Aplicaciones Industriales de la Biotecnologa alimentaria Produccin de cidos orgnicos y Aminocidos J.Arana, E. Arrese y C.

Cajavilca
cidos Orgnicos La produccin de cidos orgnicos mediante el uso de microorganismos constituye una fuera motriz de gran importancia para el estudio de regulaciones metablicas, lo cual a su vez, ha sido clave para el desarrollo de la biotecnologa en su sentido mas amplio. Se revisan las rutas bioqumicas y los procesos de produccin de los cidos orgnicos de mayor importancia para la industria alimentaria. Introduccin El uso de compuestos acidulantes en la conservacin y mejora de propiedades organolpticas en alimentos es extenso. En particular, los cidos que contienen uno o ms carboxilos son aditivos alimentarios importantes. Estos cidos, genricamente denominados cidos orgnicos, son intermediarios o productos terminales de ciclos metablicos bsicos por lo cual ocurren en una gran variedad de organismos vivientes. Tales compuestos incluyen los cidos ctrico, mlico, lctico, actico, tartrico, fumrico y glucnico. Su produccin industrial, salvo el caso del acido tartrico, se realiza mayoritariamente por mtodos biolgicos lo que los ubica como prototipo de la biotecnologa alimentaria. Los cidos orgnicos en la industria de alimentos La incorporacin de cidos en alimentos cumple diversas funciones dependiendo de la aplicacin particular. Tales aplicaciones se inscriben en la explotacin de una o varias de las siguientes propiedades de los cidos orgnicos o sus sales: 1) 2) 3) 4) 5) Poder acidulante Capacidad amortiguadora o reguladora de pH Agente quelante de iones metlicos Emulsificante Efectos organolpticos

El principal uso es la acidificacin y control del pH en el producto final. Un pH bajo, retarda el crecimiento de microorganismos indeseables (principalmente bacterias) y aumenta la efectividad de conservadores como benzoatos y sorbatos. Asimismo, reduce la necesidad de tratamientos trmicos drsticos durante la esterilizacin de futas y verduras enlatadas, o promueve la inactivacin de enzimas indeseables como polifenoloxidasas. Un pH bajo alrededor de 3 es indispensable para lograr una consistencia en geles de pectina, por lo cual los cidos orgnicos son esenciales en la produccin de

conservas y jaleas de frutas. Tambin pueden ensalzar o potenciar el sabor de un alimento dependiendo de sus propias caractersticas como saborizante y sus propiedades cidas. Por ejemplo, el cido tartrico confiere un marcado sabor a uva, mientras que el ctrico y el mlico presentan un espectro saborizante ms amplio permitiendo su uso en una variedad de sabores asociados con frutas. Tal es el caso de jugos, bebidas carbonatadas y helados. La tabla 1 contiene los niveles recomendados de cido ctrico en bebidas refrescantes constituidas Tabla 1 Niveles de cido ctrico recomendado en bebidas refrescantes Categora Sabor Nivel G acido ctrico (litro reconstituida) 4.2 -5.3 2.6-3.7 1.6- 2.1

bebida

Acidez alta Acidez mediana Acidez baja

Limonada Naranja Ponche Fresa Uva

Los cidos tienen propiedades quelantes de iones metlicos. Estos iones son catalizadores de reacciones indeseables en alimentos como decoloracin, rancidez, prdida de nutrientes, etc. Consecuentemente, los cidos orgnicos mejoran la proteccin producida por antioxidantes comunes como BHT, ascorbatos, etc. Por ejemplo, mezclas de cido ctrico con antioxidantes son agregadas comercialmente a aceites, salchichas, y carnes secas para prevenir rancidez. De igual manera, su uso durante el aprovechamiento de sangre en rastros retarda la coagulacin al secuestrar los iones calcio esenciales en este fenmeno.

En la forma de sales, los cidos moderan sabores cidos extremos en bebidas carbonatadas y balancean el sabor amargo de edulcorantes artificiales. Asimismo las sales, principalmente el citrato de sodio, son excelentes emulsificantes durante la elaboracin de quesos fundidos, promoviendo la buena textura y adecuada flexibilidad. Su uso como amortiguadores es comn en gelatinas y jaleas. Durante la produccin de mantequilla y margarina se puede aadir ctrico para ser convertido fermentativamente a diacetilo, compuesto tpicamente asociado al sabor a mantequilla. La seleccin de un cido en una aplicacin particular depende en gran medida de su solubilidad en agua. Algunas propiedades fsicas relevantes de cidos orgnicos se indican en la tabla 2. El cido ctrico es, por excelencia, el de mayor uso en alimentos. Mlico cido suave Fumrico cido Ctrico cido Tartrico cido amargo

