Desde la dcada de 1950 y 1960, los bilogos moleculares han aprendido a caracterizar, aislar y manipular los componentes moleculares

de las clulas y organismos. Estos componentes incluyen el ADN, el repositorio de informacin gentica; ARN, un pariente cercano de ADN cuyas funciones abarcan desde que acta como una copia de trabajo temporal de ADN a reales funciones estructurales y enzimticas, as como una parte funcional y estructural del aparato traslacin; y protenas, el tipo de molcula en las clulas estructural y enzimtica principal.

Clonacin de expresin
Una de las ms elementales tcnicas de biologa molecular para estudiar la funcin de las protenas es expresin de clonacin. En esta tcnica, ADN de codificacin para una protena de inters se clona (mediante PCR y enzimas de restriccin) en un plsmido (conocido como un vector de expresin). Este plsmido puede tener elementos de promotor especial a la produccin de la unidad de la protena de inters y tambin puede tener marcadores de resistencia a los antibiticos para ayudar a seguir el plsmido. Este plsmido puede insertarse en clulas bacterianas o animales. La introduccin de ADN en las clulas bacterianas puede realizarse por transformacin (a travs de la captacin de ADN desnudo), conjugacin (a travs de contacto de la clula-clula) o por transduccin (mediante vectores virales). Introducir ADN en clulas eucariotas, tales como las clulas animales, por medios fsicos o qumicos se llama transfeccin. Varias tcnicas de transfeccin diferentes estn disponibles, tales como fosfato de calcio transfeccin, electroporacin, Microinyeccin y transfeccin liposoma. ADN tambin puede introducirse en las clulas eucariotas con virus o bacterias como portadores, este ltimo a veces se llama bactofection y en particular utiliza Agrobacterium tumefaciens. El plsmido puede integrarse en el genoma, resultando en una transfeccin estable, o puede permanecer independiente del genoma, llamado transfeccin transitoria. En cualquier caso, ADN codifica una protena de inters es ahora dentro de una celda, y ahora puede expresarse la protena. Una variedad de sistemas, tales como promotores inducibles y los factores especficos de sealizacin celular, estn disponibles para ayudar a expresar la protena de inters en niveles altos. Grandes cantidades de una protena, a continuacin, pueden ser extradas de la clula eucariota o bacteriana. La protena puede probarse para actividad enzimtica bajo una variedad de situaciones, la protena puede ser cristalizada as su estructura terciaria puede ser estudiado, o en la industria farmacutica, la actividad de nuevos medicamentos contra la protena puede ser estudiada.

Reaccin en cadena de polimerasa (PCR)

La reaccin en cadena de polimerasa es una tcnica muy verstil para la copia de ADN. En breve, PCR permite una sola secuencia de ADN que se copien (millones de veces) o alterado de manera predeterminada. Por ejemplo, la PCR puede utilizarse para introducir sitios de enzima de restriccin o para mutar (cambiar) bases particulares del ADN, ste es un mtodo conocido como "Cambio rpido". PCR puede utilizarse tambin para determinar si un determinado fragmento de ADN se encuentra en una biblioteca de ADNc. PCR tiene muchas variaciones, como invertir transcripcin PCR (RT-PCR) para amplificacin de ARN y, ms recientemente, PCR en tiempo real (QPCR) que permiten la medicin cuantitativa de las molculas de ADN o ARN.

Electroforesis en gel
Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biologa molecular. El principio bsico es ADN, ARN, y protenas pueden ser separadas por medio de un campo elctrico. Gel de electroforesis en agarosa, ADN y ARN pueden separarse de tamao ejecutando el ADN a travs de un gel de agarosa. Las protenas pueden separarse de tamao mediante el uso de un gel de SDS-PAGE, o sobre la base de tamao y su carga elctrica utilizando lo que se conoce como una electroforesis en gel 2D.

