El estevisido y sus compuestos relacionados: Los beneficios teraputicos ms all de la dulzura

Varanuj Chatsudthipong, Chatchai Muanprasat

Department of Physiology, Faculty of Science, Mahidol University, Rama 6 Road, Bangkok 10400, Thailand

Fuente: Pharmacology & Therapeutics 121 (2009) 4154

RESUMEN
El Steviosido, un componente abundante de la hoja de Stevia rebaudiana, se ha hecho famoso por su intenso dulzor (250-300 veces ms dulce que la sacarosa) y est siendo usado como un dulcificante no calrico en diferentes pases. Varios estudios han sugerido que, adems del dulzor, el steviosido junto con sus compuestos relacionados, entre los que se incluyen rebaudiosido (el segundo componente ms abundante de la hoja de S. rebaudiana), steviol e isosteviol (componentes metablicos del steviosido) tambin ofrecen benecios teraputicos, debido a que contienen antihiperglicemicos, anti-hipertensivos, anti-inammatorios, antitumorales, anti-diarreicos, diurticos, y acciones inmunomoduladoras. Cabe resaltar que sus efectos a nivel de la glucosa en el plasma y tensin arterial slo son observados cuando estos parmetros son ms altos de lo normal. Puesto que el steviol puede actuar como transportadores de molculas, se propone como un modulador de frmacos. Este artculo resume el conocimiento comn de las acciones farmacolgicas, aplicaciones teraputicas, farmacocintica y seguridad del steviosido y sus compuestos relacionados con l. Aunque la mayora del progreso ha sido realizado acerca de sus efectos biolgicos y farmacolgicos, preguntas acerca de la pureza qumica y la seguridad permanecen no resueltas. Estas cuestiones son tratadas aqu con la intencin de ayudar a dirigir futuras investigaciones.

1. Introduccin 1.1. Fuente natural

Los dulcificantes naturales que pueden substituir a la sacarosa han obtenido una gran atencin debido al creciente aumento de la obesidad y la diabetes. Mucha de esta atencin se ha centrado en el steviosido, un glicosido dulce extrado de Stevia rebaudiana Bertoni. Esta planta es un pequeo arbusto originariamente cultivado en Sudamrica, en particular en Brasil y Paraguay donde es conocido como Stevia u hoja de miel, Kaa-he-e (Hanson & De Oliveira, 1993). Los nativos de Sudamrica han estado usando extracto de stevia como dulcificante y medicina tradicional durante varios cientos aos (Kinghorn & Soejarto, 2002). Debido al dulzor y a las supuestas propiedades teraputicas de la su hoja, S. rebaudiana Bertoni ha atrado intereses econmicos y cientficos. Japn fue el primer pas en Asia en comerciar con el steviosido como un dulcificante en la comida y en la industria de los medicamentos. Desde entonces, el de esta planta se ha expandido a varios pases en Asia, entre los que se incluyen China, Malasia, Singapur, Corea del Sur, Taiwn, y Tailandia. Tambin ha sido cultivado con xito en los Estados Unidos de Amrica, Canad, y Europa (Brandle et al., 2000). El uso de stos compuestos edulcorantes ha aumentado drsticamente debido a los

problemas de salud relacionados con uso de la sacarosa, como son la caries dental, la obesidad y la diabetes.

1.2.

Estructura qumica y propiedad de dulzor

El steviosido es un glicsidos diterpnico, comprendiendo una aglycona de steviol y tres molculas de glucosa. Adems de steviosido, varios compuestos dulces, como el steviobiosido, rebaudiosido A, El B, C, D, E y el dulcosido A han sido aislados de la hoja S. rebaudiana Bertoni. Todos stos glicsidos diterpnicos aislados, tienen las misma estructura vertebradora (steviol) pero se diferencian en las cadenas de hidrato de carbono en las posiciones C13 y C19 (Shibata et al., 1995). Los componentes principales de la hoja son el steviosido (el 5-10 % del peso seco total), el rebaudiosido A (El 2-4 %), el rebaudiosido C (el 1-2 %) y dulcosido (el 0.4-0.7 %) (Madera et al., 1955). Las estructuras qumicas de steviosido y sus componentes relacionados incluidos el steviol, el rebaudiosido A, isosteviol y dihy-droisosteviol se muestran en Fig. 1.

Steviosido

Rebaudiosido A

Steviol

Isoesteviol

Dihidroisosteviol

El dulzor de estos glicosidos comparado con la sacarosa es: dulcosido un 50-120, rebaudiosido A un 250-450, rebaudiosido B 300-350, rebaudiosido C 50-120, rebaudiosido D 250-450, rebaudiosido E 150-300, steviobiosido 100-125, y steviosido 300 (Crammer & Ikan,1986). El steviosido es hidrolizado por bacterias en el tracto gastrointestinal para ceder steviol y glucosa (Wingard et al., 1980; Hutapea et al., 1997; Koyama et al., 2003a). Junto con el dulzor, el steviosido posee un poco de amargura y regusto indeseable (Jakinovich et al., 1990). Sin embargo, este problema puede ser solucionado por modificacin enzimtica del steviosido mediante pullanase, isomaltase (Lobov et al., 1991), galactosi- aturdimiento (Kitahata et al., 1989), o dextrina saccharase (Yamamoto et al.,1994). Se considera al Steviosido como un sustituto del azcar y como un dulcificante comercial, ambos en forma de steviosido y de extracto de stevia (Kinghorn Soejarto, 1985; Brandle & Rosa, 1998). Se

usan en variedad de alimentos y productos, como verduras en escabeche, mariscos desecados, salsa de soja, bebidas, dulces, chicles, yogur y helado, tambin en pasta de dientes y productos para el lavado bucal. El extracto de Stevia y el steviosido son oficialmente aprobados como aditivos de comida en Brasil, Corea y Japn (Choi y al., 2002; Mizutani & Tanaka, 2002) y en los Estados Unidos, se permiten como un suplemento alimenticio. En 2006, el encuentro de la Junta del Comit de Expertos de la FAO/WHO sobre aditivos alimentarios (JECFA) evalu ciertos aditivos e ingredientes, condimentos constituyentes naturales de los alimentos, anunciando aceptar un consumo diario (IDA) de steviosido de hasta 5.0 mg./kilogramo de peso corporal (JECFA,2006). Adems de su dulzor, el extracto de stevia extracto y el steviosido han sido usados por la poblacin local en Sudamrica durante siglos. Los beneficios teraputicos de estos componentes sern discutidos en las siguientes secciones.

