UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

Biotecnologa Animal: Los modelos animales, clonacin de animales,-Dolly. Animales transgnicos, Knockouts, produccin de anticuerpos humanos en animales.

DOCENTE: Mg.QF. FANNY MARIN CACHO

INTEGRANTES:
ADRIANZN TOLENTINO MARIO AGUILAR PAREDES DIANA ALAYO MENDOZA WILY ALFARO CADILLOS GERSON ALFARO VERDE LIZET

TRUJILLO PER 2014

BIOTECNOLOGA ANIMAL La biotecnologa incluye cualquier tcnica que utilice organismos vivos o parte de esos organismos para fabricar o modificar productos, mejorar plantas o animales o para desarrollar microorganismos para usos especficos (Rodrguez-Villanueva, 1986). La aplicacin de metodologas de ingeniera gentica en biotecnologa para la cra y produccin de animales tiene como finalidad la obtencin de animales modificados genticamente con caractersticas singulares que mejoran, complementan o perfeccionan las condiciones de los ancestros originales, denominados wild-type, de los que parten las lneas transgnicas.1 MODELOS ANIMALES El genoma humano, secuenciado en 2004, tiene entre 20.000 y 25.000 genes responsables de la formacin y del mantenimiento del cuerpo humano. Gran parte de las enfermedades humanas tienen una base hereditaria y estn causadas por mutaciones de genes. Por otra parte, existe una gran concordancia entre el genoma de las diferentes especies de mamferos por lo que, los modelos animales transgnicos, son de gran ayuda para comprender el papel de los genes en el desarrollo de una enfermedad o para reproducir enfermedades humanas en animales, con el fin de investigar nuevos tratamientos. Existen modelos transgnicos animales para el estudio de una amplia variedad de enfermedades humanas.1 Las caractersticas de un modelo animal ideal son: Facilidad de cra en cautividad. Tiempos de reproduccin cortos. Descendencia numerosa. Disponibilidad de mtodos de manipulacin gentica y experimental. Elevado nmero de genes conservados respecto al ser humano. La aplicacin de la tecnologa transgnica ha sido particularmente til para el examen de la importancia de la expresin de determinados genes en la etiopatogenia de gran nmero de enfermedades. Con frecuencia aparecen en los medios de comunicacin noticias que recogen nuevos descubrimientos en los que estn implicados animales transgnicos, es bien conocido que el desarrollo de modelos animales ha sido bsico para el avance en el conocimiento de los oncogenes y los virus oncognicos, pero hay otros muchos ejemplos de avances cientficos en los que los ratones transgnicos son tambin herramientas importantes. Para algunas enfermedades, los ratones Knockout son modelos adecuados, pero los ratones y los humanos difieren significativamente en su anatoma, fisiologa y modo de vida por lo que el uso del ratn como modelo gentico ha demostrado algunas limitaciones con respecto al estudio de numerosos caracteres humanos. Los animales de granja, tales como cerdos, ovejas y ganado vacuno, podran ser modelos ms apropiados para evitar algunos problemas, como por ejemplo el requerimiento de periodos de observacin ms largos en el estudio de muchas enfermedades humanas. Se han usado cerdos transgnicos como modelo experimental en estudio de la retinitis pigmentosa.1 Tambin se ha estudiado en modelos porcinos la alteracin del factor de liberacin de la hormona del crecimiento, que se observa en pacientes con sndrome de Turner, enfermedad de Crohn, insuficiencia renal y retraso de crecimiento intrauterino. Una diversidad de enfermedades neurodegenerativas, como el sndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob o el insomnio familiar fatal, debidas a una alteracin en la protena prin celular (PrPc), han sido estudiadas en modelos transgnicos de ratn y ganado vacuno, creando incluso animales resistentes a estas patologas. Tambin se han utilizado ratones transgnicos, conejos, ovejas y cerdos como modelos para examinar el crecimiento postnatal de los mamferos. Se han incorporado en los animales los genes que expresan la Hormona del Crecimiento (GH) y los factores de crecimiento anlogos a la insulina. Esto ha permitido el estudio de la expresin crnica de estas hormonas, independientemente de la regulacin normal. Los resultados han demostrado que el aumento de GH conlleva la mejora de las tasas de crecimiento y la eficiencia alimentaria en ganadera, si bien, todava se acompaa de efectos secundarios indeseables como el aumento de la incidencia de artritis y el engrosamiento de los huesos. Son innumerables las lneas de investigacin que utilizan animales transgnicos como modelos con resultados iniciales prometedores. El estudio del envejecimiento, la ateroesclerosis, la diabetes, el Sndrome de Parkinson o las enfermedades cardiovasculares, son algunos ejemplos de campos en los que la investigacin con estos reactivos biolgicos puede dar rditos en los prximos aos.1

Fig. 1. Ratn transgnico con el gen humano.

