BIOLISA ANTI HBs

K 121 INSTRUES DE USO

FINALIDADE Teste para a deteco quantitativa de anticorpos antiantgeno de superfcie de vrus da Hepatite B em soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio, em microplaca. Somente para uso diagnstico in vitro. PRINCPIO DE AO Metodologia: Enzimaimunoensaio ou imunoenzimtrica. O Kit BIOLISA Anti-HBs um ensaio imunoenzimtico quantitativo em fase slida baseado no princpio sanduche para a deteco de anticorpos Anti- HBs incluindo anticorpos IgG, IgM e IgA em soro ou plasma humano. A microplaca revestida com HBsAg recombinante. Durante o teste, as amostras so adicionadas microplaca revestida com antgeno e ento incubadas. Se a amostra contiver anticorpos Anti-HBs, este se ligar ao antgeno que reveste a microplaca. Aps a lavagem, adiciona-se o conjugado Anti Anti-HBs que formar um complexo antgenoAnti-HBs-conjugado. Aps a incubao, a microplaca lavada para remover os materiais no ligados. Aps esta etapa, os Substratos A e B so adicionados e, em seguida, incubados produzindo uma cor azul, que indica a quantidade de anticorpos Anti- HBs presente na amostra. Uma Soluo de parada adicionada para interromper a reao havendo uma mudana de cor para amarelo, medida com um leitor de microplacas. REAGENTES 1- Padres Referncia (A - E) Cinco (5) frascos (A - E) de Padres Referncia contendo anticorpos anti - antgenos de superfcie de vrus da Hepatite B em diferentes concentraes em soluo de tampo e conservante. Estocar entre 2 e 8C. A- 0,0 mUI/mL B- 10,0 mUI/mL C- 100,0 mUI/mL D- 300,0 mUI/mL E- 500,0 mUI/mL 2-Conjugado Anticorpo anti-IgG humano ligado a peroxidase; conservante. Estocar entre 2 e 8C. 3-Placa Sensibilizada. Estocar entre 2 e 8C 4-Lavagem Concentrada (50x) Soluo tampo, surfactante e conservante. 5-Substrato A Tampo contendo perxido de hidrognio; conservante. Estocar entre 2 e 8C. 6-Substrato B Tampo contendo tetrametilbenzidina (TMB); conservante. Estocar entre 2 e 8C. 7-Soluo de Parada cido clordrico 1N. Estocar entre 2 e 8C. 8-Seladores de Placa APRESENTAO
REAGENTES 1 - Padres Referncia 2- Conjugado 3- Placa sensibilizada acondicionada em embalagem de alumnio, com slica (anti Umidade) 4- Lavagem Concentrada 5- Substrato A 6- Substrato B 7- Soluo de Parada 8- Seladores de Placas 1 96 cavidades 1 Frasco (A - E) X 1 mL 1 Frasco X 8 mL 2 192 cavidades 2 Frascos (A - E) X 1 mL 2 Frascos X 8 mL 3 480 cavidades 4 Frascos (A - E) X 1 mL 5 Frascos X 8 mL

