PRACTICA N 04

MTODO DE COLORACIN GRAM

COMPETENCIA: Lograr el dominio del alumno en los mtodos especiales de coloracin e interpretacin. La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin compuesta empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo. Los agentes bacterianos entonces se pueden clasificar por mltiples formas de acuerdo a las caractersticas morfolgicas, medios de cultivos y tincin. El mejor acceso a esta clasificacin va de acuerdo a una caracterstica muy distinguible en las bacterias, su pared celular. De acuerdo a esta condicin se tiene a disposicin la principal forma de tincin para las bacterias, la tincin GRAM, donde se toma en cuenta la proporcin de pptidoglucano que conforma la pared de estos patgenos, haciendo que este medio de tincin coloree de una forma si las bacterias poseen una gran proporcin de este compuesto (GRAM positivo) o aquellas con una proporcin reducida (GRAM negativos) luego de haber realizado el proceso de cultivo de manera que se pueda contar con una cantidad (1 x 10 ) suficiente de colonias para hacer correctamente el proceso de tincin.

Muestra a la izquierda de bacterias gram negativas (eschericha coli), a la derecha tenemos bacterias gram positivas(clostridium perfringes) Si el mtodo del coloracin gram hace tincin de bacterias patgenas y oportunistas y estas r de que sitio anatmico se tomo la muestra clnica y su adecuad recoleccin para que la tincin gram constituya una herramienta de utilidad diagnostica en los procesos invasivos. La tincin gram tiene valor diagnstico y puede ser aplicada para diversos especmenes clnicos Tambin puede aplicarse a diferentes tipos de material hospitalario como catteres y soluciones para el diagnostico, el uso de la tincin gram esta limitado en muestras fecales y no tiene valor en muestras farngeas como en la faringitis estreptoccica y en muestras nasofarngeas. La observacin con esta coloracin registra caractersticas como la forma (parejas, racimos, cadenas y empalizadas) y el tamao a partir de los cultivos bacterianos. En la interpretacin de este mtodo es relevante considerar la presencia de respuesta leucocitaria o respuesta inflamatoria del organismo husped.

Fundamento
El cristal violeta es el colorante base de la coloracin Gram, probablemente se combina con ciertos cidos orgnicos complejos que se hallan a nivel de la pared celular de las bacterias, esta estructura es bastante compleja constituye 10 al 30% del peso seco de las bacterias. Por ejemplo, en la pared celular de los Staphylococcus aureus se observa de afuera hacia adentro: la cpsula, una capa de protenas, luego otra capa de carbohidratos y luego una capa de mucopptidos; adems de los cidos que conforman la murena, se observa la presencia de cido teitoico slo en las Gram positivas. Todos concluyen que los colorantes que tienen ncleo de cristal violeta o violeta de genciana se combinan con el Acido diamino pimlico que conforma el Acido Murmico, colorendose de esta manera de violeta las Gram Positivas y al decolorarse con el alcohol acetona las Gram Negativas se colorean con el colorante rojo como la Safranina o Fucsina para hacer contraste, apareciendo rosadas o rojas claras las Gram negativas, de esta manera tenemos dos grandes grupos de bacterias Gram positivas y Gram negativas. Ejemplo de bacterias Gram : Gram Positivas: Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Bacillus, etc. Gran Negativas: Neisseria, Aeromonas, Pseudomonas, Escherichia, Proteus, etc.

Procedimiento
a.- Preparacin del frotis.- La muestra a colorear puede ser lquida o slida, en el primer caso la muestra se toma con el aro del asa de siembra y se coloca en el centro del portaobjeto, se procede a extenderla en un rea de 2 x 2cm. , luego se fija a la llama del mechero pasando suavemente a unos centmetros por encima de ella evitando que llegue a ebullicin o a quemar, porque las bacterias quemadas no quedan en la lmina cuando se procede a colorearlas y lavar. En caso de que la muestra sea slida primero se coloca una gota gruesa de agua destilada o suero fisiolgico sobre el porta objetos y se hacen las extensiones mezclndolos, luego se fija a la llama hasta secar.

b.- Fijacin.- Mediante el uso de calor. c. Coloracin.- El procedimiento a seguir es el siguiente: 1.Cubrir el extendido con el cristal violeta durante 1 min. 2.Lavar con agua corriente 3.Cubrir el preparado con lugol durante 1 min. 4.Lavar con agua corriente. 5.Decolorar con el alcohol-acetona hasta observar que ya no arrastre colorante 6.Lavar la lmina con agua corriente. 7.Cubrir con el colorante de contraste safranina durante 30 seg. 8.Lavar la lmina con agua corriente

9.10.-

Secar al ambiente. Observar al microscopio con lente de inmersin.