CLONACIN DE ANIMALES El trmino clonacin se ha empleado de manera confusa en los ltimos tiempos para nombrar varios tipos de procedimientos muy diferentes en particular en debates pblicos acerca de la tica de la investigacin con clulas madre. Es importante entender las diferencias. De acuerdo con la definicin biolgica, un clon es un conjunto de individuos idnticos desde el punto de vista gentico debido a que provienen de un mismo progenitor. El tipo de clonacin ms simple es la clonacin de clulas, que implica tomar una sola clula madre epidrmica de la piel y dejarla crecer y dividirse en cultivo para obtener un gran clon de clulas epidrmicas genticamente idnticas y luego usarlas, por ejemplo, para ayudar a reconstruir la piel de un paciente con quemaduras graves. Este tipo de clonacin no es ms que una extensin de los procesos de proliferacin y reparacin celular que se producen en un cuerpo humano normal por mtodos artificiales.2

La clonacin de animales multicelulares enteros, denominada clonacin reproductiva, es una empresa muy diferente que implica un alejamiento mucho ms radical de la evolucin natural normal. En condiciones normales cada animal tiene una madre y un padre y desde el punto de vista gentico no es idntico a ninguno de los dos. La clonacin reproductiva saltea la necesidad de padres y de unin sexual. En los mamferos esta hazaa difcil se logr en ovejas y en algunos animales domsticos por medio del trasplante nuclear. El procedimiento comienza con un vulo no fecundado. El ncleo de este gameto haploide se elimina por aspiracin y en su lugar se introduce un ncleo de una clula diploide comn. La clula diploide donante puede obtenerse, por ejemplo, de un tejido de un individuo adulto. Se permite el desarrollo de la clula hbrida, compuesta por un ncleo diploide de un donante alojado en el citoplasma de un vulo husped, durante un perodo breve en un medio de cultivo. En un pequeo porcentaje de casos este cultivo puede originar un embrin temprano, que luego se inserta en el tero de una madre sustituta.2

Fig. 2. Las clulas del tejido adulto pueden usarse para clonacin, trmino con dos significados bastante diferentes. En la clonacin reproductiva se produce un individuo multicelular nuevo completo; en la clonacin teraputica solo se producen clulas.

Dolly fue el resultado de la fusin de un ncleo procedente de una clula mamaria extrada de una oveja adulta con un vulo al que previamente se le haba extrado el material gentico (proceso conocido como enucleacin). El equipo escocs demostraba as que las clulas adultas y especializadas podan ser reprogramadas. (4)

Clonacin de la oveja Dolly

Se aislaron las clulas de la glndula mamaria de una oveja de una oveja Finn Dorset de seis aos. Se aislaron los ovocitos de otra oveja adulta, y se eliminaron los ncleos haploides por micromanipulacin. Se fusionaron las clulas de ambas ovejas por electroporacin y se mantuvieron en cultivo 6 das antes de su implantacin en el tero. Tras 150 das de gestacin naci Dolly. (4)

fig.3: Esquema representativo de las etapas que llevaron a la creacin de la oveja Dolly mediante la tcnica de transferencia de nuclear una clula somtica diferenciada.

TRANSGNESIS: La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN extrao en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismos multicelulares. (3) Hoy en da, la insercin de genes forneos en bacterias es prcticamente rutinaria. El procedimiento de aislamiento de los genes, as como el de su incorporacin a las bacterias (4) A travs del tiempo se fueron desarrollando varias tcnicas para la creacin de animales transgnicos.