1.3.

Extraccin y puricacin

Procedimientos para aislamiento de steviosido de las hojas de S.rebaudiana a nivel prctico sobre todo implican la extraccin lquida con solventes como metano del cloroformo, glicerol, y propilenglicol, seguido por el refinado, lo que implica la extraccin en un solvente orgnico polar, decolorizacin, coagulacin, cambio inico cromatografa y cristalizacin (Kinghorn y Soejarto, 1985; Pasquel et al., 2000). La puricacin del steviosido tambin puede ser realizada por la cromatografa de intercambio inico, la cual ha sido aceptada como la mejor tcnica. Entonces el extracto acuoso es precipitado de nuevo y ltrado con un rendimiento del 90% de steviosido puro. Recientemente, Pol et al. (2007) han desarrollado un mtodo de extraccin por agua caliente presurizada para el steviosido de S. rebaudiana Bertoni estableciendo as un mtodo "verde" de aislamiento.

2. Farmacocintica del steviosido.

La farmacocintica describe del destino del steviosido administrado a organismos vivos en trminos de absorcin, distribucin, metabolismo y la excrecin (ADME), esto tiene particular importancia cuando nos aporta entendimiento del grado y la cintica de exposicin sistmica al steviosido o a sus productos metablicos. Estos datos son necesarios para evaluacin dela seguridad del steviosido.

2.1.

Absorcin

El steviosido, siendo un diterpenoid glicosido hidriflico con un peso molecular relativamente alto (804.9) tiene muchas probabilidades de no ser absorbido en el intestino. Adems, los jugos gstricos y las enzimas digestivas de los animales y de los humanos no degradan bien el steviosido (Wingard et al.,1980; Hutapea et al., 1997; Koyama et al., 2003a). Sin embargo, la flora intestinal bacteriana de ratas (Wingard et al., 1980), ratones (Hutapea et al.,1997), cerdos (Geuns et al., 2003a) y humanos (Gardana et al., 2003; Koyama et al., 2003a) son capaces de convertir el steviosido en steviol aglycona, Bacteroides sp. es el responsable de esta conversin en la parte ms baja del tracto intestinal tanto de la rata como de los humano (Gardana et al., 2003). Los estudios en voluntarios humanos mostraron que despus de 3 das tras el consumo de steviosido (750 mg./da), no fue encontrada cantidad alguna mensurable de steviosido en las heces de todos los sujetos, mientras que s se encontr steviol libre (Geuns, 2007). Los estudios

experimentales usando saco intestinal evertido de rara demostraron que el transporte absortivo de steviol es mucho ms alto que el de steviosido (Geuns et al., 2003a). Del mismo modo, la administracin oral de steviol a ratas result en un rpido incremento de steviol en sangre con un pico de concentracin de aproximadamente 15 minutos (Koyama et al., 2003b). Investigaciones sobre las propiedades de transporte del steviosido y el steviol en lneas celulares de Caco-2 en el intestino humano, un modelo estndar para el estudio de absorcin de medicamentos, indic que el transporte de steviosido es muy bajo ( coeficiente de permeabilidad Papp de 0.16106 cm/s), mientras que el de transporte de steviol es mucho ms rpido y a favor de una direccin de absorcin (Papp de 44.5106 cm/s para absorcin y Papp de 7.93106 cm/s para secrecin) (Geuns et al., 2003a). Adems, el mecanismo de absorcin del steviol implica tanto la difusin pasiva como mediado por una protena de transporte de la membrana celular por medio del transportador de monocarboxilicos. En su conjunto, estos datos indican que en una ingestin oral de steviosido, es el steviol el que absorbido por el intestino hacia la sangre.

2.2.

Distribucin

El perfil de distribucin del steviol en rganos especcos permite predecir de sus efectos sistmicos y preocupaciones toxicolgicas del consumo de steviosido. La distribucin de steviol en rganos vitales tales como el cerebro y el corazn seran considerados desfavorables ya que el steviol o sus metabolitos pueden inducir reacciones adversas en estos rganos. Para objetivos teraputicos, la acumulacin preferente de steviol en el rgano objetivo es considerada como deseable. Nakayama et al. (1986) fue el primero en determinar la farmacocintica del steviosido despus de una sola dosis de administracin oral de 3H-stevioside (BW de 125 mg./kilogramos) en machos de ratas Wistar. El mximo el nivel de radiactividad en la sangre (4.8 g/ml) fue encontrado 8 h despus de haber administrado el steviosido con un perodo de vida media de eliminacin de 24 h. Anlisis de los niveles de radiactividad en rganos claves y tejidos manifestaron una preferente acumulacin en entraas pequeas y grandes. Despus de la inyeccin intravenosa del radiactivo 131 I-steviosido en ratas macho Wistar, la radioactividad en corazn, estmago, testculos y msculo es menos del 1.8 % de la dosis inyectada durante todo experimento de 24h (Cardoso et al., 1996). Sin embargo, una cantidad signicante de la radiactividad fue descubierta en el hgado, intestino y riones. La acumulacin en el hgado es la mxima 10 minutos despus de la inyeccin. Una radioactividad significante est presente en la bilis despus de 120 minutos, con una cantidad acumulativa del 52 % de la dosis inyectada. Su presencia es mxima en los intestinos gruesos y delgados despus de 120 y 240 minutos tras la inyeccin de steviosido, respectivamente. El anlisis de la bilis por medio de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) mostr al steviol como el metabolito mayoritario. Mientras que, el anlisis de orina revel la presencia de steviosido como componente principal con mucha menos cantidad de un metabolito desconocido que tambin fue encontrado en la bilis. Estos resultados indican que la conversin metablica del steviosido y el steviol en ratas ocurre en el hgado y existen dos rutas de excrecin de steviosido, va bilis y va orina. Adems, el steviol puede someterse a la circulacin enterohepatica donde el steviol es excretado a la bilis y absorbido de nuevo a la circulacin. Sin embargo, la presencia de steviol en sistema venoso portal no se documenta en el estudio.

2.3.

