Jornadas terico-practicas

Cromatografa liquida. Uso y aplicaciones de un equipo HPLC.

Lus Miguel Osta Cano Enero-Febrero 2009

Introduccin
Para empezar vamos a recordar varios datos y conceptos bsicos: La cromatografa es una tcnica de separacin. Es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases; una de ellas es un lecho estacionario y la otra se mueve por percolacin a travs de este lecho. Los procesos cromatogrficos tienen lugar como resultado de repetidas adsorciones y desorciones durante el movimiento, de los componentes de la muestra a lo largo del lecho estacionario, debido a las diferencias en los coeficientes de distribucin se alcanza la separacin de los distintos componentes. En el ao 1903 el ruso M. S. Tswett desarrollo el primer mtodo cromatogrfico al separar y aislar pigmentos vegetales. El nombre de Cromatografa (escritura en color) procede del griego y se le ocurri al ver las bandas de colores que aparecieron en la separacin. En 1956 J. J. van Deemter desarrolla la teora de la separacin cromatogrfica. En los aos 60 del pasado siglo nace la cromatografa moderna HPLC. Existen muchas formas de clasificar las tcnicas cromatogrficas, por lo que nos ajustaremos a lo que necesitamos para esta introduccin: Cromatografa Preparativa Cromatografa en papel Cromatografa Plana Cromatografa en capa fina (HPTLC) Cromatografa analtica Cromatografa en Columna

Qu es la HPLC?
Inicialmente se le bautiz con las siglas en ingles de cromatografa Liquida de Alta Presin, Posteriormente pas a llamarse High Performance Liquid Cromatography Cromatografa Liquida de Alta Resolucin. Consiste en la inyeccin de una mezcla de sustancias, ms o menos compleja, en un torrente a alta presin (fase mvil), que la introduce en una columna cilndrica, con un relleno (fase estacionaria) que interacta con los distintos componentes de la mezcla y la fase mvil, produciendo un ordenamiento en la elucin de los distintos componentes de la columna. A su salida, son conducidos hasta un detector, que trasmite una seal elctrica proporcional a la concentracin de los distintos
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componentes. Esta seal es recibida por un registrador (de plumilla u ordenador) que lo transforma en una representacin grafica llamada cromatograma.

Elementos que lo forman.

Bombas: Son elementos esenciales en un equipo, ya que son las encargadas de impulsar el flujo de F.M. y debe de ser capaz de alcanzar altas presiones, a la vez que consigue gran precisin en los parmetros que se ajuste para trabajar. Hay muchas tipos de bombas pero podemos clasificarlas como sigue: -A presin constante -A caudal constante Las bombas a caudal constante son las ms utilizadas, ya que consiguen una mejor reproducibilidad en los ensayos, estas pueden ser de dos tipos: Alternantes e impelentes. -Alternantes: Un motor, mueve por medio de una leva, un pistn que expele a travs de una vlvula de direccin nica. Esto produce una serie de pulsos que producen oscilaciones en la seal. Par evitar este efecto se desarrollaron bombas de doble pistn (bombas alternantes dobles). En las que se combinan dos pistones movidos por el mismo motor de tal manera que mientras un pistn carga el otro expele. Superponindose los perfiles del flujo y reduciendo as las perturbaciones en la seal.
Pulso amortiguado

Pistn A

Pistn B

Bomba de un solo pistn

Bomba de doble pistn

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Se puede trabajar con una o ms bombas. Si trabajamos con una fase mvil que no vara su composicin a lo largo del cromatograma (sistema isocrtico) se puede utilizar una sola bomba pero si esta composicin variara (sistema anisocrtico o elucin por gradiente) sera necesario al menos dos. - Impelentes: Un cilindro que contiene fase mvil, es expelida por un pistn. ste avanza gracias a un motor conectado a un tornillo sin fin, proporcionando un flujo constante y sin pulsos durante la inyeccin. Este tipo de bombas no precisan apenas mantenimiento por su robustez y sencillez, ya que no tienen electrovlvulas ni elementos sensibles. Existen adems bombas multicanal, en la que un sistema de electrovlvulas independientes, se regulan para proporcionar la composicin de la fase mvil que se le haya fijado, pudiendo hacer gradientes. Estos pueden ser lineales o con curvas.