Recombinacin homloga: Se basa en el hecho de que las regiones con homologa en la secuencia de ADN se atraen Mutuamente, lo cual permite el intercambio de material gentico entre esas regiones. (4) Esta tcnica emplea regiones de homologa entre el ADN endgeno (cromosmico) y el exgeno (transgn), para insertar el gen de inters en un rea especfica del cromosoma (4) Transferencia gnica por microinyeccin: Microinyeccin pronuclear: pequeas cantidades del ADN de inters (transgen) eran inyectadas en el proncleo de un embrin al estado de dos clulas.(3) El proceso de recombinacin homloga tiene una eficiencia baja que, a diferencia de la inyeccin pronuclear, no permite su empleo directo en embriones, por lo cual debe realizarse en clulas pluripotenciales: las clulas madre embrionarias. (4)

fig.4: Representa un dibujo esquemtico de cmo se introduce el ADN por microinyeccin en el proncleo del zigoto

fig.5: foto tomada en tiempo real en la que se observa lo descrito anteriormente.

 Transferencia gnica con transposones: Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen genes adicionales a parte de los necesarios para la transposicin y estn dentro de secuencias repetidas. (3) Los trasposones son secuencias de material genmico que tienen la capacidad del saltar fuera y dentro del genoma. Son capaces de

autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios dentro del genoma (trasponerse o saltar). Pueden entrar en plsmidos y ser propagados por ellos. Estas propiedades les confieren la capacidad de ser transferidos fig.6: Estructura bsica de los transposones

exitosamente en clulas y genomas extraos.

Transferencia gnica con vectores virales Los vectores virales son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de un virus, tratando de eliminar sus caractersticas patolgicas y adaptarlos a una nueva funcin como transportadores de material gentico heterlogo. (3) Esta tcnica se ha usado en ratones con xito y se ha extendido a gallinas, vacunos y suinos .

fig.7: Vectores virales de transferencia gnica

Terapia gnica: problemas con vectores virales (5)

REPUESTA INMUNE (ADENOVIRUS) ESPECIFICIDAD MUTAGENESIS INSERCIONAL (RETROVIRUS)

ELIMINACIN GENES VIRALES EN EL VECTOR MODIFICACIN PROTENAS CAPSIDA, TRANSCRIPCIN DIRIGIDA GENES SUICIDAS INTEGRACION ESPECIFICA

Transplante de ncleos y clones Clonacin: Proceso de elaboracin o de manipulacin que permite obtener copias idnticas o casi idnticas de las clulas madre o progenitoras utilizadas. (3) Si el producto o embrin se transfiere a un tero, se produce la implantacin en el endometrio y se desarrolla un nuevo ser (clonacin reproductiva) si se transfiere a un medio de cultivo, el embrin dar origen a clulas madre embrionarias con la potencialidad para diferenciarse hacia cualquier tipo de clula adulta (clonacin teraputica).

Mtodos de clonacin 1. Particin.- En esta tcnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de preimplantacin. A partir del embrin seleccionado, se toman mitades o secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelcidas naturales o artificiales. (3) 2. Clonacin por transferencia nuclear de clulas somticas (SCNT: Somatic Cell Nuclear Transfer).-Esta tcnica se basa en la habilidad de inyectar o fusionar vulos carentes de ncleos con ncleos diploides derivados de clulas somticas en cultivo. Estas clulas pueden ser transfectadas de manera estable y proporcionar cientos de animales idnticos en una generacin. (3) Sin embargo, los intentos por realizar transferencia nuclear con clulas ms diferenciadas fueron infructuosos, lo que llev a pensar que el ADN de clulas diferenciadas no poda reprogramarse, surgiendo entonces el dogma de que el proceso de diferenciacin celular era irreversible. Este dogma se derrumb el 27 de febrero de 1997, fecha en que Ian Wilmut y sus colegas del Instituto Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en la revista Nature cmo haban creado a la oveja Dolly. (3)

Animales transgnicos Los animales transgnicos son organismos manipulados genticamente para incorporar un gen forneo en su genoma. (4) Hay mltiples razones que respaldan la necesidad de criar y producir animales transgnicos, entre ellas podemos destacar (6): avanzar en el conocimiento y descifrar el cdigo gentico. Estudiar el control gentico de los productos fisiolgicos. Construir modelos genticos de enfermedades Mejorar la produccin animal, enriqueciendo sus rasgos y consiguiendo nuevos productos dentro de este contexto general, la biotecnologa ha incorporado la modificacin gentica en animales como una herramienta ms, utilizada en:

a) Ciencia bsica b) Biomedicina (modelos animales de enfermedades humanas, donacin de rganos para xenotrasplantes) c) Industria farmacutica (animales transgnicos como birreactores para la sntesis de protenas de alto valor y como biosensores) d) Zootecnia (mejora de los caracteres productivos; resistencia a enfermedades, etc.) Modelos de animales transgnicos (3)

a. Animales transgnicos como fbricas de protenas: Vaca transgnica productora de hormona del crecimiento: b. Las ventajas de esta estrategia son es un mtodo natural con muy bajo impacto ambiental el costo de produccin es relativamente bajo.

