Anlise quantitativa em Cromatografia Lquida (LC)

Anlise quantitativa
Compreende os mtodos e tcnicas usados para quantificar os componentes de uma amostra.

Relembrando conceitos...
Cromatografia Lquida
Mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio destes componentes entre duas fases: mvel e estacionria (ambas lquidas). Cada um dos componentes seletivamente retido pela fase estacionria, resultando em migraes diferenciais destes.

Cromatografia em Coluna (CC) Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia em Papel (CP) Cromatografia Lquida de alta Eficincia (CLAE) Entre outros...
Injeo Migrao Eluio 3

Relembrando conceitos...
Anlise qualitativa
Compreende os mtodos e tcnicas usados para identificao dos componentes de uma amostra. CLAE
Identificao pelo tempo de reteno (tR).
Resposta do detector Resposta do detector

Tempo (min)

Tempo (min)

Amostra

Padro

Anlise quantitativa
Conhecimento do problema Conhecimento do universo Escolha do mtodo Amostragem Tratamento prvio Homogeneizao Eliminao de interferentes Anlise Expresso dos resultados Tratamento de dados
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Mtodos de quantificao
Normalizao Interna; Normalizao de rea; Padronizao Externa; Padronizao Interna; Superposio de matriz; Adio de padro.
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Normalizao Interna
Indica a quantidade de um componente em relao aos outros componentes na amostra.

Resposta do detector

% A = (rea de A / rea total ) x 100

Tempo (min)

_____________________________________Normalizao interna
Vantagens simples e prtica, sendo ideal para anlises de rotina em que a exatido no um fator importante; Independe do volume injetado; Independe da estabilidade do aparelho; No necessria a utilizao de padres. Desvantagens No se aplica a amostras complexas Exige o registro de todos os componentes No adequada para anlise de traos Assume que todos os componentes injetados na coluna so eludos; Assume que o detector apresenta a mesma resposta para todos os componentes da mistura.
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Exemplo
Perkin Elmer (Sries 200): TotalChrom Software LaPNaT (Lab. 627 IQ/UFRJ)

Figura. Cromatograma em CLAE-DAD de mistura flavonodica. Condies cromatogrficas: coluna Inertsil Prep-ODS (250 x 6 mm, 10 m); Temp. de 30C; 1,4 mL.min-1. 265 nm.

Normalizao de reas
Preparam-se diferentes solues padro com massas conhecidas (m); Obtem-se a rea de cada um dos picos; Calcula-se a razo A/m (fator de resposta).
Tempo (min)

Resposta do detector

% A = [(rea de A / F) / ( reas / F )] x 100

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_____________________________________Normalizao de rea

Vantagens As mesmas que a normalizao interna, atrelado ao fato de que nesse caso o resultado mais exato; Desvantagens no se aplica a amostras complexas; exige o registro de todos os componentes; no adequada para anlise de traos; utiliza vrios padres;

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Padronizao externa
Preparam-se uma srie de solues padro contendo a substncia de interesse; Os padres so injetados no sistema cromatogrfico; A partir das reas dos padres constri-se grfico: rea x concentrao; Injeta-se a amostra com o analito de concentrao desconhecida; A concentrao da substncia de interesse pode ser determinada por interpolao grfica ou atravs da equao da reta determinada por regresso linear.
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Padronizao externa

Padronizao externa

Padronizao externa

Padronizao externa

Padronizao externa

Padronizao externa

Padronizao externa

Padronizao externa

Curva analtica
Em tcnicas instrumentais, a relao linear simples, descrita pelo modelo: f(x) = b0 + b1x geralmente, vlida em um determinado intervalo de massa ou concentrao da espcie medida.

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Curva analtica

Ateno:
Faixa linear dinmica.

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Limite de deteco (LD)

O limite de deteco representa a menor concentrao da substncia em anlise que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental. Importante: O LD pode ser calculado com base na relao sinal/rudo (3:1).
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Limite de quantificao (LQ)

O limite de quantificao representa a menor concentrao da substncia em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental.

