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I nstituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa
Departamento de Bioingeniera
Academia de Ingeniera de Bioconversiones




Manual de Prcticas
del
Laboratorio de Biorreactores







M. en C. Dynora Vzquez Gurrola
M. en C. Carlos Orozco lvarez
M. en C. Leobardo Ordaz Contreras
Dr. Sergio Garca Salas

2
ndice


Prctica 1. Presentacin de biorreactores diversos ......................................................... 3

prctica 2. Instrumentacin para el seguimiento y control de la biorreaccin .................. 9

prctica 3. Servicios auxiliares ...................................................................................... 26

prctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores ......................................................... 39

prctica 5. Determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno ........................ 48

prctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores ................................................ 59

prctica 7. Esterilizacin del sistema de biorreaccin ................................................... 63

prctica 8. Produccin de biomasa en cultivo por lote ................................................... 72

prctica 9. Produccin de biomasa en cultivo por lote alimentado ................................ 81

pctica 10. Produccin de biomasa en cultivo continuo ................................................ 92




3

PRCTICA 1

Prctica 1. Presentacin de biorreactores diversos



Presentacin de
biorreactores
diversos


INTRODUCCIN

Cualquier proceso biotecnolgico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las
siguientes escalas de operacin: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden
temporal).

Cada escala tiene sus propias caractersticas y objetivos, mismos que sern tratados en
otra asignatura (Ingeniera de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores
habr que hacer la distincin entre tamaos, forma de operacin y configuracin
geomtrica.

El biorreactor puede considerarse como el corazn de todo proceso biotecnolgico, ya
que en l se lleva a cabo la transformacin de la materia prima al producto de inters y
su operacin deber garantizar la maximizacin en la conversin, por lo que su
funcionamiento es de vital importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en
aquellos catalogados como de altos volmenes de produccin y bajo valor agregado.
4

CARACTERSTICAS DE LOS BIORREACTORES

Entre las caractersticas que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:

1. Calidad de mezclado, incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que
favorezcan tanto la distribucin de la materia prima en el biorreactor como su
conversin a producto.
2. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con
economa aceptable.
3. Factibilidad tcnica y econmica en la construccin de unidades de gran
volumen.
4. Bajos costos de operacin y mantenimiento.
5. Operacin asptica.

CLASIFICACIN DE BIORREACTORES

Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:








A continuacin se describe cada tipo de biorreactor.


Biorreactores agitados

Agitado
Columna
Biorreactores
Propelas
Airlift
Jet
Circulacin
5
Este tipo de biorreactor es muy empleado en todas las escalas de produccin, en
laboratorios de investigacin o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse
incluso para fermentaciones de reologa compleja y en procesos en los que se exigen
altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten en un cuerpo cilndrico
con tapas elipsoidales, semiesfricas o toriesfricas y generalmente su relacin
altura/dimetro es menor a tres y ms comnmente menor a dos.

Cuentan con un motor al que se acopla la flecha de transmisin que contiene a su vez
los impulsores que agitarn el lquido. Dependiendo del tamao del reactor, el motor
puede colocarse en la tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de
sellos mecnicos para garantizar el trabajo asptico. Generalmente la aireacin se
realiza a travs de tubos (o placas) perforados, efectundose la dispersin del aire en
las zonas cercanas a los impulsores.

Son muy onerosos a pesar de su versatilidad, sus costos de construccin, operacin y
mantenimiento. Por limitaciones tcnicas referentes a la transmisin de potencia y a los
problemas de sostenimiento del conjunto flecha de transmisin impulsores no es
posible construir unidades mayores a los 300 m
3
.

Biorreactores de columna

Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisin mecnica para mezclar el
caldo de cultivo. El mezclado se realiza por la inyeccin de aire en el lquido desde el
fondo del recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la
turbulencia del lquido. Generalmente la relacin altura/dimetro es mayor a tres. Si las
columnas son grandes se pueden emplear platos perforados colocados en posiciones
intermedias de las mismas para redispersar las burbujas de gas.

Al carecer de partes mviles tanto la construccin, operacin y mantenimiento de este
tipo de biorreactores son ms econmicos que cualquier otro tipo. Quiz el mayor gasto
6
de operacin sea el de compresin de aire, debido a los altos flujos requeridos.
Generalmente se emplean para fermentaciones de baja viscosidad.

Biorreactores de circulacin

La denominacin de esto tipo de reactores se debe al patrn de circulacin definido del
lquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulacin externa o
interna. Externa si el lquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al
cuerpo principal del biorreactor en su parte inferior y superior, y de circulacin interna si
el lquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor. Los primeros
slo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a
utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales,
alcanzando volmenes de hasta 13,600 m
3
.

OBJETIVO

Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniera
Biotecnolgica se relaciona con el diseo, construccin, implementacin, operacin y
mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente prctica se propone como
objetivo que el alumno identifique y describa los diferentes tipos de biorreactores y sus
partes accesorias, al igual que la forma como se operan, controlan, esterilizan, cargan y
descargan, etctera.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

En principio para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno deber haber
consultado en todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean a nivel
laboratorio, planta piloto e industrial, tras lo que se le mostrar los diversos tipos de
biorreactores de nivel laboratorio y planta piloto de la unidad para el estudio de sus
componentes.

7
FORMULACIN DE RESULTADOS

El alumno realizar un informe detallado de los biorreactores presentados donde deber
reportar los siguientes puntos:

- Tipo de biorreactor.
- Capacidad.
- Caractersticas geomtricas (incluyendo el esquema del biorreactor).
- Sistema de carga y descarga.
- Sistema de agitacin del lquido de reaccin.
- Patrones de flujo. Sistema de aireacin.
- Sistemas de control (incluyendo el sistema de enfriamiento).
- Mtodo o forma de esterilizacin de los medios de cultivo, reactor (incluyendo su
limpieza), aire, aditivos de fermentacin (cidos, lcalis, antiespumante,
etctera).
- Mtodos de Cultivo (lote, lote alimentado o cultivo continuo) que se lleva a cabo
en el biorreactor.
- Produccin.
- Dispositivo de toma de muestra y de inoculacin.









BIBLIOGRAFA

8
Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. (1983), Bioreactors for Submerged Culture,
Adv. Biotech, Process, 1: 1-30.

Charles, M. (1985). Fermentation Scale-Up: Problems and Possibilities, Trends in
Biotech, 3: 80-84.

Schegerl, K. (1982), New Biorreactors for Aerobic Processes, Int. Chem. Eng., 22:
591-610.

Schegerl, K. (1985), Nonmechanical Agitated Biorreactor Systems en Comprehensive
Biotechnology, M. Moo-Young, Pergamon Press, 2: 99-118.

Sitting, W. (1983), Fermentation Reactors, Chem. Tech., 13: 606-613.

Zlokarnik, M. (1985), Tower-Shaped Reactors for Aerobic Biological Waste Water
Treatment, en Biotechnology, Rehm, H. J. y G. Reed, 2: 537-569.
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PRCTICA 2

Prctica 2. Instrumentacin para el seguimiento y control de la biorreaccin



I nstrumentacin para el
seguimiento y control
de la biorreaccin

INTRODUCCIN

Los biorreactores estn equipados con distintos instrumentos que se utilizan para
facilitar el registro y anlisis de las variables de operacin y de parmetros especficos
que sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de
operacin de la biorreaccin con el fin de maximizar la productividad y garantizar el
xito de la biorreaccin.

La instrumentacin ha sido definida como una ventana al proceso y su objetivo es
mantener al mnimo la diferencia entre el valor medido y un valor deseado. El control de
un parmetro particular se lleva a cabo a travs de un sistema que consta de un sensor
(o electrodo), un medidor y un controlador:

Sensor: dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir
en otra que facilita su medida.

Medidor: recibe la medida del valor de la propiedad que emite el sensor.
Controlador: compara dicha medida con un valor fijo.
10

Del resultado de la comparacin, el controlador toma una decisin enviando una seal
(generalmente elctrica) a algn dispositivo que ajustar el valor medido de la
propiedad hasta el valor predeterminado o de control (set point). La seal usualmente
implica la modificacin del estado de una vlvula, el encendido o apagado de una
bomba dosificadora, la modificacin de la velocidad de giro de un motor de algn
equipo, etctera.

Si, por ejemplo, se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el
estado de una vlvula se requerir de un transductor y de un actuador.

Transductor: es un dispositivo que convierte un tipo de energa en otro tipo de energa.

Actuadores: dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energa elctrica,
gaseosa o lquida. Existen tres tipos de actuadores:

- Hidrulicos, que se usan cuando lo que se necesita es potencia.
- Neumticos, simples posicionamientos.
- Elctricos, usados para manejar aparatos electrnicos o mecatrnicos.

Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo
con la masa lquida o slida de fermentacin), en cuyo caso se dice que estn en
lnea, si no estn conectados directamente al biorreactor, entonces se dice que estn
fuera de lnea.

REQUISITOS DE LOS SENSORES EN LNEA

Debido a la naturaleza de la biorreaccin se requiere que la gran mayora de los
sensores en lnea renan, entre otros, los siguientes requisitos:

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- Que sean capaces de resistir el proceso trmico al que se somete el caldo de
cultivo en el biorreactor (esterilizacin con calor hmedo).
- Que sean capaces de resistir las presiones de operacin.
- Que sean de fcil calibracin.
- Que muestren valores estables.
- Que su mantenimiento sea fcil y econmico.
- Que tengan una adecuada vida media til.

Estos sensores en lnea se utilizan bsicamente para medir propiedades fsicas o
variables de operacin como la temperatura, presin, intensidad de agitacin o
velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo de lquidos y gases, y para
medir ciertas propiedades qumicas como el pH, concentracin de oxgeno disuelto y
gaseoso, concentracin de dixido de carbono disuelto y en el gas la concentracin de
azcares disueltos, concentracin de algunos productos celulares, entre otros.

Para conocer el estado de una variable de operacin o de un parmetro especfico con
sensores fuera de lnea se deber tomar aspticamente una muestra para que en ella
se mida la propiedad.

Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos es fcil concluir que los sensores en
lnea son mucho ms adecuados para controlar el valor de una propiedad en una
biorreaccin.

PROPIEDADES MEDIBLES EN LOS BIORREACTORES

Entre las propiedades ms comunes que se miden en un biorreactor figuran las
siguientes:

- Temperatura.
- pH.
- Flujo de aire.
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- Presin.
- Intensidad de agitacin.
- Nivel o volumen de medio de cultivo.
- Espuma.
- Concentracin de oxgeno disuelto.
- Concentracin celular.
- Concentracin de sustrato.
- Concentracin de producto.

A continuacin detallamos algunas de estas mediciones.

Medicin y control de pH

El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H
+
) en una disolucin acuosa
y est definida por la siguiente ecuacin:

pH = - log
10
[H
+
] (1)

Para la medicin y control del valor del pH se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en
forma asptica, en el biorreactor y que est directamente en contacto con el caldo de
fermentacin. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un
medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set
Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medicin.

Un electrodo de pH est integrado por dos celdas: un elemento sensor del pH y un
elemento de referencia.

El elemento sensor consiste en un alambre de plata cubierto con cloruro de plata
inmerso en una solucin buffer (usualmente de pH 7), en un tubo sellado que termina
con un fino bulbo de vidrio sensible al pH. El elemento de referencia consiste en otro
alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solucin buffer saturada
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de cloruro de potasio y un diafragma poroso que comunica con la sustancia a la que se
medir el pH.

Dicho electrodo comnmente se construye como una sola unidad con el sensor de
referencia construido en una parte anular del elemento sensor, tal como puede
apreciarse en la Figura 1.

El mtodo se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos
caras de la membrana de vidrio expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su
valor de pH. A temperatura constante la magnitud de esta diferencia de potencial es
directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones.


Figura 1. Esquema de un electrodo de pH.

Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un
comportamiento imperfecto es preciso calibrar el dispositivo de determinacin del pH
con dos disoluciones patrn antes de usarlos en los biorreactores. Para ello, los
electrodos se sumergen sucesivamente en dos disoluciones patrn con valor conocido,
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denominados P1 y P2, a la misma temperatura que la disolucin problema y
seleccionadas de forma que el valor de pH de la disolucin problema est comprendida
entre los valores de pH P1 y P2.

Como el valor del pH del caldo de fermentacin puede cambiar despus de ser
esterilizado debido al drstico tratamiento trmico se recomienda recalibrar el electrodo,
para lo que se hace necesario tomar aspticamente una muestra del caldo de
fermentacin y medir su valor de pH con un medidor y un electrodo fuera de lnea. En
caso de que el valor del electrodo en lnea sea distinto del que marca el fuera de
lnea se ajustar el valor de aqul con el equipo de medicin empleado en el
biorreactor.

Una vez realizado todo lo anterior se est en posibilidades de medir y controlar el valor
del pH de una biorreaccin en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al
valor del Set Point, entonces el controlador emitir una seal elctrica con la que se
podr activar alguna bomba para adicionar cido o lcali, dependiendo de la
diferencia entre el valor medido y el Set Point.

En la Figura 2.2 se puede observar la disposicin de un sistema de medicin y control
del valor de una variable cualquiera de un caldo de cultivo contenido en un biorreactor.


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Figura 2. Diagrama de bloques de un sistema de control.

Medicin y control de temperatura

Aunque no existe un consenso para establecer cul de todas las variables de operacin
es la ms importante de mantener y controlar en una biorreaccin, la temperatura se
cuenta entre las ms importantes. El control, la medicin precisa y adecuada de la
temperatura resultan esenciales para la biorreaccin. Un sistema de medicin de la
temperatura debe presentar una precisin menor a los 0.5 C respecto a la temperatura
de medicin y en muchos casos una variacin de 1 a 1.5 C durante la biorreaccin
puede dar lugar a grandes prdidas econmicas en el bioproceso, por lo que se
recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre
0.5 y 1.5 C.