Algunos animales de granja transgnicos: La primera oveja transgnica fue Tracy y vivi entre 1991 y 1998. Tracy produca a1- antitripsina en la leche, un medicamento para tratar la fibrosis qustica, una enfermedad que afecta los pulmones (3) Animal Conejo Cabra Cerdo Oveja Vaca Frmaco producido Interleukina-2 a-Glucosidasa Activador del plasmingeno tisular Anti-trombina III Factor VIII humano Protena C a1-antitripsina Factor de coagulacin IX lactoferrina Hormona de crecimiento humano Tratamiento Deficiencias inmunolgicas Enfermedad de Pompe Cogulos coronarios Resistencia a la heparina Hemofilia Prevencin de trombos Fibrosis qustica Hemofilia Deficiencia de hierro Enanismo

Vaca Transgnica productora de hormona del crecimiento La tcnica empleada consiste en la fusin de un vulo de vaca no fecundado al que se le quit el ncleo, con una clula de una vaca que fue previamente transformada mediante la introduccin del gen humano que codifica para la hormona de crecimiento humana. La clula que contiene el transgn en este caso fue un fibroblasto (un tipo de clula que forma parte del tejido conectivo). Como resultado de la fusin se origina un cigoto transgnico, que se desarrolla en embrin y se implanta dentro de una vaca madre portadora, hasta su nacimiento. (3)

Fig.8: PRIMERA GENERACION: PAMPA MANSA

Posteriormente, se obtuvo la segunda generacin de animales transgnicos, Pampa Mansa II y III, clones obtenidos a partir de Pampa Mansa. (3)

Fig.9: PRIMERA GENERACION: PAMPA MANSA

c. Animales transgnicos resistentes a la mastitis: Vaca transgnica resistente a la infeccin intramamaria: Cuando una bacteria logra atravesar el canal del pezn las probabilidades de mastitis son altas. Aunque las bases genticas de la resistencia a la mastitis no son an bien conocidas. (4) Los ensayos para incrementar la resistencia de la glndula mamaria a la mastitis utilizando cruces o vacunas han tenido hasta el momento un impacto muy limitado. Sin embargo la revolucin contempornea en gentica animal conducir a posibilidades an no pensadas, la transgnesis puede ser la clave de una de ellas. (3)

Generacin de animales knockout Es la modificacin gentica que conduce a la prdida de funcin de un gen, o ms comnmente conocida como gene knock out, (3) a. Generacin de ratones knockouts.- Los ratones knockout estn alterados genticamente de tal manera que un gen concreto (diana) se ha interrumpido (inactivado y se ha convertido en no funcional. Es una tcnica compleja que utiliza la combinacin de ADN recombinante, de cultivos celulares y de manipulacin de embriones. (3)

b. Condicional knockouts.- Esta tcnica permite inactivar un gen slo en tejidos particulares y/o a tiempos especficos durante su ciclo de vida. Un ejemplo es la mutagnesis condicional que lograron en el ao 2006 en Max-Planck-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Alemania con el ratn NEX-Cre. Crearon una lnea de ratones que expresaba la recombinasa Cre bajo el control de las secuencias regulatorias de NEX, gen que codifica para la protena neuronal bHLH. Para mimetizar la expresin endgena de NEX en el telencfalo dorsal, la recombinasa Cre fue insertada en el locus de NEX por recombinacin homloga en clulas ES. El patrn de expresin de Cre fue analizado despus de que las lneas se cruzaran con lneas de ratones que tenan insertado el gen marcador lac-Z. Se visualiz una expresin prominente en el hipocampo y en el neocortex a partir de los 11,5 das. (3)

