelo detallado estequiomtrica , la distribucin de flujo metablico se determin a baja (D = 0,066 h-1 ) y alto ( D = 0,375 h-1 ) las tasas de dilucin en condiciones de celular en carbono y la limitacin de energa de carbn , respectivamente ( Fig. . 5 ) . Con el aumento de la tasa de dilucin , el flujo a travs de la va de PP oxidativo aument a expensas del flujo a travs de la va de EMP y el ciclo del TCA . El flujo de carbono en exceso en la va de PP se canaliza de nuevo a la va a travs de la EMP transaldolasa - no oxidativo ( r40 ) y transcetolasa -( r41 ) reacciones catalizadas . En el nivel de gliceraldehdo 3 -fosfato ( GAP ; r7 ) , 168 % en moles mol21 en D = 0,066 h-1 y 1,57 % en moles mol21 en D = 0,375 h-1 entrar en la va EMP ? ? . Por lo tanto , el carbono que se utiliza para la biomasa y la formacin de CO2 hasta el nivel de GAP aumenta del 16 al 22 % . A la velocidad de dilucin ms alta, menos carbono entra en el ciclo TCA . La disminucin de la tasa de produccin de NADH resultante disminuye la velocidad de formacin de ATP en la cadena respiratoria ( R33 y R34 ) en un 24 % . Vas alternativas , tales como la va de MG ( R42 ) o la va alternativa del glioxilato ( r27 y r28 ) no se prev que funcionar en glucosa - limitados cultivos bajo condiciones de estado estacionario . La va de MG es ms probable que slo se activa bajo condiciones de exceso de glucosa ( vase el documento de acompaamiento ; . Weber et al , 2005 ) y de la va alternativa del glioxilato puede no funcionar en E. coli K - 12 cepas , como se ha demostrado experimentalmente ( 13C etiquetado ) para el E. coli K - 12 cepa JM109 ( Noronha et al , 2000 ; . Phue y Shiloaj , 2004 ) , un pariente cercano de la E. coli K - 12 cepa TG1 ( Sambrook et al , 1989 . ) empleada en este estudio . Los flujos a travs del ciclo de Krebs ( r18 ) y PP va ( r36 ) se muestran en la figura . 6 como funciones de la tasa de dilucin . El PP va de flujo ( r36 ) aumenta de 39 % mol mol21 a 73 % en moles mol21 al aumentar la velocidad de dilucin , que muestra el aumento ms destacado por encima de una tasa de dilucin de 0 ,3 h-1 . El flujo del ciclo del TCA ( r18 ) se comporta de forma inversa y disminucin de 71 % en moles mol21 a 34 % en moles mol21 con el aumento de la tasa de dilucin . En este contexto , es importante tener en cuenta que los resultados de flujo obtenidos por el mtodo de equilibrio metabolito tambin incluyen el equilibrio cofactor para NADH y NADPH . El equilibrio de NADPH obliga al PP va para funcionar nicamente para satisfacer las demandas de biosntesis para NADPH y precursores de pentosa . Flujo mediciones en E. coli utilizando glucosa marcado con 13C, que no dependen de la estequiometra NADPH estn en estrecho acuerdo con el anlisis anterior : una va de flujo de PP de 53 % en moles mol21 y un flujo del ciclo del TCA del 45 % en moles mol21 han sido reportado ( Schmidt et al . , 1999 ) . Por lo tanto , la utilizacin de la va de PP se intensifica en el coste de la actividad del ciclo del TCA cuando aumentan las tasas de crecimiento en cultivos chemostat glucosa - limitados . Este cambio en la distribucin de la utilizacin de la va metablica est conectado a un aumento de la eficiencia energtica de la utilizacin de sustratos de carbono para la produccin de biomasa . Adems, hay que recordar que los mutantes fosfoglucosa - isomerasa negativas de E. coli ( r2 no es posible) son capaces de crecer en glucosa, aunque a un ritmo ms lento en comparacin con las clulas de tipo salvaje , pero con un rendimiento de biomasa ms alta ( Fraenkel y Vinopal , 1973 ; Canonaco et al , 2001 ; . . Hua et al , 2003 ) , lo que indica que la funcin de la va de PP se extiende ms all del suministro de NADPH y biosinttica precursores . Por otra parte , los estudios sobre E. coli mutantes de genes knock-out deficientes en enzimas catablicas indican una red metablica ms robusto y flexible , donde las vas se pueden sustituir unos por otros , a veces sin afectar de manera significativa las tasas de crecimiento (por ejemplo, Zhao et al. , 2004 ) . La