1 Unidade (96 cavidades)

2 Unidades (96 cavidades)

5 Unidades (96 cavidades)

1 Frasco X 20 mL 1 Frasco X 8 mL 1 Frasco X 8 mL 1 Frasco X 8 mL 3 unidades

2 Frascos X 20 mL 2 Frascos X 8 mL 2 Frascos X 8 mL 2 Frascos X 8 mL 5 unidades

5 Frascos X 20 mL 5 Frascos X 8 mL 5 Frascos X 8 mL 4 Frascos X 8 mL 10 unidades

EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS Materiais contidos no kit: - Reagentes descritos no item anterior - Instrues de uso (manual) Materiais necessrios, no contidos nos Kit: 1- Pipetas capazes de dispensar volumes de 5, 50 e 100 mL com preciso maior que 1,5%. 2- Repipetadores para pipetagens repetitivas de volumes de 100 mL e 300 mL, com preciso maior que 1,5% (opcional) ou pipeta multicanal. 3- Lavadora de microplaca (opcional). 4- Leitora de ELISA com capacidade de absorbncia em 450/630 nm de comprimento de onda. 5- Pipetas com volumes regulveis (200 mL a 1000 mL) para preparao do Substrato. 6- Tubos de ensaio para a preparao dos Substratos A e B. 7-Papel absorvente para secar as microcavidades. 8- Cronmetro ou relgio. 9- Frasco para estocar a soluo de lavagem, aps diluida. 10- gua destilada ou deionizada. 11- Ferramentas de Controle de Qualidade. 12- Incubadora de 37C 2C. CONDIES DE ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE A temperatura de armazenamento dever ser de 2 a 8C. O transporte em temperaturas entre 15 e 30C no dever exceder a 72 (setenta e duas) horas. No congelar. Manter ao abrigo da luz e evitar umidade. CUIDADOS ESPECIAIS 1 - Somente para uso diagnstico in vitro. 2 - Seguir com rigor a metodologia proposta para a obteno de resultados exatos. 3 - O envelope contendo as tiras deve ser aberto somente aps atingirem a temperatura ambiente Recolocar as tiras de microcavidades

no utilizadas no invlucro de alumnio, vedar e estocar a 2-8C. 4 - A gua utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de contaminantes. 5 - Colunas deionizadoras saturadas liberam gua alcalina, ons diversos e agentes oxidantes e redutores, que podem alterar de forma significativa os resultados. 6 Toda matria-prima do produto testada e deve ser no reagente para Anti-HIV 1&2 e Anti-HCV. Entretanto, esses testes no oferecem total segurana da ausncia de agentes infecciosos. A manipulao manual de todo produto que contm soro potencialmente capaz de transmitir doenas. Portanto, preciso tomar os devidos cuidados de biossegurana na manipulao desses produtos. 7- Pipetar os reagentes sempre na mesma ordem para minimizar a diferena de tempo de reao entre as microcavidades. 8 - Por medida de proteo, pode-se cobrir a placa durante a reao. Caso opte por este procedimento, necessrio que seja estabelecido como rotina. 9 - Assegurar que o fundo da cavidade esteja limpo e seco e que no haja bolhas na superfcie do lquido antes de ler a placa. No permitir que as cavidades sequem durante o ensaio. 10 - No exponha os reagentes, especialmente o substrato, luz forte ou vapores de hipoclorito durante armazenamento ou etapas de incubao. 11 - A Soluo de Parada contm cido clordrico, que um cido forte. Portanto, manuse-lo com o devido cuidado. 12 - Recomendamos aplicar as normas locais, estaduais e federais de proteo ambiental para que o descarte dos reagentes e do material biolgico seja feito de acordo com a legislao vigente. 13 - Para obteno de informaes relacionadas biossegurana ou em caso de acidentes com o produto, consultar as FISPQ (Ficha de Informaes de Segurana de Produtos Qumicos) disponibilizadas no site www.bioclin.com.br ou atravs de solicitao pelo SAC (Servio de Assessoria ao Cliente) da Quibasa. AMOSTRAS Utilizar soro ou plasma (EDTA ou Heparina). Amostras hemolisadas ou altamente lipmicas no devem ser usadas. As amostras podem ser conservadas sob refrigerao, entre 2 e 8C , pelo perodo mximo de 5 dias. Se as amostras no puderem ser analisadas dentro de 5 dias, podem ser estocadas por at 30 dias a temperatura de -20C (freezer). Para amostras que sero testadas em duplicata, o volume requerido de 0,010 mL de soro. DESCRIO DO PROCESSO PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO 1) Soluo de Lavagem: Diluir o contedo do frasco N4 (Lavagem Concentrada) em 1000mL de gua destilada ou deionizada. Estocar entre 2 e 8C at a data de validade impressa no frasco original. Pode ser armazenada em temperatura ambiente. Caso ocorra cristalizao, aquecer a 37C at dissoluo. 2) Substrato Soluo de Trabalho Determinar a quantidade de cavidades que sero utilizadas para preparo de um volume adequado. Preparar a soluo misturando partes iguais de Substrato A e Substrato B, 15 minutos antes de sua utilizao. Mantenha-o protegido da luz at ser utilizado Para cada microcavidade (teste), utilizar: 50mL de Substrato A + 50mL de Substrato B Por exemplo: misture 1 mL de Substrato A e 1 mL de Substrato B para duas tiras de 8 microcavidades (16 testes). Ocorre sobra de reagente

