CAPTULO 2.8.

PESTE PORCINA CLSICA (clera del cerdo)

RESUMEN
La peste porcina clsica (PPC), tambin denominada clera del cerdo, es una enfermedad vrica contagiosa de los cerdos. El agente causal es un miembro del gnero Pestivirus de la familia Flaviviridae, estrechamente relacionado con los virus de la diarrea bovina fetal y de la enfermedad de la frontera. Solo existe un serotipo de virus de la PPC (CSFV). La enfermedad puede tener un desarrollo agudo, subagudo, crnico, de aparicin tarda o inaparente, dependiendo de varios factores vricos y del hospedador, siendo los ms importantes la edad de los animales, la virulencia del virus y el tiempo de infeccin (pre- o post-natal). Los cerdos adultos suelen mostrar menos sntomas graves de la enfermedad que los jvenes y tienen mayor probabilidad de supervivencia. En las cerdas gestantes, el virus puede atravesar la barrera placentaria e infectar a los fetos. La infeccin intrauterina con cepas del virus de baja o moderada virulencia origina lo que se conoce como el sndrome de la cerda portadora, que se caracteriza por la muerte prenatal o perinatal, el nacimiento de lechones enfermos o una camada aparentemente "sana" pero infectada persistentemente. Un brote de PPC tiene graves consecuencias econmicas para el mercado de los cerdos y de sus productos derivados. La elevada variabilidad clnica de la PPC dificulta a menudo el diagnstico realizado sobre bases clnicas y patolgicas. Los mtodos de laboratorio son por tanto, esenciales para un diagnstico inequvoco. La deteccin del virus, del cido nucleico vrico en la sangre y de anticuerpos en el suero son los mejores mtodos para diagnosticar PPC en cerdos vivos, mientras la deteccin del virus o del cido nucleico vrico o del antgeno en muestras de rganos resulta ms adecuada en cerdos muertos. Identificacin del agente: Para la deteccin del antgeno de la PPC puede utilizarse la inmunofluorescencia directa (IFD) en cortes de rganos de cerdos afectados. Para determinar si la fluorescencia se debe a antgenos de PPC o de Pestivirus que no producen PPC se emplean varios anticuerpos monoclonales. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza generalmente para la deteccin del fenmeno de la PPC. El aislamiento del CSFV se debe intentar en la lnea celular de rin de cerdo (PK-15) o en otra lnea celular adecuada. El crecimiento del virus en los cultivos se examinan por inmunofluorescencia o tincin con inmunoperoxidasa; los aislamientos positivos se caracterizan posteriormente por medio de MAbs y por secuenciacin gnica parcial. Los protocolos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa para la identificacin del cido nucleico del CSFV, estn actualmente ganando aceptacin internacional y se estn utilizando en varios laboratorios, tanto para la deteccin del agente como para la diferenciacin de los pestivirus de los rumiantes. Los enzimoinmunoensayos de captura antignica (ELISA) son tambin tiles para realizar una criba en la piara pero no deben utilizarse en base a un solo animal. Pruebas serolgicas: La deteccin de los anticuerpos especficos contra el virus es particularmente til en las piaras donde se sospecha una infeccin por CSFV iniciada al menos 21 das antes. Los mtodos serolgicos son tambin adecuados para el control y para estudios de prevalencia, y resultan esenciales en el caso de que un pas desee el reconocimiento internacional de estar exento de la enfermedad sin vacunacin. Como en los cerdos de cra se observan ocasionalmente anticuerpos contra CSFV que muestran reaccin cruzada con los pestivirus de los rumiantes, las pruebas de anlisis deben acompaarse de pruebas confirmativas que sean especficas para CSFV Algunas pruebas ELISA son relativamente especficas para CSFV pero la prueba de la neutralizacin comparativa es el mtodo

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definitivo de diferenciacin, y compara el nivel de anticuerpos frente a diferentes especies de Pestivirus. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Las vacunas contra la PPC contienen un virus vivo que se ha atenuado mediante pases en cultivos celulares o a travs de los hospedadores adecuados que no pertenezcan a la familia Suidae. La produccin de estas vacunas con virus vivos modificados (MLV) se basa en un sistema de lotes de inculos que se ha validado respecto a la identidad del virus, esterilidad, pureza, seguridad, falta de transmisin, estabilidad e inmunogenicidad. Si se utiliza el CSFV para la produccin de vacunas o en estudios de infeccin experimental, las instalaciones deben cumplir los requisitos de Contencin de la OIE para patgenos del Grupo 4. No se dispone de vacunas convencionales eficaces con virus completos inactivados. Estn disponibles subunidades de vacunas marcadoras que, en contraste con las vacunas con MLV, inducen anticuerpos que pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural utilizando una prueba diagnstica de acompaamiento. Las vacunas marcadoras registradas en la actualidad se basan en la principal glicoprotena de la envoltura vrica del CSFV (subunidad E2), y se producen en los insectos mediante la tecnologa de ADN recombinante.