En estas bombas, los diferentes componentes de la fase mvil son controlados por una electrovlvula por cada uno de los solventes, que los introduce en una cmara de mezcla para ser impulsados por el pistn. Inyector: Es el componente por el que introducimos la muestra en el sistema. Los hay automticos, semiautomticos y manuales. Nos centraremos en los manuales. Es de tipo Rehodine tiene 6 puertos: Entrada de fase mvil, salida de fase mvil, dos de desechos y dos para conectar el bucle. El bucle (Loop) es un trozo de tubo de acero calibrado a un volumen determinado y que ser el volumen de muestra a inyectar en el sistema. Cuando el inyector esta en posicin de carga (load) el puerto de inyeccin, que es frontal, esta conectado con el bucle y este a su vez con un desage, cuando inyectamos la muestra se introduce por medio de una jeringuilla un volumen siempre mayor que el del bucle por lo que saldr el sobrante por el desage. Simultneamente la fase mvil entra y sale del inyector.
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Al girar la palanca del inyector a la posicin de inyeccin (injec) comunicamos el puerto de entrada de la fase mvil con la entrada del bucle, y la salida de ste, con el puerto de salida de la fase mvil, siendo arrastrada la muestra que estaba en el interior del bucle, hacia la columna.

Columna comatogrfica: Es donde se produce la separacin por lo que podramos decir que es elemento ms importante de todo el sistema, por lo que debemos elegirla y cuidarla especialmente. Es un cilindro hueco de acero inoxidable y en la cual los extremos esta cerrada con un sistema de rosca y contra rosca en sus extremos. Contiene un relleno que es la Fase Estacionaria, puede ser un gel o un slido con una granulometra determinada. En los extremos se roscan las tuercas que conectan los capilares, formadas por la propia tuerca y un cono que se ajusta al capilar y a la entrada de la columna, estos capilares conducen la Fase Mvil. Entre las entradas de la columna y el relleno, se encuentra un pequeo disco metlico con una porosidad determinada (fritado), ste cumple varias funciones, destacando que: evita que entren partculas a la columna, evita que se muevan las partculas y favorece la difusin de la fase mvil en la entrada de la columna. Existen columnas de muchos tamaos y caractersticas, pero podemos decir, que lo mas habitual es que las dimensiones oscilen en estos valores: entre 250-100 mm de largo, 25-46 mm de dimetro interno. A mayor longitud mejor separacin, ya que la reaccin por la cual se produce la retencin del compuesto, se repite un mayor numero de veces, mejorando as la separacin de los compuestos entre s. El tamao de las partculas oscila entre 3 y 10 m. Adems esta partcula puede tener diferentes formas, que mejoran diferentes aspectos de la separacin. A menor tamao mejor separacin, ya que la superficie de contacto aumenta, multiplicando la reaccin por la cual son retenidos los compuestos. Estas partculas a las que nos estamos refiriendo pueden ser de naturaleza y propiedades muy diferentes, generando los diferentes modos de separacin:

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 Cromatografa Liquido-Liquido (adsorcin) La F.E. es un adsorbente fuertemente polar y la fase mvil es de polaridad variable segn la escala de Hildebrand, la separacin se basa en repetidas etapas de adsorcin-desorcin por polaridad. La F.E. suele ser de gel de slice o almina pero existen de florisil, carbn activo, etc. Cromatografa de Particin (reparto)Liquido-Liquido Verdadera particin entre F.M, y F.E. - fase mvil apolar y F.E. muy polar siendo casi inmiscibles entre s.

Fases enlazadas: - Fase Normal: La F.E. contiene un grupo funcional y es polar, la F.M. es de baja polaridad. Pueden ser amino, ciano y diol principalmente. - Fase Inversa: La F.E.es apolar y la F.M. es de polaridad variable. Suele usarse el C18 u Octadecilsililo, pero existen otras como el C8 u Octilsililo y Fenilsililo entre otras.

