Micologia Clinica Prova II PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS PARA DIAGNSTICO DAS MICOSES Microscopia do material O exame direto a primeira etapa

a do diagnstico laboratorial micolgico, indicando, na maioria das vezes, se o material examinado contm ou no estruturas fngicas. A escolha da tcnica depende do espcime que se quer analisar.

Escamas de pele, plos, cabelos e unhas: sobre uma lamina de microscopia, limpa, coloca-se de 1 a 2 gotas de uma soluo clarificante (KOH) e, sobre esta, a amostra a ser analisada. Cobre-se o material com uma lamnula e aguarda-se um intervalo de 5 a 10 minutos, ou at que a substancia clarificante desempenhe sua funo. Para amostras de plos e cabelos importante dar preferncia aos plos tonsurados. Em amostras de unha, quanto mais fino for o fragmento, melhor ser a visualizao dos elementos fngicos (dimetro aproximado de um fio de cabelo); Mucosas, orifcios naturais e secrees diversas: um dos swabs usados na coleta usado para a confeco de um esfregao, que ser corado pela pratametenamina e, com o material restante do mesmo swab, ser feita uma preparao do tipo lmina-lamnula, com KOH. Dessa forma, a presena de fungos demceos na leso poder ser facilmente evidenciada; Bipsias de tecidos ou rgos: no macerar; deve ser cortada em pequenos fragmentos, tanto para observao microscpica direta como para semeadura. Para a observao microscpica direta, os fragmentos devem apresentar espessura razovel, a fim de que esta no prejudique a transiluminao e, consequentemente, a observao microscpica; Sangue perifrico e medula ssea: quando a amostra j vem semeada m meio lquido, uma pequena alquota dessa cultura retirada e centrifugada. O sobrenadante desprezado e, com o sedimento, so preparados dois esfregaos, sendo um corado pela prata-metenamina e o outro pelo Giemsa. Nas amostras que vierem em seringas heparinizadas ou com outro anticoagulante, as laminas sero confeccionadas diretamente do material, sem a necessidade de centrifugao; Lquor: deve ser imediatamente centrifugado por 10 minutos; o sobrenadante deve ser armazenado. Com o auxilio de uma ala de platina ou de uma pipeta de Pasteur, coloca-se uma pequena quantidade do sedimento sobre uma lmina. So adicionadas 2 gotas de tinta da China (nanquim), seguindo-se homogeneizao da preparao e cobertura com uma lamnula. Essa tcnica permite a perfeita visualizao de cpsulas de Cryptococcus sp., um dos fungos mais frequentemente encontrados nesse tipo de material. Alm dessa lmina, deve ser feita outra, com o sedimento apenas coberto por uma lamnula que se presta para a visualizao de fungos demceos; tambm deve ser feita outra corada pela prata-metenamina; Urina: tambm deve ser centrifugada durante 10 minutos. O sobrenadante desprezado e uma lamina preparada com o sedimento do material, sem necessidade de utilizar qualquer substancia diluente ou clarificante;

Fezes: normalmente leveduras. Uma pequena alquota de fezes homogeneizada em 1-2 gotas de KOH e coberta com uma lamnula, ou realiza-se um esfregao corado pelo mtodo de Gram; Escarro: so preparadas trs lminas, sendo uma com KOH e dois esfregaos, sendo um corado pela prata-metenamina e outro pelo Giemsa; Pus e lquidos patolgicos: as lminas devem ser preparadas misturando-se uma gota do material com 1-2 gotas de KOH e cobrindo-se com uma lamnula. Tambm deve ser feito um esfregao pela colorao prata-metenamina.