Generalmente, la temperatura en un bioproceso se mide con sensores RTD (Resistance
Temperature Devices), ya que son los que presentan las mejores caractersticas antes
mencionadas; constan de un elemento metlico cuya resistencia elctrica cambia con la
temperatura, hecho en el que se basa la medicin de la misma. Debido a sus ptimas
caractersticas lineales de cambio respecto a la temperatura usualmente se utiliza
platino, aunque tambin se usa nquel, cobre y aleaciones de nquel, sin embargo, una
desventaja del platino es su precio moderamente alto.
ELEMENTO
DE CONTROL



BIORREACTOR
MEDICIN
CONTROLADOR
COMPARADOR
V V
M
V
SP
E = V
M
-V
SP
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La resistencia es medida con un dispositivo y convertida por un transductor a valores de
temperatura (en C o K). El valor medido de la temperatura es comparado con el del
control y de la diferencia entre los valores, el controlador emitir una seal que servir
para realizar una accin de control de la misma.

La accin puede consistir en hacer pasar agua de enfriamiento o vapor a travs de un
serpentn inmerso en el caldo de biorreaccin o a travs de la chaqueta del biorreactor
para ajustar la temperatura al punto de control.

Para sensores RTD la relacin entre la temperatura y la resistencia est descrita por la
siguiente ecuacin:

(

|
.
|

\
|
|
.
|

\
|
+ =
100
1
100
1
0
T T
T
R
R
T
o o (2)

Ecuacin en la que:

T
R
= resistencia a la temperatura T [=]
O

0
R
= resistencia a 0C [=]
O

o
= una constante (0.00382 0.00393 para Platino)
T
= temperatura [=] C
o
= una constante (1.48 1.51 para Platino)

Dicha ecuacin aplica para intervalos de temperatura comprendidos entre 0 y 630 C.





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Medicin y control del oxgeno disuelto

El oxgeno disuelto es muy importante para el desarrollo de una biorreaccin aerbica,
por lo que su medicin y control es un parmetro importante para el desarrollo y
produccin econmicamente rentable de bioproductos.

El oxgeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del
caldo de biorreaccin. Una parte del oxgeno contenido en el aire se disuelve en el
caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxgeno disuelto es el que
utilizarn los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformacin de
la materia prima a producto. Por esta razn es importante distinguir entre oxgeno
disuelto y oxgeno en el gas.

La medicin del oxgeno disuelto se realiza de forma amperomtrica, por la reduccin
del oxgeno en la superficie del ctodo y la formacin de cloruro de plata en el nodo.
Una solucin electroltica une al nodo establecindose un voltaje de polarizacin entre
ellos. Cuando un fluido que contiene oxgeno disuelto se pone en contacto con el
electrodo, el oxgeno se difunde a travs de una membrana semipermeable
establecindose la siguiente reaccin:

Ctodo: O
2
+ 2H
2
O + 4e
-
4OH
-


nodo: 4Ag + 4Cl
-
4AgCl + 4e
-


El resultado es una corriente elctrica que es proporcional a la actividad del oxgeno
disuelto o presin parcial del mismo.

En el comercio especializado existen distintos tipos de electrodos y de medidores
controladores de oxgeno disuelto que los usuarios podrn elegir.

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El control del oxgeno disuelto en una biorreaccin ocurre a travs de la modificacin
del flujo de gas (aire u oxgeno puro) o de la intensidad de agitacin del caldo de cultivo.

Medicin y control de espuma

Cuando en el caldo de cultivo existen compuestos orgnicos, como protenas y
carbohidratos, generalmente se forma espuma. Esto se favorece a altos flujos de aire y
alta intensidad de agitacin.

La formacin de espuma es crtica en los biorreactores por muchas razones, las ms
destacadas son las siguientes:

- Disminucin del volumen del lquido en el interior del biorreactor si la espuma
sale por el venteo o salida del gas agotado.
- Contaminacin microbiolgica del bioproceso si la espuma alcanza a salir por el
venteo o salida del gas agotado.
- Disminucin de la actividad biolgica del bioproducto si posee propiedades
tensoactivas y es sensible a fuerzas de torsin.

Razones por las cuales la medicin y el control de la espuma es imprescindible en los
Bioprocesos.

El control del volumen de la espuma se logra a travs de un rompedor mecnico o
mediante la adicin controlada de un antiespumante. El rompedor de espuma es un
impulsor colocado generalmente por encima del caldo de cultivo que gira a altas
velocidades entrando en contacto con la espuma para actuar en forma semejante a una
centrfuga, con lo que impulsa al fondo a la fase pesada, dejando pasar la fase ligera, el
gas.

El antiespumante rompe la espuma cambiando la tensin superficial del caldo de
cultivo.
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La seleccin del sistema de control de espuma ocurrir despus de evaluar las
caractersticas tcnicas y econmicas de ambos sistemas.
Un rompedor mecnico requiere de energa adicional y de acciones costosas de
mantenimiento preventivo y correctivo, mientras que los antiespumantes son
compuestos qumicos extraos al sistema biolgico de la biorreaccin que
potencialmente pueden llegar a contaminar el producto final a pesar de que existan
antiespumantes aprobados por instituciones internacionales.

No obstante lo anterior, el sistema ms empleado para controlar la formacin de
espuma es usando antiespumantes. El control de espuma se basa en la conductividad
elctrica que presentan los medios de cultivo. Cuando la espuma asciende y hace
contacto con el sensor, que es una varilla metlica colocada en la parte superior del
biorreactor, cierra un circuito elctrico que enva una seal a un controlador que acciona
la bomba de adicin de antiespumante. Una vez que la espuma se ha destruido deja de
hacer contacto con el sensor y la bomba deja de adicionar antiespumante.

OBJETIVO

El alumno manejar los sistemas de medicin y control de variables de operacin de
biorreactores de tanques agitados a travs de las determinaciones en lnea de la
temperatura, pH, oxgeno disuelto y espuma.

MATERIALES Y MTODOS

EQUIPO

- Biorreactor tipo tanque agitado.
- Tanque de nitrgeno puro con vlvula de control de presin y de flujo.
- Vasos de precipitados de 250 ml, 500 ml y de 2000 ml.
- Probetas de 1000 ml.
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- Mangueras de silicn para bombas peristlticas.


REACTIVOS

- Solucin de NaOH 0.5N.
- Solucin de HCl 0.5N.
- Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua.
- Solucin proteica o un detergente.

INSTRUMENTOS

Sistema de medicin y control de temperatura.
Sistema de medicin y control de pH.
Sistema de medicin y control de oxgeno disuelto.
Sistema de medicin y control de espuma.

Elementos del sistema de medicin y control de pH

- Electrodo de pH con su camisa presurizable y conectores para el biorreactor.
- Medidor.
- Controlador.
- Bombas de adicin de cido o lcali.

Elementos del sistema de medicin y control de temperatura

- Sensor RTD.
- Medidor.
- Controlador.
- Recipiente de agua de enfriamiento con una resistencia elctrica de inmersin.
- Bomba de agua de enfriamiento.
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Elementos del sistema de medicin y control de oxgeno disuelto

- Electrodo polarogrfico.
- Medidor.
- Controlador.

Elementos del sistema de medicin y control de espuma

- Electrodo.
- Medidor.
- Controlador.
- Bomba de adicin de antiespumante.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

ACTIVIDADES PREVIAS

- Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
- Consultar los manuales de operacin tanto del biorreactor como de los equipos
de medicin y control que se utilizarn.
- Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medicin y control de temperatura,
pH, oxgeno disuelto y espuma.
- Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solucin proteica o de
detergente (el profesor lo indicar).
- Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxgeno disuelto.
- Establecer las condiciones de operacin.

*
Todo lo anterior se realizar auxiliado por sus instructores.


22

ACTIVIDADES PARA MEDIR LAS PROPIEDADES DE LOS BIORREACTORES

A continuacin se detallan las actividades para la medicin de algunas propiedades de
los biorreactores.

Medicin y control del pH

- Establezca una velocidad de agitacin del biorreactor siguiendo las indicaciones
establecidas en el manual de operacin del equipo.
- Encienda el equipo de medicin y control y verifique que el valor de pH que
registra el mismo sea igual que el de la muestra tomada del biorreactor y medida
fuera de lnea. De no ser as, ajuste el equipo de acuerdo a las indicaciones del
manual.
- Ajuste el pH a un valor de cinco con una disolucin de cido clorhdrico 0.5 N. y
establezca en el equipo un valor de Set Point de cinco (consulte el manual del
equipo).

- El equipo de medicin y control debe tener acoplado el sistema de adicin de
lcali que consta de una bomba peristltica capaz de agregar al biorreactor una
disolucin de NaOH 0.5 N, de acuerdo a la seal del controlador.
- Agregue al biorreactor 10 ml de una disolucin de cido clorhdrico 0.5 N con
objeto de simular una biorreaccin acidognica (disminuya el valor del pH
conforme pasa el tiempo).
- Observe como el controlador enviar una seal a la bomba peristltica para
adicionar el lcali. La bomba dejar de funcionar (de adicionar lcali) cuando el
pH alcance o sobrepase el valor del Set Point.
- Repita el procedimiento hasta que quede comprendido el sistema de medicin y
control.


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Medicin y control de la temperatura

- Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25C) y
establezca una velocidad de agitacin de 300 rpm ayudado por su instructor.
- A travs de la chaqueta verifique que las vlvulas del circuito de circulacin del
agua de enfriamiento estn abiertas y encienda el equipo de medicin y control
de la temperatura, que consta de los elementos ya descritos.
- Establezca en el controlador de temperatura un valor de Set Point de 33C
ayudado por su instructor.
- Encienda la bomba de circulacin del agua y espere hasta que la temperatura en
el interior del biorreactor alcance la temperatura del Set Point.

Medicin del oxgeno disuelto

- Agregue al biorreactor 10 litros de agua a temperatura ambiente (25C) y con la
ayuda de su instructor establezca una velocidad de agitacin de 300 rpm.
- Establezca un flujo de aire a un valor de 0.5 vvm (verifquelo en el rotmetro).
- Encienda el equipo de medicin de oxgeno disuelto y espere unos 15 minutos
hasta que la lectura permanezca estable.
- Con este valor, establezca en el equipo el 100% del valor de saturacin.
- Ayudado por sus instructores conecte un tanque de nitrgeno puro al sistema de
introduccin de aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrgeno tal
que no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifquelo en el rotmetro), con objeto
de disminuir la presin parcial de oxgeno en el aire. Esto provocar que la
concentracin de oxgeno disuelto sea menor que cuando se burbujea aire
solamente.
- Observe como el oxgeno disuelto baja en el equipo de medicin.
- Ahora cierre completamente el flujo de nitrgeno y observe como el valor de
oxgeno disuelto volver a su valor normal (100% del de saturacin).

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Medicin y control de la espuma

- Agregue al biorreactor 10 litros de agua con 2% de detergente (o de ser posible
una disolucin protica) a temperatura ambiente (25C) y establezca con la
ayuda de su instructor una velocidad de agitacin de 250 rpm y un flujo de aire
de 0.15 vvm que deber verificar con el rotmetro.
- A esta velocidad observe si se forma espuma.
- Incremente la velocidad de agitacin en intervalos de 50 rpm hasta llegar a 400.
Mantenga las diferentes velocidades durante 10 minutos y observe lo que ocurre
con la formacin de espuma (debe incrementarse su velocidad de formacin) y
anote sus observaciones.
- Estando a 400 rpm incremente el flujo de aire hasta un valor de 0.75 vvm,
observe y anote lo que pasa con la formacin de espuma.
- Conecte el sistema de control de espuma. La bomba peristltica de adicin de
antiespumante debe estar conectada y la manguera debe estar inmersa en una
solucin de antiespumante Mazu al 10% en agua.
- Elija una velocidad de agitacin y un flujo de aire que tengan la ms alta
formacin de espuma, con objeto de que el controlador enve la seal de adicin
de antiespumante. Anote y discuta sus observaciones.

FORMULACIN DE RESULTADOS

- Elabore diagramas (en Autocad) donde se observen los sistemas de medicin y
control de pH, temperatura, oxgeno disuelto y espuma en un biorreactor.

- Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a
las necesidades de instrumentacin y control en las biorreacciones.




25
BIBLIOGRAFA

Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis N. F. (1973), Biochemical Engineering, 2 edicin,
Edition Academic.

Harper, E. H. (2000), El ABC de la instrumentacin en el control de procesos
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Lydersen, B. K., DElia N. A., Kim, L. M. (1994), Bioprocess Engineering: Systems,
Equipment and Facilities, John Wiley and Sons, Inc., USA.

Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
(1978), Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley and Sons.
26
PRCTICA 3

Prctica 3. Servicios auxiliares


Servicios Auxiliares



INTRODUCCIN

Los servicios auxiliares necesarios en la operacin de un biorreactor incluyen aire
comprimido, diversos gases comprimidos (nitrgeno, oxgeno, etctera), agua de
enfriamiento (agua helada y agua de torre), agua para servicios varios, vapor de planta
y energa elctrica.

AIRE

El aire tiene varios usos en un biorreactor, a continuacin mencionaremos algunos de
ellos por orden de importancia:

- Proveer oxgeno al medio de cultivo.
- Como fuerza motriz para la transferencia de momento y masa.
- Como fuerza motriz para transferir lquidos de un recipiente a otro.
- Para accionar instrumentacin de control de tipo neumtico.
- Como medio de enfriamiento para los recipientes despus de la esterilizacin.

La eleccin del tipo de aire a utilizar depender del uso que se haga de l. El aire debe
ser seco y libre de aceite. Adems cuando se requiera que el proceso o producto no se
27
afecte por la introduccin de microorganismos ajenos, contenidos en la corriente de
aire, ser necesario que ste sea estril.

Esterilizacin del aire

Actualmente para la esterilizacin del aire que se introducir al biorreactor se utilizan
prefiltros y filtros absolutos. Los prefiltros son casi obligatorios para compresores
lubricados con aceite para eliminar partculas de este lubricante, sin embargo, en la
actualidad los compresores libres de aceite van ganando terreno, por lo que en estos
casos los prefiltros sirven para aumentar la eficiencia y vida media de servicio de los
filtros absolutos. Estos ltimos debern tener 100% de retencin de partculas de hasta
0.01 m en el aire de servicio.

