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3- QUMICA E BIOQUMICA MICROBIANA

I.3- Qumica e Bioqumica Microbiana I.3.1- Introduo

Organismos vivos (microrg.) classificados: mquinas qumicas qumicos e vivem por meio so feitos de compostos de reaes qumicas

ocorrem sob a ao de uma enzima especfica.

a capacidade de desenvolverem uma infinidade de enzimas

capazes de se adaptar s mudanas necessrias que a clula microbiana solicita medida que o ambiente sofre variaes.

Como toda a matria: organismos vivos contm tomos e molculas como suas unidades estruturais bsicas. A forma como estes tomos e molculas interagem: determinam as qualidades fundamentais dos compostos (solubilidade e acidez).

Os compostos orgnicas biologicamente importantes nos organismos vivos so : carboidratos; lpideos; protenas; cidos nucleicos.

1) Carboidratos: acares e amido so fontes primrias de energia nas clulas. alguns carboidratos tambm so encontrados nas paredes celulares microbianas, enquanto outros servem como fonte de reserva nutritiva e atuam como precursores de protenas, lpideos e cidos nuclicos. Frmula geral: (CH2O)n
Estruturas simples (monossacardeos= acares simples/ 6 carbonos hexoses= glicose, glactose e frutose) Estruturas complexa (grande nmero de molculas)/ ligao de 2 ou mais monossacardeos/ lactose (2 monossac= galactose +glicose) e sacarose (glicose+frutose) 6

Polissacardeos (grande nmero de monossacardeo)- no so solveis em gua: so importantes na estrutura das clulas e no

armazenamento de energia. Ex: dextrana, sintetizada por bactrias e utilizada em substituio do plasma sanguneo e celulose encontrada nas paredes celulares de plantas e da maioria de algas.

2) Lpideos: solveis em solventes apolares (acetona, clorofrmio, ter ou benzeno/insolvel em gua; Classes: triglicerdeos, fosfolpdeos e esteris; a) Triglicerdeos: as gorduras so lpideos simples

constitudo de 2 grupamentos: glicerol (C3H8O3) e cidos graxos (CH3(CH2)n-COOH). Os grupamentos hidroxila (-OH), que so polares, tornam o glicerol solvel em gua.

b) Fosfolpideos: os lipdeos complexos so componentes importantes de membranas celulares. Ex: uma nica clula da bactria Escherichia coli contm 22.000.000 membrana. Os fosfolipdeos diferem dos triglicerdeos em dois aspectos: somente duas molculas de cidos graxos esto ligados a molcula de glicerol; e um grupo fosfato est ligado ao glicerol.
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de

molculas

de

fosfolipdeo

em

sua

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c) Esteris: altamente apolar e consiste principalmente de vrios anis constitudos de tomos de carbono ligados entre si. O composto colesterol um componente normal de algumas membranas. Certas drogas antifngicas combinam

com os esterides nas membranas dos fungos e eventualmente matam as clulas.

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3) Protenas: em termos de peso, as protenas ultrapassam os lipdeos e carboidratos na clula; em termos de funo apresentam mltiplas tarefas; algumas podem ser enzimas, os agentes catalticos que controlam todos os processos bioqumicos; outras podem fazer parte da estrutura da clula, como o flagelo;

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podem controlar o transporte de nutrientes atravs da membrana; as toxinas liberadas pelas clulas bacterianas so protenas; so compostas de muitas molculas de aminocidos ligadas entre si formando a cadeia; todas as protenas, independentemente de sua funo ou espcie de origem, so construdas a partir de um conjunto bsico de vinte aminocidos, arranjados em vrias seqncias especficas.
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exercem funes diversas, como: - Catalisadores; - Elementos estruturais (colgeno) e sistemas contrteis; - Armazenamento (ferritina); - Veculos de transporte (hemoglobina); - Hormnios; - Anti-infecciosas (imunoglobulina); - Enzimticas (lipases); - Nutricional (casena); - Agentes protetores.

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4) cidos Nuclicos: a descoberta das substncias qumicas que carregam a informao e Maclyn gentica McCarty nas clulas foi um os marco: cidos microbiologistas americanos- Oswald Avery, Colin Macleod identificaram desoxirribonuclico (DNA); DNA substncia responsvel pelas caractersticas

hereditrias dos organismos vivos.