Semeadura e tempo de observao dos isolamentos primrios A cultura absolutamente necessria para o isolamento e identificao dos fungos. Entende-se por isolamento primrio a capacidade que os microrganismos apresentam de crescer, a partir do material clnico, em um meio de cultura basal. Hoje se utiliza, na grande maioria dos isolamentos de fungos, o meio basal de Saboraud; este pode ser acrescido de antibitico, com a finalidade de inibir o crescimento de bactrias que, porventura, estejam contaminando o material clinico. Escamas de pele, plos, cabelos e unhas: utilizado o gar Saboraud; quando houver suspeita de ptirase versicolor, as escamas sero semeadas em gar Saboraud acrescido de leo de oliva ou no meio de Dixon. Com o auxilio do garfo, inoculam-se, na profundidade do meio, pequenas quantidades do material, em trs locais equidistantes do tubo contendo o gar. Na suspeita de crescimento de dermatfitos, o meio deve ser incubado a temperatura ambiente por um prazo mximo de 15 dias, com observao diria comeando no terceiro dia da semeadura. J na suspeita clinica de ptirase ou candidase, os meios devem ser incubados por at 5 dias, com observao diria comeando no segundo dia de incubao. As amostras semeadas em gar Saboraud acrescido de leo de oliva ou em meio de Dixon, devem ser incubadas temperatura de 32 C, pois esta a temperatura considerada mais adequada para o crescimento das diferentes espcies de Malassezia spp. Mucosas, orifcios naturais e secrees diversas: meio gar Saboraud ou, quando a pesquisa direta indicar a possvel existncia de leveduras, o material deve ser semeado contendo CHROMagar Candida, o qual vai facilitar a evidenciao de infeces mistas por leveduras. Com o swab sero feitos pequenos movimentos rotacionais na superfcie dos meios Saboraud e em uma extremidade da superfcie do CHROMagar Candida; em seguida, o material semeado em toda a superfcie do meio, com o auxilio de uma ala de platina. Na suspeita de crescimento de leveduras, o meio deve ser incubado a temperatura ambiente, por um prazo mximo de 72h e com observaes dirias. J na suspeita clinica de fungos filamentosos ou dimrficos, os meios devem ser incubados at 30 dias, com observao diria comeando no quinto dia de incubao. Biopsia de tecidos ou rgos: meio gar Saboraud; o meio gar Saboraud com brain heart infusion (SABHI) s deve ser utilizado na suspeita clinica de histoplasmose e/ou paracoccidioidomicose. Com o auxilio de um garfo, semeiam-se pequenos fragmentos da biopsia na profundidade do meio, em trs pontos distintos e equidistantes. 24 a 72h para leveduras e at 30 dias para fungos filamentosos ou dimrficos.

Sangue perifrico e medula ssea: em gar Saboraud simples ou com SABHI, semeia-se na superfcie, com o auxilio de uma ala de platina ou uma pipeta e Pasteur, uma alquota equivalente a aproximadamente 0,1mL em cada tubo. Lquor: no utilizar gar Saboraud com cicloeximida, pois este no permite o crescimento de Cryptococcus spp. Aps centrifugao do material para confeco das laminas, toma-se uma alquota do sedimento com ala de platina o pipeta de Pasteur e inocula-se, na superfcie do meio, o equivalente a cerca de 0,1mL em cada tubo. Na suspeita de crescimento de Cryptococcus spp. ou outra levedura, o meio deve ser incubado a temperatura ambiente por um prazo mximo de 10 dias, com observao diria aps o segundo dia da semeadura. Na suspeita clinica de fungos filamentosos ou dimrficos, os meios devem ser incubados tambm a temperatura ambiente por at 30 dias, com observao diria comeando no quinto dia de inoculao. Urina: em suspeita de leveduras utilizar CHROMagar Candida em placa; com o auxilio de uma ala, faz-se uma estria ao longo do dimetro da placa e, em seguida, com movimentos em zigue-zague, cruza-se essa primeira estria, distribuindo a urina de forma homognea sobre a placa. Dessa forma, possvel quantificar o numero de colnias de leveduras. Em suspeita de fungos filamentosos ou dimrficos utilizar gar Saboraud simples ou SABHI; a tcnica preconizada a mesma do lquor. Fezes: gar Saboraud com cloranfenicol ou gentamicina ou CHROMagar Candida em placa. O material dever ser semeado com o auxilio de uma ala de platina, espalhando apenas uma pequena alquota da amostra na superfcie do meio. No se utiliza meio isento de antibacteriano, visto que a populao desses microrganismos exuberante nesse tipo de espcime clinico e, fatalmente, a competio pelos substratos orgnicos entre as leveduras e as bactrias levaria ao no crescimento fngico. O material deve ser incubado a temperatura ambiente por um prazo mximo de 72h, com observaes dirias. Escarro: meios idem lquor. Antes da semeadura, podem passar por tcnicas que visam ao enriquecimento do material, facilitando o isolamento de fungos patognicos. Toma-se uma alquota do material com ala de platina e, aps escolha de regies do material que se apresentam mucopurulentas, inocula-se, na superfcie do meio, o equivalente a 0,1mL em cada tubo. Para leveduras incubase por at 72h, exceto Cryptococcus spp., que se deve esperar por at 10 dias, enquanto para fungo filamentosos e dimrficos, por at 30 dias. Pus e lquidos patolgicos: forma padro com ala de platina.

