Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Laboratorio de Microbiologa General II

Trabajo final de Laboratorio

Alumna: Reyes Garca Lucero Grupo: 1701 Equipo: 4 Semestre: 2014-1

Protozoarios y helmintos de vida libre y parasitaria

Protozoarios Los protozoarios incluyen a todos los organismos unicelulares. El tamao de los protozoarios varia, generalmente las formas parasitarias son pequeas. Los protozoarios estn constituidos principalmente por protoplasma y un ncleo, aunque ocasionalmente presentan dos o ms. En los protozoos se distingue una forma activa que se conoce en la mayora de ellos con el nombre de forma vegetativa o trofozoito. En muchos casos, el trofozoito tiene la capacidad de transformarse en una forma de resistencia, conocida como quiste. El componente fundamental del cuerpo del protozoo es el protoplasma, el cual est diferenciado en ncleo y citoplasma. a) Ncleo: los ncleos de los protozoos tienen formas, tamaos y estructuras variadas. La mayora de los protozoos contienen un solo ncleo, pero hay muchos que tienen dos o ms ncleos. El ncleo aparece como una vescula constituida por una membrana perfectamente definida que envuelve el nucleoplasma en el que se encuentran el o los nucleolos (=cariosomas, =endosomas) y la cromatina nuclear. Estructuralmente, los ncleos pueden clasificarse en dos tipos principales: vesicular (en el que casi siempre se pueden observar uno o varios cariosomas que destacan sobre el resto del material cromatnico) y compacto (en el que el material cromtico aparece de un tamao uniforme, llenando casi todo el ncleo, por lo que ste toma un aspecto denso y compacto). b) Citoplasma: La parte extranuclear del cuerpo del protozoo es el citoplasma. Est compuesto de un sistema coloidal que a menudo est formado por una parte perifrica, densa, denominada ectoplasma, y otra parte medular fluida llamada endoplasma. En el citoplasma se encuentran distintos orgnulos como mitocondrias, aparato de Golgi, vacuolas (pulstiles o digestivas), retculo endoplasmtico, etc. que participan en las distintas funciones inherentes a la vida del protozoo. La superficie del cuerpo est cubierta por una membrana cuya estructura se corresponde, en principio, con la membrana unidad de cualquier clula. Este sera el caso de la plasma-membrana o plasmalema de muchos protozoos (amebas y algunos flagelados). En otros protozoos, como en los ciliados, la membrana limitante del cuerpo presenta una estructura mas complicada y recibe el nombre de pelcula. La alimentacin se realiza mediante diferentes mecanismos. El mas simple se denomina osmotrofia y consiste en la incorporacin de sustancias orgnicas disueltas en el medio donde viven, a travs de su membrana. Otro procedimiento es la fagocitosis, que consiste en la incorporacin de partculas slidas de tamao considerable. Por ltimo, algunos protozoos se alimentan por pinocitosis, que es un proceso similar a la fagocitosis, del que se diferencia porque el tamao de las partculas ingeridas en este caso es mucho menor. La respiracin en algunos protozoos es aerobia y en otros anaerobia. En la primera toman el oxgeno de su medio ambiente y expulsan el dixido de carbono a travs de la membrana celular. En la segunda necesitan metabolizar ciertas sustancias de las cuales obtienen el oxgeno.

Los protozoos presentan diversos mecanismos de locomocin, que se tienen en cuenta como uno de los caracteres para su clasificacin. As, muchos se mueven gracias a que poseen rganos locomotores permanentes: cilios o flagelos. En otros el movimiento se produce como consecuencia de la formacin de pseudpodos, que son proyecciones citoplasmticas temporales y retrctiles que, fijndose al sustrato, ejercen traccin sobre el resto del cuerpo del protozoo. Por ltimo, hay bastantes protozoos que carecen de rganos especficos de locomocin en casi todas las etapas de su ciclo biolgico.

Los protozoos se multiplican por reproduccin asexual (binaria o mltiple) y solo algunos tienen reproduccin sexual. El enquistamiento en los protozoos Los ciclos biolgicos de los protozoos son ms o menos complejos dependiendo de las especies o grupos que se consideren. Entre los protozoos parsitos, cuando abandonan el hospedador en el que se encuentran para pasar a colonizar otro, es frecuente que adopten una forma de resistencia llamada quiste, a fin de superar las condiciones adversas del medio externo. Estos quistes estn formados por una masa citoplasmtica en la que se observan un nmero de ncleos igual o superior al que tena el trofozoito del que derivan. Todo ello est rodeado por una cubierta resistente llamada pared qustica que lo protege de los agentes externos, lo que permite que estos quistes acten como medios de transmisin del parsito de un hospedador a otro. Para algunas especies estos quistes sirven adems como reorganizadores de la divisin nuclear e incluso en otras actan como fijadores al hospedador.

