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Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas ANEXO: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Funciones del oxgeno en l nu!

"ici#n Como elemento constituyente del agua y componentes orgnicos, el oxgeno es un componente universal de las clulas y se proporciona en grandes cantidades en el agua. Sin embargo, muchos organismos requieren adems oxgeno molecular. Se trata de organismos que dependen de la respiracin aerbica para cubrir sus necesidades energticas y en los que el oxgeno molecular funciona como agente oxidante terminal. ales microorganismos se denominan e"o$ios o$lig dos. !n el otro extremo fisiolgico estn aquellos microorganismos que obtienen su energa mediante reacciones que no implican la utili"acin de oxgeno molecular y para los cuales esta forma qumica del elemento no act#a como nutriente. $ara muchos de estos grupos fisiolgicos el oxgeno molecular act#a como txico celular o como inhibidor del crecimiento. ales microorganismos son n e"o$ios o$lig dos. %an sido usados varios trminos, entre ellos aerobio obligado, anaerobio obligado, anaerobio aerotolerante, anaerobio facultativo y microaerfilo con el fin de subdividir las bacterias en base a su relacin con el oxgeno. !stos trminos refle&an un espectro continuo de bacterias que no pueden tolerar el oxgeno hasta aquellas que lo necesitan para su crecimiento. 'os microorganismos n e"o$ios pueden ser clasificados en dos grupos principales( l) An e"o$ios o$lig dos ll)An e"o$ios e"o!ole" n!es Con fines prcticos consideremos las bacterias n e"o$i s o$lig d s como aquellas que no se multiplican en la superficie de un medio slido nutricionalmente adecuado, incubado en aire ambiental o en una incubadora de C* + ,que contenga -)./0 de C*+ en el aire1. 2entro de este grupo se establecen dos categoras( l.a) An e"o$ios o$lig dos es!"ic!os !stos microorganismos desarrollan en superficies de agar expuestas a niveles de *+ de /./30 como mximo. l.b) An e"o$ios o$lig dos %ode" d %en!e Son bacterias que desarrollan cuando se exponen a niveles de * + de +)40. !l trmino n e"o$io e"o!ole" n!e ,grupo ll1, es usado por algunos microbilogos para describir bacterias anaerobias que tendrn un crecimiento limitado o escaso en agar expuesto al aire ambiente o en incubacin con -)./0 de C* +, pero muestran buen crecimiento ba&o condiciones anaerobias. 'os n e"o$ios & cul! !i'os crecen ba&o condiciones anaerobias o aerobias determinadas. 'os %ic"o e"#&ilos requieren oxgeno como aceptor terminal, pero no desarrollan en la superficie de medios slidos con aire ,+.0 de * +1 y crecen con escaso desarrollo, si lo hacen, en condiciones anaerobias.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas !n el desarrollo de medios y sistemas para el cultivo de anaerobios deben ser considerados dos factores fundamentales que pueden afectar el crecimiento de los anaerobios en el laboratorio. !l ms importante es el efecto inhibidor del oxgeno atmosfrico y sus derivados txicos. !l segundo factor limitante es el potencial de oxidorreduccin ,!h1 del medio de cultivo.

Resumiendo: 5erobios obligados 6icroaerfilo 5naerobios facultativo Es!"ic!o O$lig do An e"o$io Ae"o!ole" n!e Tole" nci l oxgeno Mode" d %en !e

$robablemente sean m#ltiples las ra"ones por las cuales los anaerobios varan en su tolerancia al oxgeno. 7na de las ra"ones es que la tolerancia al * + de muchos anaerobios obligados moderados depende de su produccin de en"imas superxido dismutasa, catalasas y peroxidasas, que son protectoras contra la toxicidad de los productos de oxidorreduccin. 7na teora muy difundida es que la exposicin al * + produce una serie de reacciones, mediada por flavoprotenas, que llevan a la produccin del radical superxido ,*+)1, perxido de hidrgeno ,%+*+1 y otros productos de oxidorreduccin txicos( Sustrato 8 *+ *+) 8 *+) 8 %+*+ 8 productos txicos