Blastocondio = levedura. ASPECTOS GERAIS DE FUNGOS FILAMENTOSOS E DIMRFICOS NA APRESENTAO FILAMENTOSA Na observao das caractersticas culturais de determinado microrganismo, devemos ressaltar o tamanho da colnia, caractersticas das bordas, textura, relevo e pigmentao. O estudo micromorfolgico feito, na maioria das vezes, a partir do isolamento primrio, utilizando-se uma pequena alquota da colnia retirada da cultura e montada entre lamina e lamnula com uma gota de tinta Parker. Essa montagem observada em objetiva de 40x. Nessas preparaes podem ser visualizadas estruturas de reproduo, bem como estruturas de ornamentao.

Entretanto, nem sempre essas estruturas se fazem presentes no meio Saboraud, que convencionalmente utilizado. Outro mtodo utilizado com a finalidade de evidenciar, com o mnimo de deteriorao, o arranjo das estruturas de frutificao e ornamentao denominado de microcultivo. Na primeira etapa, devem ser preparadas placas de Petri contendo uma lamina apoiada sobre um suporte. Essa lamina deve ficar ajustada placa de modo que o suporte no deslize com movimentos. Com uma lamina de bisturi, retiram-se de uma placa contendo gar-batata, blocos retangulares de meio de cultivo. Esses blocos devem ser dispostos de forma assptica sobre a lamina que se encontra acondicionada na placa de Petri. Aps, toma-se a colnia em estudo e fazem-se 4 repiques desta, nas quatro faces do retngulo de gar-batata, que ser posteriormente coberto com uma lamina estril. Montada a cultura, coloca-se 1mL de gua destilada estril dentro da placa, tendo cuidado para a gua no molhar a lamina que contm o bloco de meio de cultura. A funo bsica da gua evitar a dessecao do meio antes de se evidenciar o crescimento fngico, com seu arranjo caracterstico. Essa placa incubada temperatura ambiente at o aparecimento visual evidente do crescimento fngico sobre a lamnula. Para a observao final, coloca-se uma gota de corante sobre uma lamina e retira-se a lamnula que est cobrindo o microcultivo, utilizando-a para cobrir a lamina que est com o corante. LEVEDURAS: IDENTIFICAO LABORATORIAL As leveduras geralmente crescem bem dentro de 48h, sob temperatura entre 25 e 37 C, em meios micolgicos e bacteriolgicos comuns, incluindo gar-sangue, gar Saboraud dextrose (ASD), BHI, alm de outros. A maioria das leveduras produz colnias glabras, de colorao branca ou bege, textura cremosa e superfcie lisa. Os mtodos de identificao das leveduras so diferentes daqueles utilizados para fungos filamentosos. Em relao s caractersticas morfolgicas, consideram-se aspectos macroscpicos da colnia e microscpicos da levedura. Presena de cpsula, ascos, blastocondeos, clamidocondeos, artrocondeos, hifas, pseudo-hifas e formao de tubo germinativo deve ser pesquisada atravs de metodologia especfica, e no pela simples observao do isolamento primrio. Prova do tubo germinativo O tubo germinativo uma projeo alongada, que emerge da levedura, quando esta entra em contato com soro humano ou de outros animais, temperatura de 37 C, durante 2 a 3h. 1. Com o auxilio de uma ala de platina esterilizada, retira-se pequena alquota de uma colnia de levedura, submetida a crescimento prvio de 24 a 48h; 2. Inocula-se a levedura em um tubo contendo 0,5 a 1,0mL de soro estril humano, de coelho, cavalo, carneiro ou albumina srica; 3. Incuba-se a suspenso a 37 C durante 2 a 3h; 4. Remove-se, com auxilio de uma pipeta de Pasteur, uma gota da suspenso e monta-se uma preparao do tipo lamina-lamnula; 5. Examina-se a preparao ao microscpio ptico, com objetivas de 10 e 40x.