RESULTADOS
1.Las bacterias Gram positivas se observan de color violeta

Formas: cocos (racimos) Agrupacin: staphylofilos Coloracin: gran positivos Sp.Bacteriana:staphylofilos Stafilococos gram positivos

Formas: bastones Agrupacin: Coloracin: gran positivos Sp.Bacteriana: bacilos Bacilos gram positivos

Formas: cocos cadenas Agrupacin: streptococos Coloracin: gram positivos Sp.Bacteriana: streptococos gram positivos

Formas: cocos duos Agrupacin: diplococos Coloracin: gram positivos Sp.Bacterianos diplococos gran positivos

2.-Las bacterias Gram negativas se observan de color rosado

Formas: cocos duos Agrupacin: diplococos Coloracin: gram negativos Sp.Bacteriana: diplococos gram negativos

Formas: bastones Agrupacin: bacilos Coloracin: gram negativas -positivos Sp.Bacteriana: bacilos gram negativos negativosstreptococos gram positivos

INTERPRETACIN:
En la primera observacin se puede apreciar a bacterias con una coloracin violeta bastante oscura lo que indicara que se trata de una bacteria gram positiva y como se aprecia son cocos agrupados en grupos aglutinados en una forma parecida a las uvas por lo que estamos hablando de estafilococos gram positivos En el segundo extendido se hace la apreciacin de bacilos coloreados intensamente de un color violeta oscuro por lo que tambin son clasificados como bacterias gram positivas En la tercera lmina tambin se aprecia la presencia de cocos agrupados en racimos intensamente coloreados por el violeta cristal y como se dio la formacin de este complejo de violeta genciana o cristal decimos tambin que es una bacteria gram positiva En el cuarto extendido se tiene cocos agrupados de dos en dos por lo que se denominan diplococos y por la composicin de su pared celular se formo el complejo violeta el cual la hace otra bacteria gram positiva En la quinta lamina tambin se aprecia diplococos pero esta vez poseen un color mas claro entonces podemos decir que de la coloracin gram que se realiz, en el momento del colocar el decolorante la pared celular de esta clula ha reaccionado de distinta manera que con las dems por lo que si no se formo e complejo podemos decir que se trata de una bacteria gram negativa Igualmente que en la lamina anterior los organismos han tornando un rosa plido por su pared celular pero estas ltimas tienen una forma caracterstica que es la bacilar

CONCLUSIONES
La tincin gram esta asociada directamente a la pared celular de las bacteria ya que hara posible la determinacin del grupo al cual estas bacterias podran asociarse La presencia de mayor cantidad de lpidos le da a al pared celular de la bacterias gram negativas mas virulencia en procesos invasivos La coloracin de las bacterias gram negativas es rosa o ligeramente roja debido a la zafranina que se le adiciona en la batera de coloracin que se ofrece para la tincin gram, y su no coloracin se debe a que no se formo el complejo y el decolorante

realizo sus funciones demostrando que la composicin molecular de las gram negativas seria distinta a las de gram positivas Para la preparacin de la muestra al diferenciar si es un cultivo slidos de un liquido se usan medios de fijacin que para la tincin gram serian bsicas ay que al usar un medio solido necesitamos que este se encuentre en una solucin fisiolgica por lo que la fijacin se realizar con el mechero pero si el caso de el cultivo liquido par la fijacin de este necesitamos de dos gotas d e etanol y por ser u alcohol no podramos fijar con el mechero por lo que se utiliza el secado natural al aire.

CUESTIONARIO
1.- Qu estructura bacteriana es la que define la caracterstica de Gram positiva o Gram negativa?

La principal estructura de diferenciacin entre una gram positiva y una gram negativa es definida por la pared celular en cuyos componentes se encuentran compuestos complejos para dar caracterstica a cada una de estas bacterias. Entonces sacamos caracteriscas principales de la pared de cada una de estas: Las gram positivas poseen una pared celular interna y una pared esxterna de peptidoglucano. que es un exoesqueleto que da consistencia y forma esencial para replicacin y supervivencia de la bacteria. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena) A diferencia de las primeras las gram negativas poseen una pared celular ms complejo junto a lipidos. Considerando pared celular interna, pared externa de peptidoglucano, bicapa lipdica externa La capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

2.- Qu complejo se forma para que las bacterias se coloreen de color violeta?