Clasificacin La clasificacin de los protozoarios se basa de acuerdo a los rganos de locomocin que poseen al tipo o nmero de ncloes, plano de divisin celular (transeversal o longitudinal), y por poseer o no la capacidad de formar esporas durante alguna etapa de su ciclo biolgico. El phylum Protozoa se subdivide en dos subphylum Subphylum Plasmodroma: incuye protozoarios que poseen pseudpodos y/o flageos para locomocin u obtencin de alimento o pueden carecer de ambos. Ncleo de un solo tipo que puede variar en nmero. Con reproduccin asexual y/o sexual. Este subphylum posee cuatro clases: 1. Clase Mastigosphora. Los protozoarios parsito de este grupo poseen de uno a varios flegelos visibles, excepto en las formas que se adhieren a la superficie del hospedero (Costia ooidinium y Euglenososma). LA reproduccin asexual es por fisin binaria longitudinal. 2. Clase Sarcodina. Poseen pseudpodos, son generalmente parsitos del tracto intstinal (en peces solo se ha encontrado a Schizamoeba salmonis). Su ciclo biolgico consiste en trofozoitos y quistes. Estos ltimos son excretados con las heces fecales y son la forma infectiva.

3. Clase Sporozoa. No poseen cilios, flagelos o pseudpodos (algunos gneros desarrollan formas amoeboides). Forman esporas al final de su ciclo biolgico; la espora consiste en uno o mas esporozoitos. Todos son parsitos y en su reproduccin involucran periodos asexuales y sexuales. 4. Clase Ciliosphora. Los miembros de esta clase poseen esporas, cada espora tiene de 1 a 6 filamentos polares y de uno o ms Desarrollo experimental Objetivos Adquirir la capacidad de identificar protozoarios presentes en diferentes muestras como el agua encharcada. Conocer algunos grupos e protozoarios y helmintos a partir de las observaciones realizadas con el microscopio. Identificar los diferentes protozoarios y helmintos que pueden parasitar al humano y a los que se pueden encontrar en vida libre. Material Microscopio Esteroscopio Muestra de agua residual o estancada Portaobjetos y cubreobjetos Aceite de imersin Preparaciones fijas y/o diapositias de: a) Fasciola heptica b) Taenia solium c) Ascaris lumbricoides d) Entamoeba histoltica e) Guardia lamblia f) Plasmodium sp.

Metodologa (Diagrama de flujo)

Recolectar una muestra de agua residual.

Las preparaciones ms grandes debes ser observadas con esteroscopio.

Esquematizar asignando clase y genero de la especie.

Realizar preparaciones del agua residual colocando una gota de la misma en un portaobjetos y posteriormente colocar un cubreobjetos.

Observar las preparaciones y/o frotias a 40x y 100x.

Observar a 10x y 40x. Esquematizar lo observado, resaltando caractersticas morfolgicas de los parsitos.

Observar las preparaciones fijos y/o proyecciones asignadas.

Transmisores, vectores y ectoparsitos

La parasitologa es una rama de la biologa que estudia el fenmeno del parasitismo. Estudia a los organismos vivos parsitos y la relacin de ellos con sus hospedadores y el medio ambiente. Convencionalmente, se ocupa slo de los parsitos eucariotas como son los protozoos, helmintos(trematodos, cestodos, nematodos) y artrpodos; el resto de los organismos parsitos (virus, procariotas y hongos). Tambin estudia las parasitosis o enfermedades causadas en el hombre, animales y plantas por los organismos parsitos. Para un estudio ms especfico, la parasitologa se divide en tres ramas:

Parasitologa mdica o clnica: Estudia los parsitos del ser humano. Zooparasitologa: Estudia los parsitos de los animales. Fitoparasitologa: Estudia los parsitos de las plantas.

Todo organismo vivo depende del ambiente en el cual vive, obteniendo de ste sus nutrientes, que en unos casos son inorgnicos (fotoauttrofos), en otros orgnicos (hetertrofos). La dependencia a un ambiente especfico determina la asociacin entre organismos vivos, supliendose as las necesidades metablicas, de una forma unilateral o bilateral. Las asociaciones entre organismos vivos se han divididos en varios tipos. La simbiosis ha pasado, de un tipo de asociacin biolgica a ser considerada como el trmino que abarca todas las asociaciones biolgicas. Tipos de simbiosis El comensalismo es una forma de interaccin biolgica en la que uno de los intervinientes obtiene un beneficio, mientras que el otro no se ve ni perjudicado ni beneficiado. El parasitismo es un tipo de simbiosis y tiene una estrecha relacin en la cual uno de los participantes, (el parsito) depende del otro (el hospedero u hospedador) y obtiene algn beneficio; lo cual no necesariamente implica dao para el hospedero. El mutualismo es una interaccin biolgica, entre individuos de diferentes especies, en donde ambos se benefician y mejoran su aptitud biolgica. El mutualismo se diferencia de otras interacciones en las que una especie se beneficia a costas de otra. Un parsito es todo ser viviente, animal o vegetal, unicelular o pluricelular, que debe sacar necesariamente su alimentacin de la sustancia de otro organismo vivo (llamado husped) Depredador muy especializado cuya accin expoliadora no causa la muerte inmediata de la especie de que toma el alimento, pero puede causrsela a largo plazo. Si acta en el exterior del patrn, se lo denomina ectoparsito; si lo hace en el interior, se le llama endoparsito.