surements in E. coli using 13C-labelled glucose which are not dependent on NADPH stoichiometries are in close agreement with the above analysis: a PP pathway ux of 53% mol mol 2 1 and a TCA cycle ux of 45% mol mol 2 1 have been reported (Schmidt et al., 1999). Thus, the PP pathway utilization is intensied at the cost of the TCA Fig. 6. Catabolic and anabolic ux distributions during glucosecycle activity when rates increase of E. coli TG1. Estimations of the posibilidadlimited de continuous utilizar culture el modelo detallado estequiomtrica para la growth prediccin de in glucose-limited chemostat cultures. This change in the distribution of the metabolic ux through the TCA cycle ($ ) (r18) and the PP distribuciones de flujo confiables fue validado demostrando su capacidad para predecir la pathway (% ) (r36) as functions of the dilution rate D. Fluxes metabolic pathway utilization is connected to an increased medida are normalized with respect to the glucose uptake rate. energy efciency of carbon substrate utilization for biomass tasas respiratorias ; la desviacin relativa para RO2 fue de menos de 10 % (one Tabla 4 ) recall . production. Also, should that phosphoglucoseisomerase-negative mutants of E. coli (r2 not possible) are able to grow on glucose, although at slower rates compared biomass and CO2 formation up to the GAP level increases with wild-type cells but with a higher biomass yield from 16 to 22%. At the higher dilution rate, less carbon (Fraenkel & Vinopal, 1973; Canonaco et al., 2001; Hua enters the TCA cycle. The resulting decreased NADH et al., 2003), indicating that the function of the PP production rate decreases the ATP formation rate in the pathway extends beyond the supply of NADPH and respiratory chain (r33 and r34) by 24%. Alternative biosynthetic precursors. Moreover, studies on E. coli genepathways such as the MG pathway (r42) or the glyoxylate knockout mutants decient in catabolic enzymes indicate shunt (r27 and r28) arenot predicted to function in glucosea rather robust and exible metabolic network, where limited cultures under steady-state conditions. The MG pathways can substitute for each other, sometimes without pathway is most likely only activated under conditions signican tly affecting growth rates (e.g. Zhao et al., 2004) of glucose excess (see accompanying paper; Weber et al., The feasibility of using the detailed stoichiometric mode 2005) and the glyoxylate shunt may not function in E. coli for prediction of reliable ux distributions was further K-12 strains, as has been shown experimentally ( 13C validated by proving its ability to predict the measured labelling) for the E. coli K-12 strain JM109 (Noronha respiratory rates; the relative deviation for r O2 and r CO2 et al., 2000; Phue & Shiloach, 2004), a close relative of the was less than 10% (Table 4). E. coli K-12 strain TG1 (Sambrook et al., 1989) employed in this study. Conclusions The uxes through the TCA cycle (r18) and PP pathway (r36) are shown in Fig. 6 as functions of the dilution rate. Glucose is used as a cell-mass precursor and energy source The PP pathway ux (r36) increases from 39% mol mol 2 1 Thus, two types of limitations can occur: cell-carbon or to 73 % mol mol 2 1 with increasing dilution rate, showing energy-carbon limitation. Our data reveal a shift from cellthe most prominent increase above a dilution rate of carbon limitation at low dilution rates to energy-carbon 0? 3 h2 1. The TCA cycle ux (r18) behaves inversely and limitation at high dilution rates. This shift is accompanied

