Professional Documents
Culture Documents
aa. 2008-2009
alberts
orario
Martedi: 8.30 -10.30 Mercoledi: 10.30 -12.30 Venerdi: 8.30 -10.30 U3-04 U3-01 U3-05
Programma: *come si studia un gene: come si definisce la struttura di un gene come si studiano le sequenze regolative di un gene che cosa un gene??? come si studia la funzione di un gene
* micro RNA: struttura e funzione * elementi trasponibili: struttura e funzione
*mutazione e riparazione del DNA: principi di base * retrovirus *genetica dei tumori *genetica dello sviluppo in drosophila *genetica delle immunoglobuline
Come si isola un gene e se ne definisce la struttura? (librerie, clonaggio) Come si puo studiarne lespressione (cellule, sviluppo)? regolative) Come si puo studiarne la funzione? (studio seq.
Overespressione / silenziamento
collezione di cloni contenenti almeno una copia di ogni sequenza contenuta nel genoma di un dato organismo - singoli cromosomi di un organismo, linea cellulare.. 1) generazione frammenti di DNA -digestione enzimatica totale o parziale -rottura meccanica (sonicazione) 2) loro clonaggio in vettori appropriati (plasmidi, fagi, cosmidi, yac) 3) amplificazione in organismi ospiti (batteri, lieviti) 4) identificazione dellinserto di interesse (screening della libreria) 5) caratterizzazione dellinserto 6) ricostruzione della struttura del gene 7) studio funzionale
TIPI DI LIBRERIA Libreria genomica: tutto il DNA (seq. codificanti, non codificanti, promotori, introni, seq intergeniche). Libreria cDNA: sequenze codificanti (si parte dallmRNA) Dato che tipi cellulari diversi esprimono geni diversi, la composizione della libreria di cDNA riflette la diversa abbondanza dei trascritti nei tessuti di partenza
Banche da tessuti diversi e/o a stadi di sviluppo diversi contengono cloni diversi e/o in proporzioni diverse
Banche di cDNA:
-clonaggio -espressione
LIBRERIE GENOMICHE
3 metodi di preparazione: 1. Digestione completa (tutti i siti di restrizione per un dato enzima)
*Produce un gran numero di piccoli frammenti diDNA. *Geni contenenti due o pi siti di restrizione per lenzima utilizzato possono essere spezzati e clonati in due o pi pezzi Si usano enzimi che riconoscono siti poco frequenti nel genoma 2 Digestione parziale *Si usano enzimi che tagliano poco frequentementee si riduce il tempo di digestione insieme di lunghi frammenti sovrapponibili 3 Rottura meccanica *Si possono produrre frammenti di DNA pi lunghi *Le estremit non sono uniformi, e occorre una modificazione enzimatica per poter inserire i frammenti generati in un vettore di clonaggio
-Tagliare DNA per ottenere frammenti della misura desiderata -con enzimi di restrizione -rottura fisica
-Inserire i pezzi di DNA in un vettore di clonaggio (che ne permette la replicazione in un organismo ospite (ex. Batteri)
Enzimi di restrizione: endonucleasi batteriche che riconoscono specifiche sequenze chiamate siti di restrizione e tagliano il DNA idrolizzando il legame fosfodiesterico. La nomencaltura tipicamente inizia con 3 lettere corsive tratte dal nome del batterio. EcoRI HindIII BamHI E. coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Bacillus amyloliquefaciens H
Molti siti di restrizione sono palindromi di 4-, 6-, o 8-coppie di basi. Maggiore la lunghezza del sito riconosciuto dallenzima di restrizione, minore la probabilit di trovare nel genoma siti riconosciuti da quellenzima
Estremit di DNA ottenute dal taglio possono essere riligate (se compatibili) utilizzando lenzima DNA Ligasi molecola di DNA ricombinante
Vettori di Clonaggio
molecole piccole e di sequenza nota replicazione indipendente dalla cellula ospite (p.es. resistenza a antibiotici)
marcatori che permettano il riconoscimento della cellula trasformata presenti in pi copie per cellula: * alto numero di copie
-Plasmidi -Fago -Cosmidi -Yeast artificial chromosomes (YACs) -Bacterial artificial chromosomes (BACs)
Vettori PLASMIDICI
trasformazione in batteri
ORIGINE DI REPLICAZIONE per moltiplicazione nei batteri
SELEZIONE COLORE: - se non c inserto, il gene intatto LacZ in grado di metabolizzare Un substrato COLONIE BLU -Se c INSERTO, il gene LacZ interrotto colonie bianche
senza inserto
Fago lambda
virus batteriofago che puo dare : -ciclo litico (infezione e lisi della cellula batterica con rilascio di nuove particelle fagiche) -ciclo lisogenico (integrazione nel genoma del fago nel DNA della cellula ospite)
I geni che controllano il ciclo lisogenico possono essere rimossi (non essenziali) e sostituiti con linserto di interesse
15kb circa
ciclo lisogenico
ciclo litico
Estremit laterali: sequenze COS riconosciute dal sistema di impaccamento nel capside
placche di lisi
Inserti molto maggiori o inferiori di 15kb non si clonano perch il sistema di impaccamento nel capside riconosce solo molecole lunghe piu o meno come il DNA di lambda wt
Cosmidi
1. 2. 3. 4. 5. Caratteristiche congiunte di plasmidi e fagi Non presente in natura Sequenza origine (ori) per E. coli. Marcatore selezionabile, e.g. ampR. Siti di restrizione per clonggio.
6.
Siti COS del fago per permettere limpacchettamento nei capsidi fagici di e quindi linfezione di E. coli
caratteristiche: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Telomeri di lievito alle estremit. Sequenza centromerica del lievito (cen) Marcatore selezionabile (dipendenza aminoacidica, URA, TRP,etc.) su entrambe le braccia. Sequenza di replicazione autonoma (ARS) Siti di restrizione (per il clonaggio del DNA). Trasformazione nel lievito e crescita in terreno selettivo
1. 2. 3. 4.
Sequenza origine (ori) derivata dal plasmide fattore F di E. coli Multipli siti di clonazione (siti di restrizione). Marcatori selezionabili Propagazione in batteri
Numero di cloni richiesti per avere una libreria rappresentativa di tutto il genoma umano a seconda dei vettori di clonaggio
Per avere il 99% di probabilit di avere tutto il genoma rappresentato: 820.000 cloni
una volta costruita la libreria genomica nel vettore scelto,come si fa a recuperare il clone (i cloni) corrispondenti al gene di interesse?
screening library
Ibridazione
Presuppone la conoscenza di una sequenza nella regione di interesse, che viene utilizzata come PROBE probe marcata radioattivamente o rilevabile per chemiluminescenza
II lezione
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
I vettori plasmidici contenenti il DNA genomico digerito sono trasformati in E. coli e piastrati in terreno selettivo (e.g., ampicillina). Le colonie cresciute sono replicate su una membrana (E. coli continua a crescere su membrana). I batteri sono lisati e il DNA denaturato Il DNA legato alla membrana poi ibridato con un DNA complementare (e.g., DNA marcato con 32P). Le sonde in eccesso non ibridate sono lavate via dal filtro. Libridazione delle sonde rilevata attraverso esposizione su pellicola autoradiografica (o attraverso rilevazione per chemioluminescenza). I cloni positivi vengono riamplificati dalla piasta copia per le analisi successive
LIBRERIE DI cDNA
Il cDNA derivato da mRNA, quindi la libreria di cDNA riflette lattivit genica al momento in cui sono isolati gli mRNA Varia: -da tessuto a tessuto -a secondo del momento nello sviluppo 1. 2. 3. Isolamento di mRNA Sintesi di cDNA Clonaggio di cDNA in vettori
Isolamento RNA
trascrittasi inversa
cassetta di espressione: *promotore: forte, inducibile *segnali terminazione Marcatore di selezione per cellule mammifero (resistenza ad antibiotici: neomicina, puromicina igromicina)
In aggiunta alle sequenze per il mantenimento/Propagazione in batteri in cui la libreria viene Mantenuta e amplificata
B)-screening immunologico per clonare geni da proteine note (purificate, e contro le quali sia disponibile un anticorpo)
Chromosome walking
Probe A
Probe a Probe b
ricostruzione regione
-Analisi di restrizione
Southern blot:
*Sul DNA cellulare *Sul DNA dei cloni
ritaglio clono
Cicli ripetuti di: Denaturazione del DNA a 94C. Annealing dei primers alle sequenze complementari fiancheggianti la regione bersaglio. Estensione dei primers a 72C utilizzando una DNA polimerasi resistente al calore Taq polimerasi ( derivata da Thermus aquaticus).
SEQUENZIAMENTO INSERTI Il sequenziamento automatico utilizza didesossiNTPs (incorporati, non permettono lallungamento della catena) marcati con coloranti fluorescenti. Combina 4 ddNTPs colorati in una provetta di reazione e lelettroforesi avviene in una corsia unica, o in un capillare contenente poliacrilamide. Laser UV individua i coloranti e legge la sequenza.