Violeta genciana

Lugol

Complejo violeta gram+

Decolora nte cetona

zafranina

Muestra de bacterias gram positivas o negativas

3.- Graficar las observaciones indicando cada uno de los detalles. 1: Se toma la plaquita fijada con la muestra del cultivo

2: Procede a cubrirla completamente con cristal violeta por un minuto, luego se elimina el exceso con abundante agua.

3: Con el portaobjetos escurrido se procede a llenarlo con solucin de lugol completamente por encima de la muestra fijada por un minuto y luego se elimina el exceso con abundante agua.

4: Se procede entonces a cubrir la plaquita con alcohol-acetona por 10 segundos para lavar con abundante agua.

5: Por ltimo el portaobjetos con la muestra se le aade suficiente tincin de zafranina por un minuto para entonces proceder a lavar el exceso de la tincin.

6: La placa teida se procede a secar y a observar en el microscopio.

4.-

Bibliografa
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA MADRE Y MAESTRA DEPARTAMENTO DE MEDICINA Tincin gram. UNIVERSIDAD DE SALAMANCA DEPARTAMETO DE MICROBIOLOGIA Y GENETICA Tcnicas de microbiologa bsica: aislamiento y resiembra de microorganismos, manejo del microscopio ptico y tinciones. USMP FILIAL NORTE SEMINARIOS DE BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR BIOLOGA MDICA Bacterias gram positivas y gram negativas UNIVERSIDAD DE CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD Tincin gram

PRACTICA N 05

COLORACIN ZIEHL NEELSEN

COMPETENCIA:
Lograr el dominio del alumno en los mtodos especiales de coloracin e interpretacin. Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacterilogo y Friedrich Nieelsen (1854 to 1894), un patlogo. Se denomina tincin cido-alcohol resistente y es especfica para una serie de bacterias con estructura de pared particular como las micobacterias, que adiferencia de las otras no se tien con la coloracin gram. La pared de las micobacterias no est basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en cidos miclicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloracin con cido y alcohol que no se produce en casi ningn otro tipo bacteriano. La tincin de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina fenicada que tie toda la preparacin de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparacin con el colorante. La solucin decolorante que en cual sea el caso puede ser alcohol acido elimina el colorante primario excepto el los bacilos cido alcohol resistentes.(BAAR). Por ltimo el azul de metileno tie de azul el resto de la preparacin, en tal caso no tia a la muestra se denominaran bacilos alcohol-acido resistentes positivo . Esta tincin es til en la deteccin de bacterias del gnero Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnstico casi definitivo de tuberculosis.

Materiales.o o o o o o o Esputo Bateria de coloracin (Fucsina fenicada, Alcohol cido, Azul de metileno ) Lminas portaobjetos Asas de siembra. Mechero. Microscopio. Aceite de inmersin ( aceite de cedro )

PROCEDIMIENTO
a.-

Preparacin del frotis.- Con sumo cuidado, tomar con el asa de siembra estril un poco de esputo y extender sobre la lmina sin llegar a los bordes. Quemar el asa para eliminar el exceso de inculo. Secar al aire

b.- Fijacin.- Fijar al calor (a la llama del mechero)

c.- Coloracin:
1.- Cubrir la preparacin con el colorante fucsina fenicada y dejarlo por treinta a sesenta segundos. 2.- Calentar el preparado con suavidad, calentar la lmina con el mechero de alcohol, hasta observar el desprendimiento de vapor. Evitar que el colorante hierva, repetir la operacin durante tres veces. 3.- Dejar enfriar y lavar con agua corriente. 4.- Decolorar con el alcohol cido, hasta que ya no fluya colorante del frotis (dos minutos). 5.- Lavar con agua corriente. 10.- Cubrir con azul de metileno durante treinta a sesenta segundos. 11.- Lavar con agua corriente. 12.- Secar la muestra al ambiente. 12.- Observar al microscopio con aceite de inmersin.