Table 4. Specic rates of carbon dioxide evolution and oxygen uptake determined from experimental data (Table 2) and predicted according to the detailed stoichiometric model and the relative deviation for glucose-limited continuous culture at dilution rates D= 0? 066 h 1 and 0? 375 h 1
Rate (g g 1 h 1) D= 0? 066 h 1 From Model experimental data prediction 0? 087 0? 057 0? 084 0? 056 % Wrong estimate* 0? 831 0? 600 D= 0? 375 h 1 From Model experimental data prediction 0? 332 0? 242 0? 327 0? 209 %

r CO2 r O2

3? 4 1? 8

1? 5 13? 6

*The wrong estimate serves as a control for the response of the network. These values were calculated assuming a glucose uptake rate corresponding to D= 0? 375 h2 1.

Conclusiones La glucosa se utiliza como un precursor de clula - masa y la fuente de energa . Por lo tanto , se pueden producir dos tipos de limitaciones: limitacin de las clulas de carbono o la energa de carbono . Nuestros datos revelan un cambio de la limitacin de clulas de carbono en tasas bajas de dilucin a la limitacin de energa de carbono a altas tasas de dilucin . Este cambio se acompaa de un estado energtico alterado . A altas tasas de dilucin , se observ una tasa de

700

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disminucin de la produccin especfica de ATP y una gota de la AEC . Por otra parte , este cambio va acompaado de un aumento del flujo a travs de la va de PP en el costo del flujo del ciclo del TCA . El aumento de las limitaciones en el ciclo del TCA o en la cadena respiratoria con el aumento de las tasas de crecimiento concomitantes con un PP va ms flexible puede causar el cambio de clula - carbono a la limitacin de energa de carbono a altas tasas de dilucin , lo que resulta en una conversin ms eficiente energticamente - sin de carbono glucosa en biomasa. A muy altas tasas de crecimiento cercanas al punto de lavado de salida , la limitacin de energa se vuelve ms grave , conduciendo a la formacin de etilo como una ruta alternativa para la generacin de energa a travs de fosforilacin a nivel de sustrato . La generacin de energa a travs de la formacin de etilo se obtiene menos ATP en comparacin con la oxidacin completa del sustrato de carbono de azcar , sin embargo , esta ruta para la generacin de energa parece ser el resultado de la generacin de energa maximizado en condiciones de restricciones en el ciclo de TCA o del volumen de negocios NADH respiratoria . Aunque un mecanismo detallado de la formacin de etilo en cultivos aerbicos sigue siendo desconocido , diferentes hiptesis se han sugerido para su formacin por E. coli en condiciones ' de carbono - desbordamiento ' . Todos acetato atributo for-macin ya sea a las limitaciones de la facturacin NADH respiratoria y la generacin de ATP concomitante travs de la fosforilacin oxidativa ( Andersen & von Meyenburg , 1980 ; Doelle et al, 1982 ; . Reiling et al, 1985 ; . Varma y Palsson , 1994 ) o a las limitaciones iniciales en el ciclo TCA ( Majewski y Domach , 1990 ; . Han et al , 1992 ) . Por otra parte , Han et al . ( 1992 ) concluyeron que estas limitaciones causan una reorganizacin - cin de la distribucin de flujo catablico para satisfacer las demandas anablicos a altas tasas de crecimiento mediante la generacin de la cantidad necesaria de energa mediante el uso tanto en el metabolismo oxidativo y la formacin de cido actico . Se observ Tal reorganizacin del metabolismo en E. coli TG1 con el aumento de las tasas de dilucin . Durante el cambio de clula - a la energa de carbono - carbono condiciones limitantes , los requisitos anablicos se cumplen por primera vez por una manera ms eficiente y menos consumo de energa de formacin de la biomasa por la actividad del ciclo TCA reducida y el aumento de PP va de flujo , y , en incluso un mayor crecimiento las tasas , por la activacin de una va alternativa , pero menos eficiente para la generacin de energa a travs de fosforilacin a nivel de sustrato y la formacin concomitante de acetato .