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Os trabalhos de James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins resultaram na compreenso da aparncia fsica do DNA, bem como seu funcionamento. O DNA e uma outra substncia, inicialmente encontrada nos ncleos das clulas, o cido ribonuclico (RNA), so denominados de cidos nuclicos.

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1.3.2- Fonte de carbono: O carbono um elemento essencial necessrio ao crescimento microbiano. Todos os organismos requerem carbono de alguma forma; Os compostos orgnicos so aqueles que contem carbono, enquanto os compostos inorgnicos so os que no contm (exceo CO2 inorgnico);

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O carbono forma o esqueleto das trs maiores classes de nutrientes: carboidratos, lipdeos e protenas; Tais compostos fornecem energia para o crescimento das clulas e servem como unidade bsica do material celular. Entre os microrganismos h duas categorias de acordo com as suas necessidades nutricionais: - autotrficos; - heterotrficos.

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autotrficos: - usam carbono inorgnico na forma de dixido de carbono (CO2) como nica ou principal fonte de carbono. Estes microrganismos podem ser cultivados num meio de cultura s com compostos inorgnicos, pois no necessitam de compostos orgnicos e podem ser inibidos por eles.

Ex: Cianobactrias

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heterotrficos: usam compostos orgnicos como principal fonte de carbono. Estes microrganismos no podem ser cultivados num meio s com compostos inorgnicos, pois eles necessitam de nutrientes orgnicos, principalmente glicose.

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1.3.3- Fonte de nitrognio: Todos os organismos tambm necessitam de nitrognio em alguma forma. O elemento parte essencial dos aminocidos que juntos formam as protenas. As bactrias so particularmente versteis na utilizao de nitrognio.

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Algumas bactrias podem utilizar nitrognio gasoso ou atmosfrico para a sntese celular por meio do processo fixao de nitrognio. Podem utilizar compostos nitrogenados inorgnicos como: nitratos; nitritos; sais de amnia Fontes orgnicas como: aminocidos peptdeos.
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1.3.4- Hidrognio, Oxignio, Enxofre e Fsforo: O H2 e o O2 fazem parte de muitos compostos orgnicos. O enxofre necessrio para a biossntese dos aminocidos cistena, cistina e metionina. O fsforo essencial para a sntese de cidos nuclicos e adenosina trifosfato (ATP), importante para o armazenamento e a transferncia de energia. Sulfatos e fosfatos podem suprir os principais elementos necessrios.
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1.3.5- Outros elementos: Outros elementos so importantes embora em menores quantidades so eles: Na+; Fe+2 requerido como cofator para enzimas (catalases); Zn+2-; Cu+2; Mn+2; Mo+2 (nitrogenase); Co+2.
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Ativadores de enzimas

1.3.6- Fonte de Energia:

Os organismos que utilizam compostos qumicos para obter energia so chamados quimiotrficos. Os que dependem primariamente da energia radiante (luz) so chamados fototrficos. Pela combinao destes termos com aqueles relacionados s principais fontes de carbono, os seguintes grupos emergem:

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Quimioautotrficos: organismos que utilizam subst. qumicas (inorgnicas) como fontes de energia e dixido de carbono como principal fonte de carbono. Quimioheterotrficos: organismos que utilizam subst.

qumicas (orgnicas) como fontes de energia e os compostos orgnicos como principal fonte de carbono.

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Fotoautotrficos: utilizam a luz como fonte de energia e dixido de carbono como fonte principal de carbono. Fotoheterotrfico: utilizam a luz como fonte de energia e compostos orgnicos como fonte principal de carbono.

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Classificao nutricional dos microrganismos:

Grupo Nutricional Quimioautotrfico Quimioheterotrficos Fotoautotrficos Fotoheterotrficos Fonte de Carbono Dixido de Carbono Compostos Orgnicos Dixido de Carbono Compostos Orgnicos Fonte de energia Compostos Inorgnicos Compostos Orgnicos Luz Luz

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1.3.7- Reaes Qumicas: Enzimas

As enzimas so sintetizadas atravs de informao gentica. Quimicamente as enzimas so: protenas (com uma estrutura qumica especial); contendo um centro ativo (apoenzima); necessita de coenzimas ou cofatores.

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1.3.7.1- Co-enzimas e cofatores (caderno)

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1.3.7.2-Classificao das Enzimas As enzimas podem ser classificadas em 6 classes: Oxidorredutases; Transferases; Hidrolases; Liases; Isomerases; Ligases.