Metabolismo

Steviol parece ser el metabolito principal del steviosido que se muestra en la circulacin sangunea despus de la ingesta oral. En consecuencia, se ha puesto especial atencin a su metabolismo en el

hgado. Despus de haber incubado steviol con microsomas hepticos de ratas y humanos, se ha observada la oxidacin (monohidroxida e dihidroxida) de los metabolitos de steviol (Koyama et al., 2003b). Este proceso requiere NADPH-generado por el sistema, sugiriendo un metabolismo de fase I de steviol por citocromo P450. Sin embargo, como antes se encontraron conjugados de steviol desconocidos en la bilis en los estudios en vivo en ratas (Nakayama et al., 1986), la conjugacin del metabolismo de la fase II de steviol metabolitos puede suceder. Recientemente, Roberts y Renwick (2008) han informado que el steviosido y el rebaudiosido A son metabolizados en steviol glucuronido en ratas. Antes Geuns et al. (2006) encontr steviol glucuronido en orina humana despus de haber administrado steviosido. En siguientes estudios sobre sujetos humanos que haban recibido una dosis oral de 750mg/da durante 3 das, el steviol glucuronido fue el nico metabolito encontrado tanto en sangre como en orina, mientras que no se detect ni steviosido ni steviol. El anlisis de las heces mostro nicamente steviol libre y no steviosido o steviol glucuronido sugiriendo una ruta adicional para la eliminacin del steviol. En un reciente estudio cruzado, del tipo aleatorio doble ciego, la farmacocintica del steviol glucurnido, y steviol libre en 8 individuos macho adultos, recibiendo un dosis oral individual de rebaudiosido A (5mg/Kg de peso corporal) o steviosido (4,2 mg/Kg de peso corporal) mostraron un nivel de steviol de 121 ng/ml en sangre transcurridas 6h desde la administracin (Wheeler et al.,2008). El steviol glucurnido esta presente en el plasma de todos los sujetos administrados oralmente con steviosido, con una media de tiempo para alcanzar el mximo de concentracin de 8 horas, siendo este mximo de 1,89 g/ml. En orina, la mayor parte del steviol encontrado fue en forma de conjugados glucurnidos (62% de la dosis) con un nivel muy inferior del steviol libre (0,04% de la dosis). As, parece que, adems de a la fase I del metabolismo, el steviol se somete a la fase II, en la cual la mayor parte del steviol es conjugado como glucorinido antes de ser eliminado mediante la orina. Este estudio tambin sugiere la participacin de un camino metablico similar para el rebaudiosido A.

2.4.

Excrecin

El entendimiento de la excrecin por la que el steviosido y sus productos metablicos son eliminados del cuerpo es crucial para las consideraciones toxicolgicas del consumo de steviosido. Esta determina la duracin y la cantidad de steviosido o sus metabolitos presentes en el cuerpo tras la ingesta. Por ello, se han estudiado los mecanismos excretores del steviosido en humanos y ratas. El steviol glucuronido es comnmente el mayor metabolito encontrado en circulacin en ambos, humanos y ratas. Los tractos biliar y urinario parecen ser las mayores rutas para la excrecin del steviol glucuronido. Sin embargo, las extensiones por la que este metabolito es excretado por estas dos rutas son diferentes entre humanos y ratas. En estas ltimas, la ruta principal es la excrecin por va biliar del steviol glucuronido en heces (Wingard et al.1980; Nakayama et al., 1986; Roberts & Renwick, 2008). En humanos, la excrecin urinaria parece ser la que juega el papel predominante en la excrecin del steviol glucurnido (Cardoso et al., 1996; Geuns et al., 2006, 2007;Wheeler et al., 2008). Un estudio metablico reciente en humanos mostr que 72h despus de la ingesta oral del steviosido, el steviol glucurnido y steviol libre en heces era de un 62% y un 5,2% de la dosis de steviosido administrada respectivamente (Wheeler et al.,2008). Esta diferencia entre humanos y ratas en el camino de la excrecin del steviol glucuronido se debe a la diferencia entre el umbral de peso molecular para humanos y ratas de excrecin de aniones orgnicos. Los aniones orgnicos con masa molecular mayor de 600 Da en humanos y 325 Da en ratas son excretados por la bilis en vez

de pasar por la filtracin glomerular del rin (Renwick, 2008a). As el steviol glucurnido, con peso molecular de 512.9 Da, es preferentemente eliminado por va biliar en heces en ratas.

3. Efectos biolgicos y potenciales aplicaciones teraputicas del steviosido y sus componentes relacionados. 3.1. Efecto anti-hiperglicmico

En el presente, se ha incrementado la incidencia de la diabetes de tipo 2 y de la obesidad como resultado del envejecimiento, los hbitos dietticos y la disminucin de las actividades fsicas. Estos sndromes metablicos se han convertido en un problema de salud pblica en los pases industrializados y ms desarrollados. La diabetes mellitus de tipo 2 es un desorden metablico crnico resultado de defectos en la secrecin de insulina de las clulas y en la accin de la insulina (DeFronzo, 1988). Adems de esto, tambin contribuyen la disfuncin de las clulas del pncreas y el exceso relativo de glucagn (Unger, 1997). La hiperglicemia postprandial observada en la diabetes de tipo 2 esta normalmente debida a un incremento de la produccin de glucosa heptica basal y una disminucin de glucosa perifrica. Por lo tanto, la correccin de este desequilibrio bien sea a la entrada o la salida de la glucosa plasmtica debe ayudar a corregir esta afeccin patolgica. En la actualidad, es comn el uso de hierbas y medicina alternativa para el tratamiento de la diabetes. En realidad, el extracto de S. rebaudiana ha sido utilizada en tratamientos para la diabetes (Kinghorn & Soejarto, 2002). Adems, el steviosido, el mayor componente del extracto, tiene altos niveles de dulzor sin caloras y slo una pequea cantidad de este es necesaria con el propsito de edulcorar.

3.1.1.

Efecto en la absorcin de glucosa

El steviosido en dosis altas (5mM) no tiene efecto inhibitorio sobre la absorcin de glucosa. Sin embargo, 1mM de steviol inhibe la absorcin de glucosa aproximadamente un 40%. El Steviol causa una disminucin de la acumulacin de la glucosa en el tejido intestinal. Adems el steviol altera la morfologa de las clulas de absorcin intestinales. Estos resultados sugieren que el lugar de la accin inhibidora del steviol podra ser en la parte de la mucosa y/o en los orgnulos intracelulares de las clulas de absorcin intestinales (Toskulkao et al., 1995a). Estudios del mismo grupo de investigacin (Toskulkao et al.,1995b) demostraron que el steviosido en dosis de 1 a 5 mM no inhiben la absorcin intestinal de la glucosa en hmsteres, mientras que 1mM de steviol inhibe la absorcin de la glucosa sobre el 30% pero no afecta a la actividad intestinal Na+-K+-ATPasa Los investigadores sugirieron que al inhibicin de la absorcin de la glucosa por el steviol se debe a la reduccin del contenido de ATp en la mucosa intestinal, lo que es una consecuencia de la disminucin de las actividades enzimticas mitocondriales en el intestino al nivel de fosforilacin y alteraciones morfolgicas de las clulas de absorcin intestinales. De hecho, la inhibicin por steviol de la absorcin de glucosa en clulas intestinales podra resultar en una bajada del nivel de glucosa plasmtica, lo que sera indeseable en individuos sanos. De todas formas, la ingesta diaria aceptable (IDA) de steviosido (5mg/Kg de peso corporal/da) tendra un rendimiento mximo de concentracin de steviol de aproximadamente 20M si el steviosido se convierte por completo en steviol (JECFA,2006). Esta concentracin de steviol esta muy por debajo de la cantidad estudiada para inhibir la absorcin de glucosa intestinal.

