Comparison of Saccharomyces boulardii growth in an air-lift fermentor and in a shaker

Jos Luis MULLER1, Karina Luvizutto PROTTI1, Marina da Silva MACHADO1, Leo Lynce Valle de LACERDA1, Tania Mari Bell BRESOLIN1, Pablo Sanchez PODLECH1* Resumo
Os fermentadores tipo air lift oferecem vantagens tais como: eciente homogeneizao dos componentes, baixo cisalhamento e economia de energia, pois o meio agitado pelo processo de aerao, sem necessidade de agitao mecnica. O objetivo deste trabalho foi analisar a cintica de crescimento de Saccharomyces boulardii neste fermentador, com aerao de 1 e 1,5 vvm (volume de ar por volume de meio, por minuto), comparada com o crescimento em frascos agitados em shaker, visando a futura aplicao deste fermentador, em escala industrial. Os resultados indicaram que houve uma diminuio do pH com o consumo da glicose do meio, a qual foi totalmente consumida at o nal da fase exponencial, de 5 e 6 horas para o shaker e o air lift, respectivamente. Aps este perodo houve uma alterao na velocidade de crescimento de S. boulardii, em ambos os equipamentos, indicando uma possvel mudana na fonte de carbono utilizada, uma vez que toda a glicose foi consumida aps estes perodos. Os valores de velocidades especcas de crescimento foram semelhantes para o shaker e air-lift com 1,0 vvm, porm inferiores ao air-lift com 1,5 vvm, indicando que neste ltimo reator h possibilidades de se conseguir uma velocidade de produo celular maior, dependendo apenas da ecincia de oxigenao oferecida. Palavras-chave: S. boulardii; fermentao; air lift; shaker.

Comparao do crescimento de Saccharomyces boulardii em fermentador por batelada tipo air lift e shaker

Abstract
This work aimed to analyze the kinetics of S. boulardii growth in an air lift fermentor under two aeration conditions: 1 and 1.5 air vvm (air volume per volume of culture medium per minute), in comparison with growth in shaken asks, with a view to the future application of this fermenter on an industrial scale. Air lift fermentors offer advantages such as efcient homogenization of the components, low shear stress, and energy savings because the medium is stirred by aeration and does not require mechanical stirring. The pH of the medium decreased with the glucose uptake during the exponential phase, probably due to the formation of secondary metabolites. The entire process showed a similar specic growth rate during the exponential phase (up to 5 hours in the case of the shaker and 6 hours in that of the air-lift fermentor), indicating a possible change in the carbon source, since all the glucose was depleted after the aforementioned periods. After 6 hours, the growth rates in the shaker and the fermentor were similar under 1.0 vvm, but lower than in the fermentor under 1.5 vvm, suggesting that the fermentor may reach a higher cell production rate depending only on the oxygenation efciency. Keywords: S. boulardii; fermentation; air-lift fermentor; shaker.