Cromatografa de Cambio Inico Cuando la F.E. posee iones capaces de retener a otros de signo contrario.
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 Cromatografa de Exclusin Molecular La F.E. es un gel poroso de tamao de poro controlado, que permite la entrada de ciertas molculas y deja fuera otras de mayor tamao. Detector: Los detectores de cromatografa liquida tienen un alto rango operativo permitiendo trabajar en escala analtica o preparativa. Tiene gran sensibilidad, permitiendo detectar del orden de nanogramos o incluso picogramos. La muestra cuando llega al detector esta diluida en la fase mvil en una relacin que va desde 1:100 hasta 1:10000. La lectura se realiza en una cubeta de entre 5 y 10 l aproximadamente, de esta cubeta depende que los compuestos permanezcan separados y no produzcan un ensanchamiento de la banda de seal. El termino eficacia de la cubeta se usa para definir la capacidad de la cubeta de un detector para mantener los componentes eluidos en forma de bandas separadas y agudas con poca o nula dilucin en la cubeta. Si se produjera esta dilucin apareceran las siguientes respuestas: Ensanchamiento de las bandas debido a la difusin longitudinal. La altura de las bandas disminuye. Se superponen bandas. Aparecen colas en las bandas Los detectores miden en continuo, esto registra las pequeas oscilaciones de las medidas quedando como ruido de fondo. Tenemos multitud de detectores, dependiendo de la naturaleza de la medida podemos encontrar los siguientes: ndice de refraccin: Reflexin De desviacin Electroqumicos o polarogrficos Conductividad electroltica Ms/Ms Espectroscpicos: UV-Vis Red de fotodiodos ARRAY Los detectores de UV-Vis trabajan en un rango que suele ser de 180 a 600 nm. La cubeta que es de cuarzo, es atravesada por un haz de luz monocromtica que esta dirigido hacia una clula de fotoelctrica, que emite una intensidad proporcional a la luz recibida, al pasar las sustancias, aquellas que absorban energa en esa longitud de onda producirn una variacin en la seal elctrica proporcional a la concentracin del compuesto.

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La mayora de los compuestos orgnicos son detectables con este tipo de detectores, aproximadamente el 65% de los compuestos orgnicos tienen absorbancia a 254 nm y el 90% tienen actividad en el rango que cubren estos detectores. Adems el uso de reacciones post columnas de coloracin permite detectar metales y otras sustancias; todo esto sumado a su sencillez de manejo, hace de este detector el mas til y utilizado. El detector de red de diodos ARRAY, es un detector UV-Vis pero con modificaciones, este detector fue un gran avance en la cromatografa liquida, ya que nos proporciona el espectro de cada uno de los compuestos. Estas modificaciones son la incorporacin de un segundo colimador, a la salida del haz de la cubeta y una red de fotodiodos. A la hora de trabajar con el, se selecciona un rango de lectura, que es ajustado por el primer colimador, al pasar un compuesto absorber energa en todas las longitudes de onda a las que sea activa. Al pasar el haz por el segundo colimador, ste descompondr el rango seleccionado en fracciones de 05 nm. Cada fraccin va a parar a un fotodiodo detectando toda variacin de energa sufrida en cada una de las fracciones de longitudes de onda. De tal manera que podemos saber la absorbancia de cada componente en el rango de longitudes de onda seleccionado, el resultado es que podemos extraer el espectro UV del compuesto que eluye en un momento determinado. Esto simplifico el mtodo de identificacin de los compuestos, acortando los tiempos de anlisis enormemente.

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Puesta en marcha de un equipo de HPLC.