3.1.2. Efecto sobre la secrecin de insulina y la sensibilidad

La mayor incidencia de diabetes en el mundo es la de tipo 2, diabetes mellitus (Kolterman et al., 1980). Bajo esta condicin, la reduccin de la sensibilidad en tejidos perifricos hace decrecer la eficiencia de la utilizacin de la glucosa conduciendo al desarrollo de hiperglucemia. As, el rol del steviosido para incrementar la sensibilidad a la insulina ha sido estudiado en ratas alimentadas con comida rica en fructosa (Chang et al., 2005). La habilidad de la insulina para estimular la disposicin de glucosa esta marcadamente afectada en estas ratas, indicando un descenso de la sensibilidad a la insulina en tejidos perifricos asociado a una resistencia a la insulina. Estos modelos de ratas representan el desarrollo de la obesidad acompaado del sndrome de resistencia a la insulina. El Steviosido (5,0mg/kg de peso corporal) administrado oralmente a las ratas alimentadas con comida rica en fructosa aumenta en de gran manera la sensibilidad a la insulina indicado por el ndice glucosa-insulina. Repetido el tratamiento de steviosido 3 veces al da retrasa el desarrollo de la resistencia a la insulina respondiendo al tolbutamido. La ingesta aguda de steviosido (500mg/kg de peso corporal) en ratas diabticas incrementa la sensibilidad a la insulina del cuerpo en su totalidad, como ha determinado el valor del ndice glucosa-insulina, lo que indica sensibilidad a la insulina o accin de la insulina en la tasa de eliminacin de la glucosa. Adems, se ha estudiado in vitro, el efecto directo del steviosido en la actividad de transporte de glucosa en los msculos esquelticos, lugar de mayor concentracin de glucosa. Se ha comprobado que una baja concentracin de steviosido (0,01 a 0,1 mM) puede aumentar el efecto de la insulina en el transporte de glucosa de dichos msculos tanto en ratas flacas como en las obesas, sugiriendo como lugar potencial de accin del steviosido el sistema de transporte de glucosa de los msculos esquelticos. As, los efectos del steviosido en la estimulacin de la secrecin de insulina (Jeppesen et al., 2000) y as como en el aumento de la sensibilidad a la insulina (Lailerd et al., 2004) subrayan sus efectos beneficiosos sobre el metabolismo de la glucosa. En realidad, se observ una reduccin en la glucosa plasmtica y los glucagones junto con un incremento de la secrecin de insulina, en las ratas diabticas de tipo 2 de Goto-Kakizaki despus de una ingesta oral de steviosido de 25mg/kg de peso corporal/da durante 6 semanas (Jeppesen et al., 2003). De todas formas, ms adelante, deben hacerse estudios sobre la administracin prolongada tanto de steviosido como de steviol. Sin embargo, estos resultados aumenta la preocupacin sobre si la ingesta de steviosido en ayunas puede conducir a la hipoglucemia, como en el la situacin de sulfonilurea, que estimula la liberacin de insulina, constituyendo as, una amenaza potencial para sujetos diabticos Para contestar esta cuestin, se ha administrado steviosido a ratas GK y Wistar en ayunas, con una concentracin normal y baja de glucosa plasmtica (3,3 mM o menos), y no se encontr accin insulinotrpica (Jeppesen et al., 2002). De hecho, el steviosido estimula la liberacin de insulina slo en algunos casos aislados de ratones con altas concentraciones de glucosa (> 8,3 mM) (Jeppesen et al., 2000). De ah, es probable que el steviosido muestre su efecto beneficioso estimulando la liberacin de insulina slo en estado diabtico. Se han realizado un nmero limitado de estudios experimentales para evaluar el efecto del extracto de stevia y del steviosido en humanos. Un comida estndar suplementada con 1 g de steviosido administrada a 12 sujetos diabticos de tipo 2, es capaz de reducir los niveles de glucosa postprandial en sangre sobre un 18% (Gregersen et al., 2004). Se observ un leve incremento en la circulacin de insulina y un descenso en los niveles de glucagones. El ndice insulinognico indic que tras el tratamiento con steviosido se increment un 40% la secrecin de insulina. No se observ