Fig.10. Seccin frontal cerebral de un ratn doble transgnico NEXCre*LacZ-marcador a la edad de 55 das. La tincin de lac-Z corresponde exactamente a la expresin conocida de los dominios del gen NEX, como el hipocampo y el neocortex. c. Aplicaciones de las tcnicas knockout.- Actualmente existe una gran carencia de rganos para trasplantes humanos que no es cubierta por las donaciones. El trasplante de rganos de animales hacia humanos (xenotrasplantes) podra ser la solucin. Sin embargo, existen muchas barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal barrera consiste en el fenmeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia de anticuerpos naturales contra eptopes del disacrido galactosa 1-3 galactosa presente en las superficies celulares de mamferos, pero que estaran ausentes en las superficies celulares de humanos y monos. (3) Este es uno de los principales usos donde la tecnologa de recombinacin homloga acoplada con transferencia nuclear est siendo explotada. La reciente generacin de cerdos transgnicos en los que se elimin el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitira la produccin de animales que carecen del eptope responsable del rechazo hiperagudo, es una clara demostracin del poder de esta tecnologa. (3)

Produccin de anticuerpos humamos en animales Introduccin: En los seres vivos hay un mecanismo de defensa frente a microorganismos o sustancias extraas al organismo (como los patgenos) denominado Sistema Inmune. Cuando una de estas agresiones externas entra en contacto con el organismo, se pone en marcha la Respuesta Inmune. Una de las primeras lneas de defensa del organismo son los linfocitos B, los cuales forman anticuerpos; clulas capaces de reconocer las sustancias extraas (7). Anticuerpos: Los anticuerpos, tambin denominadas inmunoglobulinas (Ig), son glucoproteinas especializadas que hacen parte de la inmunidad humoral; son producidos por las clulas del sistema inmune llamadas clulas B, que tienen la capacidad de reconocer otras molculas especificas llamadas antgenos. Funcionan como la parte especfica del denominado complejo receptor de clulas B (BCR) reconociendo al antgeno a nivel de la membrana del linfocito B, y como molculas circulantes secretadas por las clulas plasmticas procedentes de la activacin, proliferacin y diferenciacin de clulas B. Estructuralmente estn formados por dos cadenas polipeptdicas pesadas H (del trmino anglosajn Heavy pesado) y dos cadenas ligeras L (del trmino anglosajn Light ligero) unidas entre s mediante enlaces covalentes. Las cadenas ligeras consisten en una regin variable (VL) y una constante (CL) mientras que las pesadas presentan una regin variable (VH) y tres constantes (CH1, CH2, CH3). Funcionalmente podemos distinguir dos porciones en los anticuerpos: una de ellas implicada en el reconocimiento y unin al antgeno denominada regin Fab (antigen binding Fragment) y otra implicada en las funciones de los anticuerpos y en su vida media en sangre4, llamada regin Fc (crystallizable Fragment)(7).

Estructura de un anticuerpo

Existen cinco clases diferentes de anticuerpos, que se diferencian entre s por una serie de cambios estructurales que les confieren diferentes funciones en el organismo. Los cinco tipos de anticuerpos se denominan: Ig G, Ig M, Ig E, Ig A e Ig D(7).

TIPO DE ANTICUERPO Nombre IgG

Caractersticas Anticuerpos ms abundantes en el organismo. Neutralizan y hacen que precipiten los antgenos. Activan el sistema del complemento. Capaces de unirse a otras clulas del sistema inmune (macrfagos, clulas NK...). Son capaces de atravesar las membranas biolgicas y por tanto durante el embarazo pueden pasar de la madre al feto. Son los anticuerpos que responden en primer lugar en presencia de un antgeno. Neutralizan y hacen que precipiten los antgenos. Activan el sistema del complemento. Constituidos por cinco subunidades (pentamricos).

IgM

IgA

Constituidos por dos subunidades (dimricos). Neutralizan y hacen que precipiten los antgenos. Protegen la entrada ms comn para los patgenos al organismo (la boca, la vagina, los ojos, el sistema respiratorio, el sistema digestivo). Se encuentran de manera ms abundante en la superficie de mucosas y de lquidos biolgicos como lgrimas, saliva, lquido cefalorraqudeo, etc. Aparece en la leche materna, pasando de madre a hijo.

IgE

Mediador en las reacciones alrgicas.

IgD

Participa en la activacin de linfocitos B al actuar como receptor en la superficie de ellos. No se conoce con demasiada precisin cul es su funcin en el organismo.