Los filtros constan de dos elementos principales: el cartucho que contiene el elemento
filtrante y la camisa en la que se coloca el cartucho. En el comercio especializado se
encuentran varios tipos de filtros absolutos. Algunos de los materiales utilizados para
los cartuchos son: steres de celulosa, polisulfonas, fluoruro de polivinilo y
politetrafluoroetileno, mientras que el material ms utilizado para la camisa es el acero
inoxidable (304, 316 o 316L) con mecanismos de sellado rpido y hermtico. El
dimetro de los cartuchos es de 2 a 2, con longitudes variables que van desde 10
(0.25 m) hasta 40 (1m).

Se recomienda que los filtros a emplear en los biorreactores sean del tipo de membrana
hidrofbica (que repele el agua). La naturaleza hidrofbica de estas membranas pueden
alcanzar 100% de remocin de bacterias y bacterifagos en condiciones de operacin
hmedas o secas. La esterilizacin de los filtros se realiza con vapor saturado que
circula en el sentido de la introduccin del aire al biorreactor.

Sistemas de compresin de aire

28
Los sistemas de compresin de aire constan de los siguientes componentes:
compresor, filtro de admisin de aire, sistema de enfriamiento (si lo tiene), depsito de
almacenamiento y sistema de control de presin. En varios puntos del sistema de
distribucin se deben colocar trampas o purgas para eliminar condensados.

Los compresores de aire para plantas biotecnolgicas son generalmente de dos tipos:
rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo, aunque tambin existen los
compresores de tipo centrfugo para grandes volmenes de aire a bajas presiones. El
aire es tomado directamente de la atmsfera. Independientemente del tipo de
preferencia debern ser especificados como libres de aceite.

La tubera de distribucin puede ser especificada en diferentes materiales dependiendo
del servicio: desde acero al carbn para aire de equipos y motores, hasta acero
inoxidable 304 o 316 acabado sanitario para el aire proveniente del filtro absoluto hacia
el punto de suministro al biorreactor o para lneas de distribucin instaladas en un
cuarto limpio.

Adems del aire comprimido algunos gases comprimidos tambin tienen aplicaciones
en biorreactores, los ms comunes son nitrgeno y oxgeno puros: el nitrgeno es til
para la formacin de atmsferas inertes y el oxgeno se usa para enriquecer el aire y
alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxgeno en el biorreactor. Estos
gases generalmente son suministrados en cilindros a una mayor presin que la
atmosfrica, de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubera de
distribucin y suministro debe cumplir con las mismas caractersticas que la del aire.

VAPOR

El vapor de planta es utilizado como el medio principal de calentamiento en miles de
industrias y como de uso secundario para la generacin de energa elctrica. Adems el
vapor limpio o puro se utiliza en el procesamiento de alimentos y medicinas en la
29
esterilizacin de productos y equipos, entre otros. Su uso generalizado se debe a las
siguientes razones:

- La generacin de vapor es una de las formas ms econmicas de generacin de
energa.
- El vapor puede controlarse de manera relativamente sencilla debido a que circula
de una zona de alta presin a una de menor presin sin necesidad de otro
equipo.
- El vapor es fcil de producir ya que se obtiene del agua, la cual puede ser
reutilizable.

Un generador de vapor o caldera es aquel equipo que transforma el agua en vapor
aprovechando el calor generado por la combustin de un material combustible, teniendo
como caracterstica principal que es un recipiente cerrado sujeto a una presin mayor a
la atmosfrica.

Tipos de generadores de vapor

Existen dos tipos de generadores de vapor:

- Generadores de tubos de agua: en los cuales el agua circula al interior de una
serie de tubos (serpentn), mientras que el calor se transfiere de la cmara de
combustin hacia el interior de los tubos, as el agua contenida dentro de los
tubos comienza a elevar su temperatura hasta evaporarse. Este es el tipo ms
comn y con el que cuenta la UPIBI.
- Generadores de tubos de humo: en forma totalmente opuesta, en este tipo de
generadores los gases de combustin circulan por los tubos, mientras que el
agua se encuentra almacenada en la cmara exterior, as el calor se transfiere
del interior de los tubos hacia el agua almacenada alrededor de stos

30
La capacidad de un generador de vapor se mide bajo un estndar internacional llamado
Caballo Caldera, el cual es equivalente a generar 15.65 kg/h de vapor con una
temperatura de 100 C a presin atmosfrica y que es alimentado con agua a 100 C.
Otra definicin nos dice que con estos 15.65 kg/h de vapor es posible obtener 8,430
kcal/h de calor aprovechable en un proceso. As un generador de vapor que tenga una
capacidad de 100 caballos caldera ser capaz de generar 1565 kg/h de vapor.

Partes de las calderas

Las calderas generalmente vienen como paquetes en tamaos estandarizados que
incluyen:

- Tanque de condensados, que se instala generalmente 2 m arriba de la bomba de
alimentacin de agua al generador.
- Bomba de agua, que enva el agua a presin hacia el serpentn del generador.
- Generador de vapor de tubos de agua por donde circulan en sentido contrario el
agua y los gases de combustin, de tal manera que a medida que el agua
avanza en su recorrido encuentra temperaturas ms altas, por lo que incrementa
su temperatura hasta convertirse en vapor. Los componentes bsicos del
generador son el serpentn, el quemador-ventilador y la cmara de combustin.
- Separador de vapor, donde por medios mecnicos se provoca el
desprendimiento de pequeas partculas de agua (humedad) que arrastra el
vapor.
- Trampa de vapor que desaloja los condensados removidos del vapor y los enva
de regreso al tanque de condensados para repetir nuevamente el ciclo.
- Sistema de control y de seguridad, entre los que destacan: las vlvulas de alivio
y de seguridad, los manmetros, el control principal de temperatura con
termopar, los interruptores del termostato, el interruptor de presin de vapor y el
interruptor del nivel de aceite.

31
El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo para proteger
los equipos contra la incrustacin, la corrosin y otras complicaciones (ver Cuadro 1).
Por eso es necesario acoplar a sta un sistema de acondicionamiento previo del agua,
que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.

El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catinica depositada
sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva
a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la
dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene
como funcin regenerar la resina a fin de que recupere su capacidad de intercambio
inico.

Cuadro 1. Caractersticas del agua de alimentacin a una caldera
Dureza cero
Oxgeno disuelto, CO
2
cero
Sulfitos 50 100 ppm
pH 10.5 a 11.5
Slidos en suspensin cero
Slidos disueltos < 6000 ppm


Sistema de distribucin de vapor

El sistema de distribucin de vapor se realiza por medio de tuberas, generalmente de
acero al carbn cdula 40, cuidando que las velocidades y cadas de presin estn
comprendidas en los intervalos recomendados para el dimensionamiento de las
mismas. El vapor puro requerir de tuberas de acero inoxidable con acabado sanitario.

En adicin al sistema de distribucin de vapor debern preverse los sistemas de manejo
de condensados, ya que stos pueden reutilizarse con un importante ahorro en el
32
acondicionamiento del agua de alimentacin a la caldera y en la energa requerida para
el calentamiento de la misma hasta el punto de ebullicin.

AGUA DE ENFRIAMIENTO

El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la
temperatura del caldo de fermentacin en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del
agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la
biorreaccin, ni con las superficies en contacto con stos, circula a travs de las
chaquetas o serpentines segn el diseo del biorreactor.

Tipos de agua de enfriamiento

En la prctica el agua es un servicio escaso y es necesario recircularla, enfriarla y
reutilizarla. Dependiendo de la temperatura requerida para el agua de enfriamiento sta
puede ser:

- Agua de torre. Con una temperatura de entre 10 C y 25 C dependiendo del
diseo de la torre y de las condiciones ambientales del lugar. Los equipos ms
utilizados en la industria biotecnolgica por su tamao compacto son las torres
de enfriamiento por evaporacin. Otros sistemas para mayores capacidades son
las torres atmosfricas y los estanques de enfriamiento, los cuales requieren
grandes espacios para su instalacin. El agua de torre es susceptible de
degradacin debido al crecimiento de organismos o bien al aumento en la
concentracin de sales que favorecen la incrustacin, por lo tanto las torres de
enfriamiento requieren un mantenimiento constante que implica: tratamiento con
algunos qumicos para impedir la incrustacin de sales, cloracin para impedir la
formacin de microorganismos y purgas frecuentes para impedir la acumulacin
de slidos.

33
- Agua helada. Con una temperatura de entre 5C y 10 C, los componentes
principales de un sistema de agua helada son los mismos que los de un ciclo de
refrigeracin: el compresor, el condensador, la vlvula de expansin, el
evaporador, la bomba de recirculacin y el tanque de expansin. El evaporador
es simplemente un intercambiador de calor donde el refrigerante se vaporiza a
expensas de la energa que toma del agua, que como resultado de este proceso
se enfra. Esta agua helada se dirige a los puntos donde se necesita y de ah se
retorna al evaporador por medio de la bomba de recirculacin. Por otro lado, el
gas refrigerante se comprime, se enfra en el condensador y se dirige
nuevamente al evaporador pasando por una vlvula de expansin donde se
vaporiza parcialmente disminuyendo an ms su temperatura.

Para dimensionar un sistema de enfriamiento ser necesario conocer la demanda de
agua (flujo) y el intervalo de temperaturas entre el agua que sale hacia el proceso y la
que regresa al sistema. Las tuberas de transporte y suministro del agua de
enfriamiento por lo general son de acero al carbn y cobre en un dimetro adecuado
para los flujos que se manejen.

Agua para servicios varios

Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y
del rea de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero
no requiere ningn tratamiento adicional.

ENERGA ELCTRICA

La instalacin elctrica tiene como propsito proporcionar la energa para accionar
bombas, compresores, motores elctricos y otros equipos mecnicos, instrumentos,
tableros de control y alumbrado. El sistema se debe adecuar para entregar en el punto
que se requiera la energa necesaria sin causar sobrecalentamiento o cambios de
voltaje innecesarios, lo cual se logra a travs de lneas de alambrado que unen el
34
generador con el punto donde es necesaria la energa, conectando todos los
componentes que se dividen en secciones segn el servicio y el rea, dando lugar a los
circuitos.

El sistema elctrico bsico est constituido por la fuente, el equipo de transformacin,
los dispositivos de proteccin, las lneas de distribucin y los puntos de uso.

Elementos del sistema elctrico

Voltajes de distribucin

La energa comprada o generada se suministra a voltajes muy altos y para usarse en la
planta debe ser reducida al voltaje de utilizacin, para esto se requiere el uso de
subestaciones reductoras o transformadores. El voltaje de operacin recomendado por
los fabricantes de motores y dems equipo elctrico aparece en la placa o en las
instrucciones de operacin de dicho equipo. La especificacin tpica para motores
elctricos y dems equipos accionados elctricamente es de 120 V, 240 V y en algunos
casos hasta 480 V, los instrumentos generalmente necesitan voltajes de 12-24 V.

Corriente: la cual puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC), que es peridica con
pequeas oscilaciones, desde un valor mximo en un sentido hasta el mismo valor pero
en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y la corriente
continua o directa (DC o CC), que proporciona un valor constante todo el tiempo, como
la producida por dnamos, pilas y acumuladores.

Dispositivos de proteccin

Los circuitos y equipos deben ser protegidos por dispositivos que abran los circuitos
para que la corriente no fluya en condiciones de sobrecarga o falla, lo cual se hace a
travs de interruptores. Mediante los transformadores se obtienen voltajes reducidos
35
que alimentan los diferentes circuitos, cada uno de los cuales debe tener su interruptor
de desconexin.

Equipo elctrico para reas peligrosas

Cuando las materias primas o productos de la biorreaccin son potencialmente
peligrosos, es decir, emiten cantidades de partculas muy pequeas a la atmsfera
grande que pueden penetrar hacia los circuitos elctricos e iniciar una chispa (por
ejemplo, polvos, solventes, entre otros), tanto el equipo elctrico como los
transformadores, mecanismos de distribucin y motores deben ser especificados a
prueba de explosin.

Conductores

Del punto de suministro al punto de utilizacin (equipo, compresores, bombas,
etctera), la corriente elctrica se distribuye por medio de conductores que pueden ser
alambres, cordones o cables, los cuales pueden ser vistos como las arterias y venas
por donde viaja la corriente:

- Hilo o alambre: es un conductor constituido por un nico alambre macizo,
generalmente de cobre.
- Cordn: conductor constituido por varios hilos unidos elctricamente enrollados
helicoidalmente alrededor de uno o varios hilos centrales.
- Cable: conductor formado por uno o varios hilos o cordones aislados
elctricamente entre s. Segn el nmero hilos o cordones que lleva un cable se
denomina unipolar, bipolar, tripolar, etctera.

Los cables son canalizados en las instalaciones dentro de tuberas metlicas o canales
para protegerlos de agentes externos como la humedad, la corrosin los golpes,
etctera, que se sujetan al techo o paredes por medio de soportes. En algunos lugares
36
se entierran dichas tuberas bajo el piso, aunque esto lo hace de difcil acceso y
mantenimiento.

OBJETIVO

El alumno identificar los servicios auxiliares necesarios para la operacin de un
biorreactor, describir sus componentes y explicar su funcionamiento.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno buscar, en todas las fuentes
posibles, informacin sobre los tipos de sistemas de compresin de aire, generacin de
vapor y agua de enfriamiento que se emplean en la industria biotecnolgica. Tambin
investigar los elementos bsicos de una instalacin elctrica industrial.