%+*+ *%) radical hidroxilo, potente oxidante biolgico .*+ singlete

*%) 8 *+

Ciertos microorganismos producen en"imas capaces de contrarrestar estos productos txicos, como la S7$!9:;<2* 2<S67 5S5 y las C5 5'5S5S. 6ediante la superxido dismutasa ,S*21 se transforman los radicales superxido en oxgeno molecular y perxido de hidrgeno. *+) 8 *+) 8+%8 S*2 %+*+ 8 *+

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas !l perxido de hidrgeno se convierte inmediatamente en oxgeno y agua, mediante las catalasas. +%+*+
Catalasa

+ %+* 8 *+

*tra en"ima que destruye el perxido de hidrgeno es la $!9*;<25S5, se diferencia de la catalasa en que no libera oxgeno en la reaccin.

%+*+ 8 +%8

$eroxidasa

+ %+*

(o!enci l de oxido""educci#n )E*+ !n la naturale"a el lmite superior de !h es 8 4+/ mv, que podra encontrarse en algunos ambientes con oxigenacin considerable. !n los te&idos humanos sanos con suministro sanguneo intacto prevalecen condiciones de oxigenacin y el potencial redox es de alrededor de 8 .-/ mv. !n contraste, el lmite inferior de !h en la naturale"a vara alrededor de =>+/ mv. 7n ambiente anaerobio o un medio de cultivo rico en hidrgeno podra tener ese !h ba&o. !l intestino grueso de los humanos, que contiene enormes cantidades de anaerobios estrictos obligados, posee un !h de alrededor de +-/ mv. $or lo tanto, para el cultivo de microorganismos anaerobios es esencial el mantenimiento de un ba&o potencial redox. $ara tal ob&etivo se incorporan agentes reductores tales como tioglicolato y ') cistena. Con el fin de anali"ar la relacin que existe entre !h y el * + sobre la supervivencia y crecimiento de las bacterias anaerobias fueron reali"ados numerosos estudios de los cuales pudieron extraerse importantes conclusiones. %a sido ampliamente demostrado que la extraccin del * + de los medios de cultivo, para evitar su toxicidad, es ms importante que establecer un ba&o !h. $or lo tanto, el rpido logro y mantenimiento de una ba&a tensin de * + o la ausencia es un requerimiento esencial para el cultivo de anaerobios en sistemas anaerobios moderados, como la &arra de anaerobios o la cmara de guantes. Medios de cul!i'os , " $ c!e"i s n e"o$i s !l metabolismo anaerbico es menos eficiente que el aerbico para la obtencin de energa, por lo tanto los medios de cultivo deben ser ms ricos que los de uso com#n para aerobios o anaerobios facultativos, adems requieren una incubacin ms prolongada. 'os medios empleados para la recuperacin de anaerobios deben incluir tipos no selectivos y enriquecidos.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas 6edios de cultivo no selectivos $or lo general los anaerobios son bacterias muy exigentes. Se emplean medios comple&os que llevan( hidroli"ados de carne, peptonas, extracto de levadura, hemina, vitaminas, etc. !l medio requiere sustancias reductoras como tioglicolato, glucosa, cido ascrbico, cistena, hierro, etc. Como e&emplos( Medio de Schaedler Caldo de so&a triptona ./ gr $eptona - gr !xtracto de levadura - gr 2extrosa - gr Cistena /.> gr %emina /.. gr ris ?uffer /.@ gr 5gar .-.- gr 5gua destilada c.s.p. ./// ml $h @.A 'uego se suplementa con sangre desfibrinada al -0 y vitamina B ./ gCml. Medio Tioglicolato enriquecido (MTE) riptona .@ gr $eptona de so&a 3 gr 2extrosa A gr ClDa /.- gr ioglicolato de Da /.- gr 5gar /.@ gr ')cistena /.+- gr Sulfito de Da /,. gr %emina - gr Solucin de > ml resar"urina ,/./.01 5gua c.s.p .///ml $% @./ 'uego de esterili"ardo y enfriado se suplementa con /.. gCml de vitamina B y ./ mgCml de Da%C*3. Medios de cultivo selectivos $or lo general las muestras a procesar para el aislamiento de microorganismos anaerobios contienen me"clas de anaerobios obligados, facultativos yCo aerobios. 'as especies presentes en pequeEas cantidades pueden pasar inadvertidas si se usan medios no selectivos.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas <ncorporando distintas sustancias a los medios mencionados anteriormente se obtienen diferentes medios selectivos. 5gentes selectivos( Violeta de genciana( elimina bacilos esporulados aerbicos. Azida sdica: inhibe el crecimiento de bacilos Fram positivos esporulados aerbicos. enil etil alcohol( inhibe bacilos Fram negativos aerobios y anaerobios facultativos. !eomicina( inhibe Fram negativas facultativas. Vancomicina"#anamicina( selecciona bacilos Fram negativos anaerobios. Sis!e% s n e"o$ios , " el cul!i'o de $ c!e"i s n e"o$i s !studios comparativos han demostrado que los siguientes sistemas son satisfactorios para el cultivo e incubacin de bacterias anaerobias. $% T&cnica en 'arra anaero(ia Con catali"ador( a)!vacuacin)reempla"o b)6todo del sobre generador de gas descartable Sin catali"ador( Gi&acin del *+ por limaduras de Ge