1. Mappatura e sequenza: divisione del genoma in segmenti, raffinamento della mappa, e sequenziamento.
Shotgun e sequenza: rottura casuale del genoma in frammenti sovrapponibili sequenza e riassemblaggio al computer Rottura meccanica dei cloni BAC in frammento sovrapponibili di ~2 kb . Isolati in agarosio, purificati, e clonati in vettori plasmidici standard. Sequenziati ~500 bp da ciascun lato dellinserto di 2 kb Si ripete il processo fino a sequenziare 6.5-8.0 volte la lunghezza totale del genoma Si assemblano centinaia di migliaia di sequenze sovrapposte di ~500 bp con computers che lavorano in parallelo.
32,000 geni stimati (erano stati previsti 50,000-100,000). Solo 50% in pi rispetto a C. elegans (nematode). Solo 1-1.5% del genoma codifica proteine. 50% costituito da DNA ripetitivo. >95% del genoma in comune con lo scimpanz
19.000 pseudogenes
ANIMAZIONE
http://www.genome.gov/25019879
PUB MED
ATACAGAGTTTAAGTATATAATATAGACTTTAAAATTTCATGGATATATTCCATATCGAAATGTTCAATGATAGAAAAT ATAAGGAAAAGATATTTGGTAGCCAAAAGACAGATTAATTTAGGACATGAAATCTTCTGTCTTTAGGAAATATGCTTTAT TTTCATAGGCTTTTTCTGTTCCAATAATTGAGCCATTAATGTCAACAGAGACTCCCTGGCAGTGATATAGTATGAAGGCAT TTGCAGTAATGCAGTGGCACTTCTTTCTAAATCAGAGACTCTGTTGAAGTAATCACTAAAAATATTAAAATTCTGTTCTA GTTGTTCTGAATTTATAATGTGAAAGTGACTGCACCCATCTTTCAAGAACATAAAGAGCATCCATAATTTAATAATTAAG TAACACATAATAACCAATAATTTTTGTTACCTATAAATAGGCCTGTGTAACAAGAGTAAGGAATACTAAAAGAAGTAGCT GATTGTTAATAAAAACTTTTTTTTCAGAATGTGCTCATTTAAAGCATTTTATAACCTTTATTAAATTGCCATCTTACTAT GCAATTAGAATGCATTGTCATTTTTCTTTCTTTAAAACATTTGCACTTTATCCTTTTCTAAGCTGGTAGAAGTTGGACTCT CACTGCGTTTCTTTTGCTTTTTAAACTTGTATTGGAGTGATGTAGAACTAGGCCTTATCACTGCATAGAAAATTAATTTAA ATGACATATTGTTGCAGTTTCTATGACAACCATATCATGATGCTCATGTTCTTAAAAATTTATAAACTATAATCTGAAGT ATGCTAATTCTAGTGAGTGTAGGCAACAGTCATTTGCTTAATATTCATTTTGCTACTGCGCTCATCAGCTTTGAGAGTCAG ATGGTTAACATTCTGCATTCAATCCGAAGAGGTTTATATGAACTCTTGGGTTTATGCATTTTCCTCAGAAGCTACAGTTAC TGAACTTTTAAGCATGTATAAGAGAACCTTTCGCTGCCTGTTTTCTTGAAGCAATAGGAATGAATACGGGCGTGAACACAT GCTGCTGACTTTCAACATGGCTGCTTTTCTCTCCACCCCTACTGGAAAGACAATATCCTCAAACTAATGTAAAAAAAAAAC TAATAAAAACAAAAATTCAATAACATCCAATGATCTACTTAAGCAACAGTGACTATTCAAATCCTTGGGAACACTGGCTT ATTCCTTCAACTTTAGTTGTTTGAGTTCAAGAAGCTCATATCGCTATTGTATGGTTATGATGTATGATAATGACATGTATC ATCAGTTTAAGGATATTTGCCTAGCACTGATATTAAACATTTTGATTTGAAATACAGGTTGAATTTTTTTTAGGACTGAT TCAAAAATAAAATATGCTATTTAGTCTATGGCTTATAACCATGGACTCTCTTGTTAAATAAAGATGCTTTTAGATATACC ACTTGAAAAATTAGAAATGTATAATTAAAAAAATTTATTTTAGAAATGTATATAATTTGTTGGTTGATAAAAATTAGG TAATTTAATTTAAACAATATATAATGAATAAGATAATTTAACATCAGGTGGAATTATCAAACACCATTTTTGCTAATAT ATTTTATAAAAGTCATTTTTAATTCGTGTTCATTGAATTATAAAAATGCAAAACATAAATCCTTGGTTAACATGCTTTTA ATTATTTTCTTTTCACATGTTAGGCTCTCGGTGAATGCAACAGAAATCCTATACTTAGACATTTTAAAAAGCAATCTGTAG TTTCAAAAGAGAGATTGTTAAGAAACACATTTTAAAATTATAGGACACCAAATTCAGTTTTAAAAACACAATGCATAAA ACATAAAATTCTAAAGCAACTAATCAAACTTCTGAAGAAGGACAATGTCAGTAAGCTGCTTTGCTGGCAGCAACTGGTGA GCGGACCCTTGTCTGTCTTTTATGAGGCAATTACAACAGGTGTCATATTGATTTGCCTACTGTTTCCTGTGTAGCTCGAGTG TATCCTAAATGGAATGACAGTCATCGTAGCGAGTGGTAAACTTCTGGTCTGGAAGGAAGGTTTAGTCAGTCAGTCAGCACC TATGAGGCAGTGTGACAGTGGGCCACGGTGCAAAGGCAACTCAGTATCACACTCACTGAGAGGGGGTACTGGGGAGTTTTA GTGAGGGAGTTTACTGCTGTGTTTGAAACATAACTTTTCATTGTATCCCCCCACCCTGTGTGTTAAATTTGTAAATTGTCC AGATCACTTTTATTTTGGTTAAAAAAAACCCCAAATTCCATATAGGCTTTTCAAAGGAGCATTTGGATGTGTGATAAGCC TTTCTATTTCCTGTGACTGTTTGCCTGGCATTAGCTTCAGTGGCATCCAGTGGTAAAGCAGCTGTAATCCTGACTTGTTCTT TCATGGAGCAGTTCAAACAGGTTAGCTTGATGATTTTAAAGCACGGTTGGTTTATATGGGGCTTGGAGCGGTGGTAGGGGT TACAGTGGTTTCCAACCAGATCCTTGTATTTTTGATGGCGTAATTTCATTACATTTTCCTATTTATTTTCTATTTATAGTA ATGTGAAGTATGCCCATTGAATAATGTCAGCTTAATATTGCAAGGATTTTTGTTTAAAAATTATGGAATTGGTCTCTACA CATTCAATGTATTTTCCAGTTCTTTGATATTTCTACCTAAGCTTGGTTTCTGCCAGTTATGTTGGCTCTAGTGTTTGCCCGT CTCATTTAAGATAAAATGAATGGCCAGTATTATGTATAGTAAAGCCAAGCTTCCTTTGAGTTAAGGCTTTGGAGCATTGT GCAAGCCTAATGTTCTTCCATGAAGTTGGCCCACCCCACTGTGACTAAGAAATGAGATGATTTGAGGGCTATTACATACTT ACGATTTTCATAGTGGATTAGAATAACATTACTTAG
???
Bioinformatica genetica + matematica/computer Applicazioni: 1. Identifica geni entro la sequenza completa del DNA.
2. Allinea e confronta sequenze geniche in un database per determinare la funzione. 3. Predice struttura e funzioni dei prodotti genici. 4. Descrive interazioni tra geni e prodotti genici. 5. Stima relazioni filogenetiche e di popolazioni
PROCARIOTI Ricerca open reading frames (ORFs) piu lunghe possibili allinterno della sequenza. ORF = sequenza potenzialmente codificante che inizia con un codone di start (ATG) e finisce con un codone di terminazione. 6 possibili frames, 3 per ogni strand Efficace per procarioti: NON ci sono introni
EUCARIOTImolto piu complesso per eucarioti: ci sono introni! ANALISI INFORMATICA -Conservazione in SPECIE DIVERSE -Algoritmi di ricerca segnali specifici: - segnali di splicing, giunzioni esoni/introni - isole CpG (promotori e 5 geni) -promoter prediction (tata box, CCAAT, CACC) -segnali terminazione ANALISI SPERIMENTALE -Ibridazione con RNA: NORTHERN BLOT -Conservazione in SPECIE DIVERSE: ZOOBLOT (le sequenze codificanti sono preferenzialmente conservate)
per poter ricostruire la struttura ESONI - INTRONI di un gene, il sito di inizio e fine della trascizione devo ricorrere all mRNA e confrontarlo con la struttura del DNA
GENOMA
OK!
struttura
evoluzione
regolazione
funzione
utilizzo
identificazione sequenze regolative sulla base della loro conservazione in specie diverse
http://genome.ucsc.edu VISTA ENHANCER BROWSER The goal of this project is to identify distant-acting transcriptional enhancers in the human genome by coupling the identification of evolutionary conserved noncoding sequences with a moderate throughput mouse transgenesis enhancer assay.
utr
esoni
http://enhancer.lbl.gov/
enhancer
Promotore
reporter LacZ
http://enhancer.lbl.gov/
location
gene
expression
APG4C-FOXD3
esprimono
http://www.biobase-international.com/pages/guided_tours/transfac
le regioni regolative sono piu accessibili al taglio da parte dellenzima DNAsiI (o altre nucleasi)
*identificazione regioni regolative *identificazioni regioni regolative tessuto specifiche: legate da fattori trascrizionali aperte solo nei tipi cellulari dove il gene espresso
accessibile
Outline of chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. Protein:DNA crosslinks are formed with formaldehyde followed by chromatin fragmentation by sonication. The DNA:protein complexes are immunoprecipitated with antibodies specific for the protein of interest and Protein A agarose beads. The crosslinks are reversed and the DNA is isolated for analysis.