Para la sesin experimental:

- Se mostrar a los alumnos el cuarto de calderas, se les pedir que identifiquen
todos sus componentes y la elaboracin del diagrama de flujo de este sistema.
- Se expondrn a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta
piloto y los laboratorios, se les pedir que identifiquen y describan sus
componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la
literatura.
- El profesor y el tcnico a cargo describirn los procedimientos de arranque y
paro de la caldera y los compresores, as como una breve descripcin de su
funcionamiento.
- Los alumnos identificarn las lneas de agua, vapor, aire y electricidad de la
planta piloto, observando su ruta y registrando sus caractersticas: materiales,
aislamiento, dimetros, color, etctera. Se har lo mismo en el laboratorio de
biorreactores indicando la clasificacin de colores en caso que la haya. Los
alumnos realizarn un esquema tipo lay-out de la planta piloto indicando las rutas
37
de estos servicios hasta los biorreactores que se utilizarn en prcticas
posteriores.
- Se mostrar a los alumnos el biorreactor New Brunswick Scientific para que
identifiquen en ste las lneas de suministro de agua, aire, vapor y condensados,
as como sus accesorios (filtros, trampas de vapor, reguladores de presin,
vlvulas, etctera). Se har especial nfasis en los filtros para aire y vapor, y en
el sistema de esterilizacin para las lneas de agua y aire. Los alumnos
observarn el cambio de materiales en las tuberas de entrada al biorreactor.

En cada actividad los alumnos debern anotar sus observaciones en la bitcora,
acompandolas de esquemas, dibujos y dems documentos.

FORMULACIN DE RESULTADOS

El alumno realizar un informe de las actividades desarrolladas que deber contener los
siguientes puntos:

- Introduccin.
- Objetivo.
- Tipo y descripcin de caldera.
- Tipo y descripcin de compresores.
- Diagrama de flujo de servicios.
- Diagrama de ruta de servicios.
- Observaciones sobre cada una de las actividades realizadas.
- Conclusiones generales sobre el desarrollo de la prctica y bibliografa.

BIBLIOGRAFA


Clayton, A. (2000), Curso de operacin y mantenimiento preventivo a generadores de
vapor.
38

Lydersen, B. K., DElia N. A., Kim, L. N. (1994), Bioprocess Engineering: Systems,
Equipment and Facilities, John Wiley and Sons, Inc., USA.

Perry, R. H., Green, D. W. (2004), Manual del Ingeniero Qumico, McGraw-Hill.

Rase, H. F., Barrow, M. H. (1981), Ingeniera de proyectos para plantas de proceso,
CECSA.















39
PRCTICA 4
Prctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores



Tiempo de mezclado en
biorreactores






INTRODUCCIN

TANQUE AGITADO

La agitacin y aireacin en un biorreactor se realiza para alcanzar los siguientes
propsitos:

- Suministrar el oxgeno necesario a los microorganismos para que se realicen
apropiadamente sus actividades metablicas.
- Mantener en suspensin a los microorganismos.

En los biorreactores de tanque agitado, la agitacin del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante dos formas:
- Por el movimiento de dispositivos mecnicos, como impulsores de tipo turbina o
de propelas.
40
- Por el movimiento ascendente de burbujas de aire.

Por lo tanto, la intensidad de agitacin depende de la velocidad de movimiento de los
impulsores y de la velocidad de aireacin.

La agitacin puede describirse mediante el tiempo de mezclado, el cual se define como
el tiempo que transcurre despus de la adicin de un trazador para alcanzar un
determinado grado de homogeneidad, generalmente 95% del lquido contenido en el
biorreactor.

Un mezclado insuficiente puede causar regiones en las que haya altas concentraciones
de inhibidores de crecimiento, deficiencia de oxgeno o de algn otro nutriente,
gradientes importantes de temperatura y pH, que se pueden reflejar en lo obtencin de
bajas productividades y bajos rendimientos. Por ello, es importante estudiar el efecto de
las variables de operacin sobre el grado de mezclado que se pueda alcanzar en el
biorreactor.

COLUMNA

La agitacin del caldo de cultivo se lleva a cabo en los biorreactores de columna
mediante el movimiento ascendente de las burbujas de aire. El nmero y tamao de las
burbujas de aire dependen de la velocidad de aireacin, de las propiedades fsicas del
caldo de cultivo, del tipo de dispersor, de la altura de la columna y de la presencia de
dispersores colocados a lo largo de la columna. Un aumento en la velocidad de
aireacin incrementar la fraccin de gas retenido y las velocidades locales del lquido.
Junto con esto, se hacen ms pronunciados los perfiles parablicos de la fraccin de
gas retenido a travs de la seccin transversal de la columna con su mximo en el
centro.

El elemento estructural a travs del cual tiene lugar la dispersin del gas se llama
dispositivo de dispersin primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser
41
redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersin secundaria. En las
columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa el aire se
introduce a travs de dispositivo de dispersin primaria, tal como un tubo perforado, un
plato perforado o un plato sinterizado, donde es dispersado finamente. Tambin las
burbujas de aire que aumentan de tamao debido a la coalescencia pueden ser
redispersadas al pasar a travs de dispositivos de dispersin secundaria, como mallas o
bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores de
columna de burbujas multietapa la dispersin de aire se lleva a cabo
predominantemente en los dispositivos de dispersin primaria.

AIRLIFT

Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos
dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del
lquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersin gas-lquido es
diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la
de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido es una medida de
la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-lquido en dichas zonas, la cual
es la fuerza motriz para la circulacin del lquido en el biorreactor.

Debido al movimiento del lquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente
subirn ms rpido, disminuyendo la fraccin de gas retenido y la diferencia de presin
hidrosttica. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los
biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por
una distribucin ms uniforme de la fase gaseosa a travs de la seccin transversal de
la zona de flujo ascendente, con un mximo de la fraccin de gas retenido local cerca
de la pared de la zona de flujo ascendente. Tambin, en contraste con las columnas de
burbujas, los airlift muestran velocidades de lquido mucho ms altas. La velocidad del
lquido afecta decisivamente todos los parmetros que caracterizan el desempeo del
biorreactor: la fraccin de gas retenido, el tiempo de mezclado y el desempeo en
cuanto a transferencia de masa y calor. En general, la velocidad del lquido en los
42
biorreactores airlift se determina por la velocidad de aireacin, la geometra del
biorreactor y las propiedades fsicas de la fase lquida.

El mezclado del lquido es predominantemente producido por la circulacin del lquido y
en menor grado por la dispersin axial debida al ascenso de las burbujas de aire. El
mezclado ocurre predominantemente en las zonas de deflexin superior e inferior,
debido a las diferencias de velocidad ah existentes. Para una geometra definida, la
rapidez del mezclado puede expresarse en trminos del tiempo de circulacin, el cual
se define como el tiempo requerido para que el lquido circule una vez dentro del
biorreactor. Por ello el conocimiento del tiempo de circulacin y de los factores que lo
afectan es necesario para el diseo, modelado y operacin de un biorreactor airlift.

OBJETIVOS

TANQUE AGITADO

El alumno determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de tanque agitado bajo
diferentes condiciones de aireacin y agitacin.

COLUMNA Y AIRLIFT

El alumno determinar el tiempo de mezclado en un biorreactor de columna de burbujas
bajo diferentes condiciones de aireacin.








43
MATERIALES Y MTODOS

BIORREACTORES

- Biorreactor de tanque agitado.
- Biorreactor de columna de burbujas.
- Biorreactor airlift.

INSTRUMENTOS

1. Cronmetros.
2. Rotmetros.
3. Manmetros.
4. Termmetros.
5. Medidor de pH con adquisicin de datos en lnea.
6. Computadora y software para la adquisicin de datos en lnea.

REACTIVOS

1. Solucin de NaOH 6N.
2. Solucin de HCl 6N.
3. Solucin de azul de bromocresol.
4. Soluciones reguladoras de pH, de 4 y 9.








44
DETERMINACIN DEL TIEMPO DE MEZCLADO EN LOS BIORREACTORES

El mtodo que se utilizar es del de adicin de trazadores tales como cidos y bases.



PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

ACTIVIDADES PREVIAS

- Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
- Llenar el biorreactor con agua de la llave.
- Agregar al biorreactor 0.2 ml de la solucin de indicador.

CONDICIONES DE OPERACIN

Tanque agitado

- Las velocidades de agitacin sern: 300 y 500 rpm.
- Para cada velocidad de agitacin se probarn las siguientes velocidades de
aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.2 y 1.5 vvm.

Columna y Airlift

- Velocidades de aireacin: 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, y 1.5 vvm.






45
MEDICIN DEL TIEMPO DE MEZCLADO

Mtodo de adicin de pulsos

- La adicin de pulsos se realizar en una zona lo ms alejada del electrodo de
pH.
- Registrar el tiempo que transcurre desde que adiciona un pulso de cido o base
hasta lo obtencin de la homogenizacin del color del lquido en el biorreactor o
hasta la obtencin de un valor de pH constante.
- Ajustar el pH a un valor entre 8.5 y 9.0.
- Adicionar el volumen necesario de HCl 6N, para cambiar el pH de entre 8 - 9 a 3
- 4.
- Adicionar el volumen necesario de NaOH 6N, para cambiar el pH de entre 3 - 4 a
8 - 9.
- Cambiar las condiciones de operacin y una vez alcanzado el estado
estacionario, agregar nuevamente pulsos.


FORMULACIN DE RESULTADOS

TANQUE AGITADO

- Calcular el tiempo de mezclado.
- Construir grficas del tiempo de mezclado en funcin de la velocidad de
aireacin (expresada como vvm y vs).
- Calcular la potencia de agitacin sin aireacin y con aireacin.
- Calcular la potencia de aireacin.
- Obtener las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado
con las variables de operacin empleadas.


46
COLUMNA Y AIRLIFT

- Calcular el tiempo de mezclado.
- Construir grficas del tiempo de mezcla en funcin de la velocidad de aireacin
(expresada como vvm y vs).
- Calcular la potencia de aireacin.
- Obtener las correlaciones matemticas de las relaciones del tiempo de mezclado
con la velocidad de aireacin (expresada como vvm y vs).


DISCUSIN Y CONCLUSIONES

La discusin deber incluir al menos lo siguiente:

- Comparacin de los tiempos de mezclado obtenidos en cada condicin de
operacin.
- Comparacin de las potencias de aireacin y de agitacin.
- Comentarios sobre el aspecto de la dispersin gas-lquido.



BIBLIOGRAFA

TANQUE AGITADO

Aiba, S., Humphrey A. E., Millis, N.F. (1973), Biochemical Engineering, 2a edicin,
Edition Academic.

Hicks, R. W., Gates, L. E. (1976), How to Select Turbine Agitators for Dispersing Gas
Into Liquids en Chem. Eng., July 19: 141-148.

47
Moser, A. (1988), Bioprocess technology en Kinetics and reactors, Springer - Verlag.

Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
(1978), Fermentation and enzyme technology, John Wiley and Sons.

COLUMNA

Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. (1983), The Size of Bubbles Generated From
Perforated Plates en Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523.

Schegerl, K. (1982), New Bioreactors for Aerobic Processes en Int. Chem. Engng.,
22, 4: 591-610.

Schegerl, K., Lucke, J., Oels, U. (1980), Bubble Column Bioreactors, Adv. In
Biochem. Engng., 45. 7: 1-84.

AIRLIFT

Blenke, H. (1985), Biochemical Loop Reactors en Biotechnology 2, Rehm, H. J. y G.
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Joep, J. M. (1988), Gas Hold up Measurements in Bioreactors en Trends in
Biotechnology, 6: 19-22.

Weiland, P., Onken, V. (1981), Differences in the Behaviour of Bubble Columns and
Airlift Loop Reactors en Ger. Chem. Eng., 4: 174-181.

48


PRCTICA 5

Prctica 5. Determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno






Determinacin de la
Velocidad de Transferencia de Oxgeno





INTRODUCCIN

Las conversiones microbianas aerbicas son reacciones de oxidacin que requieren oxgeno
molecular disuelto. Una gran diferencia del oxgeno con respecto a otros nutrientes, es su
extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la transferencia de oxgeno puede
llegar a ser uno de los principales factores limitantes de la productividad celular y/o de
metabolitos, debido a la influencia de la concentracin del oxgeno disuelto sobre las actividades
metablicas de las clulas. La velocidad de transferencia de oxgeno de un biorreactor depende de
las condiciones de operacin (aireacin y/o agitacin) y de las propiedades fsicas del lquido. La
ecuacin que describe la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) es:

VTO = k
L
a (C* - C) (1)

donde:
k
L
a : coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (h
-1
).
C*: concentracin de oxgeno disuelto en equilibrio con la fase gaseosa (g/L).
C: concentracin de oxgeno disuelto (g/L).
49
El k
L
a es un parmetro que sirve para tener una idea de la rapidez con la que se transfiere oxgeno
del aire al lquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes mtodos para determinar la
velocidad de transferencia de oxgeno. Dos de ellos son el mtodo del sulfito y el mtodo
dinmico.

Otro parmetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxgeno de un
biorreactor es la fraccin de gas retenido () o "gas holdup", definido como la fraccin de
volumen de la dispersin gas-lquido que es ocupada por la fase gaseosa. Cuando el tamao
promedio de las burbujas es constante, una mayor fraccin de gas retenido, implica una mayor
rea interfacial gas-lquido y en consecuencia una mayor transferencia de oxgeno.

La velocidad de transferencia de oxgeno es determinada de manera importante por el rea
superficial de las burbujas de aire, de aqu que el aire se disperse en forma de burbujas pequeas
para proveer una gran rea de contacto entre las fases lquida y gaseosa. Sin embargo, en algunos
lquidos, las burbujas pequeas tienden a unirse formando burbujas ms grandes. As con una
dispersin primaria muy fina y dependiendo de las propiedades fsicas del lquido y de la
intensidad de la turbulencia dentro del biorreactor, las burbujas pueden crecer hasta
aproximadamente 6 mm de dimetro despus de dejar la zona de dispersin. Este fenmeno
conocido como coalescencia de las burbujas, es causado por el hecho de que una pelcula lquida
entre dos burbujas de aire adyacentes se hace cada vez ms delgada hasta que eventualmente se
rompe.