A. INTRODUCCIN
Los virus que causan la peste porcina clsica (PPC), la diarrea vral bovina (DVB) y la enfermedad de la frontera (EF) son miembros de la familia Flaviviridae, gnero Pestivirus, y estn estrechamente relacionados entre s tanto antignica como estructuralmente. Los sntomas clnicos y las lesiones observadas post mrtem en los cerdos afectados por PPC son muy variables debido a factores dependientes del virus y de los hospedadores. Adems, las infecciones congnitas con pestivirus de rumiantes pueden dar lugar en cerdos a una enfermedad clnica que es indistinguible de la PPC (31, 33, 35). Los sntomas ms destacados de la enfermedad son su aparicin en todos los grupos de edad, acompaada por pirexia, agrupamiento de animales, inapetencia, torpeza, debilidad, conjuntivitis, estreimiento seguido de diarrea y ataxia. Varios das despus de la aparicin de los sntomas clnicos, las orejas, el abdomen y la parte interna de los muslos pueden mostrar una decoloracin morada. Los animales con la enfermedad en forma aguda mueren en 13 semanas. La muerte sbita en ausencia de enfermedad clnica no es sintomtica de la PPC. En algunas circunstancias relacionadas con la edad del animal y su condicin, as como con la cepa de virus implicado, puede aparecer la enfermedad en forma subaguda o crnica y durar 24 semanas o incluso meses. La enfermedad crnica acarrea una disminucin del crecimiento, anorexia, pirexia intermitente y diarrea. Las infecciones congnitas persistentes pueden pasar indetectables durante meses y limitarse solo a unos cuantos lechones de la piara o puede afectar a una gran cantidad. Los sntomas clnicos son inespecficos: debilidad en ausencia de pirexia. Las infecciones crnicas y persistentes siempre conducen a la muerte del animal. Las tasas de mortalidad en la piara pueden superar ligeramente el nivel esperado. La PPC afecta al sistema inmune, y una caracterstica es una leucopenia generalizada, que a menudo puede detectarse antes de la aparicin de la fiebre. La inmunosupresin puede acarrear infecciones concurrentes. En casos agudos, las lesiones patolgicas graves pueden ser a menudo poco llamativas o estn ausentes. En los casos tpicos, los ndulos linfticos se inflaman y enrojecen, y se presentan hemorragias en la serosa, en las membranas mucosas de los rganos intestinales. Pueden ocurrir infartos del bazo, los riones, la vejiga urinaria, la piel y bajo la dermis. En los casos subagudos y crnicos, adems de las lesiones anteriores, pueden observarse lceras necrticas o en botn en la mucosa del tracto gastrointestinal, la epiglotis y la laringe. Los hallazgos histopatolgicos no son patognomnicos. Las lesiones pueden incluir una degeneracin parenquimatosa del tejido linftico, proliferacin celular del tejido vascular intersticial y una meningoencefalitis no supurativa, con o sin desgarro vascular. Una fuente autorizada ha publicado recientemente una crtica til sobre el diagnstico de la PPC y su vacunacin (3) que, a modo de gua general, tambin proporciona fuentes de informacin sobre la validacin y la opinin cientfica acerca de la aplicabilidad de ciertos productos comerciales.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
La variabilidad de los sntomas clnicos y de las lesiones post mrtem no suministran una evidencia firme para establecer un diagnstico inequvoco. Otras enfermedades vricas pueden confundirse con la PPC, como la peste porcina africana, la dermatitis y el sndrome de neuropata porcinos (PDNS), el sndrome de debilidad

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multisistmica post-destete (PMWS), la prpura trombocitopnica y varias enfermedades septicmicas como la salmonelosis (especialmente la producida por Salmonella choleraesuis), la erisipela, la pasteurelosis, la actinobacilosis (producida por Actinobacillus suis) y las infecciones con Haemophilus parasuis. De hecho, estas bacterias causan frecuentes infecciones concurrentes y el aislamiento de estos patgenos puede enmascarar al virus de la PPC (CSFV) como la causa real de la enfermedad. De forma similar, los PDNS pueden enmascarar una infeccin latente por PPC. Por tanto, un diagnstico presuntivo basado en sntomas clnicos y en lesiones post mrtem debe confirmarse con las investigaciones en el laboratorio. Dado que la pirexia es uno de los primeros signos de la PPC y est acompaada por una viremia (7), la deteccin del virus o del cido nucleico vrico en sangre, recogida en heparina, en etilndiamino tetraactico (EDTA), o en tejidos recogidos de algunos animales febriles, es el mtodo preferido para detectar las piaras infectadas en la fase inicial. De este modo, las pruebas laboratoriales de diagnstico van a ser fundamentales considerando las graves consecuencias que puede tener un brote de PPC en el mercado de ganado porcino y de sus productos derivados. Los mtodos de laboratorio para el diagnstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el cido nucleico vrico o los antgenos vricos, o bien a la deteccin de los anticuerpos especficos. Para una interpretacin correcta de los resultados de estas pruebas, el inspector veterinario debe prestar una atencin particular a la presentacin simultnea de dos o ms de los sntomas predominantes de la enfermedad citados anteriormente. Para el diagnstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar. Adicionalmente, se pueden tomar muestras de sangre de un grupo mayor de cerdos para la deteccin de los virus y los anlisis mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR) pueden recogerse de un nmero mayor de cerdos. La PPC est bajo control oficial y el virus tiene un elevado riesgo de dispersin desde el laboratorio: en consecuencia, debe realizarse un anlisis de riesgos para determinar el nivel necesario de seguridad para el diagnstico y la caracterizacin del virus. La instalacin debe cumplir los requisitos del Grupo de Contencin apropiado segn determina la estimacin de riesgos resumida en el captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales. Los pases sin acceso a un laboratorio regional o nacional especializado de ese tipo, deberan enviar las muestras a un laboratorio de referencia de la OIE. Los anticuerpos aparecen en la tercera semana de la enfermedad y persisten durante toda la vida del animal superviviente. Las muestras para deteccin de los anticuerpos se recogen en tubos ordinarios (no heparinizados) cuando hayan transcurrido 3 semanas o ms desde que ocurri el contacto sospechoso con un brote confirmado, utilizando cerdos convalecientes y piaras en contacto.

1.
a)

Identificacin del agente

Mtodos inmunolgicos
Prueba de inmunofluorescencia La prueba de inmunofluorescencia (IFD) es una prueba rpida que puede utilizarse para detectar el CSFV en cortes finos de amgdalas, bazo, rin, ndulos linfticos o porciones distales del leon. Los tejidos deben recogerse de varios animales (febriles y o enfermos) (4) y transportarse sin conservantes en fro, pero no congelados. Los cortes se tien directamente con inmunoglobulina anti-PPC conjugada con isotiocianato de fluorescena (FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se examinan en un microscopio de fluorescencia. El tejido de las amgdalas es el ms adecuado durante la primera fase de la infeccin, ya que es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de infeccin (25). En casos subagudos y crnicos, el leon es con frecuencia positivo y a veces, puede ser el nico tejido que muestre fluorescencia. Un resultado negativo por IFD no elimina por completo la presencia de infeccin de la PPC. Cuando se mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener ms muestras o intentar el aislamiento del virus en cultivo celular (por ejemplo, en rin porcino [PK-15] u otra lnea celular de origen porcino que sea sensible y que se conozca que est libre de contaminacin con Pestivirus). Existe un riesgo relativamente alto de resultados falsos (positivos y negativos) cuando la IFD es utilizada por los laboratorios no muy familiarizados con el mtodo. Por tanto, la IFD debera utilizarse solo por laboratorios que tienen experiencia en el uso de esta tcnica, en aplicarla de forma rutinaria y hayan tenido entrenamiento en la interpretacin de la fluorescencia. Procedimiento de la prueba

En cada serie de muestras de rganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo. i) ii) Se corta un trozo de las amgdalas, bazo, rin o leon, de aproximadamente 1 1 0,5 cm, y se monta con un compuesto criosttico o con agua destilada en un criostato. Se congela el trozo de rgano en el criostato.