*Ibridazione su vetrini con probes per migliaia di sequenze (ChIP on Chips) *clonaggio e sequenziamento frammenti recuperati
TF
Attivit reporter
Vettore di espressione
EFFETTO MUTAZIONI
regolazione OK!
funzione
utilizzo
IV lezione
regolazione OK!
funzione
utilizzo
Blocco traduzione
Degradazione RNA
DICER L'enzima appartiene alla famiglia delle RNasi di classe III (specifiche per i dsRNAs). Contiene una regione carica positivamente che lega i dsRNA e li taglia in modo ATP dipendente
lRNA ss viene legato dal complesso RISC e si appaia allmRNA complementare lmRNA viene *degradato * ne viene bloccata la traduzione
Elbashir, S. M. et al.
RNAi specifico
RNAi specifico RNai controllo -aspecifico(anticorpo contro lamina A/C rilevabile in fluorescenza)
Immunostaining
(gel separazione proteine-trasferimento su filtro proteineibridazione con anticorpo specifico contro Lamina A/C rilevabile in chemioluminescanza)
western blot
Scomparsa proteina
RNAi aspecifico
promotori RNA pol.III sintesi di short hairpin RNA (shRNA) e siRNA in vivo
VETTORI PLASMIDICI VETTORI RETROVIRALI MoMuLV or MSCV silenziamento del provirus durante lo sviluppo le cellule devono essere nel ciclo cellulare per poter essere infettate VETTORI LENTIVIRALI HIV-1 nessun silenziamento: Topi transgenici infettano cellule quiescenti (cellule staminali.)
Silenziamento specifico del mutante ras che induce tumore (con RNAi in vettore retrovirale)
fenotipo
gene silenziato
endogeno cellulare
miR (micro RNA): * codificati dal genoma * derivano da intermedi a doppio filamento che vengono poi processati * ruolo fondamentale nella regolazione genica: alcuni sono evolutivamente conservati alcuni sono tessuto-sviluppo specifici
microRNA: prodotti quasi esclusivamente per via endogena, tipici regno animale. Ruolo
di regolazione genica, rappresentano circa 1-2% RNA totale e regolano circa 30% dei geni
miRNA
la scomparsa della Proteina LIN14 segna la transizione fra le fasi di sviluppo larvale L1 e L2
959 cellule
2 loci identificati geneticamente come importanti per il controllo dello sviluppo larvale *LIN4 reprime LIN 14, che codifica per una proteina nucleare *LIN 4 non codifica per una proteina ma solo per un RNA complementare al 3UTR di LIN14
*LIN4 codifica per un RNA di 63nt *poi processato 22 mer *22mer si appaia con RNA di LIN14
NO proteina LIN14
Transizione fra fasi larvali successive L1 e L2 determinato dalla scomparsa della Proteina lin14: lin14 serve per specificare la fase L1, deve poi essere eliminata per passare a L2
Levels
lin-14 protein
lin-4 micRNA
Stadi dello sviluppo larvale di C.Elegans
L1
L2
L3
L4
perdita funzione LIN 14: ridotta L1: sviluppo precoce di una larva tardiva con poche cellule acquisto funzione (troppo) LIN14: L1 estesa: non c passaggio alla fase tardiva precoce tardiva
Levels
lin-14 protein
L1
L2
lin-4 micRNA
L3
L4
NB: un singolo miR puo regolare contemporaneamente piu geni (nellesempio, LIN4 reprime LIN14 e LIN28)
*Lin4 reprime lin 14 e lin 28 Progressione late stages *Let7 reprime lin41 Progressione adult stage
LIN-14 and LIN-28 expression levels are decreased by lin-4 RNA expression at the end of the first larval stage to allow progression to late larval stages. In late larval stages, the expression of LIN-41 and other genes may be similarly downregulated by the let-7 RNA, relieving their repression of LIN-29 protein expression and allowing progression to the adult stage. Because the lin-29 mRNA does not contain sites complementary to the let-7 RNA, lin-29 is not likely to be a direct target of let-7.
PASSO SUCCESSIVO:
*nematodi *insetti *piante *mammiferi Ricerca: OMOLOGIA per identificare nuovi miR e miR target in organismi diversi
miRNAs sono coinvolti in numerosi processi cellulari, inclusi sviluppo, differenziamento, proliferazione, apoptosi e risposta a stress ambientali.
ESEMPIO: il genoma di topo codifica per 11 membri della famiglia di LET-7 (OMOLOGIA) DOVE SONO ESPRESSI?
Mansfield et al. Nature Genetics, 2004
MicroRNA-responsive 'sensor' transgenes uncover Hox-like and other developmentally regulated patterns of vertebrate microRNA expression
sequenze target gal on gal off miR blu bianco
a: gene reporter LacZ (sotto il controllo di un promotore ubiquitario) contenente una sequenza target del miR di interesse nel 3UTR. Dove il miR non espresso colore blu. b: nelle cellule in cui espresso il miR complementare alla sequenza target, lmRNA di LacZ viene degradato non ho colore blu
Geni HOX: Molto conservati evolutivamente Fondamentali per *lo sviluppo assi corporei *definizione identit cellulare
precursore linfoide
precursore mieloide
NF1A deve essere spento perch ci sia differenziamento mieloide (sia granulocitario, sia momo/macrofagico)
*miR specifici contribuiscono al mantenimento dello stato indifferenziato della cellula staminale *Altri sono espressi in modo differenziale in cells diverse e la loro overespressione spinge la cellula a destini differenziativi diversi C. elegans: formazione di tipi cellulari neuronali diversi, ASEL e ASER
The vertebrate HOX b cluster includes miR-10a and miR-196a genes. miR-196a reprime Hoxb8
attiva E2F (progressione ciclo cellulare) attiva miR che reprime traduzione E2F controllo fine
miR
myc
E2F
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2005.06.036
E2FmRNA
Elementi Genetici Trasponibili (TGE): elementi genetici che hanno la capacit di cambiare posizione nel genoma attraverso meccanismi molecolari diversi
causano mutazioni genetiche complesse e danno un importante contributo allevoluzione del genoma (altra fonte di variabilit genetica oltre mutazione e ricombinazione) *Mutazioni geniche (Inserimenti nei geni), mutazioni cromosomiche (riarrangiamenti, traslocazioni) * modifiche nellespressione genica (Inserimenti nelle sequenze regolatorie). * concorrono alla struttura di geni codificanti (4% geni umani contengono seq. relate a trasposoni) significato evolutivo Sono presenti nei genomi sia di PROCARIOTI dove si possono spostare dal/al cromosoma cellulare, plasmide, cromosoma fagico. EUCARIOTI (20% genoma in Drosophila, 10-20% nelluomo) dove si possono spostare dallo/allo stesso cromosoma o a un cromosoma diverso.
TRASPOSONI
IDENTIFICAZIONE:
*Evidenze indirette: *TASSI DI MUTAZIONE MOLTO ELEVATI
Instabilit genetica del mais (McClintock) Disgenesi degli ibridi in Drosophila *Evidenze dirette: instabilit riconducibile a sequenze di DNA che si spostano nel genoma *Criteri molecolari: *duplicazioni di sequenze caratteristiche 4 -15------------------4 -15 *presenti in punti diversi del genoma *presenti in punti diversi in individui diversi
ELEMENTI TRASPONIBILI NEI PROCARIOTI 2 esempi: 1. Elementi Sequenze di Inserzione (IS). Il pi semplice tipo di elementi trasponibili, in cromosomi batterici e plasmidi.
2.
Transposoni (Tn). Simili a elementi IS ma di maggiore lunghezza, pi complessi strutturalmente e portano geni aggiuntivi.
per esempio geni di resistenza ad antibiotici, che attraverso plasmidi possono essere trasferiti da una specie allaltra
Ai margini di tutti gli elementi IS conosciuti ci sono ripetizioni terminali invertite di 2040bp (ITRs).