1 Introduo
S. boulardii foi primeiramente isolada de frutas silvestres (Lychee) na Indochina nos anos 50 e desde ento tem sido usada como probitico, adicionado dieta alimentar com a nalidade de equilibrar a ora intestinal e com ns teraputicos no tratamento de diarrias10,18. Os probiticos so substncias ativas no trato gastrintestinal na inter relao com este meio, sendo considerados medicamentos com a regulao ocial em quase 100 pases2. SCHREZENMEIR e DE VRESE13 propuseram que o termo probitico deveria ser usado para designar preparaes ou produtos que contm microrganismos viveis denidos e em quantidade adequada, que alteram a microbiota prpria das mucosas por implantao ou colonizao de um sistema do hospedeiro, e que produzem efeitos bencos em sua sade. Vrios microrganismos so usados como probiticos, entre eles bactrias cido-lcticas, bactrias no cido-lcticas e leveduras. Um probitico deve ser incuo, manter-se vivel por longo tempo durante a estocagem e transporte, tolerar o baixo pH do suco gstrico, resistir ao da bile e das secrees pancretica e intestinal, no possuir genes transmissores de resistncia a antibiticos e possuir propriedade anticarcinognica atribuda inibio de enzimas pr-carcinognicas ou estimulao do sistema imunitrio do hospedeiro, assim como resistir a fagos e ao oxignio4. Entre as formas comerciais de administrao de S. boulardii como agente teraputico est o produto liolizado, na forma de cpsulas. Um dos processos utilizados para a obteno comercial deste microrganismo a fermentao em batelada. Este o processo de escolha na indstria alimentcia e farmacutica, devido ao maior controle do processo e diculdade de contaminao3. O air lift um biorreator utilizado na fermentao industrial em batelada que promove ligao entre o lquido do topo e da base, com direcionamento do gs de modo a obter turbulncia e autocirculao dirigida, permitindo elevada transferncia de oxignio12. Este tipo de fermentador pode proporcionar processos de produo de microrganismos em grande escala, sem limitao de oxignio local, alm de apresentar foras de cisalhamento muito baixas, preservando os tecidos, principalmente os micelianos que se apresentam mais frgeis6. A aerao fator importante para que se obtenha uma maior formao de massa celular vivel durante o processo fermentativo. A injeo

Recebido para publicao em 29/8/2006 Aceito para publicao em 26/9/2007 (001831) 1 Cincias Farmacuticas, Universidade do Vale do Itaja UNIVALI, CP 360, CEP 88302-202, Itaja - SC, Brasil, E-mail: pablo.biotec@univali.br *A quem a correspondncia deve ser enviada

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do gs serve para agitar e aerar, eliminando o gasto de energia para agitao, e promovendo um aumento na capacidade de transferncia de massa e calor14. Este equipamento de construo simples e econmica, possibilitando uma manuteno fcil e barata, podendo representar uma alternativa ao processo industrialmente mais utilizado, o sistema em batelada contnua, tendo em vista, especialmente, a economia de energia, um dos principais custos do processo industrial. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento de crescimento de S. boulardii em fermentador air lift, ainda no relatado na literatura, com diferentes condies de aerao e baixa concentrao de substrato, comparando a cintica de crescimento, neste equipamento, com o processo em frascos agitados (shaker), normalmente utilizado para estabelecer as variveis do processo para posterior aumento de escala.

em ambiente de uxo laminar). Em 100 mL de meio de cultura esterilizado, foi adicionado 100 mg da levedura, seguido de homogeneizao. Foram distribudos 50 mL do meio inoculado em dois frascos Erlenmeyer de 500 mL e aps 12 horas de incubao a 30 C sob agitao de 200 min1 em shaker (modelo712, Marconi) obteve-se o inculo.

2.4 Processo fermentativo

O processo fermentativo foi realizado atravs de dois mtodos: cultivo em shaker (modelo 712, Marconi) e em fermentador air lift. Neste ltimo foram utilizadas duas vazes de ar: 1,0 e 1,5 vvm (volume de ar por volume de meio por minuto).

2 Material e mtodos
2.1 Cultura
A espcie em estudo, S. boulardii foi obtida a partir do produto comercial (Floratil, Merck). Cada cpsula de 100 mg continha cerca de 2 x 108 clulas de S. boulardii-17 na forma liolizada.

2.2 Meio de cultura

O meio de cultura foi preparado de acordo com a Tabela 1 com volume adequado para cada processo fermentativo utilizado (shaker e air lift), esterilizados em autoclave a 121C por 20minutos. Em sistemas aerados o rendimento do substrato em clulas, teoricamente, se encontra na faixa de 0,5, sabendose que 50% do corpo da clula constitui-se de carbono. Tambm foram consideradas as concentraes de nitrognio, fosfato, enxofre, vitaminas do complexo B e magnsio, de maneira a produzir uma quantidade de clulas, em relao ao percentual do peso seco, correspondente a 10 vezes a quantidade inicial9.
Tabela 1. Composio do meio de cultura utilizado no processo fermentativo.
Substncias Glicose anidra (Vetec) Peptona de carne (Biobrs) Extrato de levedura (Biolilfe) KH2PO4 (Nuclear) Uria (Nuclear) Sulfato de amnia (Vetec) Sulfato de magnsio (Analtica) Quantidade g.L1 10 2 2 0,6 0,36 0,12 0,24

Figura 1. Biorreator com agitao aerada do tipo air-lif.