prdida de glucosa urinaria por el consumo de steviosido, esto implica que el steviosido puede tener un efecto directo en la disposicin de la insulina perifrica inducido por la insulina responsable del descenso en los niveles en sangre de glucosa postprandial. Esto puede incluir un aumento en el almacenamiento de glucgeno en el hgado. En contraste con lo anterior,Barriocanal et al. (2008), ha expuesto que el consumo prolongado de steviosido (> 92% pureza) de 250 mg 3 veces/da durante 3 meses, cantidad similar a la usada como dulcificante, no tiene efectos farmacolgicos en individuos diabticos tanto de tipo 1 como de tipo 2 as como en sujetos normotensos o hipotensos. No se encontr menos glucosa en sangre o presin sangunea. Se desconoce la explicacin a esta carencia de efecto del steviosido, pero se debe sealar que el steviosido parece tener la habilidad de bajar los niveles de glucosa en plasma y la presin sangunea slo cuando estos parmetros son anormalmente elevados. Estos resultados son consecuentes con aquellos obtenidos previamente a corto plazo sobre los efectos en individuos sanos (Geuns et al., 2007). El segundo componente ms abundante de la hoja de stevia es el rebaudiosido A, que se diferencia del steviosido porque tiene una mitad de glucosa adicional. Esto eleva la posibilidad de que el rebaudiosido A pueda poseer efectos hipoglucmicos similares a los del steviosido y el extracto de stevia. De hecho, rebaudiosido A estimula la liberacin de insulina considerablemente en ratones en presencia de grandes concentraciones de glucosa (>6,6 mM) (Abudula et al., 2004). Inesperadamente, un estudio de tratamiento a largo plazo de ratas GK con rebaudiosido A fracas en el estmulo de secrecin de insulina (Dyrskog et al., 2005). De manera parecida, el consumo a largo plazo de rebaudiosido A durante 16 semanas por parte de sujetos con diabetes mellitus tipo 2 no ha tenido efecto en la homeostasis de la glucosa, ni en la presin sangunea (Maki et al., 2008). Basado en estudio en clulas, animales y humanos, steviosido y sus compuestos relacionados (steviol y rebaudiosido A) afectan a la glucosa plasmtica mediante la modulacin de la secrecin de insulina y la sensibilidad, lo que mejora la eliminacin de glucosa en el plasma. Tambin inhiben la absorcin de glucosa intestinal y la generacin de glucosa por el hgado alterando la actividad de varias enzimas claves envueltas en la sntesis de la glucosa reduciendo as el aporte de glucosa plasmtica. Los posibles efectos anti-hiperglycmicos del steviosido y sus componentes relacionados se muestran en la figura 2. Es interesante resaltar que los efectos del steviosido dependen enormemente de los niveles de glucosa plasmtica, siendo observados slo cuando estos son elevados. As, parece ser totalmente seguro para individuos sanos. De todas formas, el mecanismo de este efecto no se conoce.

Figura 2. Posibles efectos anti-hiperglicmicos del steviosido y sus componentes relacionados

3.2.

Efecto Anti-hipertensivo

La presin arterial sangunea media (mABP) vara directamente con el tono del sistmico vascular o con las resistencia periferal total (TPR) y el volumen de sangre. Cambios en cualquiera de estos parmetros afectan la mABP. La hipertensin arterial es resultado de una inapropiada relacin entre la capacidad vascular /resistencia y el volumen de sangre. Estudios previos tanto en animales como en humanos han demostrado que el steviosido y el extracto de stevia disminuyen la mABP induciendo la vasodilatacin (reduce TPR), lo que lleva a reducir el volumen plasmtico (Melis, 1995; Melis & Sainati, 1991a, 1991b). El efecto antihipertensivo del extracto de stevia crudo (2,67 g de hoja seca/da) tomado oralmente es dependiente del tiempo y requiere una administracin prolongada. Esto se deduce de observar que tras administrar el extracto oralmente a ratas hipertensivas, no existen cambios significativos en la presin sangunea durante los primeros 20 das. Pero s se pudo constatar un efecto hipotensivo del extracto pasados 40 y 60 das tras la administracin (Melis, 1996). Por otra parte, la infusin de steviosido por va intravenosa reduce la presin sangunea en ambas ratas, normales e hipertensivas

sin ningn retraso (Melis, 1992c). As, el efecto hipotensivo agudo del steviosido puede ser observado slo cuando es administrado directamente en el sistema circulatorio. Estudios en humanos han mostrado el efecto del steviosido en el sistema cardiovascular. Steviosido causa bradicardia e hipotensin (Humboldt & Boech, 1977). Similarmente, un leve efecto hipotensivo ha sido observado en sujetos humanos que recibieron t de S. rebaudiana (extracto de stevia) diariamente durante 30 das (Boeckh & Humboldt, 1981). En estos estudios, tambin se sugiri que el steviosido tiene un efecto inotrpico de reduccin de la duracin de la sstole. Esto reduce la mABP. As, tanto el steviosido como el extracto de stevia parecen tener un efecto antihipertensivo. Los resultados de los ensayos clnicos a largo plazo en humanos con leve y moderado nivel de hipertensin demostraron que un consumo continuado de steviosido (750mg/da) por un ao, reduce ambas ,la presin sangunea sistlica y diastlica, mientras que no se han observado efectos secundarios significantes o alteracin en lpidos (Chan et al., 2000). Subsiguientes estudios hasta 2 aos con un incremento de la dosis de steviosido (1500mg/da) se vio una reduccin significativa de ambas presiones sanguneas sin cambios significativos en el ndice de masa corporal, n en los valores bioqumicos de la sangre, ni en el ndice de masa ventricular (Hsieh et al., 2003). Adems, se ha podido comprobar que la calidad de vida es significantemente mejor con steviosido en comparacin con el placebo. Estos resultados refuerzan el papel hipotensivo del steviosido en humanos. Los investigadores concluyeron que el consumo de steviosido a largo plazo es bien tolerado y debe ser considerado como alternativa o suplemento en terapias con pacientes hipertensivos. Sin embargo, se ha informado de una carencia de efecto mesurable del steviosido en la mABP (Ferri et al., 2006). La administracin oral durante 6 semanas de mezcla bruta de steviosido/rebaudiosido A (15mg/Kg de masa corporal/da) en pacientes con leve hipertensin no ha producido cambios significativos en la presin sangunea. Esto puede ser consecuencia de valores bajos de presin sangunea basal en estos sujetos junto con diferecencias en las frecuencias y duracin de las tomas de steviosido en comparacin con los estudios previos (Chan et al., 2000). Otra posibilidad puede ser la pureza o la composicin de la mezcla cruda de steviosido/ rebaudiosido A que puede interferir en el efecto del steviosido. De todas formas, no se observaron otros efectos clnicos adversos.Geuns et al. (2007) demostr que la administracin oral de steviosido (750mg/day) durante 3 das no causa cambios significativos en mABP en 9 sujetos con presin sangunea normal. Esto indica que la ingesta oral de steviosido crudo es segura. En resumen, el steviosido reduce el mABP interviniendo tanto el volumen plasmtico como la resistencia vascular como se muestra en la Fig 3. Sin embargo, parece no tener un impacto significativo en la presin sangunea en humanos con niveles normales de presin sangunea. La capacidad del steviosido de disminuir la presin sangunea se observa slo en sujetos huipertensivos. As, el riesgo de desarrollar hipotensin en sujetos humanos sanos, es relativamente baja.

Fig. 3. Anti-hypertensive actions of stevioside. Stevioside inhibits Ca2+ influx in vascular smooth muscle, which causes vasodilation and consequentially reduction of total peripheral resistance. Stevioside also produces diuresis and natriuresis resulting in reduction of extracellular fluid volume. Thus, the underlining mechanism of anti-hypertensive action of stevioside is via its ability to reduce both factors that determine mean arterial blood pressure (mABP).