)% T&cnica de la c*mara anaero(ia de guante 3) Tu(os con +el,cula de agar con siem(ra +or estr,as en medios -RAS .

-. Tcnica en jarra anaerobia !xisten diferentes marcas en el mercado por e&emplo( ?reHer, Fas$aI, *xoid, 6clntosh, entre otras. 'a &arra *xoid, utili"ada en el $, es de policarbonato, tiene una capacidad de 3.lt, cerrada con una tapa de metal pesado y una abra"adera de metal. !l centro de la tapa tiene dos vlvulas Schrader y un manmetro. 'as vlvulas se utili"an en la tcnica de evacuacin)reempl"o ,!C91. !n la parte interna de la tapa se ubica el catali"ador. 'a remocin del oxgeno ocurre por reaccin con el hidrgeno agregado al sistema en presencia del catali"ador. %+ 8 *+
catali"ador

%+

!l uso de un catali"ador activo en cada sistema es importante. 'a &arra de ?reHer, ms antigua, utili"aba un catali"ador de paladio en la tapa que tena que ser calentado con una corriente elctrica para ser activo.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas 'a &arra Fas$aI usa un catali"ador en fro compuesto de bolitas de al#mina cubiertas de paladio, que no requieren calentamiento. !l catali"ador en fro es ms conveniente para usar y no tiene riesgo de explosin. !l catali"ador en fro de paladio puede ser inactivado en la &arra por la produccin de S%+ u otros productos voltiles de las bacterias. Se recomienda reempla"arlo por uno nuevo o uno reactivado cada ve" que se utili"a la &arra. $uede reactivarse mediante el calentamiento en estufa a .A/).@/JC durante + horas. 'uego se guarda en un secador. !n estos sistemas las condiciones anaerbicas se producen o bien utili"ando un sobre generador de gases o mediante la tcnica de evacuacin)reempla"o. !n la tcnica de anaerobiosis por evacuacin)reepla"o se extrae el aire de la &arra hasta -.)A. mm %g, luego se lava con corriente de D +. !ste procedimiento se repite dos veces. $or #ltimo se llena la &arra con una me"cla anaerbica de D +(4-0, C*+(-0 e %+(./0. !n la tcnica del sobre generador de gases se emplean sobres conteniendo, por e&emplo, cido ctrico o tartrico, bicarbonato de sodio y borohidruro de sodio. !n el momento de utili"arse se corta el extremo del sobre y se hidrata con un volumen de agua, luego se cierra inmediatamente la &arra. !n el sistema se producen las siguientes reacciones( CA%4*@ 8 Da%C*3 Da%> ? 8 + %+* Da3,CA%-*@1 8 3 %+* 8 3 C*+ Da?*+ 8 > %+