Todas as transferncias do inculo foram realizadas utilizandose uxo laminar vertical.

O fermentador air lift (Figura 1) utilizado foi construdo de acordo com PEDRINI et al8 e possua sistema de circulao externa com controle de temperatura no downcomer. No cultivo em shaker, para cada ensaio foram preparados frascos Erlenmeyers de 500 mL, contendo 50 mL de volume nal de trabalho, contendo 10% de inculo. Os Erlenmeyers foram colocados em shaker de bancada rotativo, sob agitao de 200 min1 e temperatura de 30 1 C. Para o cultivo em air lift foram preparados 2300 mL de volume nal de trabalho contendo 10% de inculo. A temperatura

2.3 Pr-inculo e inculo

O pr-inculo foi preparado em condies asspticas, utilizando-se levedura liolizada (Floratil), sendo as cpsulas previamente desinfetadas externamente com hipoclorito de sdio (Vetec) a 1% (borrifadas e secadas no tempo de 5minutos,

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de 30 1 C foi controlada atravs do trocador de calor colocado no downcomer. No tempo zero (t0) e em intervalos regulares (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 12 horas), foram retiradas alquotas, em ambos os processos para as anlises da massa celular, concentrao de glicose e pH. Foram utilizadas concentraes crescentes de antiespumante (Silbione 70460, Plury Qumica) na concentrao de 0,2-1,8% v.v 1, em 50 mL de meio inoculado, medindo-se a formao de espuma. Tambm foi medida a massa celular aps 6 horas de fermentao, conforme descrito abaixo, a m de vericar a inuncia sobre o microrganismo.

As mdias dos valores das variveis foram comparadas utilizando teste de Tukey, adotando o nvel de 5% de probabilidade. As anlises estatsticas foram realizadas utilizando-se o aplicativo Statistica verso 6.016.

3 Resultados e discusses
Inicialmente foi determinada a quantidade mnima do antiespumante a ser adicionada no meio. A adio de 0,2% de antiespumante evitou a formao de espuma, sem alterar a DO do meio, comparando com o controle, sem antiespumante (dados no mostrados). A Figura 2 mostra a anlise de um dos processos fermentativos, em shaker, sendo que o experimento foi realizado em triplicata e as repeties apresentaram pers similares (dados no mostrados).
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 10 Glicose (g.L1) e pH 8 6 4 2 0

2.5 Anlises dos processos

Inicialmente elaborou-se uma curva analtica, correlacionando a massa celular com a medida de densidade tica (DO). Por regresso linear foi estimada uma equao linear para calcular a massa celular das amostras. As amostras dos processos fermentativos foram retiradas nos tempos especicados, seguido de ltrao atravs de membrana de 0,22 m de tamanho de poro e 25 mm de dimetro (Millipore), diluio em gua destilada e leitura da DO em espectrofotmetro (modelo1601, Shimadzu). A massa celular das amostras foi calculada utilizando-se a equao da reta. O consumo de glicose do meio foi quanticado atravs do mtodo enzimtico Glicose PAP Liquiform (Labtest Diagnstica). Tambm foi construda uma curva analtica correlacionando a concentrao de glicose com a DO. Para quanticar o consumo de glicose durante o processo, as alquotas retiradas nos diferentes tempos foram ltradas atravs de membrana de 0,22 m de tamanho de poro e 25 mm de dimetro (Millipore) a m de separar as clulas contidas no meio fermentado. As amostras ltradas foram congeladas em freezer (Larp) a 20C at o momento da realizao da anlise de glicose. A absorbncia foi lida em duplicata em espectrofotmetro (modelo1601, Shimadzu) e, atravs da equao da reta, foi calculada a concentrao de glicose. O pH foi medido em pHmetro com compensao manual de temperatura, utilizando eletrodo de vidro calomelano ( Digimed DME-CV1). Foram calculadas as seguintes variveis caractersticas dos processos fermentativos: converso de substrato em clulas, produtividade (razo entre a massa de clulas produzida por volume de meio em fermentao por unidade de tempo) e a velocidade especca dos processos, durante a fase exponencial.