3.3. Efectos antinflamatoria y anticancerigeno

La inflamacin es una reaccin inmune innata de los tejidos vasculares a estmulos nocivos, tales como clulas patgenos, heridas o irritaciones. Las clulas satlites tales como clulas del sistema inmune, epiteliales y endoteliales de forma interactiva participa en este proceso para eliminar los estmulos nocivos y poner en marcha el proceso de curacin. Sin embargo, la inflamacin est tambin asociada con una variedad de trastornos, tales como enfermedades autoinmunes (Atassi & Casali, 2008), enfermedades de inflamacin intestinal (Bamias & Cominelli, 2007; Cho, 2008) y cncer (Niessner et al., 2007). Adems, en algunos casos patolgicos, las consecuencias de la inflamacin puede ser devastador y se asocian con el deterioro funcional de los rganos afectados. Por ejemplo, en el caso de la enfermedad inflamatoria intestinal, esta puede conducir a dao de la pared mucosa o incluso todo el intestino, lo que resulta diarrea con sangre y la mala absorcin (Kelly, 1999). Cualquier sustancia con efecto anti-inflamatorio por lo tanto, ser til en la prevencin de la inflamacin asociada a estas indeseables eventos. Hay evidencias de una amplia muestra que el estevisido posee un efecto antiinflamatorio tanto in vitro como in vivo. Inicialmente, se ha demostrado que la inflamacin inducida por la piel a nivel

local por la 12-O-tetradecanoilforbol- 13-acetato (TPA) fue inhibida por los steviol glicsidos incluido el stevisido (Yasukawa et al., 2002). Adems, el efecto antitumoral de estevisido se investig como TPA tambin es conocido por inducir la formacin de clulas cancergenas en mamferos (Nakamura et al., 1995). El estevisido inhibe la TPA inducida por la promocin de tumores en un modelo de cncer de piel en segunda fase de carcinognesis en ratones. Mizushina et al. (2005) mostr que el isosteviol inhibe las ADN polimerasas y la topoisomerasa II de ADN en humanos, los objetivos celulares para el tratamiento farmacolgico del cncer, as como enfermedades inflamatorias. Por otra parte, el isosteviol tambin retarda el crecimiento de tres tipos diferentes de clulas cancergenas humanas e inhibe la inflamacin inducida por TPA. Boonkaewwan et al. (2006) midi la liberacin de un ser humano de la lnea celular monoctica THP1 de citocinas proinflamatorias (TNF- y IL-1) y el xido ntrico, todos conocidos por participar en el desarrollo de un nmero de enfermedades inflamatorias, y encontraron que el estevisido (1 mM) moderado estimula la liberacin de las clulas no estimuladas por THP1 y la interaccin con los receptores toll-like-4, (un receptor principal de lipopolisacrido (LPS) de bacterias gram-negativas). En este nivel de estimulacin de los monocitos, el estevisido puede ser beneficioso en individuos sanos como resultado de su efecto en la mejora de la inmunidad innata. Por otro lado, en las clulas THP1 estimuladas por LPS, la misma concentracin de estevisido suprime la liberacin de TNF-, IL 1 y NO al interferir con la va de sealizacin de NF-kB, un factor de transcripcin que controla la expresin de citoquinas inflamatorias en las clulas del sistema inmune. El esteviol no tiene ningn efecto sobre la liberacin de estas citoquinas proinflamatorias en ninguno de los dos casos: sin estimular y estimuladas con clulas LPS-THP1. Por lo tanto, en el caso de un husped infectado, el estevisido puede ser til debido a su capacidad para prevenir los efectos indeseables de la respuesta inflamatoria, y en el individuo sano, puede ofrecer un beneficio relacionados con la inmunidad, ya que puede aumentar los monocitos la actividad. El estevisido y el esteviol ejercen efectos anti-inflamatorios en las clulas epiteliales del colon. Bajo una regulacin fisiolgica, no slo los colonocitos funcin para formar una barrera a travs de la cual los lquidos y electrolitos pueden ser transportados, sino tambin sirve como un sensor inmune innato de los microbios organismos patgenos y comensales (Sartor, 2008). Las funciones de los colonocitos en las reacciones inflamatorias se basan principalmente en una interaccin especfica entre los receptores tipo toll en colonocitos y antgenos patgenos derivados. Esta interaccin husped-patgeno conduce a la activacin de la va NF-kB de sealizacin y posterior induccin de la expresin de citoquinas proinflamatorias, con la IL-8, un atrayente de neutrfilos utilizado en quimioterapia, tal vez el ms importante. Recientemente, Boonkaewwan et al. (2008) evaluaron los efectos de los estevisidos y del esteviol en la liberacin de IL-8 en la lnea celular del clon de un ser humano. La liberacin mxima de IL-8 inducida por el TNF- requiere de un perodo de tiempo menor que la inducida por LPS, TNF-, que fue utilizado como un estimulador. Utilizando dosis no txicas de estevisido (<2 mM ) y esteviol (<0.2 mM), TNF- fue inducida por IL-8 mostrando que la liberacin no se ve afectada por el estevisido, pero se suprime por esteviol. El anlisis por inmunotransferencia mostr que esteviol reduce la expresin de NF-kB. Como el estevisido se degradada completamente a steviol por la microflora residente (Wingard et al., 1980; Hutapea et al.,1997; Gardana et al., 2003; Geuns 2003), sera de especial inters evaluar la capacidad de estevisido oral para reducir la inflamacin o la transformacin de diversos tipos de cncer en un modelo animal de colitis.

Se han demostrado recientemente actividades inmunomoduladoras en vivo de estevisido (Sehar et al., 2008). El estevisido (6,25, 12,5 y 25 mg / kg de peso corporal) en ratones alimentados promueven las funciones fagocticas, como se indica, por un aumento del ndice de fagocitosis de la prueba de carbono de compensacin y aumento de la respuesta inmune humoral, medida debido a un aumento del nmero de anticuerpos a la prueba del antgeno. En experimentos in vitro tambin se demostraron los efectos estimulantes de los estevisidos en la actividad fagoctica y la proliferacin de clulas B y T estimuladas por LPS y concanavalin A, respectivamente. Estos resultados apoyan an ms la suposicin de que el consumo oral de estevisido puede ser til en la promocin de la inmunidad contra la infeccin por microorganismos.

3.4.