Para empezar filtraremos por membrana de 045m y desgasificaremos la F.M. para ello podemos introducir las botellas en un bao de ultrasonidos durante 10 min o bien haremos burbujear helio en la F.M. de tal manera, que el helio desplaza por saturacin a los gases disueltos, desprendindose el helio por si solo, una vez haya cesado el borboteo, debido a su ligereza. Conectamos los equipos a la red elctrica y los encendemos, hacemos las siguientes conexiones de capilares: -Salida de la bomba al inyector: Capilar grueso y largo. -Salida del inyector a la entrada de la columna: Capilar estrecho y corto. -Salida de la columna al detector: Capilar estrecho y corto. -Salida del detector al desage: Capilar grueso y largo. Colocamos una jeringa de gran capacidad en la vlvula de purga, abrimos sta y ponemos la bomba en marcha con un caudal alto (10 ml/min), succionamos con la jeringa y veremos como empezar a llenarse de F.M. extraeremos unos 10 o 20 ml o hasta que veamos que deja de salir aire, bajamos el caudal a 02 ml/min y cerramos la vlvula de purga sin retirar la jeringa. Dejamos pasar unos segundos y observaremos que empieza a salir la F.M. por el capilar de entrada a la columna, dejamos que pase unos segundos comprobando que no sube la presin, si no fuera as el inyector tendra algn atasco. As mismo comprobamos que no fuga y no salen burbujas por el extremo del capilar. En caso de que esto no se cumpla hacer los ajustes necesarios. Una vez hemos comprobado la inexistencia de burbujas, conectamos la entrada de la columna y dejamos que se estabilice la presin. Colocamos un baso de precipitados en el extremo de la columna y dejamos unos minutos que vaya eluyendo el contenido de la columna. Pasado este tiempo iremos aumentando el flujo de F.M. de 02 en 02 ml, esperando que se estabilice la presin antes del siguiente aumento de caudal, hasta llegar a las condiciones que necesitemos para trabajar. Conectamos la salida de la columna al detector y dejamos que pase F.M. durante el tiempo suficiente para renovar todo el contenido de la columna, para ello se considera que debe de eluir un volumen igual a 20 volmenes de la columna sin contar el relleno. Ejemplo: Columna de 150mm y 46 mm r2 L = 248285 mm3 25 ml 25 x 20 = 50ml A 1 ml/min - 50min A 08 ml/min -625min A 05 ml/min 100 min

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Transcurrido este tiempo se puede empezar a trabajar. Si no quisiramos empezar podramos colocar el capilar de salida del detector a la botella que contiene la fase mvil y as recuperarla. Se enciende el detector y ajustamos las condiciones de trabajo, pasado 20 min se hace un cero, monitorizamos en el sistema de registro las condiciones analticas y el equipo est listo para trabajar. Normalmente los anlisis cromatogrficos se realizan por comparacin con un patrn que contiene las sustancias de inters. Con ste patrn observamos el comportamiento en la columna de los diferentes analitos, identificndolos posteriormente y comparndolos con los de la muestra.

Parmetros a controlar durante el anlisis.

El parmetro ms importante durante el anlisis es el flujo, pero como hemos visto anteriormente este es o debe ser constante. Le sigue la presin, est directamente relacionada con el flujo, el tamao de la columna, el tamao y la forma de las partculas y de la viscosidad de la F.M. De tal manera que podemos asegurar que: o o o o A mayor flujo de fase mvil mayor presin A mayor longitud de columna mayor presin A menor tamao de partcula mayor presin A mayor viscosidad de la F.M. mayor presin

Durante el anlisis, la presin puede oscilar en 20 PSI. La presin puede aumentar ligeramente cuando eluyen los compuestos mayoritarios. Si la presin desciende en un grado importante implica la existencia de fugas entre la columna y la bomba. La presencia de burbujas en el sistema se refleja en una fuerte oscilacin de la presin. La presencia de burbujas puede indicar la existencia de fugas. Un aumento de presin incesante, an en regmenes de flujo bajo, nos indica la existencia de atascos. Como hemos visto, unos de los factores que afectan a la presin es la viscosidad de la fase mvil, pues bien, todo aquello que produzca una variacin de este parmetro se vera reflejado con un aumento o diminucin de sta. Podra darse bien por una variacin de la temperatura a lo largo del ensayo o por la variacin de la composicin de la fase mvil (en el caso de trabajar con gradiente).

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Segn la columna instalada en el sistema, la presin se ver aumentada o disminuida, ya que adems de lo ya expuesto respecto al tamao de sta, est el de las partculas y la forma de estas partculas.