Massa celular (g.L1)

10 Tempo (horas) pH

15

x (g.L1)

Glicose (g.L1)

Figura 2. Variao de massa celular (x), consumo de glicose e pH na fermentao de S. boulardii em fermentador batelada tipo shaker.

2.6 Anlise estatstica

Para anlise das variveis: converso de substrato em clulas, produtividade, massa celular e velocidade especca de crescimento, os tratamentos foram dispostos em delineamento inteiramente casualizado, com trs repeties. Os dados foram interpretados por meio de anlise de varincia, utilizando testeF ao nvel de 5% de probabilidade.

Na fase Lag ou fase de latncia o crescimento celular nulo devido adaptao das clulas12. Esta fase praticamente no foi observada neste trabalho, devido ao meio de cultivo ser idntico ao utilizado no preparo do pr-inculo. O consumo de substrato e o pH sofreram pequenas variaes devido ao baixo metabolismo celular. Na segunda fase, chamada de fase de transio, ocorre o incio da reproduo propriamente dita, havendo um aumento gradual do crescimento, sendo que no m desta fase toda a populao comea a se dividir em um intervalo regular mdio de tempo. A prxima fase (fase Log, Logartmica ou exponencial) foi observada no perodo de 2a5horas (Figura 2). Nesta fase pde-se observar que a curva apresentou uma inclinao acentuada, atribuda a fatores e condies favorveis ao metabolismo, onde a formao de unidades funcionais celulares mxima. O consumo de substrato tambm mximo nesta fase, pois visa suprir as necessidades celulares na fermentao alcolica onde uma molcula de glicose convertida em duas molculas de ATPs gerando energia para a clula12. Segundo RIBREAU-GAYON e PEYNAUD11 a queda no pH observada, deve-se formao de cidos orgnicos (cidos succnico, ltico, actico e outros) e, conseqentemente, ao aumento da

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acidez do meio de fermentao. Aps 5 horas, observou-se um crescimento linear de S. boulardii.

Concentrao de clulas (g.L1)

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12

A Figura 3 mostra uma das repeties do processo fermentativo em air lift com aerao 1,0 e 1,5 vvm, sendo que as replicatas dos experimentos apresentaram pers idnticos (dados no mostrados).

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

10 8 6 4 2 0 2 4 6 8 10 12 14 0 Glicose (g.L1) e pH a

Massa celular (g.L1)

Tempo (horas) Air-lift 1,0 vvm Air-lift 1,5 vvm Shaker

Tempo (horas) (xg.L1) pH glic. g.L1

Figura 4. Variao de massa celular durante o processo fermentativo nos reatores batelada shaker e air-lift 1,0 vvm e 1,5 vvm. 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 10 b Glicose (g.L1) e pH 8 6 4 2 0