Produccin de Anticuerpos: Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B en el organismo como respuesta a la entrada de un patgeno o sustancia extraa a l. Del mismo modo que ocurre en los seres humanos, los animales tambin combaten agentes externos produciendo anticuerpos en su sistema inmune. Por esta razn tradicionalmente es posible obtener anticuerpos contra un antgeno conocido empleando modelos animales. Las razones por las cuales se utilizan animales y no personas son evidentes. Para producir anticuerpos clsicamente en animales, como el conejo o el caballo (sueros con anticuerpos policlonales), el primer paso consiste en inyectar al animal la sustancia frente a la cual se desea obtener las inmunoglobulinas. Posteriormente es posible extraer y aislar los anticuerpos del suero. Este procedimiento por el cual al cabo de unos das se aslan del suero de los animales los anticuerpos, se denomina inmunizacin(7). Mecanismo de accin de los Anticuerpos: La principal funcin biolgica de los anticuerpos es unirse a cualquier sustancia extraa o antgeno, que haya entrado al organismo, con el fin de facilitar su eliminacin. Los anticuerpos realizan una doble funcin dentro de la respuesta inmune del organismo cuanto lo invade un agente externo. Por un lado, se unen especficamente a una amplia variedad de antgenos y, por otro lado, se unen a un nmero limitado de molculas y clulas efectoras del Sistema Inmune (7).

Etapas del proceso de eliminacin de agentes extraos

En el mecanismo de eliminacin de agentes extraos al organismo, los anticuerpos tienen como funcin el reconocimiento especfico de los antgenos, provocando la respuesta inmune (etapa 3), y el reclutamiento de diferentes clulas y molculas del organismo que sern capaces de destruir y eliminar al antgeno (etapa 4) .Un solo antgeno puede presentar diferentes eptopos en su

superficie, es decir, puede estimular la produccin de diferentes anticuerpos, cada uno de los cuales es especfico para un eptopo concreto. Una sustancia extraa que contenga diferentes eptopos al entrar en el organismo provocar la produccin de anticuerpos procedentes de diferentes clones de linfocitos B. Este tipo de anticuerpos con diferente capacidad de reconocer y unirse al antgeno se denominan anticuerpos policlonales. Mientras que los anticuerpos monoclonales son especficos para un solo eptopo y estn producidos por un nico clon celular (7). Las caractersticas de los anticuerpos monoclonales hacen de ellos unos agentes teraputicos potentes y prometedores. Anticuerpos Monoclonales: Por todas las propiedades que poseen los anticuerpos, han sido empleados en terapias. Aprob el primer anticuerpo monoclonal para el tratamiento del rechazo del transplante de rin. Los anticuerpos monoclonales, por tanto, son empleados en terapia para el tratamiento de diversas enfermedades formando la familia de frmacos denominados anticuerpos monoclonales teraputicos. Debido a la especificidad de unin que poseen los anticuerpos, son empleados en la localizacin y eliminacin de patgenos infecciosos como el virus respiratorio sincitial (VRS). Tambin se utilizan como terapia en la deteccin de clulas concretas del organismo como por ejemplo clulas tumorales, incluso en la inhibicin de procesos inflamatorios. Los anticuerpos monoclonales teraputicos actualmente comercializados junto con sus aplicaciones teraputicas, tecnologas de produccin y mejora de su efectividad teraputica, sern presentados a continuacin (7).

Tecnologas de produccin de Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B en el organismo como respuesta a la entrada de un patgeno o sustancia extraa a l. Del mismo modo que ocurre en los seres humanos, los animales tambin combaten agentes externos produciendo anticuerpos en su sistema inmune. Por esta razn tradicionalmente es posible obtener anticuerpos contra un antgeno conocido empleando modelos animales. Las razones por las cuales se utilizan animales y no personas son evidentes. Uno de los grandes retos para el desarrollo de anticuerpos monoclonales teraputicos se centra en la bsqueda y seleccin de nuevas dianas especficas de las clulas implicadas en el desarrollo de la enfermedad. Por ejemplo, en el tratamiento de ciertos tipos de tumores, el escenario ideal sera conocer molculas o marcadores que se expresen de forma especfica en las clulas tumorales y no en las clulas sanas. Si se dispone de dianas perfectamente caracterizadas, el anticuerpo monoclonal producido ejercera su accin teraputica en aquellas clulas del organismo seleccionadas. Las diferentes tecnologas para la produccin de anticuerpos monoclonales se presentan a continuacin (7).