Aunque las columnas suelen soportar presiones de 6000 PSI es recomendable no superar los 3000 PSI, ya que esto prolonga la vida til de la columna y de las bombas. Como ltimo, pero no menos importante, de los parmetros que vamos a controlar, es la seal que emite el detector. - Lnea base: es el valor terico de 0, debe ser estable en el tiempo y no tener picos. - Ruido de fondo: es la variacin en un intervalo de tiempo corto de la lnea base respecto a una lnea recta y aparece como una serie de pequeos picos, que suele llamarse hierva. Este parmetro es limitante de la sensibilidad del mtodo. Cuando la variacin aumenta o disminuye a lo largo de todo el cromatograma se llama deriva. - Idealmente la lnea base debe ser plana. - El ruido de fondo puede ser producido por efecto del bombeo de la fase mvil, un mal ajuste del tiempo de respuesta del detector o una incorrecta purificacin de la muestra. - La deriva se produce por la variacin de la composicin de la fase mvil en el tiempo que dura el anlisis, como es el caso de trabajar con gradiente. - Picos de corriente: son seales que aparecen sin una pauta y no siempre iguales en intensidad. Los motivos son oscilaciones en la corriente que suministramos al detector, que provoca subidas de intensidad en la clula fotoelctrica apareciendo seales en forma de picos estrechos y no muy altos. La solucin pasa por estabilizar la corriente que alimenta al detector. - Picos provocados por burbujas: son seales en forma de picos, que aparecen peridicamente, estrechos y muy altos de hecho se suele saturara la lectura del detector. Estos picos aparecen por la presencia de fugas, desgasificacin nula o insuficiente de la fase mvil o bien se forman al mezclarse distintos componentes de la fase mvil en el sistema y forman gases al reaccionar. Esto se puede evitar mezclando los diferentes componentes y desgasificando posteriormente.

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Una burbuja formada en la bomba, al llegar a la columna se comprime y se descompone en multitud de burbujas casi imperceptibles, que segn vayan eluyendo de la columna se expanden provocando los efectos descritos anteriormente.

Parada de un equipo de HPLC

La parada del equipo puede ser para cambiar algn elemento del sistema o bien una parada total. Por norma general los equipos no deben pararse, no obstante si tuviramos que parar habr que seguir los pasos siguientes: Reducir el flujo de fase mvil lentamente (02ml/min en cada paso) esperando que se equilibre la presin antes de la siguiente bajada. Una vez lleguemos a la parada total y comprobemos que la presin es cercana a 0 se hacen los ajustes necesarios. Habr que tener en cuenta que la columna ha de quedarse llena de una fase mvil adecuada, para ello habr que hacer pasar primero una solucin de lavado, que garantice la renovacin de todo el volumen de la columna (20 veces el volumen de la columna). En segundo lugar, haremos pasar como fase mvil la solucin que se valla a usar para conservar correctamente la columna (metanol o acetonitrilo en agua al 60-70 %), actuando como en el primer paso, para asegurarnos la renovacin del contenido de la columna. Una vez hayamos conseguido esto, desmontaremos la columna y la cerraremos para evitar evaporaciones durante la conservacin. As mismo, los capilares han de taponarse para evitar la entrada de aire en los mismos.

Mantenimiento bsico del equipo

La mejor medida de mantenimiento es la prevencin. Por lo que debemos de fijarnos en medidas generales que puedan afectar a los diferentes elementos que forman el sistema. Si la corriente elctrica presenta oscilaciones en su amperaje es recomendable estabilizar los equipos. No golpear los equipos y conexiones. Evitar apretar en exceso las conexiones de los capilares que conducen la fase mvil. Evitar estrangulamientos y retorcer los capilares de que conducen la fase mvil. No utilizar sustancias corrosivas. Evitar la entrada de aire en el sistema. Tanto la fase mvil como las muestras han de ser filtradas por membrana de 045 m. Asegurarse de la solubilidad de la muestra en la fase mvil.