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iii)

Se cortan secciones de un grosor menor de 48 m y se montan en cubres libres de grasa de 10 32 mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posicin (por ejemplo, arriba a la derecha). Despus de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analtico) durante 10 minutos a temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37C. Los cortes se sumergen brevemente en una solucin salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina el exceso de lquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en una cmara de incubacin hmeda con un pequeo volumen de agua colocada en el fondo de la cmara. Se deposita la solucin de trabajo de inmunoglobulina anti-PPC en los cortes y se incuban en la cmara cerrada durante 30 minutos a 37C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se aade la dilucin de trabajo del conjugado con FITC, incubndose como se ha descrito antes. Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente.

iv) v)

vi)

vii)

viii) Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampn de montaje en un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta). ix) Se elimina el exceso del lquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para la fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra clulas con fluorescencia verde brillante. En las amgadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la lnea epitelial de las criptas. En cortes de rin, la fluorescencia es ms abundante en los tbulos proximales y distales del crtex renal y en los conductos colectores de la mdula. En el leon, la fluorescencia es ms destacable en las clulas epiteliales de las glndulas de Lieberknhn, mientras que en el bazo la reactividad es ms difusa, con concentraciones de clulas linfoides en la lmina linfoide periarterial (PALS).

La IFD requiere utilizar una inmunoglobulina anti-PPC preparada a partir de un anticuerpo policlonal contra el CSFV que no distingue entre los antgenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para IFD en cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-CSFV de cerdos libres del patgeno especfico. La dilucin de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un mximo de brillo con un mnimo de fondo. La prueba debera realizarse solo en muestras de animales recin muertos, dado que la autolisis y la contaminacin bacteriana a menudo dan como resultado una tincin de fondo alta. Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los ndulos linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amgdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV pueden dar la prueba IFD positiva 2 semanas despus de la vacunacin (22, 28). La inoculacin en conejo se utiliza para diferenciar entre las cepas de CSFV adaptadas a conejo y las cepas de campo. A diferencia de las cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reaccin febril e inducen una respuesta inmune en los conejos cuando se suministran intravenosamente.CSFV adaptadas al conejo. Dado que la secuenciacin del cido nucleico empieza a estar disponible y es ms fiable, la inoculacin de los animales ya no se considera necesaria para diferenciar entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV. En la prueba IFD, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas. Las infecciones congnitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar sntomas clnicos y lesiones patolgicas indistinguibles de las presentes en la PPC crnica (31, 33, 35). Las infecciones por CSFV o por pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros animales en contacto con un lechn IFD-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Si se asla el virus o se puede detectar el cido nucleico vrico utilizando la RT-PCR, las secuencias posteriores proporcionan una herramienta rpida y precisa para distinguir entre los pestivirus de los rumiantes y el CSFV. Otro mtodo para distinguir estos virus es por inoculacin de lechones seronegativos con una suspensin de material sospechoso seguido de al menos 4 semanas de pruebas de neutralizacin vrica (NV) en sus sueros para los anticuerpos respectivos. Sin embargo, las pruebas NV pueden durar varios das y los mtodos de inoculacin en los animales duran varias semanas. Diferenciacin de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa

La utilizacin de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de rbano (HRPO) o con FITC, o usados en conjuncin con un conjugado anti-ratn, que sean capaces de detectar de modo especfico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitiran, por una parte, una diferenciacin inequvoca entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (11,

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36, 38). Un prerrequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el pas. No hay ningn MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de los rumiantes (11). En reas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como nica confirmacin de que un aislamiento corresponde a la PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el pas. No hay ningn MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En reas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como la nica confirmacin de que un aislamiento corresponde a PPC. i) ii) iii) Procedimiento de la prueba Se cortan ocho o ms secciones (48 m) de las amgdalas que son positivas por IFD, o de otro rgano positivo si no se dispone de amgdalas. Se fijan los cortes con acetona (grado anlitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al aire. Se preparan diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS + 0,01% de Tween 80 + suero de caballo al 5%, pH 7,6. (tambin puede utilizarse MAb conjugado con FITC, as como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario). Despus de lavar con PBS, se depositan en la dilucin de trabajo del conjugado monoclonal respectivo dos cortes, y otros dos en la dilucin de trabajo del conjugado policlonal (controles). Se incuba durante 1 hora a 37C en una cmara hmeda. Se lavan seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez. Se tien los cortes con una solucin recin preparada de cromgeno del substrato1 durante 5 15 minutos a temperatura ambiente.

iv) v) vi) vii)

viii) Se lavan los cortes con acetato sdico 0,05 M, pH 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para microscopa. ix) Se examinan las secciones en un microscopio de fondo claro. La tincin del citoplasma de las clulas del epitelio de las criptas de las amgdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo. Interpretacin de la prueba:
Anticuerpo policlonal Anticuerpo monoclonal especfico para Interpretacin Cepa PPC Cepa PPC vacunal Cepa DVB/EF

x)

+ + + +

+ +

Cepa de campo de la PPC Cepa vacunal de la PPC Cepa DVB/EF Otros Pestivirus*, no PPC

Se debe considerar siempre la existencia de cepas nuevas de la PPC, y cualquier aislamiento de casos en que se sospeche

la PPC debera enviarse al laboratorio de referencia de la OIE.

Prueba de captura del antgeno

Para un diagnstico rpido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura del antgeno (ELISA) para investigar en piaras en las que se sospecha que se han infectado recientemente. Las pruebas ELISA son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra varias protenas vricas en el suero, en la fraccin leucocitaria de la sangre o en
Solucin de cromgeno del substrato Solucin base de cromgeno: 0,4% de 3-amino-9-etil carbazol; N, N-dimetil-formamida (1 ml). Cuidado, compuesto TXICO. Esas dos sustancias con cancergenas y producen irritacin en los ojos, la piel y el aparato respiratorio B. Acetato sdico 0,05 M, pH 5,0; 19 ml (esterilizados por filtracin con membrana). C. Solucin base de substrato (perxido de hidrgeno al 30%). Mantener las soluciones base A y C a 4C en la oscuridad y la solucin B a temperatura ambiente. La solucin base A puede mantenerse a 4C durante al menos 6 meses y la solucin C 1 ao. Inmediatamente antes de su uso, diluir 1 ml de la solucin A en 19 ml de la solucin B. Aadir despus 10 l de la solucin base C. Mezclar bien y teir los cortes. 1 A.