*Interrompere una sequenza o una regione regolatoria. *Alterare lespressione dei geni vicini. *Causare delezioni o inversioni nel DNA adiacente. *Provocare ricombinazioni ( ex. cromosomi/plasmidi) *Conferire nuove caratteristiche (ex. resistenza ad antibiotici)
Mc Clintock
Il carattere del colore della pannocchia instabile. Se avviene reversione in una cellula, questa produrr pigmento viola e conseguentemente una macchia. Prima avviene la reversione nello sviluppo e pi grande sar la macchia. McClintock concluse che lallele c dovuto ad un transposone non autonomo chiamato Ds inserito nel gene C gene (Ds = disassociazione). transposone autonomoAc controlla il trasposone Ds (Ac = attivatore).
Pigmento (C=color)
quando AC (activator) promuove la transposizione di Ds fuori da C recupero colore nella progenie della cellula in cui avvenuta lexcisione
NB: Se, attraverso una serie di incroci viene perso AC, il carattere C si stabilizza
L elemento Ac autonomo, mentre l elemento Ds non autonomo (defettivo). Ac 4,563 bp con 11 bp ITRs e 1 unit di trascrizione codificante una transposasi di 807 aminoacidi. Ac attiva Ds; Ds varia in lunghezza e in sequenza, ma ha gli stessi ITRs di Ac.
Molti elementi Ds sono versioni delete o riarrangiate di Ac: Ds derivano da Ac. Ac/Ds transpongono solo durante la replicazione del cromosoma
movie!
march 2009
..speciazione disgenesi: dovuta a elemento trasponobile P che si inserisce nei geni disattivandoli: -alto tasso di mutazione e reversione a carico di singoli geni disgenesi -alto tasso riarrangiamenti cromosomici e aberrazioni cromosomiche
*perch la disgenesi si manifesta solo nellincrocio femmina M x maschi P e non nel reciproco?
Elemento P: transposone, porta: * gene transposasi, che permette trasposizione (espresso nelle cellule germinali) *repressore trasposasi, che previene trasposizione (espresso nelle cellule somatiche)
Nelluovo non c repressore: trasposizione e disgenesi La presenza nel citoplasma della CELLULA UOVO del repressore inibisce la trasposizione
lelemento P si comporta da parassita: * SI MUOVE SOLO IN GERM LINE (minimizza i danni per lospite, costituito dalla linea P)
www.mun.ca/biology/scarr/P_element
STOP
Elementi Genetici Trasponibili (TGE): elementi genetici che hanno la capacit di cambiare posizione nel genoma attraverso meccanismi molecolari diversi STRUTTURA MOLECOLARE, molto varia:
*DNA *altri simili a virus a RNA MA non fanno particelle non trasmessi orizzontalmente IDENTIFICAZIONE: *Evidenze indirette: *TASSI DI MUTAZIONE MOLTO ELEVATI
*Evidenze dirette: instabilit riconducibile a sequenze di DNA che si spostano nel genoma *Criteri molecolari: *duplicazioni di sequenze caratteristiche 4 -15------------------4 -15 *presenti in punti diversi del genoma *presenti in punti diversi in individui diversi
ELEMENTI TRASPONIBILI IN
EUCARIOTI
*lo spostamento puo essere * neutro per lospite * dannoso (aberrazioni cromosomiche/ Mut/riarr) * potenzialmente positivo: contribuiscono alla diversit genetica dellorganismo possono essere reclutati ex. come sequenze regolative nuove funzioni
Nature 2006
Trasposoni a DNA
miniature inverted-repeat TE
Trasposoni con intermedi a RNA: retro trasposoni: *elementi retrotrasponibili autonomi a RNA (LTRgag-pol) duplicazione *retrotrasposoni senza LTR (LINEs) (endonucleasi) *non coding retrotrasp (SINEs), derivanti da geni per tRNA, 5S e 7SL
sfruttano per la trasposizioni enzimi dei retrotrasposoni autonomi
DNA
RNA
trascrittasi inversa
DNA DNA
http://nitro.biosci.arizona.edu/courses/EEB600A-2003/lectures/lecture26/lecture26.html
Non-LTR retrotransposons
Alu1 SINEs (short-interspersed sequences) ~300 bp, ripetuti 300,000-500,000 volte Fiancheggiati da 7-20 bp di ripetizioni dirette. inserzioni AluI SINEs possono essere causa di malattia >proteina non funzionale. L-1 LINEs (long-interspersed sequences) Elementi 6.5 kb, (~5% del genoma). L1 lunico elemento LINE attivo nelluomo Contengono ORFs con omologia alla trascriptasi inversa; non hanno LTRs. Alcuni casi di emofilia (OMIM-306700) sono il risultato di nuove inserzioni di L1.
conseguenze
mutazioni loss of function gain of function
nuove funzioni
sequenze codificanti sequenze regolative rimodellamento cromatina e struttura cromosomi (centromeri, telomeri) DOMESTICATION
Haemophilia B due to a de novo insertion of a human-specific Alu subfamily member within the coding region of the factor IX gene.
conseguenze
mutazioni loss of function gain of function
nuove funzioni
sequenze codificanti sequenze regolative rimodellamento cromatina e struttura cromosomi (centromeri, telomeri) DOMESTICATION
promoter disruption
rag1/rag2
catalizzano i riarrangiamenti somatici Ricombinazione VDJ che permettono la formazione degli anticorpi. Agiscono tagliando specifiche sequenze di DNA (RSS) che fiancheggiano gli elementi V, D,J.
http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pbio.0030181
elementi dinamici
lineage specific activity & extinction: alcuni genomi ne hanno piu di altri genomi diversi ne hanno di tipo e variet diversi dovuto a diverso successo nellespansione/estinzione
lineage specific introduction: in specie diverse attraverso infezione e trasferimento orizzontale (elementi retrovirali derivanti da retrovirus) lineage specific formation: ex SINE da geni per tRNA (seq. Alu nelluomo)
uso retrovirus endogeni come marcatori genetici retrotype ricostruzione storia evolutiva
-sequenze retrovirali integrate (provirus) possono modificare la cellula ospite (se lintegrazione avviene a carico di cellule germinali la modificazione puo trasmettersi alla progenie) -sequenze cellulari (ospite) possono ricombinare con le sequenze virali ed essere trasposte insieme al retrovirus riarrangiamenti -sequenze cellulari trasportate dal retrovirus possono cambiare le proprieta della cellula infettata virus oncogeni
*2 copie di un genoma costituito da 7-10 kb di ssRNA *Nucleo virale proteico *Involucro glicolipidico (glicoproteine che mediano il riconoscimento della cellula ospite)
1 RNA convertito in DNA dallenzima virale trascrittasi inversa, che si trova nella particella virale e manca di attivit esonucleasica 3 - 5 (no proofreading molte mutazioni). trascrittasi inversa: VIRALE 2 il DNA si integra nel genoma dellospite ed trascritto. trascrizione ad opera della pol.II dellospite 3 RNA: * tradotto a dare proteine virali * impaccato nel capside (informazione genetica del virus)
RU5---------------U3R
genomic RNA
IRS: inverted repeat sequences LTR: long terminal repeats, segnali di regolazione. Forti enhancer, in grado di attivare la trascrizione di geni cellulari adiacenti allinserzione. NB: le sequenze promotrici sono al 3 sullRNA, al 5 nel DNA alterazione espressione geni cellulari adiacenti lintegrazione
Geni retrovirali:
gag (group antigen): codifica il nucleo proteico pol (polymerase): codifica la trascrittasi inversa per l enzima per lintegrazione provirale. env (envelope): codifica linvolucro glicoproteico.
i 3 geni sono processati a dare piu proteine attraverso diversi meccanismi molecolari: -reading frames diversi -splicing alternativi -tagli proteolitici delle proteine
lewin il geneVIII
vettori lentivirali: infettano anche cells quiescenti alti livelli di espressione no mutagenesi inserzionale
MUTAZIONE
cambiamento che altera la sequenza del DNA. La mutazione puo essere trasmessa alla progenie della cellula in cui si verifica. Mutazione in avanti Reversione
Mutato (Mut.)
Mutazioni
GENOMICHE: alterano il numero cromosomico CROMOSOMICHE: alterano la struttura dei singoli cromosomi GENICHE: alterano la funzione dei singoli geni
Mutazioni che interessano singole coppie di basi: mutazioni puntiformi AGeTC A T, G C, A C, G T Delezioni inserzioni coppie di basi
La conseguenza della mutazione negli organismi pluricellulari dipende da: -cellula in cui si verifica (somatica o germinale) -momento dell sviluppo in cui si verifica (precoce o tardivo) Progenie normale tessuto somatico tessuto germinale Progenie normale
Mutazioni Somatiche avvengono in cellule somatiche e coinvolgono solo lindividuo in cui avviene la mutazione Mutazioni Germinali alterano i gameti e passano alla generazione successiva.