Aplicaciones potenciales como agentes teraputicos contra la diarrea

La diarrea se define como un aumento en el contenido acuoso o la frecuencia de deposiciones, generalmente ms de 3 veces/da (Binder, 1990). La causa ms comn de esta patologa son las infecciones intestinales por bacterias y virus (Petri et al., 2008). Estos patgenos pueden causar un dao directo debido a la invasin en el intestino o trastornado las funciones intestinales, resultando los sntomas de la diarrea. Hasta el da de hoy la diarrea se clasifica en cuatro tipos: secretora, osmtica, relacionados con la motilidad y diarrea exudativa (Binder, 1990). En la actualidad el tratamiento ms generalizado es la terapia de rehidratacin y tratamiento antibitico. Sin embargo, el primero es principalmente de apoyo y ste no puede ser eficaz en situaciones en las que existe resistencia a los antibiticos. Por lo tanto, es necesario todava descubrir nuevas farmacoterapias especficas para las enfermedades diarreicas. La identificacin de potenciales frmacos contra la diarrea de medicamentos tradicionales representa una estrategia atractiva, as como su eficacia y seguridad que ya han sido apoyadas por las experiencias humanas. La potencial aplicacin del estevisido en el tratamiento contra la diarrea fue sugerido originalmente a partir de observaciones de actividades bactericidas y antirotavirales en la extraccin con agua caliente de hoja secas de Stevia rebaudiana. Tomita et al. (1997) fueron los primeros en reportar un efecto bactericida de este extracto contra una amplia gama de bacterias patgenas transmitidas por los alimentos, incluyendo la enterohemorrgica Esherichia coli, que se sabe que causan hemorragia severa / diarrea exudativa. Este extracto de stevia tambin inhibe el crecimiento de rotavirus, un virus de ARN cuya infeccin causa la gastroenteritis en los nios, al interferir con la unin contra el rotavirus de las clulas husped (Takahashi et al., 2001). Un polisacrido que contienen compuestos de gran tamao molecular (peso de 9.800 Da) se aisl y fue sugerido de ser responsable de el efecto inhibidor viral. Sin embargo, otras fracciones extradas de hojas secas de Stevia rebaudiana tambin se encontraron que producan propiedades similares anti-rotavirus. Como el estevisido es el mayor constituyente de este extracto de stevia es posible que los glucsidos relacionados con el estevisido y otros contribuyeran a combatir los efectos de la diarrea. El estevisido tiene un efecto inhibidor en la contraccin sobre el msculo liso intestinal, y esta estimulacin es lo que se traduce en hipermotilidad asociada a la diarrea (Shiozaki et al., 2006). A una concentracin de 1 mM, el estevisido inhibe CaCl2 (10 mM) inducido en la contraccin del leon en un 40% probado conejillo de indias aisladas. El mecanismo se cree que est relacionado con su efecto inhibitorio sobre el flujo de Ca2 + en las clulas musculares. Por lo tanto, el estevisido puede ser til en el tratamiento de la diarrea que resulta de enfermedades infecciosas intestinales de hipermotilidad, como el sndrome del intestino irritable e inflamatorias como la

enfermedad intestinal. Otros estudios en modelos animales son necesarios para demostrar in vivo la eficacia contra la diarrea del extracto de stevia obtenido con agua caliente en la diarrea hemorrgica y del estevisido en la diarrea hipermotilidad. Adems, estos estudios indican la baja potencia de estevisido y ms optimizacin se requiere para obtener los compuestos derivados de mayor potencial. Se ha demostrado un gran potencial teraputico del steviol y de sus anlogos (dihydroisosteviol) en el tratamiento de la diarrea secretora, que sobre todo se refleja en los resultados de la secrecin excesiva de lquido intestinal (Pariwat et al., 2008). En general, la secrecin de fluidos en el intestino es impulsado por la fuerza osmtica generada por la secrecin activa de aniones, especialmente cloruro, en el lumen intestinal (Field, 2003). La enterotoxina bacteriana es capaz de estimular la secrecin de cloro activo, seguido por el transporte celular de sodio y agua (Field, 1979). Esta respuesta de hipersecrecin de enterotoxina mediada conduce a una prdida masiva de lquido intestinal y deshidratacin en el caso de la diarrea secretora (Field, 2003). Un regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR), es un canal de cloro activado por AMPc, y constituye la principal ruta para la secrecin de cloruro en la mayora de los tipos de diarrea secretora (Thiagarajah & Verkman, 2003). En la lnea celular T84 intestinal de un ser humano, el steviol inhibe el AMPc activando la secrecin de cloruro con un IC50 de 100 M (Pariwat et al., 2008). La sntesis de esteviol anlogos ha llevado a la identificacin de las series de los compuestos ms activos, como el dihydroisosteviol que es el ms potente y que inhibe de manera reversible AMPc y activa la secrecin de cloruro en las clulas T84 con una IC50 de 10 mM (Pariwat et al., 2008). Anlisis electrofisiolgicos y enzimtico indican que el dihydroisosteviol elimina directamente CFTR. Este compuesto no es txico y especfico para la secrecin de cloruro estimulado por AMPc, pero no por el calcio. En experiencias in vivo de de clera mostr que la secrecin de fluidos intestinales estimuladas por Vibrio enterotoxina del clera se reduce notablemente por dihydroisosteviol. Por otra parte, administracin intraperitoneal de esteviol es eficaz en la reduccin de la secrecin de fluidos intestinales en los modelos in vivo(Muanprasat, C.,observacin no publicada). Estos resultados son consistentes con anteriores estudios farmacocinticos sugiriendo la circulacin enteroheptica del esteviol (Nakayama et al., 1986; Cardoso et al., 1996). Los compuestos relacionados con el steviol han sido comparados favorablemente con los inhibidores de CFTR en desarrollo (Ma et al., 2002; Muanprasat et al., 2004; Sonawane et al., 2005; Sonawane et al., 2006; Muanprasat et al., 2007; Sonawane et al., 2007; Sonawane et al., 2008), y por lo tanto representan una nueva opcin en el desarrollo de inhibidores de CFTR antidiarreicos. Se debe realizar todava una mayor optimizacin de los anlogos de steviol, incluyendo estudios de mecnica, evaluacin de la toxicidad y la eficacia in vivo en modelos animales de gran tamao.

4. Aspectos de seguridad: Toxicidad, carcinognesis y teratognesis

Debido a su uso popular como sustituto del azcar no calrico, han sido estudiadas de manera intensiva las propiedades toxicolgicas del steviosido y el steviol tanto en condiciones in vitro como en animales experimentales. Adems, se han evaluado los potenciales carcinognicos y teratognicos as como los efectos en la reproduccin.