Sabor

Punto Fusin

de 130

286

153

168

Densidad relativa de soluciones saturas a 25C Solubilidad en agua a 25C (g/100mlH2O) Calor de solucin Kcal/mol 25C Viscosidad de soluciones acuosas 25C en centipoises

1.25

1.0

1.28

1.27

60

<5

60

138

4.9

---

3.9

3.3

6.5

---

6.5

6.5

Generalidades del cido ctrico El cido ctrico producido actualmente rebasa las 300 000 toneladas al ao. A diferencia de muchos otros productos que previamente eran elaborados por mtodos microbiolgicos y en la actualidad se producen por va qumica, este cido se produce en su totalidad por fermentacin. Gran parte de la produccin mundial se efecta en Estados Unidos y Europa. La mayor planta pertenece a Pfizer con una capacidad superior a 80 000 toneladas anuales. Del total producido, un 70% es consumido por la industria de alimentos y bebidas, mientras que el 18% se dirige a la industria farmacutica y 18% a otros usos. Su empleo en alientos representa el 55-65% del mercado total de acidulantes, contra 20-25% cubierto por el cido fosfrico, principalmente en bebidas decola, y 5% corresponde al cido mlico. Microbiologa del cido ctrico Varios microorganismos han sido descritos como productores de cido ctrico predominando los gneros de Aspergillus y Penicillium. El descubrimiento de la capacidad de algunos hongos filamentosos de producir cido ctrico se remonta a 1883, gracias a los estudios de Wehlmer. En 1917 Currie demostr que especies de Aspergillus Niger acumulaban cido ctrico a la par con cido

oxlico. Posteriormente se definieron las condiciones de cultivo que reducan considerablemente la produccin de acido ctrico contaminante. A partir de entonces, variedades de A. niger han dominado la produccin industrial, fundamentalmente porque su fisiologa es ms conocida que la de otros hongos y porque utiliza materias primas de bajo costo como melazas de caa. A pesar que la importancia comercial del cido ctrico son escasos, los estudios fundamentales basados en tcnicas genticas dirigidas a las cepas productoras. El mtodo emprico de mutacin seguido de seleccin sigue siendo el ms usado. Por ejemplo, se ha reportado el aislamiento de mutantes de A. Nger obtenidos por tratamiento secuencial de rayos UV y etilenamida con capacidad de acumular 7 veces mas cido ctrico como paradimetilamino benzaldehdo y seleccionando aquellas con el halo de mayor dimetro. Durante la dcada del 60 surgieron varios reportes de levaduras, en particular miembros del gnero candida, con capacidad productora de cido ctrico a partir de hidrocarburos, con rendimientos cercanos al 100%. Esta lnea, sin embargo, pronto fue relegada debido al creciente precio del petrleo. Avances posteriores revelaron que levaduras, as como bacterias, pueden acumular ctrico de glucosa, abriendo un nuevo campo de estudio en el que se trabaja intensamente. El mayor potencial de bacterias y levaduras es el menor tiempo de fermentacin comparado con el caso de A. Niger. Bioqumica del cido ctrico La produccin industrial de cido ctrico surgi como resultado de experimentacin sistemtica y exhaustiva desde los trabajos pioneros de Currie en 1917. Gran parte de esta investigacin se desarroll de manera emprica debido al desconocimiento en detalle de la bioqumica involucrada. No es sino hasta pocas mas recientes que los avances en fisiologa microbiana permiten lograr un mayor entendimiento de la relacin entre medio ambiente y acumulacin de cido ctrico. Sin embargo, todava hay muchos puntos que necesitan clarificarse y la investigacin es intensa en ese aspecto. En consecuencia, antes de detallar las condiciones que promueven la produccin de cido ctrico, como la composicin del medio nutriente, resulta imperioso un conocimiento, aunque sea superficial, de las rutas bioqumicas involucradas. El cido ctrico es un intermediario en el inicio de los cidos tricarboxlicos (CAT), o ciclo de Krebs. Las funciones de este ciclo son generar energa en forma de ATP en conjuncin con la oxidacin fosoforilativa durante el metabolismo aerbico de carbohidratos y crear precursores de otros ciclos biosintticos como aminocidos. En condiciones ambientales que promueven el desarrollo celular el ciclo funciona en estado estacionario, o sea que los intermediarios que lo constituyen se mantienen a niveles bajos sin acumulacin de alguno en particular. Tal acumulacin resultara en un ineficiente uso de nutrientes. El mantenimiento de dicho estado estacionario se efecta mediante una regulacin precisa de enzimas presentes en rutas metablicas que alimentan el ciclo o que