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 Hacer lavados con fases mviles adecuadas cada vez que terminemos de trabajar. No introducir en el sistema aquello que no estemos seguros que va ha eluir con las condiciones fijadas por el mtodo en uso. Cuando una columna pierde sus propiedades puede intentarse la regeneracin de sta para eliminar los componentes que se hayan fijado en su interior, para ello puede darse la vuelta a la columna y hacer circular fase mvil elevando el flujo poco a poco; aunque esta opcin no es muy recomendable, ya que corremos el riesgo de crear canales preferentes por los que circulara la fase mvil sin producirse las separacin de los compuestos. Sin embargo hay diferentes mtodos creados para el lavado efectivo de las columnas dependiendo del relleno de estas y de los posibles contaminantes estos mtodos son expuestos seguidamente:

Preparacin de las muestras para su anlisis por HPLC

La preparacin de la muestra para su anlisis por este mtodo es muy importante, para que podamos separar el analito sin interferencias y por que de ello depende la vida til de la columna.

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A modo general podemos fijar como norma general que debe reunir toda muestra para poder ser analizadas por HPLC, las expuestas seguidamente: La muestra debe ser liquida. El solvente usado para disolver la muestra, ha de ser compatible la fase mvil y la estacionaria. Los distintos componentes de la muestra no deben reaccionar con la fase mvil y la estacionaria. Los analitos deben ser adecuados al mtodo diseado para la deteccin. En lo posible debemos evitar la entrada en el sistema de compuestos que interfieran en la deteccin de los analitos. Debemos evitar en lo posible la entrada en el sistema de compuestos que prolonguen innecesariamente el tiempo de anlisis. Para poder cumplir estos objetivos hay una serie de mtodos generales y otros ms especficos que dependen de la sustancia a investigar y de la matriz en la que se encuentra. Podemos distinguir diferentes etapas en la preparacin de las muestras, en algunos casos habr que aplicar todos los pasos y en otros casos no ser necesario. Estas etapas son: Extraccin: consiste en colocar la muestra en contacto con un disolvente ms o menos especfico, que disuelve o extrae el analito. Los mtodos ms habituales son: SolidoLiquido LiquidoLiquido GasLiquido Purificacin (Clean-up): en esta etapa intentamos eliminar todas aquellas sustancias que se han extrado de la muestra, pero evitando perder la sustancia de inters. Para este fin se utilizan mltiples tcnicas que se pueden resumir en el siguiente esquema:

Cambio de disolventes: evaporacinredisolucin Uso de cromatografa preparativa: plana o en columna. - por hidrlisis previa Extracciones LiquidoLiquido - por polaridad - por solubilidad

- hidrlisis previa: adsorcin Extraccin en fase solida - polaridad: adsorcin (Ex. Liquidosolido/liquido) - solubilidad: absorcin del agua

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Activacin

Carga

Lavado Elucin

Principales usos de fases enlazadas

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Caractersticas de los compuestos ms habituales en HPLC.

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Dilucin concentracin: en sta etapa lo que se busca es la adecuacin de la concentracin del analito, al rango en el que sea medible a nuestra escala de trabajo. Para ello concentraremos los extractos obtenidos en la etapa anterior por evaporacin y redisolucin al volumen deseado con un disolvente seleccionado previamente. O bien habr que diluir aun ms el extracto obtenido en la etapa de purificacin si la concentracin del analito es muy alta. Para acabar con la preparacin podemos indicar las siguientes normas bsicas: El disolvente final del extracto, debe ser lo mas parecido posible a la composicin de la fase mvil. Filtrar todos los extractos finales por membrana de 045 m, antes de introducirlo en el sistema. Analizar lo antes posible las muestras ya procesadas. No almacenar las muestras ya procesadas en el frigorfico antes de analizarlas, si no se van a filtrar posteriormente.