Desarrollo experimental Objetivos Adquirir la capacidad para identificar parsitos as como la diversas formas en las que se presentan. Conocer algunos mecanismos de transmisin y propagacin de un parsito. Conocer los ciclos biolgicos de algunos parsitos. Material Microscopio Estuche de diseccin Solucin salina isotnica Colorante de giemsa Lugol Artrpodos vivos (pulgas, chinches, piojos, moscas, cucarachas, garrapatas, hormigas, termitas, etc.).

Metodologa (Diagrama de flujo)

Tomar una muestra de contenido intestinal con solucin salina y colocarla en otro portaobjetos con una gota de lugol. Colocar cubreobjetos y observar a 10x, 40x y 100x. Con el resto de contenido intestinal, hacer un frotis , fijar con metanol y tenir con colorante de Giemsa. Observar a 10x, 40x y 100x.

Obtener cuidadosamente el contenido intestinal de los artrpodos.

Tomar los insectos grandes por la cabeza con pinzas, colocarlos en una base y abrirlos con ayuda de bistur.

Tomar muestra o agregar una gota de solucin salina isotnica. Colocar cubreobjetos y observar a 10x y 40x.

Adicionar una gota de solucin salina isotnica en un cubreobjetos y colocar el contenido intestinal. Colocar cubreobjetos y observar a 10x y 40x.

Insectos pequeos: Colocar el insecto entre dos portaobjetos y presionar para obtener contenido intestinal.

Tcnica de colecta y tincin de parsitos

Los procedimientos qumicos son los ms utilizados para matar y fijar parsitos. Una buena fijacin es aquella en la cual el agente fijador penetra rpidamente y detiene de inmediato los procesos metablicos con un mnimo de distorsin o cambios degenerativos. La mayora de los fijadores son venenos citoplasmticos y actan ms rpido en caliente en forma tal que el material se conserva indefinidamente. Los mejores resultados para una buena tincin, se obtienen cuando sta se hace lo ms rpido posible despus de la fijacin. Las tinciones pueden realizarse en dos formas: Progresivas: son aquellas en las que el material se coloca en colorante diluido, durante el tiempo necesario para lograr la tincin hasta la intensidad deseada. Regresivas: son las tinciones en las que el material o preparaciones se colocan en colorante concentrado hasta lograr una sobre tincin y posteriormente decolorar hasta lograr la intensidad deseada. Para que los productos tomen el color de un colorante, ya sea uno a uno o mezclados adecuadamente a veces es necesario la accin de un mordente; generalmente se utiliza una sal compuesta de aluminio o hierro o bien un cido, ya sea antes del colorante, o adicionado a la solucin de tincin. Para procesos contrastantes es necesario utilizar ms. Conservacin Un contacto prolongado en envases con tapones de corcho, produce tinciones turbias. Nunca se debern almacenar especmenes para conservacin en frascos o recipientes con tapa metlica, pues se lamentar meses despus como la corrosin y oxidacin vuelve algunas muestras variables en lamentables prdidas. Montaje: Los especmenes ya aclarados, se montan con blsamo de Canad o resina sinttica. Para piezas grandes como progltidos de cestodos o trematodos como F. Heptica, se requiere un medio de montaje espeso, mientras que para frotes debe estar diluido para posteriormente hacer una buena observacin con objetivos de inmersin. Tincin de Wright Esta coloracin es conocida como policromtica debido a que produce varios colores. Es una solucin de alcohol metlico de un colorante cido (eosina) y otro bsico (azul de metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguneo al portaobjetos. El amortiguador, que consiste en una solucin tamponada, mantiene el pH del colorante y favorece la mejor absorcin por los diferentes componentes celulares.

Tcnica Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tincin con la sangre hacia arriba. Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Wright gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los glbulos sanguneos. El colorante deber cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deber agregarse una cantidad adicional si ste se comienza a evaporar. Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright, para evitar la coloracin dbil. Esperar la formacin de brillo metlico. Puede usarse de igual manera agua desionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos. Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensin presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin. Tincin de Giemsa Es la segunda coloracin en uso, luego de la tincin de Wright, y en importancia de las mezclas de Romanowsky. Es quizs la mejor modificacin de este tipo de coloraciones para descubrir parsitos en la sangre, como en el caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de Giemsa tambin da excelentes resultados para la tincin rutinaria de frotes sanguneos. Cuando se va a teir con este colorante, debe fijarse primero la muestra con metanol absoluto por un tiempo mnimo de tres minutos (cuando la preparacin no incluye metanol). El colorante en solucin nunca se utiliza de manera directa, por lo que se debe diluir con la solucin amortiguadora en una proporcin de 1:10 1:20 y el tiempo de coloracin podr ser de 10 20 minutos, respectivamente.