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sangre completa anticoagulada; adems, se pueden utilizar algunos kits de prueba para probar homogeneizados titulares clarificados (8). La tcnica es relativamente simple de realizar, no requiere servicios de cultivo de tejidos, se puede automatizar y se pueden conseguir los resultados en medio da. La desventaja de que es menos sensible que el aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos suaves o subclnicos, puede compensarse probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia. No obstante, debe tenerse tambin en cuenta la baja especificidad de estas pruebas. La prueba no es apropiada para el diagnstico de la PPC en un solo animal.

b)

Aislamiento de virus
El aislamiento de virus en cultivos celulares es un mtodo de diagnstico de PPC ms sensible, pero ms lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento se realiza mejor en clulas PK-15, que se dividen rpidamente, y que se siembran sobre cubres simultneamente con una suspensin de las amgadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras lneas celulares, pero deberan ser por lo menos tan sensibles como las clulas PK-15. Los cultivos se examinan para focos fluorescentes por IFD despus de 2472 horas o, despus de 4 das de incubacin, se fijan por tincin con inmunoperoxidasa. Para fines de diagnstico, el rgano ms adecuado para aislar el virus de los cerdos muertos o sacrificados son las amgdalas. Alternativamente, tambin se pueden utilizar el bazo, el rin, el leon o los ndulos linfticos. Un procedimiento detallado del aislamiento de virus es el siguiente: i) Se prepara una solucin base concentrada 100 veces de glutamina-antibitico: disolver la glutamina (2,92 g) en 50 ml de agua destilada (solucin A) y se esteriliza por filtracin. Se disuelve cada uno de los siguientes antibiticos en 510 ml de agua destilada estril: penicilina (106 Unidades Internacionales [UI]; estreptomicina (1 g); mycostatn (5 105 U); polimixina B (15 104 U); y kanamicina (1 g). Se juntan estas soluciones (solucin B). Se mezclan aspticamente las soluciones A y B, y se completa hasta 100 ml con agua destilada estril y se guarda a 20C en alcuotas de 5 ml. La constitucin exacta del antibitico no es definitiva siempre que se consiga la esterilidad y las clulas no estn afectadas. Se cortan en trozos pequeos 12 g de tejido y se machacan en un mortero u otro aparato con arena estril y un pequeo volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homognea. Alternativamente, se puede utilizar una trituradora a 4C. Se hace una suspensin al 20% (p/v) aadiendo solucin salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio mnimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensin, se aade 1 ml del base de glutamina-antibitico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente hasta 1 hora. Se centrifuga a 1.000 g durante 15 minutos Se tripsiniza una monocapa de clulas PK-15, se centrifuga la suspensin celular a 160 g durante 10 minutos y se resuspende para que contenga aproximadamente 2 106 clulas/ml en medio de cultivo (MEM de Eagle con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y de anticuerpos contra pestivirus; y 0,2 ml de la solucin stock de glutamina-antibitico por cada 10 ml de la suspensin celular). Como gua, una botella de 75 cm2 dar aproximadamente 50 ml de suspensin celular a una concentracin adecuada. O bien: Inoculacin con la suspensin. Se mezclan nueve partes de la suspensin celular (del paso (v)) y una parte del sobrenadante (del paso (iv)) y se inocula 1,01,5 ml en 68 tubos Leighton con cubres, o en otros recipientes apropiados de cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con solo 1,0 1,5 ml de suspensin celular. Despus de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres tubos como controles positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminacin con esta suspensin vrica positiva. Tambin deben prepararse cultivos negativos. Se incuba a 37. O: Inoculacin por monocapas preformadas: para cada tejido, inocular 1,01,5 ml de suspensin de clulas (preparadas como en el paso (v)) en 68 tubos de Leighton con cubres u otros frascos de cultivo celular apropiados. Se Incuba a 37C durante un mnimo de 4 horas y un mximo de 36. Luego se escurre el medio, se inocula 0,2 ml de lquido sobrenadante (del paso (iv)), se incuba durante 1 hora a 37C, se lava y se recubre con 1 ml de medio de crecimiento y se incuba a 37C. vii) En los das 1, 2 y 3 post-inoculacin, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan con acetona fra (de grado analtico) durante 10 minutos, y se tien con un conjugado directo anti-

ii)

iii)

iv) v)

vi)

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CSFV a la dilucin de trabajo apropiada, o bien se tien indirectamente, como se describe en la Saccin B.1.a. Si la suspensin de amgdalas al 2% resulta txica para las clulas, la prueba debe repetirse utilizando una dilucin mayor u otro rgano. El uso del mtodo en el que se emplean monocapas preformadas (indicado antes) nos ayudar a evitar la repeticin de la prueba. viii) Despus de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia. En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden usarse tambin para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulacin de fondo plano o placas M24. En tal caso, las placas se fijan y se tien como se describe ms adelante para la prueba de neutralizacin ligada con peroxidasa (NPLA). La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clnicamente enfermos es una muestra adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fraccin de leucocitos u otros componentes, pero por razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (10). El procedimiento es el siguiente: i) ii) iii) iv) Se congela una muestra de sangre completa a 20C y se descongela en un bao a 37C. Se inoculan 300 l de sangre hemolizada en una monocapa de clulas PK-15 crecidas hasta un 75% de confluencia2 en una placa M24, y se permite la adsorcin durante 1 hora a 37C. Se elimina el inculo, se lava la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y se aade medio de cultivo. Despus de una incubacin de 34 das, las placas se lavan, se fijan y se tien, como se describe ms adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 l para compensar la mayor superficie celular.

Nota: este mtodo es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la deteccin de PPC aguda. Reaccin en cadena de la polimerasa de trascripcin inversa

Se han descrito muchos mtodos de (RT-PCR) y otros se estn an desarrollando (20). Este mtodo aceptado internacionalmente es rpido y ms sensible que los ELISA de captura de antgeno, el aislamiento vrico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado para el diagnstico preclnico. Se han descrito varios protocolos de PCR convencionales y en tiempo real (14, 20, 24, 26, 27) y se puede obtener un protocolo adecuado en la literatura o en los laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres). Debido a su rapidez y sensibilidad, la RT-PCR posee un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de enfermedad y est aceptada por varios pases y por la Unin Europea (1). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que pueden ocurrir resultados positivos falsos debidos a la contaminacin del laboratorio as como resultados negativos falsos debidos a los inhibidores contenidos en la muestra. Cualquier resultado positivo de brotes deberan confirmarse siempre con otras pruebas. Es obligatorio incluir un nmero adecuado de controles positivos y negativos en cada serie; tambin es recomendable que se incluyan controles internos. Para posteriores detalles sobre las tcnicas de PCR, vase el captulo 1.1.5. Validacin y control de calidad de los mtodos de reaccin en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnstico de enfermedades infecciosas. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva as como a rganos slidos, y se ha utilizado con xito para controlar brotes. La epidemiologa molecular de la PPC se basa en la comparacin de diferencias genticas entre los virus aislados. La amplificacin del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciacin nucleotdica es el mtodo ms simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiolgicos moleculares (23). Se han estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la regin 5 no codificante (5NCR) del genoma (150 nucletidos) y la otra en el gen de la glicoprotena mayor E2 (190 nucletidos). En resumen, el mtodo usado consiste en extraer el ARN vrico de cultivos de clulas PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar una o ambas zonas dentro de 5NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotdica de los productos y comparar con la informacin acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para
2 La inoculacin simultnea, aunque ligeramente ms sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir con la adhesin de las clulas a la superficie.