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Parmetros que rigen el proceso cromatogrfico RETENCION: Es una caracterstica particular de cada sustancia, en determinadas condiciones. Si modificamos cualquiera de estas condiciones variar (columna, flujo, composicin de la fase mvil o temperatura). En HPLC se expresa en tiempo. Tiempo de Retencin (tr): Es el tiempo que tarda en recorrer el sistema un grupo de molculas del mismo compuesto, bajo las condiciones establecidas. El tr coincide con el momento de elucin de la mxima concentracin del compuesto. Tiempo Muerto (tm): Es el tiempo que transcurre desde la inyeccin y la salida del primer compuesto. Este compuesto es conocido como sustancia no retenida y suele ser eluyente de la muestra, que al no interactuar con la fase estacionaria, represente la velocidad de la fase mvil. Tiempo de Retencin Corregido (tr): Es el tiempo que permanece la sustancia en la fase estacionaria. tr = tr tm

B E = altura de pico. H J = wh = ancho del pico a mitad de altura.

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F G = wb = ancho del pico en la base. Factor de Capacidad (k): Es la relacin entre el tiempo que permanece la sustancia en la fase estacionaria y en la fase mvil. Ha de estar comprendido entre 1 y 5 k = EFICACIA (N) (ensanchamiento de pico): La elucin de un compuesto a travs de la cubeta del detector produce una seal en forma de banda. Esta banda tendr una distribucin Gaussiana, cuyo centro coincide idealmente con el tiempo de retencin. Estas bandas son los picos cromatogrficos. La distribucin Gaussiana viene defina por la desviacin tpica y la varianza 2. La varianza es directamente proporcional a la distancia recorrida por el centro de la banda (Z). 2 = Z x H H es la constante de proporcionalidad y se la denomina altura de plato terico. H= Siendo L la longitud de la columna. Considerando que cuanto menor sea H, mayor ser la eficacia de la columna. Tambin se puede la medir la eficacia por el nmero de platos tericos (N). N= Es decir, el nmero de veces que existe en una columna una altura equivalente de plato terico. En este caso cuanto mayor sea N, mayor eficacia tendr la columna.

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El ensanchamiento de banda depende de 4 factores: Difusin molecular: difusin del compuesto en la fase mvil y en la estacionaria debido a la concentracin de este. Difusin de Eddy: debido a las irregularidades de los canales que forma el relleno. Transferencia de materia en fase mvil: debido a las diferencias de velocidad lineal del compuesto en los canales que forma la fase estacionaria. Transferencia de materia en la fase estacionaria: debido a la cintica de desorcin del compuesto. De tal manera que: H=A+ +Cxu

A= difusin de Eddy. B= difusin molecular. C= transferencias de materia. u= velocidad lineal de la fase mvil. La importancia de todo esto, es que la optimizacin de un sistema cromatogrfico para conseguir la mxima eficacia de la columna, para un compuesto determinado, pasa por ajustar el caudal o el flujo de la fase mvil para conseguir el mnimo H y el mximo N. Tal como muestra la curva de Van Deemter:

Altura de plato (cm)

Velocidad Lineal (cm/sg)

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Debido a estos clculos se demuestra que a menor tamao y homogeneidad de la forma de las partculas mayor eficacia, tal y como se observa en el siguiente grafico:

SELECTIVIDAD (): Se refiere al sistema, tomando como referencia dos picos. De tal manera, que cuanto mas diferencias existan las retenciones de dichos compuestos, mayor selectividad tendr el mtodo para estos compuestos. = =

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Se considera aceptable cuando 114. Depende de los compuestos, la temperatura y de la naturaleza de las fases estacionaria y mvil. Pudindose intervenir para mejorar este parmetro sobre la temperatura (limitadamente) o por la composicin de la fase mvil (principalmente). RESOLUCION (R): Se define como el cociente entre la distancia de los tiempos de retencin corregidos de cada pico y el valor de la anchura de los picos en la base. R= Cuando el valor es de 1 la resolucin ser aproximadamente del 90%, mientras que si es 15 es del 100%. Considerndose valido si el valor esta entre dichos valores. La resolucin esta influenciada por: - La eficacia de la columna. - La retencin. - La retencin relativa. Dando origen estas variables a la ecuacin ms importante en la HPLC: R=
x x

Variables del sistema que influyen sobre el sistema cromatogrfico: Velocidad Lineal: F = Et x x u x