Macromolcula Blot y sondeo

Los trminos '' Norte '', '' western'' y '' Oriental '' Blot se derivan de lo que inicialmente fue una broma de biologa molecular toc en el trmino '' Southern blot '', despus de que la tcnica descrita por Edwin sur para la hibridacin de contrarrestarlo ADN. Patricia Thomas, desarrollador de la Mancha de RNA que entonces fue conocida como la '' Mancha Norte '' realmente no utilizar el trmino. Ms combinaciones de estas tcnicas producen trminos como '' southwesterns'' (hibridaciones ADN protena), '' northwesterns'' (para detectar interacciones protena-ARN) y '' farwesterns'' (interacciones protena-protena), todos los cuales son actualmente encontr en la literatura.

Southern blot
En honor de su inventor, el bilogo Edwin Southern, the Southern blot es un mtodo para sondear la presencia de una secuencia especfica de ADN en una muestra de ADN. Muestras de ADN antes o despus de la digestin de la enzima de restriccin se separan por electroforesis en gel y luego transferidas a una membrana por Blot a travs de la accin capilar. La membrana entonces est expuesta a una sonda de ADN etiquetada que tiene una secuencia base de complemento a la secuencia de ADN de inters. Protocolos ms originales utilizan etiquetas radiactivas, ahora existen alternativas sin embargo no radiactivos. Southern Blot es menos utilizada en Ciencias de laboratorio debido a la capacidad de otras tcnicas, tales como PCR, para detectar secuencias especficas de ADN de muestras de ADN. Estas manchas se siguen utilizando para algunas aplicaciones, sin embargo, como el nmero de copia de transgen en ratones transgnicos, o en la ingeniera de lneas de clulas madre embrionarias de gene knockout de medicin.

Northern blot
The northern blot se utiliza para estudiar los patrones de expresin de un tipo especfico de la molcula de ARN como comparacin relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una combinacin de desnaturalizacin electroforesis en gel RNA y una mancha. En este proceso de ARN est separado basado en tamao y es transferido a una membrana que luego es sondeada con un etiquetado como complemento de una secuencia de inters. Los resultados pueden visualizarse a travs de una variedad de formas dependiendo de la etiqueta utilizada; Sin embargo, la mayora como resultado la revelacin de bandas que representa el tamao del ARN detectado en la muestra. La intensidad de estas bandas est relacionada con la cantidad del objetivo del RNA en las muestras analizadas. El procedimiento es utilizado comnmente para estudiar cundo y cunto expresin gnica ocurre midiendo cunto de ese ARN est presente en diferentes muestras. Es una de las herramientas ms bsicas para determinar en qu momento y bajo qu condiciones, algunos genes se expresan en tejidos vivos.

Western blot
Anticuerpos contra la mayora de las protenas se puede crear inyectando pequeas cantidades de la protena en un animal como un ratn, conejos, ovejas o burro (anticuerpos policlonales) o producido en cultivos celulares (anticuerpos monoclonales). Estos anticuerpos pueden utilizarse para una variedad de tcnicas analticas y preparativos. En western Blot, protenas en primer lugar se separan por tamao en un gel fino entre dos placas de vidrio en una tcnica conocida como SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida sodio Dodecil sulfato). Las protenas en el gel luego son transferidas a un PVDF, nitrocelulosa, nylon o otro membrana de soporte. Esta membrana, a continuacin, puede ser sondeada con soluciones de anticuerpos. Los anticuerpos que se unen especficamente a la protena de inters, a continuacin, pueden visualizarse por una variedad de tcnicas, incluyendo productos coloreados, quimioluminiscencia o autorradiografa. A menudo, los anticuerpos estn etiquetados con un enzimas. Cuando un sustrato quimioluminiscencia es expuesto a la enzima permite deteccin. Utilizando tcnicas occidentales Blot permite no slo la deteccin, sino tambin el anlisis cuantitativo. Mtodos anlogos a western Blot pueden utilizarse para teir directamente protenas especficas en secciones de tejidos o clulas vivos. Sin embargo, estos mtodos '' Inmunodeteccin '', como el pescado, se utilizan ms a menudo en investigacin de biologa celular.