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Captulo 2.8.3. Peste porcina clsica (clera del cerdo)

investigacin epidemiolgica molecular. Se debe obtener un permiso de importacin antes de su envo. Recientes descubrimientos sobre el anlisis de secuencias de los pestivirus de los rumiantes destacan la necesidad de analizar mltiples regiones con el fin de clasificar las cepas por este mtodo (15).

2.

Pruebas serolgicas

La deteccin de los anticuerpos especficos contra el virus es til cuando se sospechan infecciones con cepas de PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21 das post-infeccin. Las investigaciones serolgicas dirigidas a detectar focos residuales de infeccin, especialmente en piaras de produccin, pueden ser tambin tiles para la erradicacin de PPC en una fase terminal. Como la incidencia de la infeccin con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cra, solo resultan tiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberan confirmarse por pruebas NV comparativas. Las pruebas de neutralizacin se realizan en cultivos celulares utilizando un mtodo virus constante/suero variable. Como el CSFV no es citoptico, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras su multiplicacin, por un sistema indicador. La NPLA (29) y la prueba de neutralizacin vrica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (18) son las tcnicas ms ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema NPLA es actualmente el preferido, es fcil de leer y tiene la ventaja de que puede determinarse mediante el uso de un microscopio de luz invertida, aunque puede realizarse a simple vista una primera valoracin del ttulo.

a)

Prueba de la neutralizacin ligada a la peroxidasa (prueba obligada para el comercio internacional)

La NPLA se realiza en placas de microtitulacin de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56C durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilucin inicial de suero de 1/5 (dilucin final 1/10). Para los programas de seguimiento en un pas, puede ser suficiente una dilucin al 1/10. En cada prueba deben incorporarse los controles apropiados para asegurar la especificidad y la sensibilidad de las reacciones. i) Procedimiento de la prueba En dos pocillos de una placa de microtitulacin se depositan 50 l de diluciones de suero en medio de crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibiticos). El suero fetal bovino debe estar libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tincin inespecfica). Se aade a los pocillos 50 l de suspensin vrica, diluida en un medio de crecimiento hasta contener aproximademente 100 DICT50/50 l, y se mezcla el contenido en un agitador de microplacas durante 20 segundos. Se incuban las placas en un incubador de CO2 durante 1 hora a 37C. Se aaden a todos los pocillos 50 l de medio de crecimiento con 2 105 clulas/ml. Se dejan crecer las clulas a 37 en una atmsfera con un 5% de CO2 hasta confluencia, normalmente en 34 das. Se elimina el medio de crecimiento y se lavan las placas una vez con NaCl 0,15 M. Se secan las placas en papel absorbente.

ii)

iii) iv) v) vi) vii)

viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes mtodos: Se incuban las placas 45 minutos a 37C, y luego a 20C durante al menos 45 minutos. Se sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 l de paraformaldehido al 4% en PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 510 minutos. Se elimina el paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0,15M; o Se incuban las placas a 7080C durante 12 horas; o Se fijan las placas en acetona al 80% y se incuban a 7080 durante una hora; o Se fijan las placas en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total a 2530C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo se

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Captulo 2.8.3. Peste porcina clsica (clera del cerdo)

obtiene un secado completo despus de 35 minutos segn se observa por el color blanquecino de la monocapa celular). ix) Se aade a cada pocillo 50 l de un suero porcino hiperinmune contra la PPC o un anticuerpo monoclonal, diluido en NaCl 0,5 M que contiene 1% de Tween 80 + 0,1 ml de azida sdica, pH 7,6. Incubar a 37C durante 15 minutos. La dilucin de trabajo del antisuero debe determinarse mediante titulacin previa: es decir, un suero con un ttulo por NPLA de 1/30.000 puede utilizarse a 1/100. Se lavan cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6. Se aaden a cada pocillo 50 l de un conjugado de Ig-HRPO anti-cerdo o anti-ratn (segn convenga), diluido a su dilucin de trabajo con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6, y luego se incuba durante 10 minutos a 37C. Se lavan las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.

x) xi)

xii)

xiii) Se aaden 50 l de solucin de cromgeno del substrato a cada pocillo y teir durante 1530 minutos a temperatura ambiente. Esta solucin se describe en la Seccin B.1.a. Diferenciacin de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa. xiv) Se lee la prueba visualmente. Las capas celulares infectadas se tien total o parcialmente de color marrn rojizo. Debe examinarse la monocapa por microscopa a baja resolucin para determinar el punto final de la titulacin. El citoplasma de las clulas infectadas se tie de rojo oscuro. xv) En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de clulas, de suero positivo y de titulacin del virus problema. La titulacin del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una concentracin entre 30 y 300 DICT50/ 50 l.

Nota: El tiempo de incubacin dado anteriormente es solo como orientacin. Para conservar los reactivos, pueden utilizarse tiempos de incubacin mayores con diluciones de reactivos adecuadas a dichos tiempos.

b)

Prueba de neutralizacin vrica con anticuerpos fluorescentes (prueba prescrita para el comercio internacional)
i) ii) iii) iv) Se siembra una suspensin de clulas PK-15 a una concentracin de 2 105 clulas/ml en tubos Leighton con un cubre. Se incuban los cultivos 12 das a 37C hasta que alcancen el 7080% de confluencia. Se inactivan los sueros durante 30 minutos a 56C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar con una dilucin inicial del suero de 1/5 (dilucin final 1/10). Se incuban durante 12 horas a 37C volmenes iguales de suero diluido y de suspensin vrica que contenga 200 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml durante 12 horas a 37C. De esta forma se utiliza una cantidad constante de CSFV de 100 DICT50 por cada pocillo de reaccin. Se retiran los cubres de los tubos Leighton, Se lavan brevemente en medio sin suero, Se cubre la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37C en una atmsfera hmeda. Se colocan los cubres en un tubo Leighton limpio y se incuban los cultivos en un medio de mantenimiento durante dos das ms. Se retiran los cubres de los tubos Leighton, se lavan las monocapas dos veces con PBS, pH 7,2, durante 5 minutos cada vez, se fijan con acetona pura durante 10 minutos y se tien con la solucin de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37C antes de lavar.