TCNICA Antes de iniciar o ensaio, colocar todos os Reagentes,Amostras, Padres de Referncia e Controles para estabilizarem em temperatura ambiente (15 - 30C) por no mnimo 40 minutos. Retornar as tiras da microplaca que no sero utilizadas para a embalagem original selada. 1- Separar as cavidades a serem utilizadas considerando: Padres, Controles e Amostras (podendo ser testados em duplicata); 2- Separar a primeira cavidade para o Branco (OPCIONAL); 3- Pipetar 50 mL dos Padres Referncia (A - E), e amostras nas cavidades determinadas; 4- Pipetar 50 mL de Conjugado em cada cavidade exceto na cavidade Branco (caso tenha feito a opo de usar o branco); 5- Homogeneizar gentilmente durante 30 segundos. Cobrir as cavidades com o selador de placa; 6- Incubar por 60 minutos 2 minutos em uma incubadora a 37C 2C; 7- Retirar o selador de placa das cavidades; 8- Descartar o contedo das cavidades por aspirao (Lavadora) ou por decantao (manual); Usar 300 mL aproximadamente de Lavagem Concentrada previamente preparada*, para efetuar um total de cinco (5) Ciclos de lavagem. Para a garantia da secagem da placa, ao final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente. Nota: Lavagem/ secagem deficiente pode causar resultados inadequados. 9- ATENO SIGA um dos seguintes procedimentos: A) Pipetar 100 mL de Substrato previamente preparado* Soluo de Trabalho (A + B) em cada cavidade. *(Vide preparo de reagentes) OU B) Pipetar 50 mL de Substrato A em cada cavidade. Pipetar 50 mL de Substrato B em cada cavidade. 10- Homogeneizar gentilmente durante 30 segundos. 11- Incubar por 30 minutos 1 minuto em temperatura ambiente (15 30C) ao abrigo da luz. 12- Pipetar 50 mL de Soluo de Parada em cada cavidade. 13- Homogeneizar gentilmente durante 30 segundos. 14- Ler: 450nm (filtro primrio) / 630nm (filtro secundrio) em at 30 minutos (no mximo). DESCRIO DOS CALCULOS Uma curva de calibrao usada para determinar a concentrao de Anti-HBs em amostras desconhecidas. Preparo da Curva de Calibrao Registrar as absorbncias obtidas na Leitora de microplaca, como apresentado no exemplo 1. Calcular as mdias das duplicatas, caso sejam realizadas duplicatas. Plotar as absorbncias mdias de cada Padro de Referncia versus a concentrao correspondente em mUI/mL em papel milimetrado (antes de plot-las no grfico).Traar a curva. NOTA: Os dados apresentados no exemplo 1 so apenas para ilustrao e no podem ser usados em substituio curva de calibrao, que deve ser construda no laboratrio.