Blot oriental
Tcnica oriental de Blot es detectar modificacin post-translacional de las protenas. Protenas contrarrestarlo con el PVDF o membrana de nitrocelulosa son sondeado para modificaciones utilizando sustratos especficos.

Arreglos de discos
Una matriz de ADN es una coleccin de puntos conectados a un soporte slido como un portaobjetos de microscopio donde cada punto contiene uno o ms fragmentos de oligonucletidos de ADN monocatenario. Matrices permiten poner una gran cantidad de muy pequeas manchas (100 micrmetros de dimetro) en una sola diapositiva. Cada lugar tiene una molcula de fragmento de ADN que es complementaria a una nica secuencia de ADN (similar a Southern blot). Una variacin de esta tcnica permite la expresin de genes de un organismo en un momento

particular en el desarrollo para ser calificado (perfil de expresin). En esta tcnica el ARN en un tejido est aislado y convertir a ADNc etiquetado. Este ADNc es hibrida entonces a los fragmentos de la matriz y puede hacerse la visualizacin de la hibridacin. Ya se pueden hacer mltiples arreglos de discos con la misma posicin exacta de los fragmentos son particularmente tiles para comparar la expresin de genes de dos tejidos diferentes, como un tejido canceroso y saludable. Adems, uno puede medir qu genes se expresan y cmo esa expresin cambia con el tiempo o con otros factores. Por ejemplo, la comn la levadura, '' Saccharomyces cerevisiae'', contiene unos 7000 genes; con un microarray, uno puede medir cualitativamente cmo se expresa cada gen y cmo esa expresin cambia, por ejemplo, con un cambio de temperatura. Hay muchas maneras diferentes de fabricar microarrays; los ms comunes son chips de silicio, microscopio con manchas de ~ 100 dimetro de micrmetros, arreglos personalizados y arreglos de discos con grandes manchas en membranas porosas (macroarrays). Puede haber en cualquier parte de 100 puntos a ms de 10.000 en una determinada matriz. Tambin pueden hacerse arreglos con molculas distintas de ADN. Por ejemplo, una matriz de anticuerpos puede utilizarse para determinar qu protenas o bacterias estn presentes en una muestra de sangre.

Oligonucletidos especficos de alelo

Oligonucletidos especficos de alelo (ASO) es una tcnica que permite la deteccin de mutaciones base nica sin necesidad de PCR o gel de electroforesis. Corto (20-25 nucletidos de longitud), con la etiqueta de sondeos estn expuestos al destino no fragmentado ADN. Hibridacin se produce con alta especificidad debido a la corta duracin de los sondeos y incluso un nico cambio base dificultarn la hibridacin. El ADN de destino, a continuacin, se lava y se eliminan los sondeos etiquetados que no hibridar. El ADN de destino, a continuacin, se analiza para la presencia de la sonda a travs de radiactividad o fluorescencia. En este experimento, como en tcnicas de biologa molecular de la mayora, debe utilizarse un control para garantizar la experimentacin exitosa. El ensayo de metilacin Illumina es un ejemplo de un mtodo que toma ventaja de la tcnica ASO para medir un par de bases diferencias en la secuencia.

Tecnologas anticuadas
En biologa molecular, procedimientos y tecnologas estn continuamente desarrollando y tecnologas antiguas abandonadas. Por ejemplo, antes de la llegada de ADN gel de electroforesis (agarosa o poliacrilamida), determina el tamao de molculas de ADN fue tpicamente por sedimentacin de tasa en gradientes de sacarosa, una tcnica lenta y trabajosa que requieren instrumentacin caro; antes de gradientes de sacarosa, se utilizaba viscometry. Aparte de su inters histrico, a menudo es interesante saber sobre tecnologa antigua, como lo es en ocasiones til para resolver otro problema nuevo para los que la tcnica ms reciente es inadecuada.