3
La conseguenza della mutazione negli organismi pluricellulari dipende da -cellula in cui si verifica: -germinale -somatica
sviluppo
La mutazione un evento raro che si verifica con frequenze variabili da gene a gene e nei diversi organismi
tasso di mutazione = probabilit di un particolare tipo di mutazione per generazione per un certo gene frequenza della mutazione nella popolazione = numero di volte in cui una
Mutazione in avanti: ordine di grandezza: 10-6-10-9 Reversione: ordine di grandezza 10-9 10-12 Piu rara !!!
MUTAZIONI GENICHE
Mutazioni puntiformi:
1. Sostituzioni di coppie di basi. GT AG TC AT GC AC e 2. Delezioni e inserzioni di coppie di basi
A carico di: -sequenze codificanti: conseguenze su STRUTTURA DELLA PROTEINA -sequenze regolative: conseguenze su DOVE, QUANDO, QUANTO il gene espresso
6
STOP
mutazioni regolative
10
Pierce
*II mutazione in un sito diverso dalla mutazione originale e maschera o compensa la mutazione originale senza ripristinare il tipo selvatico. ex: inserzione vicina ripristina il frame di lettura perturbato da una delezione o viceversa
NOTA BENE: la reversione un fenomeno talmente raro che si evidenzia praticamente solo nei microrganismi elevati numeri di individui-
11
Reversione: la soppressione della mutazione puo avvenire grazie ad una seconda mutazione che avviene in un gene diverso originariamente mutato
Le 2 mutazioni si compensano
12
Elementi trasponibili
13
Appaiamento errato
1:4
14
15
Malattie da espansione di triplette nelluomo: un caso particolare di sequenza ripetute che costituiscono regioni di instabilit, la cui errata copiatura causa di malattia
16
POLIGLUTAMINE
*non sono note altri tipi di mutazione associate alla malattia *la sequenza espansa trascritta e tradotta *soglia critica di n di ripetizioni associata allinsorgenza malattia *maggiore il numero di ripetizioni, piu precoce linsorgenza della malattia *?? formazione di aggragati proteici
17
NB: la presenza di mutazioni anche in DNA di cellule che non replicano -ex cells nervose, muscolari- suggerisce che la mutazione possa essere causata anche da meccanismi che non coinvolgono la replicazione del DNA
18
MUTAGENI CHIMICI:
1) Analoghi di Basi Simili alle basi normali, incorporate nel DNA durante la replicazione, causano misappaiamenti (ex 5BrDu) e blocco della replicazione del DNA. - ex farmaci ANTITUMORALI
19
3) Agenti intercalanti:
sottili molecole idrofobiche che si inseriscono tra coppie di basi adiacenti (e.g., proflavina, bromuro di etidio). Causano inserzioni/delezioni durante la replicazione del DNA.
Nota Bene:
*La mutazione spontanea e indotta, una volta generate, sono indistinguibili, quello che cambia levento che le ha generate *La possibilit di indurre elevate frequenze di mutazione grazie alluso di mutageni un prezioso strumento di analisi genetica in quanto la frequenza di mutazione spontanea molto bassa
20
H. sapiens
Soprattutto negli eucarioti superiori (vita lunga, n divisioni cellulari altissimo) sono
21
-attivazione risposta
Griffiths, Zanichelli
-RIPARAZIONE PER EXCISIONE DI NUCLEOTIDI Eliminazione del DNA danneggiato e uso della sequenza complementare come stampo per la sintesi di nuovo DNA integro
23
La riparazione per excisione un meccanismo fondamentale di riparo anche nelluomo. Diverse malattie sono associate a malfunzionamento dei sistemi riparativi
24
Xp1
Xp2
Xp1
Xp3
fusione fibroblasti
fusione fibroblasti
UV
UV NON RIPARA
RIPARA
geni diversi
stesso gene
25
XPA
XPG
26
Xeroderma pigmentosum group A. XPA Xeroderma pigmentosum group B. XPB Xeroderma pigmentosum group C. XPC
Xeroderma pigmentosum group E. DDB2 Xeroderma pigmentosum group F. ERCC4 Xeroderma pigmentosum group G. RAD2 ERCC5
Legend: The nucleotide excision repair pathway involves several different disorders including xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy and at least eleven genes.
27
E Coli
La perdita/mutazione degli omologhi umani dei geni MutS, MutL, Muth coinvolta nellinsorgenza di una forma di tumore al colon
geni mutatori
28
SISTEMI ERROR-PRONE
SOS: Bypass della lesione che rimane e viene trasmessa alle cellule figlie eucarioti
DANNO
RIPARO
SISTEMA DI RIPARAZIONE
MORTE CELLULA
ACCUMULO
30
31
http://www.weizmann.ac.il/Livneh/JNCI/intro.html
TUMORI
32
TUMORE: malattia genetica dovuta allaccumulo in un clone cellulare di mutazioni in geni che presiedono al controllo del bilanciamento fra proliferazione e differenziamento cellulare e che controllano lintegrit dellinformazione genetica
-oncogeni -oncosoppressori -geni implicati nella riparazione del DNA (mutator genes)
-velocita di crescita -capacita di colonizzare tessuti adiacenti -trasporto nel circolo sanguigno -capacita di colonizzare tessuti diversi (metastasi)
carcinomi epiteli sarcomi fibroblasti, ossa, muscoli, vasi linfomi, mielomi sangue
Tumore: accumulo di mutazioni allinterno dello stesso clone cellulare che porta a proliferazione incontrollata
2 meccanismi concorrono allaccumulo di mutazioni nella stessa cellula:
*insorgenza di mutazioni che conferiscono vantaggio proliferativo *mutazioni che riducono la stabilit genetica genetic instability accumulo mutazioni
tumore in situ tumore che invade tessuti circostanti disseminazione in tessuti e organi distanti metastasi
Mutazione che conferisce vantaggio proliferativo Proliferazione clonale: clone amplificato= bersaglio per mutazioni successive
prove:
*Tumori femminili
Tutti i tessuti femminili sono mosaici per inattivazione di X Femmine eterozigoti G6PD (su X) hanno nei tessuti sani sia cellule sia cellule mentre i tumori sono o o
*traslocazioni
in alcuni linfomi
Segnali attivatori
Segnali inibitori
Proliferazione incontrollata
ATTIVAZIONE ONCOGENI:
Mutazioni acquisto di funzione dominanti
INATTIVAZIONE ONCOSOPPRESSORI:
Mutazioni con perdita di funzione recessive
TUMORE
quasi sempre.
*virus
*virus
a RNA:
virus a RNA
1919 Rous:virus del Sarcoma di pollo: prima dimostrazione che esistono GENI in grado di contribuire allinsorgenza di tumori
induce tumori in animali e trasforma cellule in coltura il genoma virale ha dimensioni ridotte identificazione gene responsabile induzione tumore: V-src (presente oltre a gag, pol env, costituisce differenza fra virus oncogeni e non)
1976:
Verma & Bishop: identificazione controparte cellulare: (per ibridazione con DNA genomico cellulare)
c-src
gene cellulare
genoma virale
l integrazione di un gene di origine cellulare porta alla perdita di geni virali Il virus non e piu in grado di trasdursi a meno che la stessa cellula non venga infettata da un virus wt che fornisce le funzioni mancanti (virus helper)
delezione-fusione
La maggior parte dei virus oncgeni sono defettivi: l integrazione di un gene di origine cellulare porta alla perdita di geni virali
Il virus non e piu in grado di trasdursi a meno che la stessa cellula non venga infettata da un virus wt che fornisce le funzioni mancanti (virus helper)
a) non trasformanti, hanno lunga latenza (per indurre tumore deve integrarsi in vicinanza
di protooncogeni cellulari, evento a bassa probabilita) (conferito dal v-onc)
b) virus defettivi, necessitano di un helper per riprodursi. Hanno potere trasformante c) si riproducono autonomamente e hanno potere trasformante (v-onc) ROUS
immortalizzazione trasformazione
in coltura
*crescono in assenza di segnali mitogeni (fattori di crescita) *non risentono inibizione da contatto (segnali inibitori da cells vicine) formazione di foci
in vivo
metastasi
ex v-src -retrovirus hanno genoma piccolo: facile identificazione v-onc: v-src -ibridazione con genoma cellula ospite identificazione c-onc: c-src -confronto v-onc vs. c-onc mutazioni oncogene mutazioni
Protooncogene: gene cellulare che normalmente regola la proliferazione cellulare. A seguito di mutazioni gain of function si trasforma in oncogene in grado di concorrere allo sviluppo del tumore
B) clonaggio e studi di geni adiacenti nel genoma di cellule tumorali ad LTR virali
non trasformanti, hanno lunga latenza (per indurre tumore deve integrarsi in vicinanza di protooncogeni cellulari, evento a bassa probabilita)
il DNA di cellule tumorali contiene geni in grado di trasformare cellule in coltura e di indurre tumori in topi nude
Approccio sperimentale:
sfrutta la presenza di sequenze ripetute Alu nel genoma umano, assenti nel topo ( marcano il DNA umano)
uso come probe per screening della libreria seq. Alu che permettono di recuperare DNA umano sequenza trasformante
prova: se il DNA isolato contiene l oncogene deve essere in grado di: * trasformare cellule sane se introdotto per transfezione *indurre tumori in topi nude.