Tcnica Fijar el frotis con alcohol metlico de 3-4 minutos. En caso de que la preparacin del colorante ya posea metanol, este paso queda obviado. Sumergirlo verticalmente en una solucin de Giemsa preparada extemporalmente a partir de 1 volumen de la solucin colorante ms 9 volmenes de solucin tampn (pBs, pH 6.8) o bien en agua desionizada. Esperar durante 10-20 minutos. Lavar el frotis con abundante agua, directamente del chorro. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.

A los animales solicitados se les sacrifica en una forma rpida y lo menos dolorosa posible.

NOM-062-ZOO-1999: Especificaciones tcnicas para la produccin, cuidado y uso de los animales de laboratorio. Numeral 8: Cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los animales, que la producida por inyeccin o marcaje en orejas, requerir el uso de tranquilizantes, analgsicos o anestsicos. Numeral 9: Eutanasia. La eleccin del mtodo de eutanasia depende de la especie del animal, su cantidad y la naturaleza del estudio. El animal se coloca en un receptculo cerrado que contenga un algodn o gasa empapada en el anestsico. Los vapores se inhalan hasta que cesa la respiracin y ocurre la muerte. Manipulacin del vector Mantener vivo e integro al vector hasta la recoleccin del parsito El parsito debe ser recin extrado Debe ser representativo a la enfermedad que produce Parsitos en animales Parsitos en rata

Hymenolepis diminuta

Hymenolepis diminuta(huevo)

Hymenolepis diminuta (Proglotide) Parsitos en peces

Corynosoma wegeneri (acantocfalo) Parsitos en sapo

Acanthocephala rhadinorhynchus

Posible observacin y fijacin

Trypanosoma sp

Filaria sp

Echinostoma sp

Esclex de Diphyllobothrium latum

Corte de hgado de un caso de infeccin por Plasmodium falciparum

Desarrollo experimental Objetivos Aprender a colectar material parasitario de animales de experimentacin y domsticos. Conocer y utilizar las diferentes tcnicas de tincin, utilizadas en parasitologa. Material Microscopio Papel absorbente Estuche de diseccin Animales como; sapos, ratones, ratas, pollo, palomas, tortuga, etc. Vsceras de animales de rastro

Reactivos Solucin salina isotnica 250 mL Formaldehido 100 mL Alcohol etlico al 95% 100 mL Ac. Actico glacial 100 mL Agua destilada 100 mL Azul de cresilo en solucin salina 50 L Azul de metileno en solucin salina 50 mL Colorante de Giemsa 50 mL Colorante de Wright 50 mL Amortiguador de fosfatos pH 6.8 (Fosfato de sodio monocido, fosfato de sodio dicido) 100 mL Glicerina 10 mL Solucin de AFA 100 mL Gelatina 10 g Etanol al 50% 100 mL

Etanol al 70% 100 mL Xilol 100 mL Blsamo de Canad 50 mL Hilo de camo 1 m Lactofenol 50 mL Una caja de portaobjetos y una de cibreobjetos Azul de cresilo al 75% en solucin salina 50 mL Ringer de mamferos 200 mL Ringer de anfibios 200 mL

Metodologa Bsqueda y estudio de ectoparsitos

Localizar obtener los ectoparsitos que se encuentra en los animales.

Sacrificar los ectoparsitos

Hacer observaciones de diferentes porciones del artrpodo.

Realizar diversas preparaciones, en solucin salina y utilizando colorantes de contrate (Lugol).

Observar con ayuda del microscopio .

Sacrificar a los animales solicitados en una forma rpida y lo menos dolorosa. Se les toma sangre y:

Sangre Tcnica de gota gruesa Frotis o extensin fina de sangre

Colocar sobre un portaobjetos limpio una gota de sangre del animal estudiado y extender, formando un cuadro de 1.5 x 1.5 cm, dejar secar.

Depositar una gota de sangre del animal estudiado en un extremos del portaobjetos, con el borde de otro reallizar la extensin d ela sangre.

Mover rpidamente el segundo portaobjetos en un ngulo de 30, evitando lisar los eritrocitos.

Lisar los eritrocitos durante 810 minutos en agua destilada. Dejar secar y teir por mtodo de Giemsa. Observar a 10x, 40x y 100x.

Dejar secar, y teir con el mtodo de Wright. Observar a 10x, 40x y 100x.

Obtencin de protozoarios y helmintos El procedimiento se aplicar a todos los animales y vsceras

Cortar mediante una incicion a todo lo largo de la lnea media ventral.

Limpiar de moco y resto de tejido a los helmintos encontrados.

Conservar a los helmintos en AFA y fijar posteriormente.

Una vez abierto el animal buscar en la superficie de los rganos internos y las membranas serosas la presencia de quistes.

Realizar una impronta con una porcin pequea y delgada de algunos de los rganos del animal.

Extraer rgano por rgano, colocandolos en placas con solucin salina, de manera que cubra el rgano.