NO CONFUDIR COM PSEUDO-HIFA: o tubo germinativo asseptado, com lados paralelos, e no h constrio no ponto de insero entre a estrutura da parede celular da projeo crescente e o blastocondio. A pseudo-hifa pode ser septada ou no, tem lados no necessariamente paralelos e apresenta constrio no ponto de insero entre a estrutura da parede celular da projeo crescente e o blastocondio.

Assimilao de carboidratos A assimilao de carboidratos a habilidade que uma levedura tem de crescer aerobiamente na presena de determinado carboidrato fornecido como nica fonte de energia. Pode-se utilizar como fontes de carbono dextrose, maltose, sacarose, e outro se necessrio. Emprega-se meio gar destitudo de qualquer fonte de carboidrato, adicionado da suspenso da levedura e distribudo em placa. Aps a solidificao, so aliquotados os carboidratos sobre o gar. Alternativamente, podem-se utilizar discos de papel filtro impregnados com os diferentes carboidratos. A positividade avaliada atravs da observao de halo de crescimento da levedura em presena do carboidrato fornecido. Assimilao de nitrognio A assimilao de nitrognio a habilidade que uma levedura tem de crescer aerobiamente na presena de um composto nitrogenado fornecido como nica fonte de energia. Geralmente empregam-se a peptona e o nitrato de potssio como fontes de nitrognio, mas outros compostos podem ser utilizados. Emprega meio gar destitudo de qualquer fonte de nitrognio, adicionado da suspenso de levedura e distribudo em placa. Aps a solidificao, so aliquotados compostos nitrogenados sobre o gar. A positividade avaliada atravs do crescimento da levedura em presena do composto nitrogenado fornecido. Fermentao de carboidratos Fermentao de carboidratos a habilidade que uma levedura tem de crescer anaerobiamente na presena de determinado acar fornecido como nica fonte de energia, observada atravs da produo de gs carbnico e alterao de pH. A prova realizada inoculando-se suspenso da levedura em tubo de ensaio contendo meio de cultura, soluo do acar desejado a 2% e um tubo de Durham invertido. A

positividade observada atravs da produo de gs no interior do tubo de Durham e da mudana da colorao do meio, quando se utiliza um indicador de pH. CHROMagar: seu principio a produo de cor nas colnias por reaes enzimticas espcie-especificas, com um substrato cromognico do meio. DIAGNSTICO LABORATORIAL MICOSES SUPERFICIAIS E CUTNEAS Ptirase versicolor Malassezia furfur. realizado pelo exame micolgico direto com KOH/tinta Parker. O parasito apresenta-se sob a forma de elemento arredondado, ou mais ou menos quadrangular, caracteristicamente aglomerado em nmero varivel de 5 a mais de 30 elementos. Esses agrupamentos apresentam-se em vrios pontos de campo microscpico. Ao lado dessas formas agrupadas, podemos ver uma quantidade varivel de hifas curtas, retas ou curvas, podendo chegar a mais de 10m de comprimento. Algumas vezes, h predominncia absoluta destas hifas em relao s formas arredondadas. A cultura no feita para fins diagnsticos, mesmo porque o cultivo do agente etiolgico difcil. Sabe-se que o parasito exige substncias oleosas nos meios de cultivo.