En una dispersin gas-lquido cuyo comportamiento es 100% coalescente, el lquido es un lquido
puro. Al ir aumentando la concentracin de electrolitos disueltos en dicho lquido, se va
inhibiendo la coalescencia de las burbujas. Tambin la presencia de protenas, alcoholes y
substancias surfactantes, afecta el grado de coalescencia de las burbujas. La coalescencia de las
burbujas afecta entonces el dimetro de las burbujas. ste, junto con la fraccin de gas retenido,
determina el rea superficial de contacto entre las fases lquida y gaseosa.

Si el oxgeno molecular no fuera continuamente transferido del aire al lquido donde se
desarrollan los microorganismos, el oxgeno disuelto sera consumido en pocos segundos bajo
condiciones normales de operacin, debido a la baja solubilidad del oxgeno en agua. El
50
suministro del oxgeno es por lo tanto un aspecto muy importante en el diseo de biorreactores
para procesos aerbicos.

El k
L
a es un parmetro que depende del grado de coalescencia del lquido. Por ejemplo, el k
L
a
empleando una solucin acuosa con una fuerza inica de I=0.4, es ms grande, por un factor de
seis, que el obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del rea interfacial.

En general, en los biorreactores de columna de burbujas se obtienen fracciones de gas retenido
ms grandes, mientras que el los biorreactores airlift, la fraccin de gas retenido disminuye al
aumentar la velocidad de circulacin del lquido. La velocidad del lquido representa por lo tanto,
un parmetro muy importante para adaptar la fraccin de gas retenido y el tiempo de residencia
promedio de las burbujas a los requerimientos de proceso.

En los biorreactores airlift, la velocidad de transferencia de masa cambia a lo largo de la ruta de
flujo de una manera complicada, debido a que el rea interfacial y la diferencia de concentracin
de oxgeno cambian de una altura a otra debido a la expansin o compresin, al consumo de
oxgeno y a cambios en la presin hidrosttica.
51
OBJETIVO
Determinar la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO), el coeficiente volumtrico de
transferencia de oxgeno (k
L
a) y la fraccin de gas retenido global () en diferentes tipos de
biorreactores.



EQUIPO, MATERIALES Y MTODOS

Biorreactores
Biorreactor de tanque agitado.
Biorreactor de columna de burbujeo.
Biorreactor airlift.
Electrodo y medidor de oxgeno disuelto.


Reactivos
Sulfito de sodio
Sulfato de cobre pentahidratado
Solucin de Yodo 0.1 N.
Solucin de Tiosulfato de sodio 0.1 N.
Solucin de almidn soluble al 1%.


Mtodo del sulfito para la determinacin de VTO y kLa.
En el mtodo de oxidacin del sulfito, la oxidacin del in sulfito a in sulfato es casi instantnea
y la velocidad es independiente de las concentraciones de sulfito y de oxgeno disuelto. Puesto
que la velocidad de reaccin es mucho ms rpida que la velocidad de transferencia, la velocidad
de oxidacin es controlada por la velocidad de transferencia de oxgeno a la solucin, donde la C
es prcticamente de cero. Para determinar el k
L
a por este mtodo, se usa una solucin de NaSO
3

que contiene Cu
+2
como catalizador, despus de un tiempo de operacin, se toma una muestra
para determinar la concentracin de in sulfito que no reaccion mediante la titulacin con una
solucin de Yodo. El Yodo que no reaccion se cuantifica titulndolo con Tiosulfato de sodio.


52
Las reacciones que se llevan a cabo en este mtodo son:

2 Na
2
SO
3
+ O
2
2 Na
2
SO
4


2 Na
2
SO
3
+ 2 I
2
+ 2 H
2
O 2 Na
2
SO
4
+ 4 HI

2 I
2
+ 4 Na
2
S
2
O
3
4 NaI + 4 Na
2
S
4
O
6




Preparacin de soluciones
Solucin de Sulfito de sodio 0.4 M.
Esta solucin se prepara justo antes de ser empleada. El volumen a preparar depende del volumen
de operacin del biorreactor que empleen.

Solucin de Sulfato de cobre.
La solucin a preparar deber tener una concentracin tal que al agregarla al biorreactor resulte
en una concentracin de 0.0008 M.


Determinacin del k
L
a por el mtodo dinmico.

Este mtodo se basa en un balance dinmico de oxgeno bajo condiciones no estacionarias.
Cuando se aplica este mtodo en un biorreactor que no contiene microorganismos se usa la
ecuacin (2); es igual que la ecuacin (1) pero sustituyendo VTO por el cambio de la
concentracin de oxgeno con respecto al tiempo (dC/dt).

) 2 ( ) * ( C C a k
dt
dC
L
=
53

En este mtodo el suministro de aire se reemplaza por un suministro de nitrgeno, que desplaza al
oxgeno presente en el seno del lquido, disminuyendo C. Despus se inicia la aireacin a una
velocidad constante y se mide el aumento de C. En esta etapa, el balance de oxgeno se describe
por la ecuacin (2), que al integrarla entre los lmites C
1
y C
2
obtenemos la ecuacin (3). Una
grafica de ln[(C*- C2)/(C* - C1)] vs tiempo produce una lnea recta con una pendiente que es
igual a k
L
a. La figura (1a) muestra el cambio de C y la figura (1b) muestra la lnea obtenida con
la ecuacin (3).

( ) ) 3 (
*
*
ln
1 2
1
2
t t a k
C C
C C
L
=
|
|
.
|

\
|

(a) (b)
Figura 1. Determinacin de k
L
a usando el mtodo dinmico.


Tiempo

a k
L

Tiempo
C
Eliminacin
de oxgeno
Inicio de
aireacin
|
|
.
|

\
|

1
2
*
*
ln
C C
C C

54
Determinacin de la fraccin de gas retenido global por el mtodo de expansin
Medir el volumen del lquido aireado y el volumen del lquido sin airear


DESARROLLO EXPERIMENTAL

Determinacin del k
L
a por el mtodo del sulfito
o Agregar al biorreactor la solucin de Sulfito de sodio 0.4 M.
o Adicionar la solucin de Sulfato de cobre al biorreactor.
o Ajustar el pH a un valor de 7.2 con HCl concentrado.
o Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operacin.
o Despus de que el biorreactor alcance una operacin estable, tomar una muestra de 1 mL
y verterla a un matraz erlenmeyer de 250 mL, que contiene 10 mL de la solucin de Yodo
0.1N. Este tiempo de toma de muestra es el tiempo cero.
o Dependiendo de la capacidad de transferencia de oxgeno del biorreactor, se tomarn
muestras cada X tiempo. El tiempo ser sugerido por el profesor y se establecer de
acuerdo a los resultados que se tengan de la titulacin de la segunda muestra.
o Despus de tomar 5 muestras, detener la aireacin y/o la agitacin del biorreactor.
o Titular el exceso de Yodo de los matraces donde se depositaron las muestras con la
solucin de Tiosulfato de sodio 0.1N. Registrar el volumen gastado de Tiosulfato de
sodio.

Determinacin del k
L
a por el mtodo dinmico
o Calibrar el electrodo de oxgeno disuelto e instalarlo en el biorreactor.
o Llenar el biorreactor con agua de la llave hasta alcanzar el volumen de operacin.
o Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operacin.
o Despus de que el biorreactor alcance una operacin estable, suministrar nitrgeno para
que la C disminuya.
o Cuando la C sea baja, del orden de 0% a 10% de saturacin, suspender el suministro de
nitrgeno e iniciar el suministro de oxgeno a un flujo correspondiente a una condicin de
operacin, registrando el % de saturacin de oxgeno disuelto cada 15 s. Este tiempo
55
puede ser diferente de acuerdo a la capacidad de transferencia de oxgeno del biorreactor.
Despus del primer experimento usted establecer cada cuanto tiempo debe registrar % de
saturacin de oxgeno disuelto.
o Cuando el % de saturacin de oxgeno disuelto sea alto, del orden de 90% a 100% puede
terminar el experimento.


Condiciones de operacin
Las siguientes condiciones de operacin se siguieren, queda en el profesor seguirlas o cambiarlas
por otras, de acuerdo al tipo y tamao de biorreactor que se utilice.

Biorreactor tanque agitado.
Velocidades de agitacin: 300 y 700 rpm.
Para cada velocidad de agitacin se probarn las siguientes velocidades de aireacin: 0.3, 0.6,
1.0, 1.2 y 1.5 vvm.

Biorreactores de columna de burbujeo y airlift.
Velocidad de aireacin: 0.3, 0.6, 1.0, 1.2 y 1.5 vvm.

Medicin de la fraccin de gas retenido global por el mtodo de expansin.
Medir el nivel del lquido sin airear y el nivel del lquido aireado para cada condicin de
operacin en cada tipo de biorreactor











56
RESULTADOS

Para el mtodo del sulfito

1. Elabore graficas del volumen de Tiosulfato de sodio (mL) gastado en las titulaciones vs el
tiempo (h).

2. Calcule la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) de acuerdo a la ecuacin (4).

3. La VTO es la pendiente de la grafica del volumen de Tiosulfato de sodio (mL) gastado en
la titulacin vs el tiempo (h).



( )
( )
) 4 (
1 2
1 2
V t t
A N V V
VTO

=


Donde:
V
1
y V
2
: volmenes de la solucin de Tiosulfato de sodio gastados (en mL),
correspondientes al tiempo t
1
y t
2
(en h), respectivamente.
N: normalidad de la solucin de Tiosulfato de sodio (meq/mL).
V: volumen de muestra (L).
A: equivalente estequiomtrico de oxgeno a Tiosulfato de sodio e igual a 0.25 mMoles
O
2
/meq de Tiosulfato de sodio.


4. Calcule el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (k
L
a) de acuerdo a la
ecuacin (1).

5. Elabore una grafica de k
L
a en funcin de fraccin de gas retenido, velocidad de agitacin,
velocidad de aireacin, potencia de agitacin con aireacin y potencia de aireacin.

57
6. Obtenga la correlacin del k
L
a en funcin de cada una de las variables mencionadas en el
prrafo anterior.



Para el mtodo dinmico

1. Tabule los valores de tiempo (s) y % de saturacin de oxgeno. Calcule el valor de C
*

(g/L) usando la Ley de Henry; este valor es el 100% de saturacin. Calcule la C (g/L).
Haga una grafica de C (g/L) vs tiempo (h).

2. Tabule los valores necesarios para que elabore una grafica que le permita obtener el k
L
a
(h
-1
)

3. Calcule la VTO, el k
L
a y la fraccin de gas retenido global para cada condicin de
operacin.

4. Obtenga la correlacin del k
L
a en funcin de la fraccin de gas retenido, velocidad de
agitacin, la velocidad de aireacin, la potencia de agitacin con aireacin y la potencia
de aireacin.




DISCUSIN
La discusin deber contener al menos la siguiente informacin:

1. Comparacin de las diferentes condiciones de operacin y fracciones de gas retenido con
respecto a los valores del k
L
a.

2. Comparacin de los valores de k
L
a que obtuvo para cada uno de los biorreactores
empleados y explique el porqu de las diferencias.

58
3. Cul es el aspecto de la dispersin gas-lquido para cada condicin de operacin.

4. Explicacin de los valores de k
L
a de los lquidos que promueven la coalescencia y de los
lquidos que la evitan.




BIBLIOGRAFA

TANQUE AGITADO Y COLUMNA

1. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
2. Wang, D .I .C ., Cooney, C. L, Demain, A. D., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D. 1978.
Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.
3. Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis, N. F. 1973. Biochemical engineering. Academic Press.


AIRLIFT

1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England.

2. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.

3. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and airlift loop
reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.

4. Merchuk, J. C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71.


59
PRCTICA 6
Prctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores



Mantenimiento de asepsia en
biorreactores




INTRODUCCIN

En esta prctica la asepsia se considera como el conjunto de procedimientos
destinados a eliminar o retirar microorganismos de un biorreactor y de todas las
tuberas conectadas a l con el propsito de asegurar que nicamente estn presentes
el o los biocatalizadores, microorganismos o enzimas responsables de efectuar la
bioconversin de materias primas a un producto especificado. En consecuencia, la
asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l garantizan que los procesos de
bioconversin se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraos.

Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado
por el substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor,
incluso pueden producir sustancias que daen al microorganismo cultivado o inactiven a
las enzimas. Por lo tanto, la presencia de microorganismos contaminantes ocasionan
que los rendimientos y productividades de produccin establecidos no se puedan
alcanzar, ocasionando prdidas econmicas.

60
Para lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l se deben
proponer desde la etapa de diseo una geometra interna y arreglos de tuberas que
eviten la acumulacin de sustancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las sustancias
acumuladas pueden propiciar una contaminacin. Tambin la asepsia se facilita
mediante una limpieza efectiva del biorreactor y de las tuberas, lo que se alcanza al
especificar materiales de construccin con un acabado que evite el atrapamiento de
partculas slidas con microorganismos. Las partculas slidas eventualmente limitan la
transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la
temperatura de esterilizacin y por lo tanto dejndolos viables para generar una
contaminacin.

Una vez lavado el biorreactor y las tuberas, el biorreactor se llena con medio de cultivo
para proceder a la esterilizacin. Despus de la esterilizacin el biorreactor debe operar
aspticamente. Para lograrlo es necesario el buen funcionamiento del sello mecnico
para mantener una presin positiva que evite la entrada de microorganismos. Tambin
se requiere el ms alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de remocin
del filtro para la esterilizacin del aire.

Existen diferentes mtodos para probar la integridad de filtros, uno de ellos es la prueba
de la intrusin del agua. Es una prueba prctica y validada que se puede considerar
para probar la integridad in situ de los filtros hidrofbicos para la esterilizacin del aire.
Otra prueba es la de mantenimiento de la presin.

OBJETIVO

El alumno conocer las pruebas de intrusin de agua y de mantenimiento de la presin
para probar la integridad de filtros de aire con los que se garantice la operacin asptica
en biorreactores.


PRUEBA DE INTRUSIN DE AGUA
61

El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofbico seco
se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofbica de la membrana porosa
prevendr el flujo del lquido a travs del filtro hasta que se alcanza la presin de la
intrusin. A presiones por debajo de la presin de intrusin ocurre un flujo pequeo,
pero medible del agua a travs de la membrana. La presencia de poros ms grandes en
el filtro ser detectada por un flujo creciente debido al agua que atraviesa estos poros.
La Figura 3 muestra el principio de esta prueba.