Abrir los rganos huecos con tijera y desmenuzar los esponjosos en busca de helmintios. observar el contenido del intestino en microscopio buscando protozoarios y helmintos.

Hemoparsitos
Un gran nmero de protozoarios con localizacin hemtica parasitan a los animales domsticos causando grandes prdidas econmicas ya sea por muerte de los mismos o por deterioro del organismo con la consecuente disminucin de la cantidad y calidad de sus productos y subproductos. A nivel del sistema hemtico existen protozoarios conocidos como hematozoarios por su localizacin hemtica ( Babesias, Tripanosomas y Anaplasmas ) y larvas de nematodos ( filarias ) con alta capacidad patgena. Coloracin para protozoarios hemticos La coloracin para protozoarios hemticos (hematozoarios)tiene como finalidad el poder reconocer los diferentes parsitos y facilitar un diagnstico mas exacto , luego de relizar el correspondiente examen clnico. Debe tenerse en cuenta que la mayor ayuda para un clnico es la utilizacin del laboratorio para lograr diagnsticos seguros que permita la instauracin o aplicacin de tratamientos eficientes y sistemas de profilaxis adecuados. Las coloraciones corrientemente utilizadas corresponden a las de Wright y Giemsa. Coloracin de Wright. El colorante de Wright es el mas usado en nuestro medio para el diagnstico de Hematozoarios. El colorante est compuesto de: Azul de metileno ( que tie los componentes cidos como el ncleo y el RNA citoplasmtico) y la eosina (que tie de rojo los componentes bsicos como la hemoglobina) Preparacin del colorante Wright. Colorante Wright Metanol 0.3 g 100 cc

Colocar en un mortero el colorante y adicionar peridicaamente el alcohol mientras se va macerando durante unos 15 minutos . Finalmente se debe filtrar y almacenar en frasco oscuro y tapar. Este colorante se encuentra preparado a nivel comercial. Se recomienda filtrar siempre la cantidad que se desee utilizar. Tcnica. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Secar el frotis sanguneo previamente preparado y luego fijarlo en alcohol Colocar la lmina sobre un soporte con el frotis hacia arriba Cubrir totalmente la lmina con el colorante durante tres minutos y un mximo de cuatro Dejar el colorante durante 5 7 minutos Lavar con agua destilada Dejar secar a medio ambiente Mirar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersin

Coloracin de Giemsa Preparacin del colorante

Giensa (polvo) Glicerina pura

0.75 g 35.0 cc

Mezclar ambas sustancias en un envase de vidrio que contenga perlas de vidrio. Dejar en maduracin encubando a 60 C durante 12 a18 horas y agitar peridicamente cada hora Agregar alcohol metlico puro en cantidad de 65 cc despus de enfriada la mezcla anterior Tapar bien el colorante para evitar evaporacin y contaminacin con polvo ambiental

Tcnica 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Dejar secar el frotis sanguneo a medio ambiente Fijar el frotis en alcohol metlico absoluto durante dos a tres minutos Secar a medio ambiente el frotis Sumergir la lmina en el colorante de Giensa durante 20 a 30 minutos Lavar con agua destilada y colocar la lmina verticalmente Dejar secar al aire Mirar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersin

Diagnostico de filariasis El diagnostico de la filariasis se basa en el hallazgo de sus primeras larvas o microfilarias. La muestra a examinar debe ser sangre por considerarse la va evolutiva que buscan las microfilarias para alcanzar a sus vectores. Las tcnicas comnmente utilizadas para el diagnostico directo de microfiliarias utilizan sangre con anticoagulante en proporcin de y gota de cido etil-diamino- tetra-actico (EDTA) por cada 1-2 ml de sangre, corresponden a: Preparaciones frescas, Woo del tubo capilar y Knott modificado. Dentro de la gama de Hemoparsitos y sus agentes vectores descritos en el continente tenemos a especies exoglobulares pertenecientes al Gnero Trypanosoma (Trypanosoma gambiense, producen la enfermedad del sueo. Trypanosoma rhodesiense, producen la enfermedad del sueo. Trypanosoma cruzi, produce la enfermedad de Chagas. Trypanosoma rangeli, no patgeno en humanos, pero produce alteraciones en los canes y equinos. Las especies de Plasmodium que afectan al hombre son: Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale. Los gneros de filarias que afectan al hombre son: con Vaina: Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa loa. Sin vaina: Onchocerca vlvulus, Dipetalonema perstans, Mansonella ozzardi Gnero Trypanosoma: Trypanosoma tiene un complejo ciclo de vida, inclusive con diferentes formas morfolgicas especialmente en las especies que transmiten va invertebrados. Tendrn una variedad de diferentes formas en el invertebrado husped, y en los huspedes vertebrados las clulas toman una caracterstica forma llamada tripomastigota, donde el flagelo corre de atrs hacia adelante de la clula y se conecta por una membrana ondulante plateada.

Morfologa Presenta tres formas distintas: amastigota, epimastigota y tripomastigota.

