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Lutilizzo dei biocatalizzatori produce certamente molti vantaggi: 1) Gli enzimi sono catalizzatori molto efficienti. Vi una accelerazione per una reazione catalizzata da enzimi di circa un fattore di 108. Si pu arrivare anche a 1012 che molto lontano da quello che pu fare un catalizzatore chimico. Inoltre la concentrazione di un catalizzatore chimico va dallo 0.1-1% mentre quella di un biocatalizzatore va dal 10-3 -10-4%. 2) Gli enzimi sono accettati dallambiente. A differenza dei metalli pesanti che compongono normalmente i catalizzatori chimici gli enzimi sono completamente degradati dallambiente. 3) Gli enzimi agiscono in condizioni blande. Gli enzimi lavorano in un intervallo di pH che vada 5 a 8, normalmente 7, a temperatura di 20-40C, normalmente 30C. Questo minimizza la possibilit di avere reazioni non desiderate come decomposizione, isomerizzazione, racemizzazione,
riarrangiamento.
2 4) Gli enzimi non sono legati al loro ruolo naturale. Dimostrano una grande tolleranza accettando anche substrati di produzione umana e non devono per forza lavorare in acqua. 5) Gli enzimi possono catalizzare un largo spettro di reazioni. Come tutti i catalizzatori gli enzimi accelerano solo la reazione ma non influenzano lequilibrio termodinamico.
Dal punto di vista stereochimico gli enzimi mostrano queste caratteristiche: Chemoselettivit. Poich lenzima in grado di agire su un singolo tipo di gruppo funzionale, altre funzioni sensibili non vengono elaborate. Regioselettivit e diastereoselettivit. Data la loro struttura tridimensionale complessa, gli enzimi possono distinguere tra gruppi funzionali che sono chimicamente situati in regioni differenti della stessa molecola substrato. Enantioselettivit. gli enzimi sono tutti formati, in quanto proteine, da L-amminoacidi, e quindi sono catalizzatori chirali. Ogni tipo di chiralit quindi presente nel substrato riconosciuta nel momento della formazione del complesso enzima-substrato. Cos un substrato prochirale pu essere trasformato in un prodotto otticamente attivo, e i due enantiomeri di un substrato racemico possono reagire e con velocit differenti portando ad una risoluzione cinetica.
Importanza dellenantioselettivit
Tutti i processi biochimici che avvengono in un organismo sono governati da enzimi. Dal momento che la maggior parte di essi altamente selettiva nei confronti della chiralit del substrato, ovvio che gli enantiomeri di un composto bioattivo come un farmaco o un composto agrochimico danno differenti effetti biologici. Di conseguenza essi possono essere visti come due specie differenti: lisomero che ha lattivit pi alta chiamato eutomero, mentre il suo enantiomero che possiede attivit minore o indesiderata detto distomero. Leffetto del distomero pu essere pi basso, nullo o addirittura tossico.
3 R-enantiomeri S-enantiomeri
HOOC SH NH2
COOH
penicillammina
HS NH2
tossico
antiartritico
terpene
OH
OH
odore di lill
HOOC
NH2
H2N
COOH
asparagina
NH2 O O NH2
dolce
amaro
Di conseguenza i racemati dei prodotti farmaceutici ed agrochimici sono visti con sospetto. Con grande meraviglia l88% dei 480 farmaci chirali sintetici venivano nel 1982 venduti in forma racemica e circa
4 il 92% dei pesticidi. Questa situazione andata via via cambiando sotto la spinta legislativa che ha portato ad una sempre maggiore richiesta di prodotti enantiomericamente puri. Sfortunatamente solo il 10% dei composti organici pu essere separata mediante tecniche di cristallizzazione frazionata. Le principali sintesi asimmetriche inoltre fanno uso di ausiliari chirali enantiomericamente puri che in molti casi sono molto costosi e non possono essere ricuperati. Daltra parte la sintesi del composto desiderato partendo dal cosiddetto chiral pool che sono i composti naturali enantiomericamente puri come i carboidrati, gli amminoacidi i terpeni e gli steroidi non sempre possibile.
5 libera o immobilizzati dipende da una serie di fattori: a) il tipo di reazione; b) i cofattori che devono essere riciclati; c) la scala in cui la biotrasformazione deve essere fatta.
sciolto in acqua
Vantaggi apparecchiatura semplice, lavorazione semplice, migliore produzione dovuta alla capacit di tollerare alte concentrazioni alta attivit dellenzima
sospeso in reazione facile da fare, solvente organico reazione facile da lavorare, substrati lipofilici solubili, facile recupero dellenzima immobilizzato facile recupero dellenzima Cellule come tali equipaggiamento costoso, lavoro oneroso a causa dei grandi volumi, bassa produttivit data dalla bassa tolleranza alla concentrazione, bassa tolleranza ai solventi organici, reazioni collaterali dovute al metabolismo attivit pi alta facile lavorazione, pochi prodotti collaterali possibile riciclaggio delle cellule
Le biotecnologie hanno sviluppato la sintesi di una serie di prodotti chimici che vanno dagli amminoacidi alle penicilline, partendo da prodotti poco costosi come i carboidrati e utilizzando le cellule di vari microrganismi. Queste sintesi sono dei processi fermentativi che avvengono mediante una serie di reazioni consecutive. In constrasto la maggior parte delle biotrasformazioni microbiologiche partono da molecole organiche complesse e avvengono in un unico stadio usando le
6 potenzialit enzimatiche di un microrganismo per trasformare il composto organico non-naturale nel prodotto desiderato.