Exemplo 1
Padres A A B B C C D D E E Absorb 0,026 0,029 0,101 0,103 0,660 0,670 1,700 1,768 2,214 2,220 Abs. Mdia 0,027 Concentrao 0 mUI / mL

A sensibilidade, que corresponde a soma da mdia encontrada com 3 vezes o desvio padro, para este mtodo, igual a 1,02 mUI/mL. Sensibilidade e Especificidade Clnica O Kit BIOLISA Anti HBs analisou amostras clnicas em comparao com outros mtodos de EIA. Os resultados mostram que a sensibilidade clnica do Kit BIOLISA Anti HBs 99,3%, e a especificidade clnica de 99,1%. BIOLISA ANTI HBs X EIA REFERNCIA
TOTAL 898 1667 2565

panhamento dos indivduos infectados, bem como um indicador de sucesso dos vacinados contra o VHB. NMERO DE TESTES Apresentao 1 96 testes Apresentao 2 192 testes Apresentao 3 480 testes BIBLIOGRAFIA 1. Frank Fenner and David O. White, Medical Virology, 4th Edition, Academic Press, 1994. 2. Centers for Disease Control. Viral Hepatitis B Fact Sheet. 3. Richman, D., R. Whitley, F. Hayden.Clinical Virology. New York: Churchill Livingstone Inc., 1997. 4. World Health Organization. World Health Organization Hepatitis B Fact Sheet. N204.Revised October 2000. 5. World Health Organization. Hepatitis B. 2002. 6. Bioclin Dados de arquivos. GARANTIA DE QUALIDADE Antes de serem liberados para consumo, todos os reagentes Bioclin so testados pelo Departamento de Controle de Qualidade. A qualidade dos reagentes assegurada at a data de validade mencionada na embalagem de apresentao, desde que armazenados e transportados nas condies adequadas. DADOS DO FABRICANTE QUIBASA QUMICA BSICA Ltda Rua Teles de Menezes, 92 - Santa Branca CEP 31565-130 - Belo Horizonte - MG - Brasil Tel.: ( 31 ) 3439.5454 - Fax ( 31 ) 3439.5455 E-mail: bioclin@bioclin.com.br CNPJ: 19.400.787/0001-07 - Indstria Brasileira ATENDIMENTO AO CONSUMIDOR Servio de Assessoria ao Cliente Tel.: 0800 0315454. e-mail: sac@bioclin.com.br Nmero de Registro do Kit Biolisa Anti HBs na ANVISA: 10269360198 Reviso: Fevereiro/12