!l %+ generado reacciona con el *+ del aire, en presencia del catali"ador produciendo %+*. 2entro de la &arra se colocar un indicador de !h, independientemente de la tcnica empleada. $ara lo cual se encuentra en el comercio tiras de a"ul de metileno que en condiciones de anaerobiosis vira del a"ul al blanco. 7na alternativa consiste en colocar dentro de la &arra un tubo de ensayo con unos mililitros de una me"cla de a"ul de metileno 8 DaC* 3 8 glucosa. !l indicador es a"ul cuando est oxidado e incoloro cuando est reducido. !l cambio de color ocurre alrededor de los 8.. mv. Con&untamente con el vira&e del indicador de !h ocurre un calentamiento de la tapa de la &arra luego de los >/ minutos y se observa condensacin en la superficie interna dentro de los +-minutos. 'a tcnica !C9 resulta ms econmica que el generador de gas y permite que las condiciones de anaerobiosis se estable"can ms rpidamente. !n los sistemas sin catali"ador la anaerobiosis se logra mediante Ge finamente dividido, cido ctrico, C*3Da+ y tierra silcea como soporte ,Bit comercial 6ercI1. !n el momento de usar se humedece con un volumen de agua, el * + del aire es fi&ado con avide" por el Ge dando los siguientes productos(

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas Ge,*%1+ 8 Ge,*%13 8 Ge+*3 8 Ge* 8 %+ 8 C*+ !n breve tiempo se registra el descenso del * +, creando una atmsfera anaerbica rica en C*+.

'a tcnica empleada en el $ es una adaptacin del Bit comercial. Se utili"a lana de Ge embebida con una solucin c#prica ,CuS* >.-%+* al /.-0, tHeen 4/ /.+-0, p% +1. Como generador de C*+ se coloca un tubo conteniendo una solucin acuosa de B%C*3 y cido ctrico. /.Cmara anaerobia de guante 7na cmara anaerobia de guante es un sistema anaerobio autoabastecido que permite procesar muestras y reali"ar la mayor parte de las tcnicas bacteriolgicas para aislamiento e identificacin de bacterias anaerobias sin exposicin al aire. $ueden construirse de diferentes materiales, incluyendo acero, acrlico o fibra de vidrio. 'a ms ampliamente usada es la de plstico vinlico flexible. 7na ve" adquiridas el funcionamiento de estas cmaras es econmico porque permiten el uso de medios convencionales y el costo de los gases es mnimo. 'os materiales se colocan y se retiran de una pre)cmara flexible. 'as condiciones anaerobias se mantienen por una constante recirculacin de la atmsfera dentro de la cmara plstica ,4-0de D+. ./0 de %+ y -0 de C*+1 a travs de un catali"ador de paladio en fro.

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0.Medios PRAS en tubos arrollados !sta tcnica utili"a medios $95S( medios previamente reducidos y anaerbicamente esterili"ados. !l medio se envasa en tubos con tapn de caucho butlico ba&o gas libre de * + y se esterili"an y mantienen en ambiente anaerbico. 'uego de esterili"ados se enfran en una mquina giratoria lo que resulta en una capa fina de agar en la superficie interna de los tubos. !l sistema requiere el agregado de un agente reductor, como ')cistena en la frmula del medio de cultivo. odas las inoculaciones de estos medios sean lquidos o slidos se reali"an ba&o corriente de C*+. Cada tubo con $95S se convierte as en su propia cmara de cultivo anaerbico y puede ser colocado en un incubador de aire ambiental para su incubacin. $ermiten la inspeccin de las colonias en cualquier momento sin la exposicin al *+. Dis!"i$uci#n en l n !u" le1 de l s $ c!e"i s n e"#$ic s2 'as bacterias anaerbias estn ampliamente distribuidas en la tierra, pantanos, sedimentos de lagos y ros, ocanos, aguas residuales, alimentos y animales. 'a mayor parte de estas hbitat tienen una tensin de oxgeno ba&a y un !h reducido, resultantes de la actividad metablica de los microorganismos que