Importante: LQ pode ser calculado utilizando a relao sinal-rudo (10:1).

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_____________________________________Padronizao externa Vantagens: Pode ser usada de maneira pontual, relacionando a rea da substncia de interesse na amostra com a rea de apenas um padro, independe da deteco dos demais picos; Utilizada para amostras complexas; Pode ser utilizada na anlise de traos. Desvantagens Depende da estabilidade do sistema cromatogrfico; afetado por erros durante a introduo da amostra no sistema cromatogrfico; No considera efeito de matriz.
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Exemplo
Densitometria computacional: quantificao em CCD
Aplicao da amostra

Legenda:
A - amostra 1 soluo padro Menor concentrao 2-4 soluo padro Concentraes intermedirias A 1 2 3 4 5 5 soluo padro Maior concentrao

Marta Olech, ukasz Komsta, Renata Nowak, ukasz Ciesla, Monika Waksmundzka-Hajnos. Investigation of antiradical activity of plant 26 material by thin-layer chromatography with image processing. Food Chemistry 132,549553, 2012.

Exemplo
Densitometria computacional: quantificao em CCD
Aps eluio

Densitograma

Olech, M.; Komsta, .; Nowak, R.; Ciesla, .; Waksmundzka-Hajnos, M. Investigation of antiradical activity of plant material by thin-layer 27 chromatography with image processing. Food Chemistry, 132, 549553, 2012.

Padronizao interna
A padronizao interna uma tcnica na qual um padro injetado concomitantemente amostra desconhecida, isto , ele dissolvido na prpria amostra e servir de base para os clculos quantitativos do alvo analtico a partir de uma relao de reas.

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Da escolha do padro interno:

No pode estar presente na amostra; Deve estar disponvel em elevado grau de pureza; Deve ter comportamento cromatogrfico similar ao da substncia a ser analisada; Deve estar numa concentrao prxima a da substncia de interesse na amostra (devendo esta ser previamente estimada); estvel, no-reativo; Deve ser bem resolvido dos outros picos.

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Exerccio
Um analista deseja determinar a concentrao da substncia A em uma amostra de gua por cromatografia lquida de alta eficincia. Para isso, escolheu um padro interno (PI) adequado e preparou vrios padres contendo o PI e a substncia A em gua destilada, obtendo os seguintes resultados:

Qual a concentrao da substncia A na amostra de gua?

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_____________________________________Padronizao interna Vantagens: O volume de injeo no influi no resultado; til, especialmente pelo fato de que independe de pequenas mudanas em variveis experimentais, como temperatura da coluna e tamanho da amostra. Desvantagens Dificuldade de encontrar uma substncia candidata a padro interno para o sistema em anlise.

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Superposio de matriz
O mtodo de superposio de matriz consiste na adio do padro da substncia em diversas concentraes em uma matriz similar da amostra, isenta da substncia, e construo do grfico de calibrao relacionando as reas obtidas com as concentraes do padres.
Vantagens Compensa o efeito da matriz ou de possveis interferentes; Sua principal vantagem sobre o mtodo de padronizao externa que fornece uma melhor correspondncia com a composio da amostra. Desvantagem No Proporciona a magnitude do efeito de co-extratos e aumenta o custo e o tempo das anlises.
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Adio padro
o mtodo utilizado nos casos em que no possvel a mimetizao da matriz sem a presena da substncia de interesse; Consiste na adio de diferentes concentraes de padro da substncia de interesse matriz, que j contm determinada quantidade da substncia de interesse; A matriz permanece quase inalterada aps cada adio, a nica diferena concentrao da substncia de interesse.

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Adio padro

Adio padro

Adio padro

Adio padro

Adio padro

Adio padro

Comparao entre mtodos

Figura. Interrelao entre os diferentes mtodos de construo da curva analtica.

Queiroz, S. C. N.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F. MTODOS DE EXTRAO E/OU CONCENTRAO DE COMPOSTOS ENCONTRADOS EM FLUIDOS BIOLGICOS PARA POSTERIOR DETERMINAO CROMATOGRFICA. Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, 68-76, 2001. 40