Figura 3. Principio de la prueba de intrusin de agua. Si el tamao de los poros es como
el tamao del poro B, el flujo de agua ser menor que el flujo correspondiente a poros
del tamao del poro A.

El Cuadro 2 muestra el resultado de una prueba de intrusin de agua para un filtro de
membrana de la marca Pall. Los parmetros de la prueba son especficos para cada
filtro y deben ser proporcionados por el fabricante.

Cuadro 2. Parmetros de la prueba de intrusin de agua para un filtro de cartucho
EMFLON PFR de Pall
Carcasa
Aire
Agua
Filtro:
Membrana
hidrofbica

Aire
Agua
Membrana
hidrofbica

Presin
Poro A
Poro B
Unidad de filtracin

62
Nmero de catlogo AB1PFR7PVH4
Presin de prueba 2500 mbar
Flujo mximo permisible 0.33 ml/min
Usando agua desionizada a una temperatura de 20 2C.

PRUEBA DE MANTENIMIENTO DE LA PRESIN

La prueba de mantenimiento de la presin es una forma modificada de una prueba de
flujo difusivo, que es la prueba de flujo hacia delante corriente arriba del filtro. sta
puede llevarse a cabo despus de la esterilizacin del filtro, antes de la filtracin y
despus de la filtracin estril, puesto que las conexiones estriles corriente abajo no se
desconectan. Una ventaja de la prueba de mantenimiento de la presin es que tambin
confirma la integridad de la unidad de filtracin, incluyendo los sellos de la carcasa.


BIBLIOGRAFA

Lydersen B. K., DElia N. A., Nelson, K. M. L. (1994), Bioprocess Engineering: Systems,
Equipment and Facilities, John Wiley and Sons, Inc. New York.

Johnston P. R. (2004), Fluid Sterilization by Filtration, Interpharm, CRC Press LLC.

Jornitz. M. W. (2006), Sterile Filtration, Springer-Verlag, Berlin.
63
PRCTICA 7
Prctica 7. Esterilizacin del sistema de biorreaccin



Esterilizacin del sistema de
biorreaccin



INTRODUCCIN

Una esterilizacin adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el xito
de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propsito se emplea cualquier
mtodo capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables.
La tcnica ms comn es la destruccin de los microorganismos contaminantes. El
trmino destruccin, en este caso, significa la prdida de viabilidad del microorganismo.

La destruccin de microorganismos se puede llevar a cabo por varios mtodos:

- Calor, ya sea seco o hmedo.
- Agentes qumicos.
- Radiaciones.
- Vibraciones snicas.


El mtodo que se utiliza con mayor frecuencia para medios lquidos es el de calor
hmedo, ya que es simple, confiable y econmico.
64

CINTICA DE MUERTE TRMICA DE MICROORGANISMOS

Generalmente la velocidad de muerte de los microorganismos se clasifica en: velocidad
de muerte logartmica y velocidad de muerte no logartmica.

VELOCIDAD DE MUERTE LOGARTMICA

La velocidad de muerte logartmica se puede expresar matemticamente mediante la
ecuacin:

-
dN
dt
kN = (1)

Separando variables e integrando.

ln
N
No
kt = (2)
N
No
kt = exp( ) (3)


La ecuacin (3) describe apropiadamente la cintica de muerte trmica de clulas
vegetativas.

VELOCIDAD DE MUERTE NO LOGARTMICA

Este tipo de comportamiento de muerte trmica se encuentra a menudo en esporas
bacterianas. Se proponen varias explicaciones para esta conducta: germinacin de
esporas, tcnicas experimentales deficientes, impactos mltiples para la inactivacin y
eventos secuenciales en la induccin de muerte.
65

El modelo de eventos secuenciales propone que la muerte se suscite de la siguiente
manera:

N N N
R
k
S
k
D
R S
(4)

Se propone que una espora resistente N
R
sufre inactivacin o muerte a un estado final
N
D
a travs de un intermediario sensible N
S
.

Se establecen las ecuaciones diferenciales:

dN
dt
k N
R
R R
= (5)

dN
dt
k N k N
S
R R S S
= (6)

La solucin a estas ecuaciones diferenciales simultneas es:

( ) ( )
(

= t k exp
k
k
t k exp
k k
k
N
N
R
R
S
S
S R
R
0
(7)

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA CINTICA DE MUERTE

Considerando la muerte trmica de los microorganismos de manera similar a las
reacciones qumicas, la relacin entre las constantes cinticas y la temperatura
presenta un comportamiento anlogo. La teora ms frecuentemente empleada es la
teora de Arrhenius.

Esta relacin se expresa matemticamente como:

66
k A
E
RT
=

|
\

|
.
|
exp (8)

ESTERILIZACIN POR LOTE

En el proceso de esterilizacin por lote el medio se coloca en el fermentador y el
contenido se calienta a la temperatura de esterilizacin asignada. Para establecer la
relacin entre tiempo y temperatura se puede utilizar la ecuacin (1). Sin embargo, k
durante la esterilizacin por lote no es constante ya que la temperatura durante el
calentamiento y enfriamiento varan. Incorporando el efecto de la temperatura
establecido por la ecuacin de Arrhenius la ecuacin queda:

V = =

|
\

|
.
|
}
TOTAL
t
No
N
A
E
RT
dt ln exp
0
(9)


El smbolo V representa el grado de destruccin en todo el proceso.

El ciclo de esterilizacin est formado por tres periodos:

- Elevacin de temperatura o calentamiento.
- Mantenimiento de temperatura
- Descenso de temperatura o enfriamiento.

El perfil temperaturatiempo durante la fase de calentamiento es funcin de varios
factores, por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calentamiento, ya sea
inyeccin directa de vapor, calentamiento indirecto a la chaqueta mediante serpentines
o elctricamente. El Cuadro 3 muestra las relaciones tiempotemperatura de acuerdo a
la forma de transferencia de calor.
Cuadro 3. Relaciones tiempotemperatura de acuerdo a la forma de transferencia de
calor
67
TIPO DE
TRANSFERENCIA DE
CALOR
RELACIN
TEMPERATURA
TIEMPO

a y b
Adicin de vapor al
medio
T To
at
bt
= +
+
|
\

|
.
|
1
1


(Hiperblica )
a
hs
MToC
=

b
s
M
=

Calentamiento con
dispositivo elctrico

( ) T To at = + 1

(lineal)

a
q
MToC
=
Calentamiento con vapor
(intercambiador de calor)

( )
T T be
H
at
= +

1

(exponencial)

a
Ua
MC
=
'


b
To T
T
H
H
=


Enfriamiento
(Intercambiador de calor)

( )
T T be
at
= +

1
a
WC
MC
e
Ua
MC
=
'

|
\

|
.
|
'
'
1


b
To T
T
=

OBJETIVO

El alumno disear el ciclo de esterilizacin para un medio de cultivo en un biorreactor.

MATERIAL
68

- Fermentador de 12 litros.
- Cronmetro.
- Cajas de Petri estriles.
- Pipetas estriles.
- Agar nutritivo.
- Mechero.
- Esporas de Bacillus stearothermophilus.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

- Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de
Bacillus stearothermophilus.
- Establecer la temperatura de esterilizacin.
- Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de esterilizacin,
en intervalos de un minuto.
- Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos: al principio del ciclo de
esterilizacin (N
o
), al final del periodo de calentamiento (N
1
), al final del periodo
de mantenimiento (N
2
), y al final del periodo de enfriamiento (N
3
).
- De cada una de las muestras tomadas, se hace una dilucin y se siembran por
duplicado en cajas de Petri utilizando la tcnica de vaciado en placas. Se
incuban a 30 C, hacer cuenta de colonias cada 24 h, durante tres das.

MUESTRA DILUCIN
N
O
10
-1
10
-5

N
1
10
-1
10
-5

N
2
10
-1
10
-3

N
3
10
-1
10
-2


69
FORMULACIN DE RESULTADOS

- Presentar los valores de temperatura y tiempo para el ciclo de esterilizacin en
un cuadro.
- Graficar los perfiles para las etapas de calentamiento, mantenimiento y
enfriamiento.
- Determinar los valores de (a) y (b) de las ecuaciones de temperatura en funcin
del tiempo para las etapas de calentamiento y enfriamiento.
- Calcular el coeficiente global de transferencia de calor (U
iD
) para las etapas de
calentamiento y enfriamiento.
- Con los valores de No, N
1
, N
2
y N
3
determinar el grado de destruccin para el
calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el V
ciclo de esterilizacin
.
- En el periodo de mantenimiento determinar el valor de la energa de activacin
conociendo el valor de la constante de Arrhenius: A = 7.49 X 10
38
min
-1
.
- Elaborar un cuadro de valores de (k) en funcin del tiempo y trazar la grfica
correspondiente. Obtener el grado de destruccin para calentamiento,
mantenimiento, enfriamiento y total por integracin grfica en la curva anterior y
por algn mtodo numrico.
- En el caso de que la esterilizacin haya sido deficiente, recalcular el tiempo de
mantenimiento, suponiendo los criterios de diseo de calentamiento y
enfriamiento constantes y una poblacin final de microorganismos viables de 10
-3

(probabilidad de que en mil lotes de esterilizacin, uno resulte contaminado).

BIBLIOGRAFA

Abbot, F. J., Clamen, A. (1973). Biotechnol. Bioeng., 15:117-127.

Bailey, J. E., Ollis, D. F. (1977). Biochemical engineering fundamentals. McGraw-Hill,
Inc.

Deindoerfer, F. H. y Humphrey, A. E. (1959), Appl. Microbiol. 7: 256-264.
70

Richards, J. W. (1961). Progress in Ind. Microbiol. 5: 143-173.

Wang, I. C. D., y col. (1979), Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley, N. Y.
71
ANEXO 1
NOMENCLATURA

a - rea de transferencia de calor: calcularla experimentalmente
A - Constante de Arrhenius, min
-1
.
C - Calor especfico del medio de cultivo, kcal/ kg C.
C - Calor especfico del elemento enfriador, kcal / kg C.
E - Energa de activacin, cal / g mol, kcal / kg mol.
h - Entalpa relativa al medio, kcal / kg (entalpa del vapor a la temperatura del
medio de cultivo).
k - Constante especfica de velocidad de muerte, min.
-1
.

k
R
- Constante especfica de inactivacin de esporas resistentes.
k
s
- Constante especfica de intermediarios sensibles.
M - Masa inicial del medio, kg.
N - Concentracin de microorganismos en el tiempo t.
No - Concentracin de microorganismos t
o
.
N
1
- Concentracin de microorganismos t
1
.
N
2
- Concentracin de microorganismos t
2
.

N
3
- Concentracin de microorganismos t
3
.
N
D
- Concentracin de esporas inactivas.
N
R
- Concentracin de esporas resistentes.
N
S
- Concentracin de esporas sensibles.
q - Velocidad de transferencia de calor, kcal / s.
R - Constante universal de los gases, 1.98 cal / g Mol K.
s - Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.
t - Tiempo, min, h.
T - Temperatura absoluta K.
T
0
- Temperatura inicial del medio K.
T
H
- Temperatura de la fuente de calentamiento K.
T

- Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 K.

U - Coeficiente global de transferencia de calor, kcal / m
2
h C.
W - Gasto masa del elemento enfriador: calcularla experimentalmente.



72
PRCTICA 8
Prctica 8. Produccin de biomasa en cultivo por lote



Produccin de biomasa en
Cultivo por lote





INTRODUCCIN

Los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: cerrados, abiertos y sistemas
semicerrados. Al primer grupo pertenece el cultivo por lote empleado tradicionalmente
desde el siglo antepasado, en el cual una vez iniciada la fermentacin ya no existe
entrada ni salida de materiales.

Hasta la fecha la gran mayora de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo
en cultivo por lote. ste consiste en agregar al fermentador un medio de cultivo que
contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la
produccin de un metabolito. El medio despus de ser esterilizado y enfriado a la
temperatura de fermentacin se inocular con el microorganismo para permitir su
desarrollo y produccin del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento
de uno o ms nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentacin se cosecha la
totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.
73
Ya vaco el fermentador se limpia y lava perfectamente para permitir la siguiente
fermentacin. La determinacin de los parmetros cinticos de un cultivo por lote tiene
la finalidad de conocer, predecir y controlar la fermentacin misma. El cultivo por lote
tiene la particularidad de que todos los parmetros cinticos varan con el tiempo de
fermentacin. Los valores obtenidos de estos parmetros son lo suficientemente
confiables si las determinaciones se realizan adecuadamente durante el proceso de
fermentacin.

OBJETIVO

El alumno determinar los parmetros cinticos de la levadura Candida utilis o
Sacharomyces cerevisiae creciendo en condiciones ptimas en un cultivo por lote.

MATERIALES Y MTODOS

EQUIPO

- Autoclave (15 l de capacidad).
- Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
- Fermentador con ambiente controlado (de dos litros).
- Electrodo de pH esterilizable.
- Medidor controlador de pH.
- Bombas peristltica (0 a 2 l/h).
- Placas de calentamiento y agitacin.
- Espectrofotmetro (rango: visible y UV).
- Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
- Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad).
- Estufa.
- Equipo de filtracin con vaco.


74
MICROORGANISMO Sacharomyces cerevisiae

La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 4
0
C.