4.1. Estudios toxicolgicos

En estudios de vitro que implican varias lneas de clula diferentes de rin e intestino indicaron que steviosido en una concentracin tan alta como 2 mM tienen que ser expuestos a clulas para afectar la viabilidad de clula, pero 0.2 mM de steviol reduce significantemente la viabilidad de la

clula (Srimaroeng et al., 2005b;Boonkaewwan et al., 2008). Este efecto txico puede ser consecuencia de una interrupcin del metabolismo mitocondrial como se ha sugerido en estudios anteriores (Toskulkao et al., 1997; Srimaroeng et al., 2005b). En evaluaciones de toxicidad agudas y crnicas de ingestin steviosido investigado en ratones, ratas y hmsteres, con un consumo de steviosido tan elevado como 15g/Kg de peso corporal no produce toxicidad aguda alguna (Akashi & Yokoyama, 1975;Mitsuhashi, 1976; Medon et al., 1982; Xili et al., 1992; Toskulkao et al.,1997). Sin embargo, la administracin oral de steviol es letal con un LD50 de 5-20 g/kg de peso corporal, dependiendo de la especie animal, siendo los hmsteres ms susceptibles a la toxicidad del steviol que las ratas o los ratones (Toskulkao et al.,1997). El examen histolgico del tratamiento con steviol en hmsteres ha revelado la degeneracin de la clula tubular del proximal, la extensin de la cual esta relacionada con el la subida en el suero sanguneo del nitrgeno de urea y la creatinina, indicadores del deterioro de la funcin renal. As pues, la causa de muerte en hmsteres tratados con steviol es un fallo renal agudo. La ingesta de steviosido (750mg/da durante 3 mese) en individuos sanos o con enfermedades subyacentes como la diabetes mellitus e hipertensin, no produce efectos adversos o anormalidades en el hgado o en la funcin renal (Hsieh et al.,2003; Barriocanal et al., 2008). De acuerdo con estudios farmacocinticos previos en humanos, despus de la administracin oral de una dosis individual de 4,2 mg de steviosido por Kg de peso corporal, supone la mxima concentracin de steviol glucorinido y steviol libre en plasma de 1,89 g/ml (3,7 M) y 0,19 g/ml (0,38 M) respectivamente (Wheeler et al., 2008). Este nivel de steviol, no debera ser txico para las clulas humanas, y parece que el steviol glocornido no se convierte de nuevo en steviol.

4.2. Evaluacin carcinognica

El potencial carcinognico del steviol es una preocupacin particular y varias investigaciones usando diferentes modelos experimentales han sido realizadas para evaluar los efectos mutagnicos del steviosido y el steviol. Anlisis genticos bacterianos han revelado que el steviosido no es mutagnico (Pezzuto et al., 1985; Pezzuto et al., 1986; Suttajit et al.,1993; Matsui et al., 1996a; Klongpanichpak et al., 1997) sin embargo, varios ensayos mutagnicos sobre el potencial genotxico del steviol permanecen inconclusos. En ensayos de mutacin usando Salmonella typhimurium TM677, el steviol mostr toxicidad gentica despus de la activacin metablica por homogenato de hgado (Pezzuto et al., 1985; Matsui et al., 1989; Matsui et al.,1996a; Temcharoen et al., 1998; Terai et al., 2002). Los mecanismos mutagnicos de steviol activado metablicamente se mostraron a travs de transicin, transversin, duplicacin y borrado de material gentico. Adems, estudios usando E. coli (Nunes et al., 2006) y clulas mamarias cultivadas (Matsui et al., 1996a) sugirieron que el steviol puede producir lesiones genticas que pueden derivar en la formacin de cncer. Sin embargo, otros ensayos mutagnicos de bacterias, como la mutacin inversa, Ames y ensayos rec fracasaron en la demostracin de la actividad mutagnica del steviol (Matsui et al., 1996a; Klongpanichpak et al.,1997). Adems, linfocitos cultivados de donantes humanos, no mostraron alteraciones cromosmicas tras la exposicin a steviosido o steviol (Suttajit et al., 1993; Temcharoen et al., 2000).

En pruebas en vivo sobre el potencial carcinognico del steviosido ha sido llevado a cabo en ratones y ratas. El steviosido administrado oralmente no aumenta la incidencia de cncer en ratas

(Yamada et al., 1985; Hagiwara y 1984., Al-; Xili y 1992., Al-; Toyoda y 1997., Al-; Sekihashi et al., 2002). No se han obtenido evidencias de carcinognesis en estudios in vivo con ratones (Matsui et al., 1996a; Yasukawa et al., 2002). En realidad, el steviosido suprime el fomento de tumor por 12-Otetradecanoylphorbol- 13 acetato en la piel de los ratones (Yasukawa et al., 2002). En 2006, JECFA declar que no existen evidencias de que el steviosido induzca a la genotoxicidad tanto in vivo con in vitro. En dosis de hasta 2,0 g/Kg de peso corporal (varones) y 2,4 g/Kg de peso corporal (mujeres), el steviol no promovi ninguna incidencia de cncer.

4.3. Fertilidad y evaluacin teratognica.

La preocupacin sobre los efectos antifertilidad y teratognicos del steviosido incrementaron despus de ver q las decocciones de stevia disminuyen el ritmo de nacimiento en ratas (Planas & Kuc, 1968), pero estos resultados no han podido ser reproducidos (Shiotsu, 1996). Varios estudios han demostrado que el steviosido oral no tiene efectos sobre la fertilidad en ratones (Akashi & Yokoyama, 1975), ratas (Mori et al., 1981; Xili et al., 1992) o hmsteres (Yodyingyuad & Bunyawong, 1991). Las ratas alimentadas con comida conteniendo un 1% (peso/peso) de steviosido no mostraron cambios en la espermatognesis o en las clulas intersticiales de proliferacin (Yamada et al., 1985). Sin embargo, cuando se alimentan con una dosis inusualmente altas (2,6g/da) de extracto de stevia durante 2 meses las ratas pueden manifestar un descenso en la fertilidad (Melis, 1999). Sin embargo, esto podra deberse a la presencia de componentes minoritarios que son txicos en estas cantidades elevadas de extracto de stevia. La mayora de estudios estn de acuerdo en que el steviosido oral, en una ingesta aceptable de (5mg/kg de peso corporal) es seguro y no carcinognico o teratognico.

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