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Oxidorredutases: So enzimas que catalisam reaes de transferncia de eltrons, ou seja: reaes de oxi-reduo. So as desidrogenases e as oxidases. Se uma molcula se reduz, tem que haver outra que se oxide. Transferases: Enzimas que catalisam reaes de

transferncia de grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Como exemplo: Quinases e as Transaminases.

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Hidrolases: Catalisam reaes de hidrlise de ligao covalente. Ex: As peptidades.

Liases: Catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico. Dehidratases e as descarboxilases so bons exemplos.

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Isomerases: Catalisam reaes de inter-converso entre ismeros pticos ou geomtricos. As epimerases so exemplos.

Ligases: Catalisam reaes de formao e novas molculas a partir da ligao entre duas j existentes, sempre s custas de energia (ATP). So as sintetases.

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1.3.8- Complexo Enzima/Substrato: Em uma reao qumica, o composto-alvo da enzima o substrato (especificidade), que ser convertido em produto. Enzima + Substrato= Complexo enzima-substrato. Especificidade= nico substrato ou com grupos de subst. Itimamente relacionados. Existe alguns modelos de ligao:

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Modelo Chave/Fechadura: que prev um encaixe perfeito do substrato no stio de ligao, que seria rgido como uma fechadura.

Modelo do Ajuste Induzido: que prev um stio de ligao no totalmente pr-formado, mas sim moldvel molcula do substrato; a enzima se ajustaria molcula do substrato na sua presena.

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Terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma "toro" da molcula do substrato, que o "ativaria" e o prepararia para a sua transformao em produto.

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1.3.8.1- Inibio Enzimtica: Inibidor composto que se liga enzima e que afeta negativamente a sua atividade. Pode ser: natural utilizado pelas clulas para regularem o seu metabolismo. artificial usado para combater doenas, eliminar pestes, estudar laboratorialmente as enzimas, indstria alimentar...

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Outras formas de inibio: Inibio competitiva: competio entre duas molculas

diferentes pelo mesmo stio ativo. Inibio no-competitiva: componente da enzima. o inibidor no compete com o

substrato pelo stio ativo. O inibidor liga-se a um outro

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1.3.9- Aplicaes Industriais das Enzimas: a) Uso Das Enzimas Nas Indstrias Alimentcias: - Reduo da viscosidade. - Melhoria da filtrabilidade. - Clarificao e estabilizao dos lquidos devido sua conservao. - Insolubilizao das macromolculas para formao de cogulo. - Melhoria da digestibilidade. - Melhoria da fermentabilidade. - Melhoria da textura. - Melhoria da caracterstica organolpticas. - Aumento do poder adoante. - Melhoria da estabilidade bacteriolgica. - Reduo da dificuldade para cristalizao. - Correo das deficincias enzimticas de origem natural.
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Ex: 1) Alfa-amilase bacteriana EC (Alfa-1,4 Glucanes /// 4glucanoidrolase; amyloliquefaciens amilopectina 3.2.1.1) Bacillus

hidroliza amilose e solubiliza o amido viscosidade

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1.4- CARACTERSTICAS DOS MEIOS DE CULTIVO

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I.4- Caractersticas do Meio de Cultivo Os meios de cultivo preparados podem ser: aplicados diretamente no processo (obteno de produtos); manuteno das culturas.

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Concentrao no inibitria dos nutrientes

pH Fatores

Condies de Assepsia

Nutrientes necessrios

Esterilizao

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Meios de cultura: associao quali e quantitativamente equilibrada, de substncias que, por natureza, permitem o cultivo dos microorganismos fora de seu habitat.

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Em termos de caractersticas estes devem: Ser o mais barato possvel; Atender s necessidades nutricionais dos microrganismos; Auxiliar no controle do processo, como o caso de ser ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas do pH ou evitar excessiva formao de espuma;

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No provocar problemas na recuperao do produto; Os componentes devem permitir algum tempo de armazenamento, a fim de estarem disponveis todo o tempo; Ter composio razoavelmente fixa;

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No causar dificuldades no tratamento final de efluente; Sem substncias txicas.