10

12

14

Tempo (horas) (xg.L1) pH glic. g.L1

As curvas apresentadas (Figura 4) mostram uma pequena inexo a partir do tempo 6 horas (air lift) e 5 horas (shaker), o que coincide com o nal da fase exponencial da fermentao, conforme observado anteriormente (Figuras 2 e 3). Na prxima fase, que compreende o tempo 7 a 12, a velocidade passa a ser linear e no mais exponencial. Nesta segunda fase pode haver a presena de interferentes, comuns no decorrer do processo, como a formao de metablitos ou escassez de substrato. Como no havia mais glicose presente no meio, e o microrganismo continuou a crescer nesta segunda fase, haveria uma mudana de substrato utilizado, o qual pode ser um metablito formado durante a primeira fase. O consumo de etanol, glicerol e outros cidos orgnicos, no decorrer do processo fermentativo, ocorre devido oxidao metablica pela clula com o objetivo de gerar mais ATP e biomassa, mas apenas em aerobiose5. medida que a glicose foi sendo consumida houve uma diminuio do pH (Figuras 2e3), provavelmente devido formao de cidos orgnicos. Na fase exponencial do processo foi calculada a velocidade especca de crescimento (Tabela 2). Embora a produtividade e a massa de clulas no tenha se diferenciado nos trs processos fermentativos, o air lift 1,5vvm apresentou maior velocidade especca de crescimento em relao aos dois outros processos (p <0,05), indicando que a maior aerao provocou um aumento na velocidade especca de crescimento de S. boulardii. No que diz respeito converso de substrato em glicose, o air lift 1,0 (mdia de 0,334) e Shaker (mdia de 0,417) apresentaram diferena signicativa (p < 0,05). O airlift1,5 apresentou converso intermediria entre os demais, com diferenas no signicativas (p > 0,05).

Figura 3. Variao de massa celular (x), a) consumo de glicose e pH na fermentao de S. boulardii em fermentador batelada air-lift 1vvme b) 1,5 vvm.

O perl dos processos fermentativos em air lift ( Figura3) apresentou similaridade com a fermentao em shaker ( Figura 2), porm pode-se observar que a fase exponencial em air lift parece ocorrer no perodo de 2 a 6 horas, mais prolongada em comparao com a fase exponencial em shaker (2a5horas). O trmino do contedo de glicose, no nal da fase exponencial, coincide com uma inexo na curva de massa celular, a qual continua a crescer at o nal do perodo de 12horas, em fase linear. Para melhor comparar a produo celular entre os trs processos, a massa celular foi colocada em grco, em funo do tempo (Figura 4).

Massa celular (g.L1)

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Tabela 2. Valores mdios e desvio padro das variveis converso de substrato em clulas, produtividade, massa celular e velocidade especca de crescimento de S. boulardii na fermentao em batelada em shaker e air-lift.
Reator Air-lift 1,0 vvm Air-lift 1,5 vvm Shaker Converso substrato em clulas (g.g 1) 0,334 0,023a 0,393 0,037ab 0,417 0,021
b

Produtividade (g.L1.h) 0,263 0,025a 0,320 0,030a 0,325 0,025

a

Massa celular (g.L1) 3,153 0,301a 3,969 0,536a 3,907 0,294

a

Velocidade Especca (h1)* 0,351 0,007a 0,382 0,006b 0,350 0,002a

Mdias com letras diferentes dentro da mesma coluna apresentam diferena signicativa entre si, pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade; e *estimada na fase exponencial de crescimento celular de 2 a 5 horas e 2 a 6 horas em shaker e air-lift, respectivamente.