MEDIOS DE CULTIVO

Cuadro 4. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE (g/l)
Glucosa 15.0 15.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.73 1.365
NaH
2
PO
4
1.2637 1.2637
Extracto de levadura 0.990 0.990
* FeSO
4
7H
2
O
* CuSO
4
5H
2
O
* ZnSO
4
H
2
O
* Na
2
MoO
4
2H
2
O
* MnSO
4
H
2
O
Emplear agua de la llave

(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en ml)
a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
V
sales
(ml) = 0.05 x conc. de glucosa (g/l) x volumen medio (l)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).
75
MTODOS ANALTICOS

Determinacin de la concentracin celular (x)

Para determinar la concentracin celular se emplear una curva tipo de As = f
(concentracin celular), que fue obtenida de acuerdo al siguiente procedimiento: La
curva tipo se obtuvo de la siguiente forma: A suspensiones de levadura de diferentes
concentraciones se les midi la absorbancia. Despus, en membranas puestas
previamente a peso constante y colocadas sobre el dispositivo de filtracin se les
adiciona 5 mL de suspensin levaduras y se filtr al vaco. Se separ el filtrado y el
paquete celular se lav con 5 mL de agua destilada y se filtr nuevamente (este
segundo filtrado no se mezcl con el primero). El paquete celular lavado se coloc en
una estufa a 60
0
C durante 24 horas. La concentracin celular se calcula por diferencia
de pesos (todas las pesadas se hicieron en balanza analtica). Con los datos de
absorbancia y concentracin celular de cada una de las suspensiones de levadura, se
obtuvo la curva tipo de As = f (concentracin celular).

Entonces, para conocer la concentracin de levaduras durante el cultivo en lote, basta
con tomar una muestra y determinar la absorbancia, para que con la curva tipo obtenga
la concentracin celular. Si la absorbancia de la muestra es mayor que la ms alta de la
curva tipo, entonces deber hacer diluciones de su muestra para que el valor de
absorbancia este dentro del intervalo de la curva tipo.

Determinacin de azcares reductores por DNS

Reactivos: Un gramo de cido 3,5- dinitrosaliclico se disuelve en 20 ml de NaOH 2N, se
agregan despus 50 ml de agua, y luego 30 g de tartrato de sodio y potasio. Todo se
lleva a un volumen de 100 mililitros.

Procedimiento: A 1 ml del filtrado se le adiciona 1 ml del reactivo DNS, se coloca en
bao mara a ebullicin durante cinco minutos. Posteriormente se deja enfriar y se
76
adicionan 5 ml de agua destilada. Se leen los tubos a 540 nm. Se emplean dos
controles de concentraciones de 0.4 y 0.8 g/l de glucosa y con el blanco de reactivos se
ajusta a cero el espectofotmetro.

Curva tipo de glucosa: Elaborar una curva tipo de glucosa con volmenes de 0.1 a 1 ml
de solucin patrn de 1.0 g/l de glucosa.



PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PREPARACIN DEL INOCULO

Se preparan 180 ml de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 ml) con 90 ml de medio cada uno. Se esterilizan a 15
lb/in
2
durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5 ml del mismo medio sobre la cepa en
tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora (110
golpes/minuto) a una temperatura de 35
0
C durante 18 horas.

CULTIVO POR LOTE

- Se preparan 1620 ml de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH
a 4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se
esteriliza en el autoclave a 15 lb/in
2
, 15 min. Tambin se esterilizan,
conjuntamente, los recipientes que contienen el antiespumante y el lcali.

- El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitacin,
venteo, agua de enfriamiento, etctera y despus se inocula con los dos
matraces del inoculo en condiciones aspticas: El cultivo por lote operar bajo
las siguientes condiciones:

77
Velocidad de agitacin : 500 rpm
Aireacin : 1 vvm
Temperatura : 35

C
pH (con NH
4
OH 2N) : 3.8
Antiespumante (PPG-10%) : de acuerdo a la formacin de espuma

- Se tomarn muestras cada hora para la determinacin de la concentracin
celular por absorbancia y azcares residuales por el mtodo del DNS. Las
determinaciones se harn por duplicado. El cultivo por lote durar
aproximadamente 10 horas.

- Procesamiento de muestras.

Las muestras se tratarn bajo el esquema de la Figura 4.



(10mL)





(3 ml) (5 ml)













Figura 4. Procesamiento de las muestras.


MUESTRA
Medir absorbancia
Centrifugacin
Filtrado
Paquete celular
Determinacin de
glucosa residual
Determinacin de
concentracin celular
usando la curva tipo
correspondiente
78
FORMULACIN DE RESULTADOS

- Presentar los resultados en el Cuadro 5 del Anexo 2, que est al final de la
presente prctica.
- Presentar la curva tipo de concentracin de glucosa.
- Elaborar los siguientes grficos:

o Concentracin celular (x) contra tiempo (identificar las fases del crecimiento).
o Concentracin residual de glucosa (s) contra tiempo.
o Logaritmo natural de la concentracin celular contra tiempo (slo para la fase
o exponencial).

- Determinar los siguientes conceptos:

o Velocidad especfica de crecimiento () a cada tiempo de cultivo.
o Velocidad especfica de consumo de sustrato (qs) a cada tiempo de cultivo.
o Velocidad especfica de crecimiento mxima (max).
o Rendimiento celular con base al consumo de sustrato (Yxs) a cada tiempo de
cultivo.
o Rendimiento celular global con base al consumo de sustrato (Yxs(global)).
o Constante de afinidad por el sustrato (Ks).
o Productividad celular global (Rx global).

- Al final el alumno discutir los resultados obtenidos en la prctica y elaborar un
resumen de la misma.

BIBLIOGRAFA

Dunn, I. J., Mor, J. R. (1975), Variable-volumen continuous cultivation en Biotechnol.
Bioeng.,17: 1805-1822.

79
Pirt, S. J. (1975), Principles of microbial and cell cultivation en Black Well Scientific
Publications, London.

Whitaker, A. (1980), Fed-batch culture en Process Biochem., 15:10-15.

Yaman, T., Hirano, S. (1977), Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation, J. Ferment Technol., 55:156-165.


ANEXO 2
Cuadro 5. Resultados del cultivo por lote
Da Hora Tiempo de
reaccin
(h)
Concentracin celular
(por absorbancia)
Glucosa residual
No. de tubo As Dilucin g/L Tubo Lectura Dilucin g/L














Curva tipo de biomasa
pendiente (m) =
ordenada (b) =
Reunir todas las muestras y aplicar el
mtodo DNS, empleando dos
controles de 0.4 y 0.8 g/l de glucosa
0.4 g/l _________
0.8 g/l _________
80
ANEXO 3
CULTIVO POR LOTE

ACTIVIDADES

- Curva tipo de glucosa.

- Preparacin del medio de cultivo para el inoculo / esterilizacin / enfriamiento /
inoculacin de los matraces con la cepa en tubo inclinado / incubacin durante
18 horas.

- Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo y esterilizacin
del lcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculacin con los matraces al
fermentador / arranque de la fermentacin.

- Toma de muestra cada hora del cultivo por lote / procesamiento de las muestras.

- Descarga y lavado del fermentador.
81
PRCTICA 9
Prctica 9. Produccin de biomasa en cultivo por lote alimentado



Produccin de biomasa en
Cultivo por lote alimentado





INTRODUCCIN

Generalmente los sistemas fermentativos se clasifican en tres grupos: Sistemas
cerrados, Sistemas abiertos y Sistemas semicerrados. Al primer grupo pertenece el
cultivo por lote empleado tradicionalmente desde el siglo XIX, en el cual una vez iniciada
la fermentacin ya no hay entrada ni salida de nutrientes.

Los cultivos continuos (principalmente simple etapa, con recirculacin y mltiple etapa)
pertenecen al segundo grupo, donde existe entrada (nutrientes) y salida de materiales
(nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).

En los sistemas semicerrados slo ocurre entrada de nutrientes, pero no salida de
materiales, por lo que tambin se les conoce como sistemas de volumen variable.
Tambin a este tipo de sistemas se les denomina genricamente como cultivos
Fedbatch (trmino introducido por Yoshida en 1973) porque operativamente inician con
un cultivo por lote y al finalizar ste, se inicia la alimentacin de nutrientes al biorreactor.
82
A su vez, por la forma de suministro de los nutrientes pueden clasificarse en cultivos
con alimentacin a flujo variable o flujo constante. A este ltimo pertenece el cultivo
objeto de esta prctica: cultivo por lote alimentado a flujo cte. (o Fedbatch Lineal).

Hasta antes de la dcada de los setentas, el cultivo Fedbatch Lineal vena
emplendose empricamente, pero diseado, en principio, para ser ms productivo que
el cultivo por lote. Fue en 1975 cuando Pirt
(2)
report un tratamiento matemtico de este
sistema, el cual consiste en el conjunto de ecuaciones diferenciales del sistema que
describen a las velocidades volumtricas de acumulacin de materiales en el
biorreactor, es decir, la aplicacin de la ecuacin general de balance para biomasa,
sustrato y producto (Acumulacin = Entrada - Salida + Generacin).

Como toda resolucin de sistemas de ecuaciones, la resolucin del sistema de
ecuaciones diferenciales que describen este cultivo, nos dar las funciones (x, s, p) =
f(t), es decir, podremos conocer, a cualquier tiempo del cultivo los valores de la
concentracin de biomasa, sustrato residual y del metabolito de inters. Dado que todas
las variables son dependientes del tiempo no existe solucin analtica al sistema de
ecuaciones diferenciales, por lo que debe resolverse utilizando algn mtodo numrico
(el ms usual es el de Runge-Kutta de cuarto orden).

Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las
siguientes condiciones:

- El suministro del sustrato limitante es mayor que lo demandado por el
microorganismo.
- El suministro del sustrato limitante es menor que lo demandado por el
microorganismo.

En el primer caso puede existir acumulacin y desacumulacin de la concentracin del
sustrato residual durante el tiempo necesario para alcanzar el volumen final del
biorreactor, y dependiendo de los valores del flujo de alimentacin y de la concentracin
83
del sustrato limitante pueden calcularse las concentraciones celular y de producto a
cualquier tiempo. Debido a este exceso en el suministro del sustrato limitante el
microorganismo crecer a su mxima velocidad de crecimiento.

Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo)
el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo,
por lo que la concentracin del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo
esta condicin el microorganismo ajusta su maquinaria metablica al bajo suministro del
sustrato, ocasionando limitacin en su crecimiento que se ve reflejado en una baja
velocidad de crecimiento.

Tambin el clculo de la concentracin celular y de producto podrn determinarse
resolviendo el sistema de ecuaciones bajo las condiciones de este segundo caso,
cuyos resultados dependern de los valores del flujo de alimentacin y concentracin
del sustrato limitante.

OBJETIVO

El alumno conocer y realizar un cultivo por lote con alimentacin constante
empleando Candida utilis y comprobar que este sistema fermentativo es de mayor
productividad y rendimiento que el cultivo por lote.

MATERIALES Y MTODOS

EQUIPO

- Autoclave (15 l de capacidad).
- Incubadora rotatoria de temperatura controlada.
- Fermentador con ambiente controlado (de 2 o 6 litros).
- Electrodo de pH esterilizable.
- Medidor controlador de pH.
84
- Electrodo de oxgeno disuelto.
- Medidor de oxgeno disuelto.
- Dos bombas peristlticas (0 a 2 l/h).
- Dos placas de calentamiento y agitacin.
- Espectrofotmetro (intervalo: visible y UV).
- Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
- Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad).
- Estufa con vaco.
- Equipo de filtracin con vaco.

MICROORGANISMO UTILIZADO: CANDIDA UTILIS

La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 4
0
C.

MEDIOS DE CULTIVO

Cuadro 6. Medios de cultivo
COMPONENTE MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/l)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE (g/l)
MEDIO PARA LA
ALIMENTACIN
(g/L)
Glucosa 15.0 15.0 40.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.73 1.365 3.64
NaH
2
PO
4
1.2637 1.2637 3.37
Extracto de levadura 0.990 0.990 2.64
* FeSO
4
7H
2
O
* CuSO
4
5H
2
O
* ZnSO
4
H
2
O
* Na
2
MoO
4
2H
2
O
* MnSO
4
H
2
O
Emplear agua de la llave

85
(*) Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en ml)
a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:

V
sales
(ml) = 0.05 x concentrado de glucosa (g/l) x volumen medio (l)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).

MTODOS ANALTICOS

Determinacin de la concentracin celular (x)
Igual que en la prctica de cultivo por lote.

Determinacin de azcares reductores
Igual que en la prctica de cultivo por lote.


PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparacin del inoculo

Se preparan 180 ml de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 ml) con 90 ml de medio cada uno. Se esterilizan a 15
lb/in
2
durante 15 minutos. Se enfra. Se inoculan con 5 ml del mismo medio sobre la
cepa en tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora
(110 golpes/minuto) a una temperatura de 35
0
C durante 18 horas.

Cultivo por lote

- Se preparan 810 ml de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH
a 4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se
esteriliza en el autoclave a 15 lb/in
2
, 15 min. Tambin se esterilizan,
conjuntamente, los recipientes que contienen el antiespumante y el lcali.
86

- El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitacin,
venteo, agua de enfriamiento, etctera. y despus se inocula con un matraz del
inoculo en condiciones aspticas: El cultivo por lote operar bajo las siguientes
condiciones:


Velocidad de agitacin : 500 rpm
Aireacin : 1 vvm
Temperatura : 35

C
pH (con NH
4
OH 2N) : 3.8
Antiespumante (PPG-10%) : de acuerdo a la formacin de espuma

Se tomarn muestras slo al inicio y al final del cultivo por lote, el cual durar 12
horas. A las muestras se les determinar concentracin celular y glucosa residual
por el mtodo del DNS.

Cultivo por lote alimentado constantemente (Feed-batch Lineal)

Se preparan 900 ml de medio de cultivo para el cultivo Fed Batch Lineal y se ajusta el
pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de dos litros, y se esteriliza junto con la
manguera de adicin y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in
2
durante 15 min.

B) Se calibra la bomba peristltica, previamente al paso anterior, a un flujo de 180 ml/h,
que ser el flujo de adicin para el cultivo alimentado.

C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que
contiene el medio estril a la bomba peristltica y a la entrada del fermentador en
condiciones aspticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentacin del medio
de cultivo. Esta adicin terminar cuando se agoten los 900 ml de medio de cultivo.

87
Este cultivo operar bajos las mismas condiciones de operacin del cultivo por lote:
velocidad de agitacin, aireacin, T, pH, etctera.

Se tomarn muestras cada hora, las cuales sern procesadas de acuerdo a la siguiente
figura.