RESULTADOS:
Las bacterias alcohol cido resistente se tien de color rojo sobre un campo de contraste azul. Los resultados son reportados de acuerdo a las normas de la Organizacin Mundial de Salud. (Negativo) : No se encuentran bacilos BAAR en 100 campos Paucibacilares: Se observa de 1 a 9 BAAR en 100 campos. (+) : Menor de un BAAR por un campo (10-99 BAAR) en 100 campos. (++) : De 1 a 10 BAAR por campo (revisar 40 campos) (+++) : Ms de 100 BAAR por campo (revisar 20 campos)

Formas: bastones ,cocos Agrupacin: bacilos staphylococos Coloracin: zielh neelsen BAAR+ Sp.Bacteriana: bacilo de koch Stafilococos BAAR positivos

Formas: cocos Agrupacin:staphylococos Coloracin: BAARSp.Bacteriana: Stafilococos

INTERPRETACIN:
Si en la muestra de esputo presentada para encontrar la presencia del bailo de koch para la identificacin de una posible tuberculosis se observo en dicho campo la presencia de un nmero considerable de bacilos por lo que clasificamos como resultado una lamina BAAR positivos Para la segunda lamina hecha por el grupo la prueba de BAAR fue negativa ya que en el primer campo no dimos presencia de estas bacterias, pero si se observo la presencia d cocos teidos con el azul de metileno pero que no son de mayor arraigo en esta tincin que fue hecha para comprobar la presencia de BAAR.

CONCLUSIONES:
Para la coloracin de ZIELH NEELSEN se toma en consideracin a bacterias que no posen las mismas caractersticas que las anteriores con la coloracin gram, entonces para ello se utilizaron una gama de tinciones a lo que llamamos tincin compuesta con la cual se obtiene la coloracin rosa de estas bacterias debido a la fucsina fenicada agregada en un primer instante Para comprobar su positividad alcohol acido resiste a estas bacterias se le agrega el alcohol acido para ver si se decoloran , si el caso fuese de tal manera el azul de metileno agregado despus del decolorante, tomara la accin de teir a estas bacterias, pero como es un resultado positivo no damos cuenta que estamos hablando de myconbacterias que son alcohol acido resistente positivas.

CUESTIONARIO
1.- Cul es la composicin qumica estructural de la pared celular de las Mycobacterias? La pared celular de estas bacterias est constituida por tres capas con tinciones convencionales su apariencia sera la siguiente: Capa interna.-moderadamente electrn densa compuesta por peptidoglucano cuya estructura las hace algo similar a otras bacterias Capa media .- ms ancha que la anterior y electrn transparente compuestas por polisacridos como el aminogalactano, cuyos extremos distales estn esterificados por cidos grasos de altsimo peso molecular , los cidos micolicos , de tamao y estructura nica para las mico bacterias (poseyendo entre 70-90 tomos de carbono) Capa externa.-de grosor variable electrn opaca de la cual no puede conocerse con las tcnicas actuales su exacta composicin aunque se le es atribuible una estructura glucolipida.

2.- Qu indica la presencia de bacilos alcohol cido resistentes en una muestra de esputo? Eso dependera de cuantos campos se revise al hacer el diagnostico y cuantas bacteria se encentre por campo en este caso hay la clasificacin de valores segn el numero de campos que se debe revisar. En tal caso la presencia de bacilos alcohol acido resistentes dar positivo en este caso del bacilo de koch, a la prueba de tuberculosis la cual se le hara a u paciente con una muestra de esputo. 3.- Cmo acta el calor y el fenol en el proceso de coloracin? .

LA FIJACIN DE LA MUESTRA
Para la fijacin de la muestra sea el caso de medios slidos o de medios lquidos se utilizara distintas formas segn sea conveniente en laboratorio primero la fijacin de un medio solido no necesita la adicin de alguna reactivo alcohol pero si de un medio en el cual se disuelva adecuadamente entonces par su fijacin se utilizaran el mechero ligeramente para calentarlo y no daar la muestra ese serie el modo de fijarla antes de proceder a su tincin En caso de un medio liquido como ya esta en solucin no necesita de un medio disolvente por lo que solo se procede al utilizacin del etanol que lo fijara para que la muestra a lavar en al tincin no se desperdicie 4.-

Bibliografa
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl_Neelsen http://es.scribd.com/doc/183630/MICROBIOLOGIAhttp://wwwn.cdc.gov/dls/ila/documents/AFBSmearStainingSp.pdf Paginas obtenidas el 24 de febrero del 2011 GRISEL RODRIGUESZ GUNS GENERO MICOBACTERIUM REVISTA DE CIENCIAS PUBLICACIN CIENTFICA TUBERCULOSIS PULMONAR BAAR NEGATIVA: INSISTIR PARA CONFIRMAR