ONCOGENI :
geni implicati nella trasmissione segnali mitogeni: -fattori di crescita -recettori per fattori di crescita -molecole trasduzione del segnale (chinasi associate alla membrana e citoplasmatiche) -fattori trascrizionali nucleari
v-scr ROUS
LTR
ex riarrangiamenti:
lo stesso gene ABL riarrangiato
ABL: codifica per una tirosina kinasi *nel virus defettivo leucemia murina di Abelson * a seguito di traslocazione in leucemie umane traslocazione 9:22 CROMOSOMA PHILADELPHIA
glivec
ex: overespressione
overespresso in *leucemia aviaria in cui finisce sotto il controllo dellLTR virale *leucemia umane traslocazione 8:14 linfoma Burkitt sotto il controllo enhancer Immunoglobuline (espresse solo in cells B)
NB: il primo esone di myc non tradotto, quindi entrambi i riarrangiamenti (in cui viene perso il primo esone) portano alla produzione di proteina myc normale MA a livelli costitutivi -indipendenti da stimoli mitogeni- ed elevati
ATG
ex1
ex2
ex3
deregolazione di myc
Reflecting on 25 years with MYC Natalie Meyer and Linda Z. Penn dec 2008
mad
MAX
MAX
myc
myc MAX
stimoli mitogeni
NB: myc mRNA e proteina sono fortemente instabili, per avere laccumulo necessario uno stimolo mitogeno sostenuto e persistente
leterodimero mad max reprime i target attivati da myc max equilibrio proliferazione/differenziamento
nella traslocazione 8:14 myc finisce sotto il controllo del locus Igg, che va incontro a ipermutazione somatica *myc oltre ad essere overespresso puo accumulare mutazioni *le diverse mutazioni myc determinano diverse caratteristiche della leucemia ex: minore latenza e maggiore penetranza
Igg
Myc WT
proliferazione p53
I evento
richiede 2 eventi
tumore perch myc insensibile al controllo da p53 Igg Myc MUT. I evento
basta 1 evento
Reflecting on 25 years with MYC Natalie Meyer and Linda Z. Penn nat. rev cancer 2008
proliferazione
costitutivamente attiva
ex mutazioni
GENI
-fattori di crescita -recettori per fattori di crescita -molecole trasduzione del segnale (chinasi associate alla membrana e citoplasmatiche) -fattori trascrizionali nucleari
MUTAZIONI
50
25
100
topi transgenici
oncogeni: forme attivate di geni cellulari che da soli o cooperando con altri geni inducono tumori implicazione: lattivazione del gene ha effetto dominante
MA
alcune evidenze suggeriscono che esistono elementi genetici nella cellula normale in grado di ripristinare funzione defettiva nella cellula tumorale fusione di cellula tumorale con cellula normale: *risponde a fattori di crescita *non da tumori in animali
WT
WT
se lintroduzione di un allele funzionante ripristina la funzione deduco che nella cellula tumorale entrambi gli alleli devono essere persi
ex.
II
40% casi: *famigliare *autosomico, DOMINANTE*, alta penetranza *bilaterale, con piu tumori indipendenti *insorgenza in et pediatrica *i pazienti sviluppano spesso osteosarcomi
Forma sporadica: sono necessari 2 eventi di mutazione nella stessa cellula a carico dei
2 alleli Rb bassa probabilit, evento raro (monolaterale, et adulta) Mut. WT II evento Mut. del. WT WT
+/+
I evento
+/-
-/-
Forma ereditaria: tutte le cellule ereditano gi un allele mutato (+/-) e quindi basta un
Mut. solo evento di mutazione che distrugga lallele Rb in una qualsiasi delle cellule della retina (bilaterale, et precoce) Mut. del. NB: la trasmissione della malattia DOMINANTE ma I evento a livello cellulare devo perdere i 2 alleli: RECESSIVO -/WT
-/+
CLONAGGIO DEL GENE RB COME SCHEMA GENERALE PER CLONAGGIO DI GENI ONCOSOPPRESSORI
*studi citologici per definire la regione minima di delezione comune in pazienti diversi regione in cui si trova loncosoppressore
gene oncosoppressore
T1 T2 T3 WT per Rb, 5-10% dei tumori ereditari hanno delezioni nella regione 13q14
perdita di eterozigosi, LoH: confronto fra tessuto sano e malato DELLO STESSO
ex: ho a disposizione un pannello di 4 marcatori (L1-L4) distribuiti sul cromosoma 13 che sono presenti allo stato eterozigote nellindividuo in esame
INDIVIDUO per la perdita di eterozigosi di loci polimorfici a posizione NOTA sul genoma
confronto
il gene oncosoppressore vicino ai loci L1 ed L2 (la perdita di un loro allele coincide con linsorgenza del tumore) conoscendo la posizione di L1 e L2 nel genoma risalgo alla posizione delloncosoppressore
delezione
I +/+ +/-
II -/-
*posso partire da un pannello di marcatori che coprono tutto il genoma *maggiore la densit di marcatori, piu preciso il mappaggio
PAZIENTI DIVERSI
marcatori possibili: *isoforme proteina (poche) *polimorfismi di restrizione *SNP: polimorfismi singolo nucleotide
in fase S
RB -/- cells
virus a DNA
cicline D ed E: controllo G1>S ciclina D: dipendente da mitogeni, agisce su Rb ciclina E: progressione irreversibile, svincolata da mitogeni
*Mutazioni in p53 sono implicate in ~50% dei tumori umani, tra cui: seno, cervello, fegato, polmoni, colon retto, vescica, e sangue *Lo sviluppo dei tumori richiede mutazione nei due alleli p53. *Codifica una proteina di 393 aa coinvolta nella trascrizione, nel controllo del ciclo cellulare, nella riparazione del DNA e nellapoptosi. *p53 interagisce con numerose altre proteine, agendo come controllo superiore del checkpoint
p53
forma ereditaria di perdita di un allele di p53 sindrome di Li-Fraumeni: insorgenza precoce vari tumori
Modello murino : topi p53-/- nascono ma sviluppano tumori 100% casi entro 10 mesi di et topi transgenici che overesprimono p53 invecchiamento precoce
p53 induce apoptosi *in modo diretto (attivando e reprimendo geni) *in modo indiretto
bax
bax
apoptosi
myc
oncogeni!!
myc
*le mutazioni che inattivano p53 nei tumori sono di varia natura *alcune hanno effetti specifici sulle funzioni diverse di p53 apoptosi arresto ciclo cellulare Mut dominanti negative
Mut. Wt
Haplo-insufficiency increases the probability of completing a multistep tumorigenesis pathway Kim C. Quon et al. Genes Dev. 2001; 15: 2917-2921
perdita 1 allele
perdita 2 allele
tumori ereditari Haplo-insufficiency increases the probability of completing a multistep tumorigenesis pathway. Strong (A) or partial (B) haplo-insufficiency allows cells that are heterozygous for a tumor suppressor gene to undergo clonal expansion. This increases the size of the target cell population available to complete a multistep tumorigenesis pathway, and thus greatly increases the probability of tumors occurring. For partially haplo-insufficient tumor suppressor genes (B), loss of the remaining tumor suppressor gene allele (loss of heterozygosity, LOH) is required to complete tumorigenesis. (C) In the absence of haplo-insufficiency, no clonal expansion of heterozygous cells occurs, and therefore insufficient numbers of cells are available to complete the pathway, and tumors fail to occur or only rarely occur. (D) In familial cancers, all cells are heterozygous to begin with, and therefore no clonal expansion is necessary to increase the size of heterozygous target cell population. Therefore, tumors can arise even in the absence of haplo-insufficiency. Cells carrying two wild-type alleles of a tumor suppressor gene are shown in white; heterozygous cells with one mutant allele are in light pink; tumor cells with one or two mutant alleles are in dark pink; (X) mutant tumor suppressor alleles.
95% HNPCC Hereditary Non Polyposis Colonrectal Cancer: mutazioni nei geni MLH1&2
spindle checkpoint
angiogenesi
vertebrati: vita lunga necessit di avere continua proliferazione cellulare sviluppo (1014 cells) mantenimento riparo
costo= tumori
SENESCENZA: blocco in G1 di cellule vitali, insensibili ai mitogeni. Puo essere indotta da oncogeni
PUNTI di controllo:
checkpoints (riparazione, apoptosi, senescenza) eliminazione cellule precancerose (anossia) pressione selettiva cellule circostanti pressione selettiva tessuti diversi
TUMORI possono originarsi da cellule staminali o da progenitori che riacquistano capacit di self renewal a scapito della capacit di differenziare
stessi pathways che controllano stem cell self renewal sono spesso attivati in tumori
tumori eterogenei contengono poche cancer stem cells capaci di automantenersi e differenziare parzialmente. Queste cellule sono le uniche in grado di trasferire tumore
ex AML: cells CD34+CD38- (HSC), trasferiscono AML in topi nude cells CD34+CD38+ (piu differenziate) NON trasferiscono tumore
.cercare di colpire le cellule staminali tumorali da cui origina il tumore implicazione per la terapia piuttosto che le cellule tumorali che da esse si originano !!