(10mL)





(3 ml) (5 ml)













Figura 5. Procesamiento de las muestras

MUESTRA
Medir absorbancia
Centrifugacin
Filtrado
Paquete celular
Determinacin de
glucosa residual
Determinacin de
concentracin celular
usando la curva tipo
correspondiente
88
FORMULACIN DE RESULTADOS

- Determinar max, Yx
/s
(global) y R
x
(global) de Candida utilis en el cultivo por
lote.
- Para el cultivo alimentado elaborar las siguientes grficas (tericas y
experimentales):

o Concentracin celular (x) contra tiempo.
o Volumen de medio de cultivo alimentado (V) contra tiempo.
o Biomasa total (X) contra tiempo; donde X = xV.
o Glucosa residual (s) contra tiempo.
o Velocidad especfica de crecimiento () contra tiempo.

- Estimar los valores de la productividad celular global (Rx
global
) y el rendimiento
celular global con base al consumo de sustrato (Yx/s
global
) en el cultivo por lote
alimentado constantemente.
- Al final el alumno discutir los resultados obtenidos en la prctica y elaborar un
resumen de la prctica.



89
BIBLIOGRAFA

Dunn, I. J., Mor, J. R. (1975), Variable-volumen continuous cultivation en Biotechnol.
Bioeng., 17: 1805-1822.

Pirt, S. J. (1975), Principles of microbial and cell cultivation en Black Well Scientific
Publications, London.

Whitaker, A. (1980), Fed-batch culture en Process Biochem., 15:10-15.

Yaman, T., Hirano, S. (1977), Semibatch culture of microorganism with constant feed
ofsubstrate: A mathematical simulation, J. Ferment Technol. 55:156-165.


















ANEXO 4
90

Cultivo por lote alimentado constantemente
Flujo = 180 ml / hora

Cuadro 7. Resultados del cultivo por lote alimentado constantemente
Hora Tiempo
(h)
Volumen
Lquido
(L)
Concentracin celular
(por absorbancia)
Glucosa residual
No. de tubo As Dilucin g/L Tubo Lectura Dilucin g/L














Curva tipo de biomasa
pendiente (m) =
ordenada (b) =
Reunir todas las muestras y aplicar el
mtodo DNS, empleando dos
controles de 0.4 y 0.8 g/l de glucosa
0.4 g/l _________
0.8 g/l _________








ANEXO 5
91
FEEDBATCH LINEAL

ACTIVIDADES

1. Preparacin del medio de cultivo para el inoculo /esterilizacin /enfriamiento /
inoculacin de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
2. Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculacin con los matraces al fermentador / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
3. Preparacin del medio de cultivo para la alimentacin / esterilizacin en matraz
junto con las tuberas y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento / alimentacin
constante (a un flujo previamente determinado) del medio al fermentador.
4. Toma de muestras (cada hora) del cultivo alimentado / determinacin de
absorbancia / determinacin de peso seco / determinacin de glucosa residual.
5. Calibracin, previa, de la bomba peristltica para el flujo determinado
(preparacin de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta graduada, etctera).
92
PRCTICA 10

Pctica 10. Produccin de biomasa en cultivo continuo




Produccin de biomasa en
Cultivo continuo





INTRODUCCIN

El cultivo continuo simple etapa pertenece al grupo denominado Sistemas
Fermentativos Abiertos. En este sistema hay una entrada y salida de materiales:
suministro continuo de nutrientes y salida continua de biomasa, sustrato residual y
producto. Operativamente el flujo de entrada es igual al flujo de salida, por lo que el
volumen de operacin del biorreactor permanece constante durante todo el cultivo.

Fue en la dcada de los sesenta cuando se iniciaron los primeros estudios
experimentales y tericos acerca del cultivo continuo. En estos estudios se propuso la
Teora del Quimiostato, la cual, a grandes rasgos, establece que al trabajar un volumen
constante en cultivo continuo, y despus de un determinado tiempo (el necesario para
realizar dos o tres recambios del volumen de trabajo), ste alcanza un estado de
equilibrio dinmico donde las concentraciones de biomasa, sustrato residual y producto
93
permanecern constantes en el tiempo. Esta teora tambin predice que cuando se
cambien los flujos de alimentacin y remocin de caldo (los cuales a su vez deben ser
iguales entre s para mantener la condicin de volumen constante), el sistema se
alterar y finalmente alcanzar un nuevo equilibrio dinmico donde las concentraciones
de biomasa, sustrato residual y producto ya no variarn en el tiempo, pero sus valores
sern ms o menos los mismos independientemente de los flujos. Sin embargo,
tambin predice que cuando los flujos de trabajo son ms elevados que el valor de la
velocidad especfica mxima de crecimiento, el sistema se quedar sin clulas,
condicin conocida como lavado del fermentador, debido a que se ha rebasado la
capacidad del microorganismo para metabolizar los nutrientes que le son suministrados
a altas velocidades.

En un quimiostato (biorreactor de laboratorio operando en continuo), una vez que se ha
alcanzado el estado de equilibrio se crean ambientes constantes que permiten
mantener indefinidamente un determinado estado fisiolgico del microorganismo y en
este estado la velocidad especfica de crecimiento es constante y por ende lo son
tambin el resto de las velocidades especficas de consumo de sustrato, de produccin
del metabolito, de consumo de oxgeno y de generacin de calor.

As, uno de los principales usos del quimiostato es el de la caracterizacin cintica de la
produccin de metabolitos empleando un determinado microorganismo, en un
determinado medio de cultivo y en determinadas condiciones de cultivo.

Con todo lo anterior, en un cultivo continuo puede controlarse y mantenerse aquella
velocidad especfica de crecimiento donde el microorganismo produzca la mayor
cantidad de aquel metabolito que se desea obtener, siendo sta la principal
caracterstica por la que fueron diseados los sistemas de fermentacin continuos.




94

OBJETIVO

El alumno determinar los parmetros cinticos de Candida utilis creciendo en
condiciones ptimas en un cultivo continuo.

MATERIALES Y MTODOS

EQUIPO

- Autoclave (15 litros de capacidad).
- Bao metablico de temperatura controlada.
- Fermentador con panel de control (2 o 6 litros).
- Electrodo de pH esterilizable.
- Electrodo de oxgeno disuelto.
- Tres bombas peristlticas (0 a 2 l/h).
- Dos placas de calentamiento y agitacin.
- Espectrofotmetro (intervalo: 200 a 700 nm).
- Centrfuga clnica (0 a 5000 rpm).
- Balanza analtica (0 a 200 g de capacidad).
- Estufa con vaco.
- Equipo de filtracin con vaco.

MICROORGANISMO UTILIZADO: CANDIDA UTILIS

La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosa-
agar) a una temperatura de 4
0
C.
95
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Cuadro 8. Medios de cultivo

COMPONENTE
MEDIO PARA
EL INOCULO

(g/l)
MEDIO PARA
EL CULTIVO
POR LOTE (g/l)
MEDIO PARA
EL CULTIVO
CONTINUO (g/l)
Glucosa 15.0 15.0 20.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.73 2.73 1.82
NaH
2
PO
4
1.2637 1.2637 1.685
Extracto de levadura 0.990 0.990 1.32
* FeSO
4
7H
2
O
* CuSO
4
5H
2
O
* ZnSO
4
H
2
O
* Na
2
MoO
4
2H
2
O
* MnSO
4
H
2
O
Emplear agua de la llave

(*) Todas las sales estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en mL) a
emplear se calcula mediante la siguiente relacin:

V
sales
(ml) = 0.05 [conc. de glucosa (g/l)] [volumen medio (l)]
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).

MTODOS ANALTICOS

Determinacin de la concentracin celular

Procedimiento: el mismo de la Prctica 8.

Determinacin de azcares reductores (DNS)

Reactivos: los mismos de la Prctica 8.
96
Procedimiento: el mismo de la Prctica 8.

Curva tipo de glucosa: la misma de la Prctica 8.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PREPARACIN DEL INOCULO

Se preparan 200 ml de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 ml) con 100 ml de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in
2
durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5 ml del mismo medio sobre la cepa
en tubo de medio inclinado en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una
agitadora (110 golpes/minuto) a 35
0
C durante 18 horas.


CULTIVO POR LOTE

- Se preparan 900 ml de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH
a 4.0. El medio preparado se pasa al fermentador (previamente preparado este
ltimo) y se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in
2
, 15 minutos. Tambin se
esterilizan los recipientes que contienen el lcali y el antiespumante.

- El fermentador cargado con el medio estril se coloca en el sistema de agitacin,
venteo, agua de enfriamiento, etctera y despus se inocula con un matraz del
inoculo en condiciones aspticas: El cultivo por lote operar bajo las condiciones
descritas en el Cuadro 9.





97
Cuadro 9. Condiciones de cultivo
PARMETROS CONDICIONES
Velocidad de agitacin 500 rpm
Aireacin 1 vvm
Temperatura 35 C
pH (con NH
4
OH 2N) 3.8
Antiespumante Polipropilenglicol al 10%


Se tomarn muestras al inicio y al final del cultivo por lote y ste durar 12 horas. A las
muestras se les debe determinar concentracin celular por peso seco (por filtracin) y
sustrato residual por el mtodo del DNS.

CULTIVO CONTINUO

- Se preparan 3.0 litros de medio de cultivo para el cultivo continuo y se ajusta el
pH a 3.8. El medio se prepara en un recipiente que lo contenga totalmente, y se
esteriliza junto con mangueras y conexiones a 15 lb/in
2
durante 15 minutos. Esta
misma cantidad de medio de cultivo se prepara y esteriliza para cada velocidad
de dilucin.


- Previamente al paso anterior se calibra la bomba peristltica, que adicionar el
medio de cultivo, a un flujo de 0.1 l/h para la 1 velocidad de dilucin.

Para las restantes velocidades de dilucin (D) la bomba se calibrar a los
siguientes flujos:

D (h
-1
) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
F (L/h) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5


98
- Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del
recipiente que contiene el medio estril a la bomba, y al puerto de suministro del
fermentador en condiciones aspticas.

Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo
al fermentador. El fluido de salida se recibe en otro recipiente, el cual es marcado
con la hora a la cual se inici el suministro de medio (el fluido de salida sale a
travs del tubo capilar colocado previamente en el fermentador).

El cultivo continuo operar en todas las velocidades de dilucin bajo las mismas
condiciones de agitacin (500 rpm), aireacin (1 vvm), temperatura (35 C), pH
(3.8) y control de la espuma.

- Se recomienda que cinco minutos antes de terminar la adicin de todo el medio
de cultivo para la primera velocidad de dilucin, se tome muestra para la
determinacin de concentracin celular y glucosa residual.

Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilucin restantes.
Tambin se deben tomar 2 ml del medio alimentado para determinar la
concentracin de glucosa.

- Al finalizar la adicin de todo el medio del cultivo para la primera velocidad de
dilucin, se inicia inmediatamente la adicin del siguiente medio de cultivo
(preparado y esterilizado previamente) para la segunda velocidad de dilucin y al
segundo flujo de adicin. Esto mismo se repite para las velocidades de dilucin
restantes.

- En cada velocidad de dilucin tomar una pequea muestra para observarla al
microscopio y detectar cualquier contaminacin. Si esto ocurre, detener la
fermentacin y repetir la velocidad de dilucin que se estaba trabajando.

99
FORMULACIN DE RESULTADOS

- Determinar Y
x/s
(global) y R
x
(global) de Candida utilis en el cultivo por lote.
- Para el cultivo continuo elaborar lo siguiente:
o Tabular los valores de concentracin celular (x), glucosa residual (s),
rendimiento celular en base al consumo de sustrato (Y
x/s
), velocidad
especfica de consumo de sustrato (q
s
) y la productividad celular (R
x
) en
funcin de la velocidad de dilucin (D).
o Grfica de la concentracin celular (x) contra velocidad de dilucin (D).
o Grfica de la concentracin de glucosa residual (s) contra velocidad de
dilucin (D).
o Grfica de la productividad celular (R
x
) contra velocidad de dilucin (D).
o Grfica de la velocidad especfica de consumo de sustrato (qs) contra
velocidad de dilucin (D):
Obtencin de los valores de (m) y (Y
g
).
o Grfica de la velocidad especfica de consumo de oxgeno (qo2) contra
velocidad de dilucin (D).
Determinacin de (mo
s
) y (Yo
g
).
si AH
glucosa
= 3.74 k
cal
/g ; AH
celulas
= 5.61 k
cal
/g
o Grfica de la velocidad especfica de genracin de calor (qk) contra velocidad
de dilucin (D).
Determinacin de (mk) y (Y
kg
).
- Al final el alumno discutir los resultados obtenidos en la presente prctica y
elaborar un resumen de la presente prctica.

BIBLIOGRAFA

1. Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., et al. (1978), Fermentation and enzyme
technology, John Wiley and Sons.
2. Tempert, D. W. (1970), The continuous cultivation of micro-organisms. I. Theory of
the Chemostat. Methods in Microbiology. Vol. 2, Academic. Press.
100
3. Herbert, A., Elsworth, F., Telling, H. (1956), The continuous culture of bacteria; a
theoretical and experimental study, Journal of Microbiology, 14: 601-622.





ANEXO 7
CULTIVO CONTINUO

ACTIVIDADES

Preparacin del medio de cultivo para el inoculo / esterilizacin / enfriamiento /
inoculacin de los matraces con la cepa en tubo inclinado.
Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
fermentador / esterilizacin del fermentador con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculacin con los matraces a el fermentador / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
Preparacin del medio de cultivo para cada velocidad de dilucin / esterilizacin
en matraz junto con las tuberas y medidor (pipeta) de flujo / enfriamiento /
alimentacin (a un flujo previamente determinado) del medio al fermentador.
Toma de muestras, 10 minutos antes de terminar la correspondiente velocidad
de dilucin / determinacin de absorbancia / determinacin de peso seco /
determinacin de glucosa residual.
Calibracin, previa, de la bomba peristltica para el flujo determinado para cada
velocidad de dilucin (preparacin de las mangueras, conexiones, pinzas, pipeta
graduada, etctera).