Piedra negra Piedraia hortae. realizado o exame micolgico direto e a cultura. Micolgico direto: pega-se o ndulo do fio de cabelo, macera-o e coloca-o entre lamina e lamnula. Possuem ascos (espaos claros) com esporos em seu interior.

Cultura: cresce como uma colnia escura, preto- esverdeada, podendo ser elevada ou achatada na parte central (colnia cerebriforme). Fungo filamentoso com crescimento lento. Microscopicamente, mostra hifas escuras, de paredes espessas, muito septadas, vrios elementos arredondados, lembrando clamidocondios.

Piedra branca Trichosporon beigelii. Esses ndulos so mais moles que os da piedra negra. Micolgico direto: hifas e artrocondeos (pedaos de hifas) ovais e blastocondeos. No possuem ascos. Cultura: ao primeiro isolamento, aparece bem no terceiro dia, como colnias de aspecto cerebriformes, cobrindo-se com uma camada de hifas esbranquiadas. Com o tempo, dois meses depois, a superfcie toma uma colorao amareloacastanhada, perdendo, naturalmente, o brilho inicial. Microscopicamente, apresenta o aspecto geral caracterstico do gnero Trichosporon, isto , presena de hifas septadas, que se transformam em artrocondios, estes apresentando capacidade de gemulao.

Tinea nigra Phaecannelomyces werneki. Micolgico direto: revela imediatamente hifas mais ou menos escuras, septadas, sinuosas. Pode-se observar, tambm, elementos arredondados, gemulantes, tendo at 5m no maior dimetro.

Cultura: as colnias aparecem, principalmente, como pontos negros, brilhantes, como se fossem leveduras negras. Em poucos dias, recobrem-se de hifas verdesolivceas. Fazendo-se preparado microscpico, podemos observar as hifas septadas escuras, tendo at 5m de dimetro. Os condios uni ou bicelulares nascem diretamente das hifas por gemulao, ou ento, por meio de espculo. Observamse, tambm, pequenos conidiforos com anis na extremidade onde se implantam os condios (anelocondios). As culturas velhas quase no produzem condios.

Candidoses ou leveduroses As colnias de Candida so leveduriformes, de crescimento rpido, consistncia mole e lisa (semelhante um pingo de vela) de cor branca ou creme. O que ir diferenciar as vrias espcies de Candida a microscopia. O microcultivo obrigatrio.

Candida albicans Apresentam hifas ou pseudo-hifas. Clamidocondios (estruturas de resistncia do fungo) sempre na extremidade da hifa.

Candida glabrata No possuem hifas ou clamidocondios. Aparece como uma massa de clulas leveduriformes.

Candida parapsiloris Apresentam hifas ou pseudo-hifas curvas ou largas. Os blastocondeos so pequenos e localizados ao longo das hifas.

Candida guilliermondii As hifas e pseudo-hifas so escassas. Os blastocondeos so pequenos e podem estar prximos ou no das hifas.

Candida tropicallis Apresentam hifas e pseudo-hifas. Os blastocondeos so grandes e solitrios.

gar cromognico:

Infeces oportunistas Aspergillus

Micolgico direto: possui hifas hialinas septadas formando um ngulo de 45.

Cultura: colnia filamentosa, pulverulenta. A cor varia de acordo com a espcie. Na microscopia importante verificar um conidiforo longo com vesculas globosas na extremidade. A vescula globosa tambm varia com a espcie. 1. A. niger: Preto.

2. A. flavus: Amarelada.

3. A. fumigatos: cinza-esverdeado.

Penicillium Micolgico direto: apresenta hifas hialinas septadas.