EPIGENETICA E TUMORI
CROMATINA ATTIVA: Iperacetilata e ipometilata Il reclutamento di deacetilasi istoniche e di altri complessi richiama
DNA metiltransferasi
Mut. puntiformi
segregazione aberrante
silenziamento oncosoppressori
attivazione oncogeni
Cellule normali: metilazione concentrata su sequenze ripetitive del genoma e isole CpG dei promotori sono solitamente non metilate Cellule tumorali: non c compartimentalizzazione della metilazione DNA ripetitivo non metilato, promotori metilati (silenziati)
myc
E2F
E2FmRNA
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2005.06.036
intero organismo
- mammiferi: zigote omogeneo e specializzazione successiva - Drosophila: cellula uovo gi asimmetrica ..ma fondamentalmente gli stessi pathways e gli stessi meccanismi sono comuni fra Drosophila e mammiferi
LOGICA GENETICA ALLA BASE DEI MECCANISMI DI CONTROLLO DELLO SVILUPPO: Cascata di eventi che specificano progressivamente il patrimonio trascizionale (identit) della cellula differenziata Attuazione programma trascrizionale specifico per ogni cellula
Gene A, espresso in cellule eritroidi Gene B, espresso in cellule epatiche Gene C, espresso in cellule muscolari
Il repertorio di fattori trascrizionali espresso in una data cellula determina il programma trascrizionale che essa in grado di attuare
Lo stesso gene puo essere espresso in tessuti diversi sotto il controllo di sequenze regolative composte da siti per TF diversi
CONTROLLO COMBINATORIO
* Ogni gene controllato da una combinazione di fattori trascrizionali che ne legano le seq. regolative (riconoscono le proprie sequenze consensus -ex AGATAAG-) *Alcuni fattori trascrizionali sono ubiquitari, alcuni tessuto-specifici (T.S) *Un fattore trascrizionale puo controllare decine di geni (agisce in trans)
CASCATA
Il repertorio di fattori trascrizionali espresso in una data cellula determina il programma trascrizionale che essa in grado di attuare Ad ogni stadio dello sviluppo e del differenziamento cellulare vengono espresse combinazioni diverse di fattori trascrizionali
Lo sviluppo di un determinato organo puo essere visto come lattuazione di una cascata di programmi trascrizionali, da una cellula piu indifferenziata ad una piu specializzata.
Ex: sistema emopoietico
REGOLATORI
Circuiti integrati di trasduzione del segnale che convergono su fattori trascrizionali che -in cascataattuano programmi trascrizionali specifici BERSAGLI globulo rosso
Catene Globiniche
*FATTORI TRASCRIZIONALI *COMPONENTI VIE TRASDUZIONE DEL SEGNALE -lespressione spazio-temporale di questi geni quasi sempre strettamente correlata con le regioni in cui questi geni agiscono -molti di questi geni sono altamente conservati fra i diversi phyla animali
Come due cellule uguali possono diversificarsi e specializzarsi a fare cose diverse?
repressione induzione
Inibizione reciproca:
Le cellule che riescono ad inibire maggiormente le cellule vicine rafforzano la propria specializzazione e impediscono alle vicine di assumere la stessa specializzazione
epidermide
Delta inattivato in un gruppo di cellule: non c inibizione laterale > tutte cellule fanno Peli sensori
Nature, Zelhof et al
INDUZIONE
GENI BERSAGLIO
schiusa
Luovo fecondato si sviluppa attraverso una fase di sincizio seguita dalla formazione di cellule separate e dalla formazione di cellule primordiali germinali
MUTANTI
geni che controllano numero e polarit dei segmenti (gap, pair rule, segment polarity)
www.bio.davidson.edu/.../fly/embryred.jpeg
B C
TRAPIANTI
ESPRESSIONE ECTOPICA
OVERESPRESSIONE
testa
Ftz eve
MUTANTI
Non si formano
-altre informazioni invece devono essere presenti nello ZIGOTE Evidenza genetica: ex engrailed, richiesto per la segmentazione ZIGOTE -/- MUORE
overespressione
testa
Il principale gene attivato da bicoid e represso da nanos bicoid lega in modo cooperativo il promotore hunckback hb (il legame ad un sito facilita quello al sito Attiva trascrizione blocca successivo)
traduzione
Bicoid
Nanos
Bicoid: -attiva trascrizione hunchback -reprime traduzione Caudal Nanos: -reprime traduzione hunchback
I livelli relativi di Bicoid, Caudal e hunchback lungo lasse dellembrione determinano lespressione dei geni GAP lungo lasse dellembrione
SEGMENTI
gradienti materni Geni GAP: organizzazione in regioni generali, ex. Krupper Pair rule: agiscono su segmenti alterni: -even skipped, hairy: pari -fushi tarazu, odd: dispari
WT
MUT
anticorpo
? come ?
controllo indipendente di elementi in cis che regolano un gene (ex even skipped)
A R
Il segmento caratterizzato da un specifica concentrazione relativa di fattori trascizionali (Giant, bicoid, Kr) che riconoscono siti di legame sulla regione regolativa che dirige lespressione del gene target (EVE) in quel segmento R striscia 2: Hb++ e bicoid+ Giant- Kruppel-
-azione integrata di attivatori e repressori che delimitano la regione di espressione del gene target -meccanismo combinatorio: diverse combinazioni di attivatori e repressori controllano geni diversi -combinazioni di fattori trascrizionali (trans) -combinazioni di sequenze regolative (cis)
http://zygote.swarthmore.edu/droso4.html
Casares and Mann showing that if they added the mouse homologue of extradenticle to the anal precursor precursor develops into an antenna. Since extradenticle mutant legs were produced in flies that lacked wildtype thoracic), wherein Antennapedia represses head-forming genes. (This plan is then modified by Scr which promotes athoracic development in the third thoracic segment). In dominant Antennapedia mutants, the homothorax gene in the h formation of legs.
antennal versus leg development in Drosophila. Nature 392: 723 - 726. a fly's leg. Nature 392: 657 - 658.
W. J. 1987. Molecular analysis of the dominant homeotic Antennapedia phenotype.EMBO J. 6: 201 - 206. a leg into an antenna in Drosophila. Nature 292: 635 - 638.
Eyeless (pax6):
se assente - non si forma locchio espressione ectopica: -struttura oculare sulla zampa
aniridia
MAN
CAT
MOUSE
The vertebrate homeotic complex comprises four distinct Hox gene clusters (Hox A, B, C, D)
COME LALTERAZIONE DELLESPRESSIONE DEI DETERMINING GENES PUO INFLUENZARE LA DIVERSITA MORFOLOGICA *ALTERAZIONE REGIONE DI ESPRESSIONE *ALTERAZIONE DOMINI FUNZIONALE DELLA PROTEINA *ALTERAZIONE SEQUENZE REGOLATRICI
DIVERGENZA
Diversificazione del piano strutturale generale e dei segmenti corporei Spostamento spaziale dei confini di espressione dei geni Hox!
VERTEBRE CERVICALI
VERTEBRE TORACICHE
Ancient genes, recycled and repurposed, control embryonic development in organisms of striking diversity
By Sean B. Carroll
HOXc6 serpente
pollo
Hox genes determine the form, number, and evolution of repeating parts, such as the number and type of vertebrae in animals with backbones. In the developing chick (left), the Hoxc-6 gene controls the pattern of the seven thoracic vertebrae (highlighted in purple), all of which develop ribs. In the garter snake (right), the region controlled by the Hoxc-6 gene (purple) is expanded dramatically forward to the head and rearward to the cloaca.