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F = flujo. Et = porosidad. u = velocidad lineal. di= dimetro interno. Longitud de la columna: Es directamente proporcional a la eficacia: N= Pero, a mayor longitud necesitamos mayor presin para conseguir la velocidad apropiada: P=ux P = presin. dp = dimetro de partcula. Como se deduce la ecuacin anterior el dimetro de partcula hace aumentar la presin de forma exponencial segn disminuye ste. Limitando la longitud de la columna de acuerdo a la limitacin de nuestro equipo. Tiempo de Anlisis: Es muy importante por el ahorro de fase mvil y la capacidad de analizar muestras, depende de: - La longitud de la columna. - El factor de capacidad del ltimo componente. - De la velocidad lineal de la fase mvil. tr = Clculos sobre el cromatograma: k =

=
2

N = 16

= 5545

H=

R= Identificacin de compuestos
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El anlisis por cromatografa se realiza por comparacin de los componentes de la muestra frente a un patrn perfectamente conocido, bajo las mismas condiciones analticas. De forma genrica se podra decir, que si un componente tiene el mismo tiempo de retencin que la sustancia patrn, debemos suponer que se trata de la misma sustancia; no obstante debera comprobarse cambiando las condiciones analticas y confirmar el comportamiento bajo estas nuevas condiciones. Si se dispone de un detector de diodos ARRAY o bien un detector Ms/Ms no hara falta esta confirmacin, ya que nos mostrara el espectro de estas sustancias, pudiendo comprobar en un solo pinchazo la naturaleza del mismo. Tambin podramos identificar algunas sustancias en base a el calculo de el valor de con respecto a un patrn conocido, siempre que se conozca este valor bajo las condiciones que se describan (existen tablas para ello). Por ultimo, tambin existe la posibilidad de recoger estas sustancias una vez eluidas, para su posterior anlisis por otros mtodos analticos, ya que es una tcnica no destructiva. Cuantificacin Una vez se ha comprobado la identidad de la sustancia, pasaramos a cuantificar su concentracin, para ello volvemos a compararla con la sustancia patrn. Dado que cada sustancia tiene una respuesta especifica, bajo las condiciones en la que ha sido detectada ser factible aplicar una comparacin de la respuesta dada por la sustancia patrn, con la encontrada en la muestra. Esta respuesta como hemos visto es el pico cromatogrfico. El rea de ste estar en relacin directa con la concentracin de la sustancia, de tal manera que podemos actuar de dos maneras: 1. Inyectando un patrn de concentracin conocida, este nos dar un rea determinada. Si dividimos el valor de la concentracin (mg/ l) por el rea del pico nos dar como resultado el conocido como Factor de Respuesta de la sustancia. Por lo que, al calcular el rea del pico de la sustancia encontrada en la muestra y multiplicarlo por el Factor de Respuesta, nos dara el valor de concentracin en las mismas unidades, siempre que el volumen de inyeccin sea el mismo. 2. El caso expuesto anteriormente es una forma sencilla y rpida pero tiene escasa exactitud, adems es difcil saber hasta que punto es lineal esta respuesta (Ley de Beer). Para poder trabajar con la mxima exactitud y conocer su linealidad de respuesta ha de construirse una recta de calibracin con la inyeccin de sucesivos patrones con diferentes concentraciones, dando como resultado una recta (curva) de calibrado basadas en las areas de los diferentes patrones, la cual nos dar adems de la linealidad de la medicin, otros datos como el coeficiente
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de correlacin, la dispersin de puntos, etc. Una vez construida la recta inyectaremos la muestra, y su respuesta ser interpolada en la recta dndonos el valor de concentracin en dicha muestra. Evidentemente esta forma de trabajar es la ms recomendable para dar resultados fiables, dentro de los lmites que nos permite dicha recta. En la practica hoy los software que procesan los datos cromatogrficos, estn diseados de tal manera que cada muestra o cola de muestras estn asociados a una recta de calibracin, realizada dentro de la misma cola de muestra por lo que no admiten integrarse estas, en rectas construidas en otro momento, quedando as registrado las condiciones especificas con la que se realizado dicha cola de muestras.

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