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I.4.1- Classificao dos Meios de Cultura: Quanto a apresentao: podem ser lquidos ou slidos. Os lquidos so usados quando se deseja um grande nmero de clulas; Os slidos so usados para isolamento de espcies e conservao de cultura.

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Os meios slidos tm aspecto gelatinoso, devido presena de gar (polissacardeo extrado de algas) ou de gelatina. O gar no atacado pela grande maioria dos

microrganismos e no liquefeito em temperaturas normalmente usadas para o crescimento (em torno de 30 - 35 C).

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Quanto origem dos constituintes: naturais sangue...); sintticos (meio gar nutriente, meio (caldo de cana, melao,

sabourand...).

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Quanto natureza dos constituintes: meios minerais, meios orgnicos, meios mistos (fontes de carbono orgnico e demais componentes minerais) e meios complexos (tm-se vitaminas como fatores de crescimento). Quanto finalidade: meios de cultivo, meios de enriquecimento, meios de identificao, meios diferenciais e meios para conservao.
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Meio de cultura depende: Tipo de microrganismo; Produto pretendido; Escala do processo.

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MEIOS DE CULTURA Tipos de Meios de Cultura Caldo Nutriente (Simples) Para cultivo e contagem em placa de bactrias aerbias totais. Meio YMA Tambm para o cultivo e a contagem em placa de bactrias aerbias totais. Gelose Sabouranddextrose - Para cultivo e contagem em placa de leveduras e fungos no filamentosos. Gelose Czapeck - Para cultivo e contagem em placa de fungos filamentosos.
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Exemplo: Os meios de cultura utilizados e suas respectivas frmulas so: Meio YMA- Para cultivo e contagem em placa de bactrias aerbias totais. Componentes: 10g de glicose; 3 g de extrato de levedura, 5,0 g de peptona, 18 g de agar-agar; 1L de gua destilada.

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Gelose

Sabourand-dextrose:

Para

cultivo

contagem em placa de leveduras e fungos no filamentosos. Componentes: 10g de peptona; 40 g de dextrose; 20 g de agar-agar; 1L de gua destilada.

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Fontes mais empregadas: 1- Glicose

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2- Fontes de azoto ou N2

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Preparao dos meios: Na preparao dos meios e na manuteno das culturas de microrganismos importante observar as necessrias condies de assepsia, de modo a se evitarem contaminaes com outros microrganismos.

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Sistema de Assepsia: 1- Autoclaves: Vertical e Horizontal (calor mido)

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1- Autoclave Vertical Formado por um cilindro metlico resistente vertical com uma tampa que permite fechar hermeticamente o autoclave. Essa tampa apresenta parafusos de orelhas e uma anilha de amianto que impedem a existncia de fugas de presso.

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Tem geralmente um manmetro, uma vlvula de segurana e uma torneira para descarga. Na preparao dos meios e na manuteno das culturas de microrganismos importante observar as necessrias condies de assepsia, de modo a se evitarem contaminaes com outros microrganismos.

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As autoclaves no necessitam de termmetro para indicar a que temperatura se encontra o vapor de gua no seu interior visto que existe uma relao direta entre a presso do vapor de gua saturado e a temperatura desse mesmo vapor.

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2- Fluxo Laminar Bacteriolgico

Calor Seco

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Repique a operao que consiste no transporte de uma certa poro de uma cultura (inoculum esterilizado. ou semente) para um meio

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Os repiques devem ser feito com muita assepsia, para que no ocorra contaminaes, ou seja, todo material deve ser esterilizado e deve-se ter perfeita observncia das normas da prtica assptica;

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H 2 casos de repique: da placa ao tubo; de um tubo ao outro (que ser utilizado no nosso procedimento experimental); Em geloses inclinadas, as culturas resistem por mais tempo do que em meio lquido, pois os microorganismos tem acesso mais lento ao material nutritivo, esgotando-o lentamente. No entanto, eles ressecam rapidamente.

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tempo de incubao aps repique Os tubos com as novas culturas colocados na estufa, a uma temperatura de 30oC -35oC por 48 horas para bactrias e 120 horas para fungos.

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Escala Industrial (Scaling-up)

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Condies de Fermentao
pH Temperatura Velocidade de Agitao Oxignio Dissolvido Densidade Celular Etc. Podem influenciar: - Produtividade do processo; - Morfologia das clulas; - Diretamente a atividade Microbiana; - As condies seletivas para contaminaes.

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