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas consumen oxgeno a travs de la respiracin. Si el oxgeno no es reempla"ado, se mantienen las condiciones anaerobias en el ambiente. I%,o"! nci de l s $ c!e"i s n e"o$i s a) !n bacteriologa clnica( los microorganismos anaerobios pueden dar cualquier tipo de infeccin, muchas de alta gravedad. !stos microorganismos pueden pasar inadvertidos, ya que lo ms com#n es encontrarlos en cultivos mixtos. b) !n el control sanitario de alimentos( como e&emplos Clostridium perfringens y Clostridium ?otulinun causan el deterioro de alimentos e intoxicaciones graves. !n estos casos es necesario demostrar la presencia de la toxina, el aislamiento y la tipificacin del germen. c) !n la industria( Germentacin de hidratos de carbono, distintas especies del gnero Clostridium producen acetona, butanol e isopropanol. 5ctualmente, la sntesis qumica ha despla"ado en parte al proceso microbiolgico. $rocesos fermentativos en los que se utili"an bacterias fermentativas y bacterias anaerobias estrictas.
?. metanognicas 5n. estrictos

%idratos de carbonos C%>

5n. facultativas

5c. Frasos 8 alcoholes 8 C*+ 8 %+

("oces %ien!o 3 ex %en de un n e"o$i s

%ues!"

, "

el

isl %ien!o de $ c!e"i s

!l procesamiento mnimo debe incluir( .) .a o(servacin directa%/aracter,sticas microsc+icas . 'os frotis de las muestras deben ser examinadas previamente coloreados por la tcnica de Fram. !ste paso es muy importante porque puede sugerir la presencia de bacterias anaerobias que se caracteri"an por su coloracin irregular y pleomorfismo. 5dems orientar sobre los medios selectivos a utili"ar y servir como control de calidad, debiendo recuperarse todos los tipos morfolgicos en proporcin aproximada a la que se observ. +) Siem(ra en medios slidos%Relacin con el 0 ).Se siembra( una placa de agar sangre en aerobiosis, otra en anaerobiosis una tercera placa en microaerofilia. 'a microaerofilia se logra colocando en un recipiente hermtico una vela encendida que al extinguirse dar una atmsfera con >0 de *+ y -)./0 de C*+ aproximadamente. 3) Siem(ra en medios l,quidos. 'os medios lquidos, como el tioglicolato, deben ser purgados antes de la siembra y suplementarse con vitamina B y C*3%Da. Se inoculan con pipeta $asteur llegando al fondo y sin introducir aire. 'os medios de cultivo lquidos son considerados Kel respaldoL de los medios slidos.

Microbiologa General Facultad de Ciencias Exactas 'os cultivos de bacterias anaerobias son de desarrollo lento, por lo tanto deben incubarse >4 hs. antes de la primera observacin. 'os cultivos negativos se mantienen en incubacin durante dos semanas con observaciones peridicas. >) Aislamiento de las colonias desarrolladas . 2eben verificarse la anaerobiosis y observar las caractersticas macroscpicas. 9eali"ar la observacin microscpica previa coloracin de Fram. Siembra en medios selectivos -) -rue(as (ioqu,micas destinadas a la identi1icacin del microorganismo. Se recurre en primer lugar a un con&unto de pruebas bioqumicas que permiten la identificacin en grupos preliminares. 'uego, dentro de cada grupo se procede a la identificacin definitiva. !xisten en el comercio microsistemas completos para la identificacin de los anaerobios por e&emplo( 5$<)+/M y 6initeI. 'a identificacin de los anaerobios tambin puede llevarse a cabo mediante el anlisis de los productos metablicos de la fermentacin, cidos voltiles y no voltiles, por cromatografa lquido)gas.