Amastigota: esfrico u ovalado, es la forma reproductiva en el interior de las clulas mamferas.

Epimastigota: alargado y con el cinetoplasto localizado anteriormente al ncleo, es la forma reproductiva en el tracto digestivo de los invertebrados y en medios de cultivo.

Tripomastigote: tambin alargado, pero con el cinetoplasto localizado posteriormente al ncleo. Se encuentra en la sangre de los mamferos y es la forma infectante de ellos. Esta forma no se divide. Patogenia Produce la llamada enfermedad de Chagas en Amrica. La diseminacin del T. cruzi se da por el contacto con las heces de insectos del tipo hempteros (chipo) entrando los parsitos por la herida causada por su picadura; llegan al del torrente sanguneo (forma tripomastigota metaciclico) viajando hacia los diferentes rganos y tejidos, replicndose principalmente en tejidos musculares y nervioso (forma amastigota). Pueden producir cardiopata chagasica daos irreparables en los plexos mientricos del tracto gastrointestinal, haciendo que la persona presente megaesfago, megacolon y que eventualmente muera, adems de todo esto la persona puede no presentar sntomas lo que beneficia al parsito ya que a travs del tiempo sea ms patgeno.

Desarrollo experimental Objetivos El alumno aprender a realizar tcnicas hematolgicas para determinar los parsitos presentes en sangre. Que el alumno tenga el conocimiento de las tcnicas que se utilizan en la actualidad para determinar parsitos presentes en sangre. Familiarizar al alumno con el manejo de muestras sanguneas para su posterior anlisis.

Material Microscopio Aceite de imersin Frotis o preparaciones realizadas en la prctica anterior Canastillas para tincin o en su defecto cajas petri Una caja de portaobjetos Una caja de cubreobjetos Laminila de lectura de la tcnica de ELISA Lector de ELISA

Reactivos Metanol 100 mL Colorante de Giemsa 50 mL Colorante de Wright 50 mL Amortiguador de fosfatos para la tincin de Giemsa y para la tincin de Wright, 100 mL para cada uno

Metodologa Tincin de Wright

Colocar el portaobjetos en la canastila para tinciny sumerjirlas totalmente en el recipiente que contiene colorante de Wright.

Despues de 5 minutos ecurrir la canastilla y sumerjirla en solucin amortiuadora.

Despues de 5 minutos enjuagar con agua de la llave.

Dejar secar y observar en microscopio a 10x, 40x y 100x.

Tincin de Giemsa

En un frotis delgado es necesaria la fijacin con metanol.

Si se llega a sobreteir repetir el lavado.

Secar y leer al microscopio a 10x, 40x y 100x.

Colocar los portaobjetos en canastilla spara tincin y sumerjirlas en un recipiente con metanol durante 20 minutos.

Sacar y dejar secar la preparacin y lavar con solucin amortiguadora (unas gotas del colorante en agua destilada) por 5 minutos

Dejar secar el frotis al aire.

Colocar la canastilla en el recipiente que contiene colorante de Giemsa durante 10 minutos.

Realizar el mismo proceso de tincin para las improntas. Marcar los portaobjetos antes de realizarlas tinciones con lpiz punta de diamante.

Coproparasitoscopico
Un examen coproparasitoscopico es el estudio de material fecal para la bsqueda e identificacin de formas parasitarias. Puede ser cualitativa o cuantitativa. En este estudio, el material fecal ms utilizado es el recin obtenido por expulsin natural del paciente, ya sean bien formadas o ecuaciones diminutas en consistencia con moco o sangre. Este mtodo es de gran utilidad para la deteccin en fresco de trofozoitos de Entamoeba histolitica, Giardia lamblia y Balantidium coli. En la suspensin teida con lugol se puede identificar con facilidad quistes de protozoos. Este examen en fresco es sencillo, rpido y econmico, pues requiere poco material. Es excelente para la bsqueda de trofozoitos y protozoos. Es eficaz para la bsqueda e identificacin, de quistes, huevos y larvas. FROTIS FRESCO Es un mtodo rpido pero poco seguro. Tiene posibilidad de falsos negativos, por lo que es necesario repetir. Permite observar la motilidad de los microorganismos, Amibas y otros flagelados. Detecta quistes y huevos de helmintos. Desarrollo experimental Objetivos Realizar un examen macroscpico y microscpico de la materia fecal Determinar la presencia de parsitos en la materia fecal Material Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Tubos de ensayo de 13x100 para centrfuga Gasa Centrfuga clnica

Reactivos Muestra d emateria fecal, 100 g aproximadamente del tamao de una nuez, contenida en un frasco de boca grande. Sulfato de zinc al 33%, 500 mL con densidad de 1.180 +/- 0.02, 50 mL Lugol propio para las tcnicas de CPS, 50 mL.