Cultura: essencial. A colnia do Penicillium muito caracterstica e de crescimento rpido. aveludada, branca e torna-se esverdeada com o passar do tempo. No exame microscpico, verificam-se conidiforos perpendiculares subdivididos em ramos (parecendo um pincel).

Alternaria:

Micolgico direto: apresenta hifas septadas demceas.

Cultura: um fungo filamentoso de crescimento rpido. Apresenta colorao de cinza-claro a marrom. Apresenta uma consistncia aveludada mais grosseira. Ao exame microscpico apresenta macrocondios com septos transversais e horizontais.

Scopulariopses

Micolgico direto: apresenta hifas hialinas septadas.

Cultura: um fungo filamentoso de crescimento lento. A colnia possui uma colorao branca que evolui para avel. Possui uma consistncia aveludada. No exame microscpico, pode-se observar condios.

DIAGNSTICO LABORATORIAL DERMATFITOS TODOS os dermatfitos possuem hifas hialinas septadas ao exame microscpico direto. O que diferencia a produo ou no de microcondios e macrocondios, bem como a estruturas destes. Trichophyton T. rubrum: O crescimento varia de rpido a lento. Apresenta uma colnia algodonosa, elevada e de colorao, produzindo um pigmento vermelho (no reverso da colnia). Durante o exame microscpico, podem-se observar hifas hialinas septadas com muitos microcondios em forma de lgrima, ao longo das hifas. Eventualmente, aparecem macrocondios de parede lisa em forma de lpis (muito raro).

T. mentagropytes Apresenta uma colnia pulverulenta com uma elevao central e radiada. Possui colorao de branca a bege, com o reverso de marrom-claro a amarelo. Ao exame microscpico podem se observar numerosos microcondios arredondados de paredes finas, isolados ou em cachos. Os macrocondios so raros, septados e em forma de charuto. O que caracteriza esta espcie a presena de hifas espiraladas (ou gavinhas).

T. tonsurans A colnia pode ser aveludada ou pulverulenta. Possui um aspecto de cera de vela, com colorao de branca a amarelo claro. No exame microscpico podem ser observados numeroso microcondios em forma de balo, dispostos lateralmente nas hifas. Os macrocondio possuem uma parede grossa, porm so raros. Podem-se obsevar clamidocondios intercelulares ou terminais (so raros).

 T. shoenleinii A colnia apresenta uma superfcie elevada com aspecto de cera. Ao exame microscpico no se observa nenhuma estrutura, apenas um candelabro fvico formado por hifas bifurcadas.

T. violaceum Colnia aveludada de colorao branca a avermelhada com o reverso branco. No exame microscpico, apresenta ausncia de macro ou microcondios; culturas velhas podem apresentar clamidocondios. Possuem hifas largas e tortuosas.

Microsporum M. canis A colnia possui uma franja amarela e tipicamente estrelada, de colorao branca com o reverso amarelo gema de ovo. No exame microscpico, apresenta nmeros macrocondios multisseptados, de parede grossa e rugosa, com 6 a 15 clulas internas e possuem uma ponta afilada. Apresentam microcondios piriformes em pequena quantidade.

M. gypseum

Apresentam uma colnia plana e pulverulenta de colorao marrom-canela. Ao exame microscpico, podemos observar inmeros macrocondios de forma elipsoide e de parede delgada e rugosa, com 4 a 6 clulas internas. Os microcondios possuem forma de clava e aparecem em pequena quantidade.

Epidermophytom E. floccosum Possui colnia granulosa ou algodonosa, com centro elevado de cor branca a verdeamarelada. No exame microscpico, apresentam numerosos macrocondios de parede lisa, depositados em cachos que crescem diretamente das hifas e possuem de 2 a 4 clulas internas. Os microcondios so ausentes.

Testes complementares No teste da urease, o T. mentagrophytes apresenta resultado positivo, enquanto que o T. rubrum apresenta resultado negativo. J no teste de perfurao de pelo, o T. mentagrophytes penetra no pelo, enquanto que o T. rubrum no.