Generacin de Hibridomas (George khler y cesar milstein en 1975) El primer paso necesario para la generacin de hibridomas consiste en la inmunizacin de un ratn con el antgeno de inters al que posteriormente se le han de extraer linfocitos B. Estas clulas productoras de anticuerpos contra el antgeno inyectado mueren tras pocos das en cultivo in vitro, de tal manera que para obtener una fuente continuada de anticuerpos, se fusionan con clulas inmortales de mieloma. Tras seleccionar (en diversos medios de cultivo celular) los hbridos productores de los anticuerpos especficos frente al antgeno deseado, se cultivan para producir grandes cantidades del anticuerpo (7).

Tipos de Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos murinos: el 100% del anticuerpo procede del ratn. Por este motivo las aplicaciones teraputicas de estos anticuerpos se han visto limitadas debido a la respuesta inmune que producen en el ser humano. El sistema inmune humano reconoce estos anticuerpos como extraos y genera sus propios anticuerpos frente a ellos. Actualmente existen tres anticuerpos monoclonales teraputicos en el mercado de este tipo. Anticuerpos quimricos: en este tipo de anticuerpos las regiones variables proceden de ratn y las regiones constantes son humanas. Estn construidos gracias a tcnicas de ingeniera gentica. Con esta estrategia se consigui reducir la respuesta inmune que se produca frente a los anticuerpos murinos. Actualmente existen cinco anticuerpos

monoclonales teraputicos de este tipo en el mercado. Anticuerpos humanizados: en estos anticuerpos solamente las regiones CDR de las partes variables de los anticuerpos proceden de ratn siendo el resto del anticuerpo de origen humano. Actualmente existen diez anticuerpos monoclonales teraputicos de este tipo en el mercado. Anticuerpos humanos: estos anticuerpos son en su totalidad de origen humano, reduciendo as el riesgo de producir una respuesta inmune. Actualmente existen dos anticuerpos monoclonales teraputicos de este tipo en el mercado(7).

Gracias al desarrollo de las tcnicas de Biologa Molecular entre otras, se han obtenido distintos modelos de ratones transgnicos portadores de genes para las inmunoglobulinas humanas. Dichos genes (transgenes) que portan estos ratones posibilitan el desarrollo de una gran poblacin de linfocitos B productores de un amplio repertorio de anticuerpos humanos (7). La produccin de anticuerpos monoclonales murinos mediante la tecnologa de hibridoma es relativamente sencilla, en cambio la produccin de anticuerpos humanos mediante la generacin de hibridomas humanos es dificultosa debido a la baja productividad. Por todo esto, tiene lugar el desarrollo de otras tecnologas alternativas a la generacin de hibridomas para la produccin de anticuerpos humanos. Estas tecnologas incluyen la produccin de fragmentos de anticuerpos mediante la tecnologa Phage-Display y su expresin en E. coli u otras clulas, as como el desarrollo de ratones transgnicos para los genes de las inmunoglobulinas humanas(7) .

Tecnologa de produccin de anticuerpos mediante generacin de hibridomas con clulas de ratn transgnico.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Mara DP, Fernando AV. Animales modificados genticamente. Biotecnologa [Internet]. 2008 [citado 2 Feb 2014]; 2(1): 64-73. Disponible en: http://www.colvema.org/pdf/6473geneticaii.pdf

2. BRAY, Dennis. (2006). Introduccin a la Biologa Celular. 2, ed. Panamericana: Mxico. p: 725

3.

Patricia Narbn Fernndez. Transferencia gnica en animales [internet]. junio 2008 [citado 6 feb 2014]; p: 9-30, 40-48 disponible:

http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/PatriciaNarbon.pdf

4. Dr. Brian M. Cavagnaria . Generacin de animales transgnicos.Regulacin de la expresin gentica [internet] 2010 [citado 6 feb 2014; 108(5):438-444 disponible en: http://www.scielo.org.ar/pdf/aap/v108n5/v108n5a10.pdf.

5. ANIMALES TRANSGENICOS ; citado en: citado 6 feb 2014[en lnea]: http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ldesviat/_private/GENMOLHUM/tema%209.pdf

6. http://www.colvema.org/pdf/6473geneticaii.pdf

7. Gema Ruiz y col. (2007).Anticuerpos monoclonales teraputicos. (1, ed.). Genoma: Espaa.pp:9-19