parten de l. Las enzimas pueden ser controladas a nivel de sntesis de protenas (represin o induccin) o de actividad enzimtica (inhibicin o activacin) Resulta evidente que la produccin de cido ctrico requiere de una operacin defectuosa del CAT que permita su acumulacin. Adicionalmente se requiere su transporte fuera de la clula para posteriormente ser recuperado del medio de fermentacin. Sin embargo, el conocimiento actual en el campo de transporte de membranas es incipiente para entender una explicacin convincente. En consecuencia son 3 las preguntas que pueden plantearse: 1) Cuales son las causas de la acumulacin del cido ctrico? 2) Qu modificaciones ocurren el en funcionamiento normal del CAT? 3) Cmo sobrevive el microorganismo con un CAT defectuoso? Respuestas categricas a estas preguntas no existen. Mas an, la situacin se complica al reconocer que cepas de la misma especie responden de manera diferente a variaciones ambientales. Sin embargo, ciertos lineamientos parecen ser claros. Durante la fermentacin ctrica, el catabolismo de hexosas ocurre fundamentalmente por la ruta de la gliclisis con una pequea contribucin de la ruta de las pentosas. Un esquema simplificado del CAT, alimentado por la ruta de la gliclisis, se presenta en la Figura 1.

Los nombres de las enzimas relevantes a la produccin de cido ctrico son indicados, as como los cofactores que requieren. Es importante notar que todas las reacciones del ciclo, excepto la condensacin del ciclo son reversibles. Como primer paso para acumular ctrico es necesario bloquear su transformacin. Esto se puede lograr reduciendo a un mnimo la presencia de iones fierro, cofactor de la de la aconitasa. Ciertamente la eliminacin de fierro en fuentes industriales de carbono es prctica comn. Ante la ruptura del ciclo a nivel de la formacin de cisaconitato, se interrumpe la formacin de los dems intermediarios esenciales en biosntesis. En consecuencia, se requieren reacciones adicionales, llamadas anaplerticas o de reabastecimiento que regeneren dichos intermediarios. Estas reacciones cumplen tal propsito aprovechando la reversibilidad del ciclo. Tres reacciones anaplerticas son posibles y sus puntos de accin, as como las encimas que las catalizan y sus factores, se indican en la Figura 2.

Procesos industriales Existen dos mtodos principales de produccin de cido ctrico, el cultivo superficial y el cultivo sumergido. En ambos casos se emplean cepas seleccionadas de A. Nger. Recientemente se inici la operacin del primer proceso que usa levadura en un medio de carbohidratos. En cualquier caso, es importante que los equipos utilizados sean de acero inoxidable o impregnado con recubrimientos resistentes. Esto es debido a las propiedades corrosivas del cido crtico y a la gran sensibilidad de la fermentacin a la traza de metales. El cultivo superficial tiene la ventaja de ser simple en su operacin y menos sensible a variaciones ambientales que el cultivo sumergido. Sin embargo, las bajas productividades tienen a volver obsoleta esta tcnica. Seguramente su empleo resulta an econmico por el aprovechamiento de la capacidad instalada. El medio de melazas se prepara diluyendo a un contenido de 14-20% (p/v) en azcares y se pasteuriza. El ferrocianuro requerido para precipitar metales es entonces agregado, as como el suplemento de fsforo. El medio se convierte charolas de aluminio con capacidad de 500 a 1000 L y una profundidad de lquido de no ms de 200 cm para promover un buen intercambio de gases. La inoculacin se efecta con esporas depositadas por aspersin en la superficie del medio. Las charolas son posteriormente colocadas en anaqueles dentro de la cmara de fermentacin y ventiladas con aire filtrado. El aire renueva el oxgeno necesario, remueve el CO2 producido y permite controlar la temperatura dentro de la cmara. La germinacin de las esporas ocurre a los dos das de inoculacin y la fermentacin dura un total de 9 a 12 das. Al final de esta, el micelio es separado por filtracin, lavado para remover el cido ctrico adherido y el lquido obtenido se mezcla con el licor residual antes de enviarse a las reas de separacin. Las productividades tpicas de este proceso son del orden de 0.4kg/m 3-hr con rendimientos del 70-75%. En los procesos de cultivo sumergidos se pueden usar tanques agitados con mltiples turbinas o fermentadores de tipo air-lift. Estos ltimos son favorecidos por mantener una buena oxigenacin a escalas mayores que las obtenidas econmicamente con tanques agitados. Asimismo, los air-lift favorecen el crecimiento compacto del micelio en forma de pellets con las consecuentes ventajas en la hidrodinmica del medio discutidas previamente. En tanques agitados la friccin de las aspas sobre el micelio mantienen un crecimiento fragmentado y poco compacto. En todas las plantas actualmente en operacin el proceso es intermitente (por lotes). Despus de los pretratamientos para remover metales es necesario esterilizar el medio de melazas con un vapor mnimo de 120C debido a la sensibilidad del proceso a contaminacin por bacterias. La inoculacin se realiza indistintamente con esporas o con cultivo vegetativo crecido separadamente en un tanque de alrededor de 10% el volumen del fermentador. Cuando se inocula con esporas es recomendable agregar surfactantes que garanticen su rpida suspensin en el seno del medio.

