TRINGULO DEL DIAGNSTICO PACIENTE

MDICO MDICO CLNICO PATLOGO

MTODOS DIAGNOSTICOS ESPECIALES EN PATOLOGA Avances mdicos en el rea de patologa Inmunofluorescencia directa Inmunohistoqumica Citometra de flujo Patologa molecular

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA Anticuerpo primario marcado con fluorescena (C3, C4, C1q, IgM, IgG, IgA) Antgeno celular Microscopio de fluorescencia.

INMUNOHISTOQUMICA La inmunohistoqumica es un mtodo que utiliza anticuerpos seleccionados para identificar antgenos especficos En el laboratorio se unen el anticuerpo con el antgeno en combinacin con un marcador visual. En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio

(color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o protena A.

FUNDAMENTOS DE LA INMUNOHISTOQUMICA UTILIDAD PASOS BSICOS Desparafinar Hidratar Bloquear la actividad de peroxidasa endgena Protena bloqueadora Reaccin con anticuerpo primario Poner a reaccionar con anticuerpo secundario biotilinado Colocar complejo estreptavidinaperoxidasa Colocacin del cromgeno Tincin de contraste Deshidratar, aclarar y montar La disponibilidad de anticuerpos monoclonales ha facilitado enormemente la identificacin de productos celulares y de marcadores superficie.

DIAGNSTICO DIFERENCIAL EN PATOLOGA ONCOLGICA TIPIFICACIN DE AGENTES INFECCIOSOS FACTORES PRONOSTICOS Y PREDICTIVOS

INMUNOHISTOQUIMICA APLICACIONES

TOXOPLASMOSIS HELICOBACTER PYLORI PNEUMOCYSTIS CARINII CITOMEGALOVIRUS HERPES VIRUS DE EPSTEIN-BARR HEPATITIS B

TIPIFICACIN DE AGENTES INFECCIOSOS

CLASIFICACIN DE NEOPLASIAS INDIFERENCIADAS

DIAGNOSTICO DIFERENCIAL EN PATOLOGA ONCOLGICA

METASTASIS DE ORIGEN DESCONOCIDO CLASIFICACIN DE TUMORES DE TEJIDOS BLANDOS INMUNOFENOTIPO DE LINFOMAS ETC.

FACTORES PRONSTICOS Y PREDICTIVOS

CARCINOMA DE MAMA CARCINOMA DE COLON CARCINOMA DE VEJIGA URINARIA CARCINOMA DE PROSTATA GIST

CITOMETRIA DE FLUJO Se utiliza para medir: Tamao de la clula Complejidad de la membrana Cantidad de DNA de la clula Ploidia y aneuploidia Proliferacin celular Clasificacin de Leucemias y Linfomas

PATOLOGA MOLECULAR Se utiliza: Dx de neoplasias malignas. Neoplasias hematotopoyticas asociadas a translocaciones especficas. Pronostico de neoplasias malignas Deteccin de enfermedad mnima residual.

Dx de la predisposicin hereditaria de cncer Anlisis de micromatrices de DNA y protemica. TCNICAS DE ANLISIS DE DNA DIAGNOSTICAS Southern Blott (SBH) Northern Blott Hibridizacin in situ (FISH) PCR (reaccin en cadena de polimerasa) o Amplificacin Secuencia

1. 2. 3. 4. 5.

SOUTHERN BLOTT Para la deteccin de genes especficos en el ADN celular. El ADN problema es digerido por una endonucleasa de restriccin Los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis Se transfieren los fragmentos de ADN a un gel Se incuba posteriormente con una sonda marcada que hibrida los fragmentos de ADN que contiene la secuencia complementaria. Los fragmentos se visualizan tras la exposicin del filtro a una pelcula radiogrfica.

NORTHERN BLOTT Variante de la tcnica de tranferencia de Southern. Deteccin de ARN en vez de ADN. La totalidad del ARN celular es extrada y fraccionada por electroforesis de gel. Los ARN se transfieren a un filtro y se detectan por hibridacin con una sonda radioactiva. (Similar al Southern)

HIBRIDACIN IN SITU (FISH) El mtodo de hibridacin In Situ por fluorescencia se basa en la deteccin y localizacin de secuencia especficas de ADN o ARN dentro de las clulas de los tejidos. Consiste en colocar la sonda directamente sobre el espcimen que tiene la secuencia del ADN inmovilizada. El tejido es tratado con una enzima que permite el acceso de la sonda al ADN nuclear, el que ha sido previamente desnaturalizado por calor. La sonda se agrega para la hibridacin y esta ocurre si est presente el ADN blanco complementario de la sonda. La sonda viene ligada a una sustancia fluorescente, que es observada mediante microscopio de fluorescencia.

HIBRIDIZACIN DEL ADN la hibridizacin permite la localiacin de ciertas secuencias de ADN in situ (FISH)

PCR (REACCIN EN CADENA DE POLIMERASA) Es un mtodo para conseguir un gran nmero de fragmentos de material gentico a partir de una copia de ADN. Una molcula de ADN sometida a 30 ciclos de amplificacin da mil millones de copias. Esta tcnica consiste en crear copias adicionales de la secuencia deseada o segmento especifico de ADN. Se realiza a travs de ciclos repetidos de desnaturalizacin, hibridacin y extensin. PASO 1 Desnaturalizacin con calor para abrir las hebras de ADN y permitir hibridizacin con oligonultidos (primer) (secuencia corta de pares de bases) iniciadores especficos. PASO 2 La temperatura controla la tasa de fijacin A 55C, bajo la condiciones forman uniones de hidrgeno con el molde de ADN PASO 3 Gracias a la estabilidad de la polimerasa aislada de bacterias que viven a altas temperaturas, la extensin se hace a una temperatura mayor a la de la fijacin, asegurando especificidad.

RESULTADO La secuencia entre los oligonuclotidos es copiada exponencialmente.

INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS Antgeno comn leucocitario (linfomas) Melan A-HMB45 (melanoma) Citoqueratinas (pancitoqueratinas) y antgeno de membrana epitelial (carcinomas) CD99 (MYC2) (tumor neuroectodermico primitivo) Cromogranina-sinaptofisina (tumores neuroendocrinos) Vimentina (sarcomas) Protena acido glial fibrilar (gliomas)

INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS Antgeno comn leucocitario CD45 (linfomas) CD20 (clulas B) CD3 (clulas T) CD4 CD8 CD30 (HODGKIN) CD15 (HODGKIN) Otros CD

INMUNOHISTOQUIMICA E NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS Melanoma -HMB45 -MELAN A -S 100 -VIMENTINA Citoqueratinas (pancitoqueratinas) y antgeno de membrana epitelial (carcinomas) -CITOQUERATINA 20 -CITOQUERATINA 7 *negativo para los dos anticuerpos (carcinoma renal) *positivo para citoqueratina 20 (cncer de colon) *positivo para citoqueratina 7 (cncer de pulmn) * positivo para ambas (cncer de estomago) CD99 (MYC2) (TUMOR NEUROECTODERMICO PRIMITIVO) Cromogranina sinaptofisina (tumores neuroendcrinos). -CARCINOIDES -PARAGANGLIOMAS -CARCINOMAS NEUROENDOCRINOS Tumores del estroma gastrointestinal (GIST) CD117 (c-Kit) Vimentina (sarcomas) -TUMORES DE MUSCULO LISO *DESMINA *ACTINA DE MUSCULO LISO -TUMORES DE MUSCULO ESTRIADO *DESMINA *MIOGENINA *MYO D1