v)

vi) vii)

viii) Se montan los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH > 8,0, y se examinan para flluorescencia. Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulacin, se puede seguir el procedimiento para la NPLA (ver ms adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tien a continuacin con la dilucin de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecte la fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de longitud focal larga. En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con el BVDV o el BDV reaccionan a baja dilucin en las pruebas FAVN o NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La intensidad de la reaccin cruzada depende de la cepa de pestivirus del rumiante que est implicada y del intervalo entre la infeccin y el tiempo de muestreo (37). Los altos niveles de anticuerpos que se alcanzan normalmente despus de exposicin a la infeccin por PPC, incluso con cepas de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos contra PPC, lo que evita muchas, aunque no

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todas, las reacciones cruzadas (29, 30). En caso de duda continuada, son tiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una cepa de BDV que sean representativas del pas o de la regin. Las pruebas comparativas de neutralizacin son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT50 de cada cepa vrica seleccionada. Las pruebas comparativas se realizan segn los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las lneas celulares deben ser adecuadas para el BVDV y el DVB. Los ttulos de neutralizacin se expresan como el inverso de la dilucin ms alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de tres veces o ms entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una infeccin por la especie de virus que da el ttulo ms alto. Para obtener un resultado definitivo, podra ser necesario utilizar diferentes cepas del mismo genotipo, y/o probar varios cerdos de una piara infectada.

c)

Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional)

Las tcnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado y se han descrito varias de ellas (por ejemplo: 5, 13, 17, 21, 34). Las pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el sistema de prueba debe asegurar la identificacin de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de la respuesta inmune a la infeccin. Antgeno: El antgeno debe derivar de, o corresponder a, protenas vricas de una de las cepas recomendadas de CSFV. Las clulas utilizadas para preparar antgeno deben estar libres de cualquier otra infeccin con Pestivirus. Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una protena vrica inmunodominante del CSFV. Los ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM. La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralizacin al menos 21 das despus de la inoculacin. La prueba ELISA solo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es especfico para la PPC, las muestras positivas deben analizarse adems por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por otros pestivirus. El ELISA bloqueante de captacin de complejos (5) es un mtodo de un solo paso muy adecuado para utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rpida y fcil de realizar, y detecta anticuerpos contra las cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la infeccin. Como los MAbs son especficos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captacin de complejos detectar anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser ms problemticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmacin. Recientemente se ha descrito un nuevo ELISA que utiliza protenas de fusin derivadas de pptidos vricos (19). Se alega que esta prueba proporciona una mayor sensibilidad y una deteccin de anticuerpos ms rpida que las obtenidas mediante el ELISA convencional, pero, en este momento, se desconoce su reactividad con el anticuerpo causada por diversas cepas de la PPC. Se puede obtener ms informacin sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC.

C1. vacunas con virus vivos modificados

Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenan mediante pases en cultivo celular o en una especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La produccin se lleva a cabo en cultivos celulares o en no-Suidae basndose en un sistema de lotes de siembra. Este debe ser validado respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad, ausencia de transmisin, estabilidad e inmunogenicidad. Las normas para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el captulo 1.1.8 Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el captulo 1.1.8 son de naturaleza general y puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales.

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Captulo 2.8.3. Peste porcina clsica (clera del cerdo)

El servicio de produccin de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prcticas de bioseguridad. Si se utiliza el CSFV para produccin de vacunas o para estudios de desafo de las vacunas, la parte del servicio donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contencin del Grupo 4 de patgenos como se seala en el captulo 1.1.2. Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones ptimas para la obtencin del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer experimentos con curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composicin del medio, de la regulacin del pH y del contenido atmosfrico del CO2, la concentracin inicial de clulas sembradas, la relacin entre la superficie de la capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las clulas al tiempo de la infeccin vrica, condicin estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicacin vrica, etc. Para las vacunas producidas en animales, los factores que deben ser investigados para determinar el mximo de crecimiento vrico y los tejidos a recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamao del inculo (nmero de ID50 animal [dosis infecciosa del 50%]), patognesis de la infeccin, y sntomas clnicos. Cualquiera que sea el mtodo de produccin, el substrato debe recogerse en condiciones aspticas y someterse a un ciclo de congelacin y descongelacin para liberar los virus asociados a las clulas. Los elementos celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtracin o centrifugacin a baja velocidad. Se aade un estabilizador, como lactosa, a una concentracin final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilizacin para asegurar un lote uniforme. En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en ms de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogneo.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inculo de siembra deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmacin de identidad, esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuacin, los experimentos piloto tambin deben realizarse con muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de siembra probado antes. A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos de 68 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al azar si es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual paridad. El virus de siembra debe ser estril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean especficos contra una cepa virulenta de CSFV en cerdos.

b)

Mtodo de cultivo
La produccin se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no pertenezca a la familia Suidae.

c)

Validacin como vacuna

i) Pureza La vacuna debe ser virolgicamente pura. Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto se repite 3 semanas despus utilizando la misma dosis y va de administracin. Se toman muestras de suero 2 semanas despus de la ltima inoculacin y se analizan por el mtodo ms sensible para ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB, fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, sndrome porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos, teschovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus porcino (tipos 1 y 2) ii) Seguridad Las vacunas deben ser probadas para cualquier efecto patognico en cerdos sanos y tambin en cerdos que pueden ser inmunodeprimidos debido a la presencia de infeccin o medicacin concurrente, y tambin deben probarse para garantizar que la vacuna no atraviesa la placenta en el caso de cerdas preadas.