*ALTERAZIONE DOMINI FUNZIONALE DELLA PROTEINA ..perch gli insetti non hanno arti addominali Ubx di insetto e artropode hanno C-ter diverso Ubx di insetto reprime
drosophila
NB: nel torace degli insetti lespressione di Dll e Ubx non si sovrappongono temporalmente
Dll
T1 T2 T3
crostaceo
Ubx di insetto
Ubx di artropode
*ALTERAZIONE SEQUENZE REGOLATRICI che riconoscono il fattore trascr. Ubx reprime II paio di ali negli insetti
Homeotic Genes and the Evolution of Anthropods and Chordates by Sean B. Carroll Figure 4 (from page 78 of Shaking the Tree: Readings from Nature in the History of Life edited by Henry Gee)
Asse dersoventrale
Dorsal
Gradiente nucleare
zen
GENETICA DEL SISTEMA IMMUNITARIO Assicura protezione contro infezioni provocate da virus, batteri, funghi Riconoscimento aggressione estranea Attivazione cellule appropriate Eliminazione agente estraneo RISPOSTA ASPECIFICA : INFIAMMATORIA COMPLEMENTO
20 proteine sintetizzate nel fegato poi rilasciate nel sangue dove si attivano in presenza di infezione lisi batteri attirano fagociti
T killer: riconoscono e uccidono cellule infette T helper: stimolano proliferazione cellule B e Killer
T soppressori: attenuazione della risposta B e T di memoria: assicurano maggior efficacia nella risposta a seguito di una seconda esposizione allo stesso antigene Macrofagi:inglobano agenti infettanti e processano i loro antigeni presentandoli alle cellule B e T helper
parte variabile superficie di riconoscimento dellantigene (>1010 antigeni diversi) -parte variabile catena leggera e pesanteparte costante funzione effettrice diversi tipi di risposta
IgG
IgM
IgA IgE
cummings Eredit
NB: una
produzione di immunoglobuline
rilascio nel circolo sanguigno: quiescenza ESPANSIONE CLONALE del clone la cui IgM riconosce lantigene secrezione IgG
Switch di classe: passaggio alla produzione di IgG, IgE, IgA con stessa specifit per antigene e diversa funzione effettrice
maturazione Ig memoria
Da dove deriva la capacit di generare un repertorio di anticorpi in grado di riconoscere un numero di antigeni praticamente illimitato?
-RICOMBINAZIONE SOMATICA dei loci codificanti per le immunoglobuline -VARIABILIT NEI SITI DI RICOMBINAZIONE -IPERMUTAZIONE SOMATICA
VARIABILITA 250VH 10D 4JE= 250x10x4= 10000 catene pesanti H 250VK 4JK= 250x4 = 1000 catene leggere K 2V 3J = 6 catene leggere
107 combinazioni H x L
1010
DNA dei loci IGG riarrangiato nelle cellule B rispetto alla linea germinale
RICOMBINAZIONE SOMATICA
CATENA PESANTE
la ricombinazione fra sequenze con spaziatori diversi (12 o 23) impone ordine VDJ, impedendo che vengano saltati i frammenti D
CATENA LEGGERA
VARIABILITA 250VH 10D 4JE= 250x10x4= 10000 catene pesanti H 250VK 4JK= 250x4 = 1000 catene leggere K 2V 3J = 6 catene leggere
107 combinazioni H x L
1010
struttuta riconosciuta dalle proteine che effettuano il taglio (Rag1 & Rag2)
1 giro di elica
2 giro di elica
rag1/rag2
catalizzano i riarrangiamenti somatici Ricombinazione VDJ che permettono la formazione degli anticorpi. Agiscono tagliando specifiche sequenze di DNA RSS che fiancheggiano gli elementi V, D,J. RAG1 simile agli elementiTransib (trasposoni di invertebrati)
conservazione aa
conservazione RSS
http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pbio.0030181
se il riarrangiamento non in frame, presumibilmente viene introdotto uno STOP a valle > riarrangiamento non produttivo
IPERMUTAZIONE SOMATICA
activation-induced cytidine deaminase (AID)= durante trascrizione deamina la citosina (C>U) sul DNA. Se DNA viene replicato CG> TA
RIPARAZIONE: *corretta, BER> CG * creazione sito abasico ad opera di Uracil-N glicosilasi > sito abasico > inserzione base a caso * mismatch repair, error prone >A oT
NB
poliA alternativi
SWITCH DI CLASSE:
*splicing alternativo SOLO per IgM e IgD, le uniche a poter essere coespresse sulla stessa cellula
IgM
IgD
*tipo antigene *tipo T helper *interazione con altre cellule del sistema immunitario
IgE IgA
S: promotori attivati
fanno partire trascritti sterili che richiamano fattori/cofattori che mediano il taglio del DNA
M P
M P
M P
..ma ogni cellula possiede 2 alleli (di origine materna, M e paterna P) per ciascun locus
Riarrangiamenti casuali in successione temporale in cui un riarrangiamento produttivo + blocca lulteriore riarrangiamento sullaltro allele (che viene escluso)
le cellule B in cui non si verificano riarrangiamenti produttivi per una catena H e una catena L, vengono eliminati
CELLULE T: presentano un TCR T Cell Receptor che riconosce lantigene presentato insieme ad una molecola MHC
MHC: complesso maggiore di istocompatibilit, topo HLA: human leucocyte associated antigen, uomo
MHC I antigeni da trapianto: espressi su tutte le cellule, permettono riconoscimento MHC II: espressi su linfociti B e macrofagi: riconosciuti da linfociti T helper>
attivazione risposta self/non self da parte dei linfociti killer. Riconoscimento di ogni cellula dellorganismo che viene infettata
no TRC
riconoscono poco il self: riconosceranno il proprio MHC solo se associato a antigeni esterni
MHC: complesso maggiore di istocompatibilit, topo HLA: human leucocyte associated antigen, uomo
superfamiglia immunoglobuline
MHC
* allelismo multiplo * siti molto polimorfici * codominanti microrganismi: evoluzione peptidi che non complessano MHC
linkage disequilibrium: forte associazione allelica differenziale (combinazione alleliche con frquenza maggiore dellatteso) che presumibilmente conferisce protezione contro un dato antigene
chr 6 M chr 6 P
chr 6 M chr 6 P
chr 6
esistono *molti geni HLA *ogni gene HLA ha molti alleli codominanti (ex A1..A9) gemelli monozigotici > identici milioni di combinazioni alleliche diverse
fratelli (vedi ex) 25% probabilit di essere compatibili estranei: bassissima (nulla) probabilit <1/200.000
SUCCESSO TRAPIANTI: compatibilit HLA fra donatore e ricevente HLA: antigeni da trapianto
se somiglia a
linkage disequilibrium
Common west African HLA antigens are associated with protection from severe malaria.
Hill AV, Allsopp CE, Kwiatkowski D, Anstey NM, Twumasi P, Rowe PA, Bennett S, Brewster D, McMichael AJ, Greenwood BM. Institute of Molecular Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, UK. A large case-control study of malaria in West African children shows that a
population they account for as great a reduction in disease incidence as the sickle-cell haemoglobin variant. These data support the hypothesis that the extraordinary polymorphism of major histocompatibility complex genes has evolved primarily through natural selection by infectious pathogens.
human leucocyte class I antigen (HLA-Bw53) and an HLA class II haplotype (DRB1*1302-DQB1*0501), common in West Africans but rare in other racial groups, are independently associated with protection from severe malaria. In this
Association between an MHC class II allele and clearance of hepatitis B virus in the Gambia.
Thursz MR, Kwiatkowski D, Allsopp CE, Greenwood BM, Thomas HC, Hill AV. BACKGROUND. The course of hepatitis B virus (HBV) infection does not appear to be determined by variations in viral virulence and may be influenced by the host immune response. CONCLUSIONS. The MHC class II allele DRB1*1302 was associated with protection against persistent HBV infection among both children and adults in the Gambia.
GATA1
proteina eritroide-specifica che lega enhancer -globina *Gel shift, competizione, footpronting *deduzione consensus
GATA
Cloning of cDNA for the major DNA-binding protein of the erythroid lineage through expression in mammalian cells
Shih-Feng Tsai*, David I. K. Martin*, Leonard I. Zon*, Alan D. D'Andrea*, Gordon G. Wong & Stuart H. Orkin*
Nature 339, 446-451 (8 June 1989) Genes expressed in erythroid cells contain binding sites for a cell-specific factor believed to be an important regulator for this haematopoietic lineage. Using high-level transient expression in mammalian cells, we have identified complementary DNA encoding the murine protein. The factor, a new member of the zinc-finger family of DNA-binding proteins, is restricted to erythroid cells at the level of RNA expression and is closely homologous between mouse and man.
cDNA
A B C
famiglia ruolo
*pattern di espressione
erithroid cells , megaKaryocites, eosinophils, mast cells, Sertoli cells of the testis
OVERESPRESSIONE
ESPRESSIONE ECTOPICA
Vannucchi A.
SU CELLULE ES IN TOPO
*PROTEINA
WT
NF CF
-N GATA-1 NF n CF riescono a fare rescue -Entrambi i domini Zinc-Finger sono necessari per la funzione di GATA-1 (funzionano anche ZFs di altri geni!)
wt
E9.5
wt
E15.5
NF
NF
NF
FOG
overespressione
CONTROLLO CICLO CELLULARE : bilanciamento proliferazione/differenziamento Fattori di crescita autoregolazione induzione bclxl ha effetto antiapoptotico
differenziamento
TRANSCRIPTIONAL REGULATION
PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS
synergism (FOG1, Cp2) Modulo GATA-1-Cp2 Attivazione di geni eritroidi (GATA-1, NF-E2p45, EKLF)
antagonism (Pu.1)
..modello multistep