Outras espcies de leveduras como S. cerevisiae em aerobiose se constitui em crescimento glicose-etanol diuxico. A glicose se metaboliza a etanol na primeira fase exponencial de crescimento, quando as clulas apresentam uma alta velocidade (tempo de gerao de 1,7 horas). Na produo industrial de leveduras de panicao, observa-se um tempo de gerao de 3a 4 horas, quando se forma uma boa concentrao de lcoole de 5 a 6 horas nas culturas livres de lcool. Na primeira fase de crescimento, as funes do cido tricarboxlico so apenas para a formao de esqueletos carbnicos para propsitos biossintticos. As atividades das enzimas so baixas, assim como as dos demais sistemas envolvidos, por exemplo, citocromos. Na segunda fase do crescimento diuxico as atividades aumentam, havendo a formao de enzimas de metabolismo oxidativo, crescente na fase interlag. Se a concentrao de glicose ultrapassa determinado nvel, cerca de 250 a 300mg.L1, essas enzimas no se formam ou so inibidas. O oxignio controla o metabolismo da glicose no efeito Pasteur, por isto, o fenmeno foi chamado de efeito Pasteur reverso, efeito glicose ou crabtree. medida que o mecanismo passou a ser melhor entendido, recebeu o nome de represso catablica, que mais geral. O acmulo intracelular de metablitos de acares, nomeadamente de glicose, responsvel pelos efeitos regulatrios observados da represso catablica. Evita-se a represso catablica, cultivando-se a levedura em meio de cultura com baixa concentrao de glicose, o que possvel em fermentao contnua ou, melhor ainda, em descontnuoalimentado (fedbatch)3,18. Na Saccharomyces cerevisiae este fenmeno resulta na sua preferncia para fermentar acares via gliclise a etanol e CO2 em vez de oxid-los completamente via respirao18. Para avaliar a cintica de crescimento de S. boulardii no air lift, neste trabalho foi utilizada uma baixa concentrao de substrato (10 g.L1), a m de evitar a inibio do crescimento da levedura. Na fermentao alcolica, o principal responsvel pela diminuio da viabilidade celular o seu prprio produto, o etanol (12% v.v 1 aps 72 horas de fermentao), cuja ao txica reete-se na desorganizao da membrana citoplasmtica7. BUENO NETO1, utilizando como inculo o S. cerevisiae, analisou valores crescentes de concentrao de etanol no meio fermentativo e concluiu que somente acima do teor de 7,2%v.v1 ocorreu inibio para o crescimento celular. Nos processos estudados no presente trabalho, o etanol pode ter sido gerado no meio e provavelmente foi utilizado como fonte de carbono aps o consumo de glicose. Esta hiptese pode ser apoiada no

modelo de crescimento de leveduras em glicose apresentado por SONNLEITNER e KAPELLI15. Segundo estes autores, a capacidade respiratria das clulas governa o metabolismo da glicose ou do etanol, e a formao de produtos em clulas em crescimento, e representa uma restrio ou estrangulamento (bottleneck) para a utilizao oxidativa do substrato. Como a utilizao de etanol um processo oxidativo e a sua utilizao tem uma prioridade menor que a da glicose, no h consumo de etanol nestas condies, ou seja, o princpio da capacidade respiratria limitada no permite o consumo e produo, simultneos, de etanol (o etanol usado ao se atingir a capacidade respiratria do microrganismo, quando toda a glicose j tiver sido consumida).

4 Concluses
Em termos de produtividade no houve diferena estatisticamente signicativa no crescimento celular do S. boulardii utilizando-se os processos fermentativos em shaker ou air lift na fase de 0 a 6 horas. Porm, entre 7 e 12 horas, observouse uma menor velocidade na formao de clulas no air lift 1,0 vvm. No air lift 1,5 vvm, aparentemente, a maior aerao promoveu uma maior velocidade especca de crescimento. Estes resultados sugerem que apenas a ecincia de oxigenao oferecida foi responsvel pelo aumento da velocidade especca de crescimento, o que deve ser mantido mesmo com o aumento da concentrao do substrato em escala industrial. Provavelmente, aps o consumo da glicose, o microrganismo utiliza o etanol gerado como fonte de carbono, porm, este fato precisa de um estudo de avaliao em termos de converso do novo substrato pelas clulas. Concentrao elevada de substrato inibe o crescimento da levedura e, para viabilizar o uso industrial do air lift na produo desta levedura em bateladas dever ser posteriormente avaliada a utilizao de elevada concentrao de substrato neste equipamento, normalmente utilizando o sistema fedbatch em processos industriais. Deste modo, poderiam ser selecionadas as condies ideais para minimizar esta inibio. Outro parmetro importante a ser determinado em estudos futuros, neste equipamento, seria a medida do teor de oxignio dissolvido, a m de melhor caracterizar o mesmo e avaliar sua ecincia.

Agradecimentos
Os autores agradecem ProPPEC (Pr-Reitoria de Pesquisa, Ps-Graduao, Extenso e Cultura) da UNIVALI, pelo apoio nanceiro para a realizao deste trabalho.

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