Questa schematizzazione per quanto sofisticata per quel tempo rappresenta lenzima come un catalizzatore rigido. questo non spiega il fatto che gli enzimi in generale sono capaci di biotrasformare una grande quantit di substrati anche con forme diverse. Nel 1960 Koshland ammise che gli enzimi non erano cos rigidi come descritto precedentemente. Egli formul lipotesi che durante la formazione del complesso enzima -substrato, l(enzima possa cambiare la sua conformazione sotto linfluenza del substrato stesso in modo da accoglierlo come ospite. Un modello adatto a spiegare questa interazione dato dalla mano (il substrato) e dal guanto (lenzima). Questo modello spiega anche perch in molti casi sono richieste delle particolari strutture sul substrato. Queste particolari strutture possono trovarsi anche a distanza considerevole dal sito attivo. Lesempio pi tipico di enzima in cui viene indotta la struttura (induced-fit) sono le lipasi. Questi enzimi sono in grado di elaborare una grande variet di substrati artificiali che non hanno molto in comune con i substrati naturali che sono i trigliceridi.
7 A rappresenta il gruppo reattivo del substrato, X il corrispondente gruppo reattivo dellenzima. La parte B del substrato forza lenzima ad adattarsi ad una differente conformazione. Entrambi i gruppi attivi X dellenzima sono posizionati in maniera corretta per effettuare la catalisi. Se non c la parte B, non vengono indotti cambiamenti conformazionali e loperatore chimico inattivo.
La regola dei tre punti di attacco La razionalizzazione che spiega lenantioselettivit di un enzima stata fatta da Ogston in un articolo su Nature del 1948: per avere un alto grado di enantioselettivit il substrato deve essere legato fermamente in uno spazio tridimensionale. Per fare questo ci devono essere almeno tre differenti punti di attacco del substrato allinterno del sito attivo. Facciamo un rappresentazione schematica della discriminazione fra gli enantiomeri di una miscela racemica quando la chiralit data da un carbonio sp3.
Nel caso I lenantiomero A un buon substrato per dare unottima interazione dei suoi gruppi A, B, C con i gruppi complementari del sito attivo dellenzima A, B, C. Questo assicura unottima orientazione del gruppo reattivo D nei confronti delloperatore chimico che procede alla trasformazione.
8 Nei casi II, III e IV lenantiomero B un substrato che non si adatta bene al sito attivo e lorientazione del gruppo reattivo D non possibile. In questi casi la catalisi enzimatica sar scadente. Se nella catalisi invece coinvolto un substrato prochirale che porta due gruppi identici A ma stereochimicamente differenti (gruppi enantiotopici)
si pu applicare lo stesso modello per capire quale trasformazione sar favorita: questa si chiama differenziazione enantiotopica.
Il caso V mostra un buon legame del substrato prochirale C con il sito attivo complementare dellenzima. Il gruppo A pro-R situato nella posizione corretta rispetto alloperatore chimico. nel caso VI la sistemazione del gruppo A pro-S nei confronti delloperatore chimico scadente e questo porta ad una catalisi non buona. Come conseguenza il gruppo pro-R idrolizzato in modo migliore che il gruppo pro-S. Labilit dellenzima a distinguere tra due facce enantiomeriche di un substrato prochirale del tipo D illustrata nella prossima figura si parla di differenziazione di enantiofacce.
Nel caso VII si ha una buona corrispondenza tra i gruppi funzionali del composto D con quelli delloperatore chimico e questo porta ad un attacco allatomo centrale X dalla faccia Si. Nel caso VII lorientazione speculare del substrato D porta ad una non-corrispondenza dei gruppi. Lattacco delloperatore chimico, che dovrebbe entrare sulla faccia Re, sfavorito.
Cinetica della selettivit Come in ogni altra reazione catalitica un enzima (E) accelera la reazione abbassando la barriera di energia (energia di attivazione Ea) tra il substrato e il prodotto. La catalisi quindi dovuta alla stabilizzazione dello stato di transizione da parte dellenzima, assumendo che il catalizzatore si leghi pi fortemente allo stato di transizione che al substrato nello stato fondamentale.
10 Virtualmente la stereoselettivit dellenzima si origina dalla differenza di energia nel complesso enzima-stato di transizione (ES). Per esempio, in una reazione enantioselettiva entrambi i substrati enantiomerici A e B o le due forme speculari di un substrato prochirale, che coinvolgono i suoi gruppi enantiotopici o le facce, competono con il sito attivo dellenzima. A causa dellintorno chirale del sito attivo dellenzima, si formano i complessi diastereomerici enzimasubstrato (EA#) ed (EB#) che possiedono differenti valori di energia libera per i loro stati di transizione:Il risultato una differenza nellenergia di attivazione sia per i substrati enantiomerici sia per le orientazioni enantiomeriche e come conseguenza un enantiomero si trasformer pi velocemente di un altro.
Il valore di questa differenza in energia, espressa come G#, una misura diretta della selettivit della reazione che governa il rapporto degli enantiomeri P e Q e quindi la purezza ottica del prodotto. Nella tabella successiva sono espressi alcuni valori rappresentativi di eccessi enantiomerici (ee) corrispondenti a valori di G# della reazione descritta precedentemente.