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Captulo 2.8.3. Peste porcina clsica (clera del cerdo)

En las pruebas de seguridad en cerdos convencionales, uno de cada diez cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los cerdos se observan durante las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas corporales y se toman muestras de sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se anotan sus pesos en el momento de la inoculacin y 2 semanas ms tarde. Ningn animal debe morir o mostrar sntomas de enfermedad causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La temperatura diaria media del cuerpo no debe alcanzar o superar los 40,5C durante el perodo de la prueba. El aumento diario de peso medio no debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al del grupo control. Se puede despreciar la leucopenia (nmero de leucocitos < 7 106 clulas/ml) si solo ocurre en un cerdo durante 1 da. Para garantizar el debilitamiento, incluso en los cerdos inmunodeprimidos, cada uno de diez cerdos se inmunodeprime mediante inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de peso corporal durante 5 das consecutivos. Al da 3 cada animal se inocula con el equivalente de una dosis de vacuna, y se observa durante las tres semanas siguientes. Ningn animal debe morir o enfermar debido al virus vacunal. Para garantizar la inocuidad en animales preados, cada una de diez cerdas gestantes de 2535 das, se inoculan intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacuna. Otros diez animales de la misma paridad y gestacin sirven de control. La vacunacin no debe de interferir con la gestacin a trmino, y el nmero de lechones vivos nacidos del grupo de prueba no debe ser significativamente menor (p<0,05) que el del grupo control. Para ensayos de campo se utiliza un mnimo de 200 cerdos paridos y criados por al menos 20 cerdas, y que sean seronegativos para CSF y BDV. Las camadas se distribuyen del mismo modo en dos granjas por lo menos. La mitad de los lechones de cada camada se inoculan intramuscularmente a los 714 das de edad con el equivalente de una dosis de vacuna. Los lechones no inoculados son los utilizados como controles. Todos los lechones se pesan al tiempo de la inoculacin y 2 semanas ms tarde, y se observan durante 3 semanas. Una tasa de mortalidad que supera el 5% debido a causas ajenas a la vacunacin invalida la prueba. Ningn animal debe morir o mostrar signos de la enfermedad debido al virus vacunal. El peso medio ganado por los lechones inoculados no debe ser un 20% menor que el de los controles durante las 2 semanas post-inoculacin. iii) Ausencia de transmisin Para confirmar la ausencia de transmisin, se dividen 24 cerdos seronegativos en cuatro grupos iguales. En cada grupo se inoculan cinco cerdos intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacuna. El resto de los cerdos representa los controles. Todos los cerdos se inoculan 6 semanas despus como desafo con al menos 105 PID50 (dosis infecciosa del 50% de los cerdos) de una cepa virulenta de CSFV. Todos los animales control deben ser serolgicamente negativos al tiempo del desafo, y morir despus durante las 3 semanas siguientes. Todos los cerdos vacunados deben permanecer sanos y sobrevivir. iv) Estabilidad de la atenuacin Para confirmar la estabilidad de la atenuacin vrica, cada uno de dos cerdos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus de lote de siembra equivalente a 100 dosis de vacuna y se sacrifican 67 das despus. Se juntan las amgdalas de ambos cerdos y se prepara una suspensin al 10% en PBS, pH 7,2. Esto se usa para inocular intramuscularmente otros dos cerdos con 2 ml y luego se sacrifican 67 despus. Este protocolo se repite 5 veces. Durante estos pases, el tejido de amgdalas se puede guardar a 4C, si el almacenamiento es menor de 24 horas, o a 70C por perodos ms largos. Al mismo tiempo, la presencia del antgeno de PPC se confirma en cada pase por una prueba directa de IFD en cortes finos de las amgdalas o por aislamiento del virus en un substrato adecuado. Si despus de un cierto pase no se puede demostrar CSFV o antgeno, se realiza una segunda serie de pases para mostrar infeccin, comenzando con los ltimos dos cerdos de la serie previa. Se inoculan intramuscularmente cinco cerdos con el sexto pase del virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de vacuna o, si no se ha alcanzado este pase, con el pase ms alto de las dos series en que se detect virus o antgeno vrico. Se inoculan de modo similar cinco cerdos adicionales con una dosis de virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de la vacuna. Todos los cerdos se pesan al mismo tiempo de la inoculacin y de nuevo 2 semanas ms tarde. Se recoge sangre diariamente con anticoagulante durante la primera semana, y todos los cerdos se mantienen bajo observacin durante 3 semanas. Ningn animal debe morir o enfermar por el virus de la vacuna. El peso medio adquirido en los dos grupos durante las primeras 2 semanas no debe diferir significativamente (p<0,05). Cuando mucho, se permite leucopenia (nmero de leucocitos < 7 106 clulas/ml) en un cerdo de cada grupo durante 1 da.

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v)

Inmunogenicidad Para demostrar una inmunogenicidad adecuada, se inoculan diez cerdos con una cantidad de virus equivalente a una dosis de vacuna cada uno, y otros dos cerdos se mantienen por separado no inoculados como controles. Todos los cerdos se someten una inoculacin de desafo 7 das despus con 105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV. Solo deben morir los controles. En una prueba para establecer la duracin de la inmunidad, se inoculan diez cerdos con unas dosis de vacuna cada uno y otros dos se mantienen por separado como control. Seis meses despus, los sueros de los cerdos inoculados se prueban para anticuerpos contra PPC; al menos ocho cerdos deben resultar positivos. Todos los cerdos se inoculan despus en desafo con al menos 105 PID50 de una cepa virulenta de VPCC y se observan durante 3 semanas. Solo deben morir los controles. Para determinar la proteccin al desarrollo del sndrome de la cerda portadora, se dividen al azar 20 cerdas grvidas en la misma fase de gestacin en dos grupos. Un grupo se vacuna una o dos veces con una cantidad equivalente a una dosis de vacuna, y cuatro semanas despus de la ltima inoculacin se inoculan intranasalmente con una cepa de campo de baja virulencia, junto con las cerdas control no vacunadas. Todas las cerdas se sacrifican 4 semanas despus y los fetos se examinan para presencia de CSFV o antgeno vrico. La vacunacin debera reducir de modo significativo la transmisin transplacentaria del virus. En las condiciones de conservacin prescritas por el fabricante para el producto final, un volumen de virus equivalente a una dosis de vacuna debe mantener su inmunogenicidad por lo menos hasta el final de la caducidad que se indique.

2.

Mtodo de produccin

Cada lote de vacuna de tipo MLV contra la PPC debe derivar del mismo lote de inculo utilizado para las pruebas piloto. Adems, cada lote debe prepararse de acuerdo con el protocolo de produccin y bajo las condiciones expresadas para registrar el producto final. Las propiedades de cada lote y las del lote de siembra deben ser uniformes.

3.

Control del proceso

El protocolo de produccin depender de la cepa vacunal, del sistema de produccin (animales o cultivos celulares) y de los servicios disponibles. Las normas para vacunas obtenidas de cultivos celulares pueden variar en funcin del sistema de produccin, es decir, si proceden de cultivos primarios, lneas celulares, monocapas o cultivos en suspensin.

4.