0,102

10,0 mUI / mL

0,665

100,0 mUI/ mL

MTODO RESULTADO BIOLISA ANTI HBs

EIA REFERNCIA POSITIVO 883 6 889 NEGATIVO 15 1661 1676

1,734

300,0 mUI / mL

POSITIVO NEGATIVO

2,217

500,0 mUI/mL

RESULTADO TOTAL

NOTA: As amostras que tenham absorbncia acima do Padro de Referncia devem ser pr-diludas e testadas novamente. A concentrao deve ser multiplicada pelo fator de diluio. Leitura automtica e clculo podem ser realizados atravs da funo de regresso linear em programas adequados de computador. INTERPRETAO DOS RESULTADOS NO REATIVO: Amostras com concentrao menor que 10 mUI/mL, so consideradas negativas, para Anti-HBs. REATIVO: As amostras com concentrao superior a 10 mUI/mL so consideradas positivas para Anti-HBs. NOTA: No caso de resultado entre 9 e 11 mUI/mL, a amostra deve ser reanalisada. As amostras que obtiverem resultados repetidamente entre 9 e 11 mUI/mL devem ser retestadas utilizando um mtodo alternativo. Se os resultados se confirmarem, deve-se coletar uma nova amostra em duas semanas. Se a nova amostra for positiva, a amostra deve ser considerada positiva. LIMITAES DO PROCESSO A interpretao de um teste diagnstico, no deve ser estabelecida com base em um nico ensaio. Devem- se incluir outros testes de confirmao, antes que uma amostra seja considerada positiva. Um resultado negativo no exclui a possibilidade de exposio. Enfim, todos os resultados devem ser interpretados em conjunto com outras informaes clnicas disponveis. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE O Laboratrio Clnico deve possuir um programa interno de controle da qualidade, onde procedimentos, normas, limites e tolerncia para variaes sejam claramente estabelecidos. importante ressaltar que todos os sistemas de medio apresentam uma variabilidade analtica caracterstica, que deve ser monitorada pelos prprios laboratrios. Para tanto, recomendvel a utilizao de controles, que permitem avaliar a preciso e a exatido das dosagens. CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO CONTROLE DE QUALIDADE Exatido COMPARAO DE MTODOS E ESPECIFICIDADE METODOLGICA O kit BIOLISA Anti HBs foi comparado com outro mtodo ELISA disponvel comercialmente. Foram utilizadas 07 amostras de soro humano. A equao da reta de regresso linear obtida foi y = 0,9992x + 0,4894 e o coeficiente de correlao 0,9998. Com estes resultados pode-se concluir que os kits apresentam boa especificidade metodolgica. Sensibilidade Analtica A sensibilidade indica o limite de deteco do mtodo. Foi calculada a partir de vinte (20) determinaes de Anti-HBs, em uma amostra isenta desses analitos. Foi encontrado um valor mdio igual a 0,97 mUI/mL, com desvio padro de 0,02 mUI/mL.

Sensibilidade Clnica: 99,3% (98,5 - 99,8%)* Concordncia global: 99,2% (98,8 - 99,5)* Especificidade Clnica: 99,1% (98,5 - 99,5%)* 95% Intervalo de confiana* Preciso REPETIBILIDADE Foram realizadas 20 dosagens sucessivas com trs amostras, utilizando o mesmo lote, obtendo-se os seguintes resultados:
Amostra Mdia Desvio padro Coeficiente de variao (%) Reprodutibilidade 1 1,849 0,036 1,957 2 26,716 0,295 1,104 3 137,406 0,387 0,281

REPRODUTIBILIDADE Foram realizadas 20 dosagens durante 3 dias consecutivos com trs amostras, utilizando o mesmo lote, obtendo-se os seguintes resultados:
Amostra Mdia Desvio padro Coeficiente de variao (%) Reprodutibilidade 1 1,844 0,006 0,302 2 26,691 0,030 0,1 12 3 137,514 0,094 0,068

LINEARIDADE A reao capaz de detectar concentraes at a concentrao do ponto mais alto da curva de calibrao. Para amostras com valores superiores, diluir a mesma, repetir a dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. SIGNIFICADO CLNICO O vrus da hepatite B um vrus de envelope esfrico, de DNA de cadeia dupla, da famlia Hepadnaviridae. A Hepatite B transmitida atravs do contato sexual, exposio de sangue, transmisso de me para filho durante o parto ou partilha de objetos perfuro cortantes. A infeco pelo VHB tem sido associada a uma variedade de doenas do fgado de leve a crnica, incluindo cirrose, e carcinoma hepatocelular. Em alguns casos, o vrus pode persistir por toda a vida. Anualmente, 1 milho de pessoas morrem de hepatite crnica ativa, cirrose ou cncer de fgado primrio. A Hepatite B Infecta milhes de pessoas no mundo inteiro e considerado um problema de sade pblica. O HBsAg um dos primeiros marcadores que aparecem no sangue aps a infeco com o vrus da hepatite B. A resposta imune infeco inclui o desenvolvimento de anticorpos especficos para o HBsAg. Estes anticorpos aparecem poucas semanas aps o HBsAg ser detectado no sangue, quando o vrus j no pode ser passado para outras pessoas . O aparecimento do Anti- HBs est associado com a recuperao e considerado o marcador para a imunidade. Estes anticorpos tambm aparecem como resultado de uma imunizao de sucesso. Portanto, a deteco e monitorao de anticorpos contra o HBsAg tornou-se uma importante ferramenta na triagem e no acom-