Metodologa Tecnicas coproparasitoscopicas

Examen macroscpico Reportar las caractersticas que presenta la materia fecal por estudiar.
Examen microscpico

Color Consistencia Presencia de sangre o moco Deteccin de parsitos macroscpicos Composicion

CPS directo. Con un abatelenguas tomar una pequea cantidad de materia fecal y colocar en un portaobjetos con dos gotas de lugol.

Colocar un cubreobjetos y observar en microscopio a 10x y 40x.

Tcnica de flotacin de Faust

Agregar agua (hasta cubrir la muestra) al frasco con materia fecal y disolver moviendo con abatelenguas .

Verter sobre una gasa doblada colocada dentro de un embudo, agregar poco a poco agua destilada para macerar la muestra y recolectar el lquido en un tubo de ensayo.

Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 3 minutos, desechar el sobrenadante y agregar al sediemento aga para resuspender.

Repetir la centrifugacin hasta obtener un sobrenadante ms claro.

Eliminar el sobrenadante de la ltima centrifugacin y agregar al sedimento lentamente por as paredes solucin de sulfato de zinc al 33% hast 3/4 del tubo y centrifugar a 2500 r.p.m. por 3 minutos

Sin eliminar el sobrenadante y sin agitar agregar cuidadossamente ms solucin se sulfato de zinc hasta formar un menisco cncavo en la boca del tubo.

Colocar un cubreobjetos sobre el menisco formado en la boca del tubo 2 minutos

Transferir el cubreobjetos a un portaobjetos que contenga 2 gotas de lugol y observar a 10x y 40x en microscopio.

Observacin de estructuras de hongos

Los hongos presentan un conjunto de caractersticas propias que permiten su diferenciacin de las plantas: no sintetizan clorofila, no tienen celulosa en su pared celular, excepto algunos hongos acuticos y no almacenan almidn como sustancia de reserva.

La presencia de sustancias quitinosas en la pared de la mayor parte de las especies fngicas y su capacidad de depositar glicgeno los asemejan a las clulas animales. Los hongos son seres vivos eucariticos, con un solo ncleo, como las levaduras, o multinucleados, como se observa entre los hongos filamentosos. Su citoplasma contiene mitocondrias y retculo endoplasmtico rugoso. Son heterotrficos y se nutren de materia orgnica muerta (hongos saprfagos) o viva (hongos parsitos). Sus clulas poseen vida independiente y no se renen para formar tejidos verdaderos.

Los componentes principales de la pared celular son hexosas y hexoaminas. Algunos hongos tienen pared rica en quitina (N-acetil glicosamina), otros poseen complejos polisacridos y protenas, con predominancia de cistena. Hongos del gnero Cryptococcus, como el Cryptococcus neoformans presentan cpsula de naturaleza polisacardica, que envuelve la pared celular. Los protoplastos de hongos, pueden ser obtenidos por el tratamiento de sus cultivos, en condiciones hipertnicas con enzimas de origen bacteriana o extradas del caracol Helix pomatia. Los hongos son ubicuos, encontrndose en el suelo, en el agua, en los vegetales, en animales, en el hombre y en detritos en general. El viento acta como importante vehculo de dispersin de sus propgulos y fragmentos de hifas. Estructura de los Hongos Los hongos pueden desarrollarse en medios de cultivo especiales formando colonias de dos tipos:

Levaduriformes Filamentosas Las colonias levaduriformes son pastosas o cremosas, formadas por microorganismos unicelulares que cumplen las funciones vegetativas y reproductivas. Las colonias filamentosas pueden ser algodonosas, aterciopeladas o pulverulentas; son constitudas

fundamentalmente por elementos multicelulares en forma de tubo: las hifas. Las hifas pueden ser contnuas o cenocticas y tabicadas o septadas. Poseen hifas septadas los hongos de las divisiones Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota y divisiones Mastigomycota e Zygomycota. poseen hifas cenocticas los de las

Al conjunto de hifas se da el nombre de micelio. El micelio que se desarrolla en el interior del sustrato, funcionando tambin como elemento de sustentacin y de absorcin de nutrientes es llamado micelio vegetativo. El micelio que se protege en la superficie y crece por encima del medio de cultivo es el micelio areo. Cuando el micelio areo se diferencia para sustentar los cuerpos de fructificacin o propgulos, constituye el micelio reproductivo. Los propgulos u rganos de diseminacin de los hongos, son clasificados, segn su origen, en externos e internos, sexuados y asexuados. Ms all que el micelio vegetativo no tenga especficamente funciones de reproduccin, algunos fragmentos de hifa pueden desprenderse del micelio vegetativo y cumplir funciones de propagacin, una vez que las clulas fngicas son autnomas. Estos elementos son denominados taloconidios y comprenden los:

Blastoconidios Artroconidios Clamidoconidios Los blastoconidios tambin denominados gmulas, son comunes en las levaduras y se derivan por brote de la clula madre. A veces, los blastoconidios permanecen enlazados a la clula madre, formando cadenas, las pseudos hifas, cuyo conjunto es el pseudomicelio.