Control de lotes

Todos los cerdos utilizados en las pruebas de control deben tener 68 semanas y estar libres de anticuerpos contra el CSFV o el BVDV. Deben tener un origen, raza, y crianza uniforme y, cuando sea necesario, estar distribuidos en grupos aleatorios.

a)

Identidad
La vacuna debe inducir anticuerpos neutralizantes especficos contra una cepa viruenta de CSFV.

b)

Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin de materiales biolgicos se presentan en el captulo 1.1.9

c)

Inocuidad
Se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis cada uno de la vacuna reconstitiuida, en una nica inyeccin. Los cerdos se observan durante 3 semanas y se toma diariamente la temperatura corporal durante la primera semana. Ningn cerdo debe morir o mostrar sntomas de la enfermedad atribuidos a la vacuna, su temperatura corporal diaria no debe alcanzar nunca los 40,5C o ms, y deben crecer normalmente.

d)

Pureza
El lote debe ser virolgicamente puro. Para probar esto, se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis de vacuna cada uno. Se recogen muestras de suero al tiempo de la inoculacin y 5 semanas despus. Los sueros se prueban para los anticuerpos contra el DVB (neutralizacin durante 1 hora a 37C)

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Captulo 2.8.3. Peste porcina clsica (clera del cerdo)

y contra parvovirus porcinos (inhibicin de la hemaglutinacin utilizando cuatro unidades hemaglutinantes). Los tres cerdos deben permanecer sin enfermedad. No es necesario realizar pruebas para pureza biolgica con vacunas producidas en conejos.

e)

Potencia
La potencia se expresa como el nmero de dosis protectoras del 50% (PD50) contenidas en una dosis de vacuna. Una dosis de vacuna tiene al menos 100 PD50. Se inoculan intramuscularmente dos grupos de cinco lechones de 68 semanas con una dilucin 1/40 y 1/160 de la vacuna reconstituida, respectivamente, utilizando solucin salina tamponada, pH 7,2. Dos semanas despus, los cerdos vacunados y dos cerdos control se inoculan intramuscularmente con 105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV como desafo. Los cerdos se observan durante las dos semanas siguientes, perodo en el que los controles deben morir. Usando mtodos estadsticos normales, a partir de los cerdos sobrevivientes que no muestran sntomas de PPC, se calcula el nmero de PD50 contenido en la vacuna. La prueba de potencia se puede reemplazar por una prueba de infectividad, siempre que el fabricante pueda demostrar que existe una relacin clara y reproducible entre el contenido del virus de la vacuna y la proteccin que confiere a cerdos en una inoculacin de desafo.

f)

Estabilidad
El perodo de validez de un lote de vacuna liofilizada contra la PPC no debe ser menor de 1 ao.

C2. Vacunas marcadoras

Pese a la existencia de vacunas MLV seguras y eficaces contra la PPC, su uso no ha sido favorecido en la Unin Europea y algunos otros pases libres o casi libres de PPC, debido a que los anticuerpos que inducen tales vacunas no pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural. Esta desventaja no se presenta en una vacuna marcadora que permite distinguir entre los animales infectados y los vacunados (DIVA). Es capaz de provocar una respuesta inmune protectora que puede distinguirse de la respuesta inmune inducida por el virus natural. Un prerrequisito adicional de la estrategia de cualquier DIVA es la disponibilidad de una prueba serolgica acompaante que es muy discriminatoria para demostrar la ausencia de infeccin y para el rastreo de infecciones residuales. Las exigencias mnimas para las vacunas marcadoras contra la PPC y las pruebas discriminatorias acompaantes se resumen del siguiente modo (5):

a)

Vacuna
La vacuna debe suministrar proteccin frente a cualquier contacto con el virus natural (es decir, puede prevenir signos clnicos y la re-excrecin del virus). La eficacia de la vacunacin debe demostrarse experimentalmente mediante estudios que analicen la transmisin del virus natural en grupos de cerdos vacunados. El efecto protector de la vacunacin debe alcanzarse en el menor tiempo posible, preferiblemente antes de 2 semanas. Con preferencia, la proteccin rpida y fiable debe obtenerse despus de una nica aplicacin. Adems, debe asegurarse que la infeccin de cerdas gestantes vacunadas no ocasiona infeccin transplacentaria ni el nacimiento de cras con infeccin congnita por CSFV. La duracin de la inmunidad debe ser superior a 6 meses. Hay muchas vacunas marcadoras contra la PPC en fase de desarrollo. En la Unin Europea se han registrado hasta ahora dos. Ambas son vacunas con subunidades, que emplean como inmungeno la glicoprotena E2 del CSFV y que se han sometido a valoracin independiente (9, 32). La subunidad E2 se produce en clulas de insectos infectados por baculovirus modificados genticamente, que contienen el gen E2 del CSFV. Las vacunas, por tanto, no contienen ningn CSFV, y el baculovirus vector se inactiva qumicamente. La preparacin final contiene aceites minerales como adyuvantes para formar una emulsin doble (agua/aceite/agua) o simple (agua en aceite). Varios estudios acerca de la capacidad de las vacunas DIVA E2 para prevenir la transmisin vertical y horizontal, han dado resultados contradictorios (3).

b)

Prueba discriminatoria en paralelo

La prueba serolgica discriminatoria en paralelo debe ser muy sensible puesto que la vacunacin reducir la prevalencia de la enfermedad. Lo ideal es que proporcione diferenciacin dentro del mismo perodo de tiempo en lo que se refiere al desarrollo del anticuerpo frente a la protena inmunizadora y debe ser utilizada

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en primer lugar como una prueba en la poblacin. Una sensibilidad elevada reduce la especificidad de la prueba, ya comprometida por la presencia de anticuerpos contra otros pestivirus, por lo que se debe disponer de pruebas confirmativas adecuadas y rpidas para diferenciar los resultados positivos de los positivos falsos. Las pruebas en paralelo DIVA que existen para las vacunas con subunidad E2 son pruebas ELISA basadas en la deteccin de anticuerpos contra la protena Erns (12, 16). Tales pruebas se han aprobado recientemente por la Comisin Europea (2) para la determinar si las piaras vacunadas con una vacuna con subunidad E2 tambin pueden haber estado expuestas al virus natural. Una valoracin de su realizacin (12) revela que ningn ELISA discriminatorio detect de forma consistente individuos vacunados con marcadores, cerdos destetados desafiados con PPC; de ah la recomendacin de utilizar tal estrategia solamente a nivel de la piara.

REFERENCIAS
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* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la peste porcina clsica (vase el cuadro de la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int)

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