Durante la fase de crecimiento se presenta un espumado excesivo que es controlado con el uso de rompedores mecnicos o agentes qumicos. La fermentacin se lleva a cabo a 25-30C dependiendo de la cepa y tiene una duracin total de 5 a 8 das o hasta que la produccin empieza a ser incosteable. Al trmino de esta el medio es filtrado y el licor enviado a recuperacin. El mtodo de cultivo sumergido es ms eficiente y menos intensivo en mano de obra que el de superficie pero requiere de un monitoreo constante y un control preciso. Recuperacin del producto El primer paso en la recuperacin del cido ctrico consiste en la filtracin del micelio usando filtros rotatorios o similares. En caso de que la concentracin de cido oxlico sea significativa es necesario separar este cido como oxalato de calcio agregando Ca(OH)2 a 80C. Este paso es importante debido a la toxicidad del oxlico cuando el producto final se dedica a la alimentacin. La cristalizacin directa del cido ctrico no es posible debido a la presencia de residuos micelares y polisacridos originalmente presentes en la melaza. Consecuentemente varias purificaciones son necesarias. La primera consiste en precipitar el cido en forma de citrato triclcico por adicin de cal a 90C. El precipitado es filtrado y lavado y posteriormente acidificado con 50C con H2SO4, generando el cido libre. El CaSO4 formado es separado por filtracin y el lquido que contiene el cido ctrico es desionizado en columnas de intercambio y decolorado con carbn activado. La solucin obtenida es concentrada al vaco. En Europa la cristalizacin final se produce a temperaturas de 20-25C para generar el cido monohidratado que es separado por centrifugacin. En Estados Unidos la cristalizacin se efecta por evaporacin dando como resultado la forma anhidra del cido. Para su uso de alimentos se requiere una cristalizacin final en agua. El diagrama de flujo completo se presenta en la figura 4

Futuros desarrollos A pesar de los espectaculares avances en la gentica de microorganismos y la madurez alcanzada por la tecnologa de fermentaciones los mtodos de produccin de cido ctrico no difieren notablemente de aquellos usados 30 o 40 aos atrs. Varios intentos se han hecho de producir cido ctrico por cultivo continuo, mas la tendencia del hongo a adherirse da las paredes y la complejidad de las variables ambientales han retrasado su aplicacin industrial. Muchos esfuerzos se realizan encaminados a encontrar nuevas tecnologas. Ciertos desarrollos merecen especial atencin por ser los orgenes de nuevas innovaciones. Algunos ejemplos incluyen el empleo de micelio inmovilizado por adsorcin en materiales slidos o por encapsulacin de geles y el empleo de biodiscos. En particular, el uso de levaduras y bacterias, aprovechando sus altas tasas de crecimiento y su facilidad para crecer en una gran variedad de sustratos, resulta promisorio. Finalmente, otro campo de sumo inters reside en el uso de las tcnicas de ingeniera gentica para mejorar los procesos existentes. Por citar uno de muchos posibles ejemplos, la fermentacin resultara ms econmica si se consumieran fuentes de carbono ms baratos que la melaza, tales como desperdicios celulsicos. Esto podra lograrse transfiriendo a A. niger los genes que codifican celulasas de alta actividad o aumentando las dosis ya presentes. Bibliografa Garca Garibay et al. Biotecnologa Alimentaria Editorial Limusa. 2004 Paginas 533-565