Los artroconidios estn formados por fragmentacin de las hifas en segmentos rectangulares. Se encuentran en los hongos del gnero Geotrichum, en Coccidioides immitis y en Dermatfitos.

Los clamidoconidios tienen funcin de resistencia, semejantes a la de las esporas bacterianas. Son clulas, generalmente redondeadas, de volumen aumentado, con paredes dobles y espesas, en las cuales se concentra el citoplasma. Su localizacin en el micelio, puede ser apical o intercalar. Se forman en condiciones ambientales adversas, como escasez de nutrientes, agua y temperaturas no favorables al desarrollo fngico.

Entre otras estructuras de resistencia deben ser mencionados los esclerotos, que son corpsculos duros y parenquimatosos, formados por el conjunto de hifas y que permanecen en estado de hibernacin hasta la aparicin de condiciones adecuadas para su germinacin. Son encontrados en especies de hongos de las divisiones Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota

Objetivos Reconocer las principales estructuras de hongos filamentosos y levaduriformes Adquirir la capacidad de diferenciar los tipos de esporas sexuales y asexuales. Adquirir experiencia para ser capaz de diferenciar a los hongos de otros tipos de microorganismos. Material Microscopio Preparaciones semipermanentes de hongos: 1. Calse Deuteromycota: a) Penicilium sp. b) Aspergillus sp. c) Geotrichum sp. d) Curvalaria sp. e) Alternaria sp.

f) Fusarium sp. 2. Phylum Zygomicota a) Mucor sp. b) Rhizopus sp. 3. Levaduras a) Blastoesporas b) Esporas sexuales Metodologia

Observar las preparaciones semipermanentes al microscopio en 10x y 40x.

Realizar los dibujos y registrar lo que se observo.

Aislamiento de hongos de diferentes fuentes

Desarrollo experimental Objetivos Demostrar la presencia y distribucin de los hongos que se encuentran en el medio ambiente. Analizar la morfologa de los hongos que se han obtenido de diversas fuentes. Realizar la identificacin y clasificacin de los hongos aislados de los diferentes especmenes trabajados. Material Microscopio 4 cajas Petri que contengan agar Sabouraud glucosado 2 cajas con agar Littman 6 tubos de 15x100 con 4.5 mL de solucin salina estril Portaobjetos y cubreobjetos Asa y porta asa 4 cajas Petri estriles Muestras de frutas, verduras y tierra contaminadas de hongos.

Reactivos Agar Littman Agar Sabouraud KOH al 10% Azul de algodn de lactofenol Lugol Mezcla de antibiticos; Penicilina-Estreptomicina 1:1 Hipoclorito de sodio comercial

Metodologa Aislamiento de hongos del aire

Destapar la caja Petri con agar Sabouraud y exponerla a las corrientes de aire por 15 minutos. Repetir el procedimiento con agar Littman. Se debe vigilar el crecimeiento de las colonias de hongos que crezcan.

Incbar la caja en un lgar humedo y libre de cualquier tipo de contaminacin.

Registrar las aractersticas macroscopocas de lo que se desarrollo en los medio de cultivo.

Aislamiento de hongos del suelo

Cernar la muetra de tierra, seleccionando la que este seca o ligeramente hmeda.

Pesar 0.5g de tierra y agregar a un tubo que contenga 4.5 mL de solucin salina estril con una dilucin de 1:10.

Realizar diluciones hasta alcanzar 10-5 y 10-6.

Verter agar sabouraud en dos de las cajas con diferente dilucin. Repetir rl procedimiento con el agar Littman.

Tomal 1 mL de la dilucin 105 y verter en dos cajas Petri esteriles diferentes. Repetir el procedimiento con la dilucin 10-6.

Preparar los medios Sabouraud y Littman, cuando esten fundidos y a temperatura de 25-30, aadir dos gotas de la mezcla de antibiticos.

Incubar las placas sembradas a temperatura ambiente y en un lugar hmedo.

Realizar lectura y reportar las caractersticas maroscpicas de los hongos desarrollados en las cajas Petri.

Aislamiento de hongos de frutas y verduras Cortar una pequea porcin del tejido de la fruta o verdura donde se encuentra el hongo con asa, pasar por hipoclorito. Si el hongo no tiene aspecto pastoso, este paso no es necesario.

Sembrar en una caja Petri con agar sabouraud, reptir para la caja con agar Lttman. La siembra se realiza por puncin superficial del hongo en el centro de la caja.

En caso de ser varias muestras, dividir las cajas y sembrar en el centro de cada divisin.

Realizar la lectura y reportar las caractersticas macroscpicas de lo que se desarrollo en la caja Petri.

De los especmenes trabajados en la prctica, reportar: a) Lugar donde se obtuvo Fuente de aislamiento Fecha de aislamiento Caractersticas macroscpica de las colonias como: Pigmentacin de la colonia, del frente y reverso, centro y periferia, diferentes zonas areas y en distintos periodos de incubacin. b) Consistencia c) Tipo de crecimiento: radial, lento, rpido, etc.