PEMERIKSAAN SEROLOGI & IMMUNOLOGI HIV & AIDS

Prof. DR. Dr. Ratna Akbari Ganie, SpPK, FISH Prof Dr. Adi Koesoema Aman, SpPK(KH), FISH

DEPARTEMEN PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN USU / RSUP H.ADAM MALIK MEDAN

Acquired Immune Deficiency Syndrome

Syndrome penyakit disebabkan oleh virus RNA pada umumnya HIVHIV -1 dan sebagian kasus di Afrika Tengah disebabkan oleh HIV HIV-2.
Transmisi cairan virus melalui cairan tubuh yang terinfeksi melalui hubungan Seksual, Homoseksual, Homoseksual Penggunaan jarum suntik yang terkontaminasi, Transfusi komponen darah dan Vertikal transmisi kepada bayi yang dilahirkan oleh ibu yang menderita HIV

Tujuan Pemeriksaan : AntiAnti -HIV digunakan untuk menegakkan diagnosis, diagnosis menentukan angka kesakitan infeksi HIV/AIDS melaui surveilans, mengamankan darah transfusi dan transplantasi jaringan jaringan. .

Pemeriksaan Laboratorium Pasien Terinfeksi HIV ditujukan kepada :

1. Humoral Component ( antibodi ) 2 Cellular Component ( CD4 = T2. T- Helper ) 3. Viral Load (PCR)
Pada Pasien AIDS, penentuan konsentrasi sel T-helper limfosit sangat penting. penting . Leukopenia dan lymphocytopenia selalu dijumpai dijumpai. .

Struktur HIV

STRUKTUR PROTEIN HIV-1 dan HIV-2` Virus HIVHIV -1 Protein gp41 Location Envelope(transmembrane protein) Gene env env gag env env gag g g

gp160/12 Envelope (external protein) 0 p24 HIVHIV -2 Gp34 gp140 p26 p Core (major structural protein) Envelope(transmembrane protein) Envelope (external protein) Core ( (major j structural p protein) )

gp120

translation

1 PEMERIKSAAN KOMPONEN HUMORAL 1.

Humoral component : Penderita HIV ( + ) membentuk antibodi anti anti-envelope antibodi gp120, antianti -p24 antibodi Metode pemeriksaan : - ELISA S ( (Enzym Immunoassay) ) - kuantisasi - kualitasi (Rapid test)

HIV Antigen ELISA mendeteksi HIV core Antigen (p24) merupakan mayor antigen . HIV antibodi terhadap protein gp120 dan p24

Pemeriksaan antibodi Induplo ( cek ulang dengan duplikasi ) untuk menghindari teknikal error dan false positif. Hasil :
Reaktif pemeriksaan konfirmasi menggunakan metode Western Blood Test ( WB Test ) . False positif jarang terjadi.

Kekurangan WB Test :
1. Memerlukan waktu yang lama 2 Membutuhkan Staff yang terlatih 2. 3. Memerlukan biaya yang relatif mahal

KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA NOMOR : 241/Menkes/SK/IV/2006 TENTANG STANDAR PELAYANAN LABORATORIUM KESEHATAN PEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIK Tentang g Penggunaan strategi III :

Kombinasi 3 reagen rapid test HIV Tujuan T j an Diagnosis Diagnosis.

Strategi III dengan persyaratan reagensia sebagai berikut : 1. Sensitivitas reagen pertama >99% 2. Spesifisitas reagen kedua > 98% 3. Spesifitas S f reagen ketiga > 95% % Untuk tujuan surveilans :
reagen pertama harus memiliki sensitiviras >99%. Spesifisitas reagen kedua >98%. Semua regensia yang dipakai harus terdaftar di DepKes RI RI.
Pemeriksaan menggunakan strategi III untuk diagnosis pasien yang Asymptomatic.

Standar St d alur l pemeriksaan ik anti antiti-HIV Pemeriksaan anti anti-HIV disertai informed consent tertulis, sebelumnya didahului dengan konseling pra pra-uji / test dan sesudahnya konseling pascapasca-uji / test test. . Pelaporan p pemeriksaan dilaporkan p p reaktif dan non reaktif. reaktif.

KERAHASIAAN!!!!

Alur Pemeriksaan Strategi III

2. Pengukuran cellular component :

Target cell adalah T.helper (CD4+) Normal :CD4+ : 65 % dan CD8+ : 35% dari total T T-cell Pada penderita AIDS konsentrasi CD4+ menurun secara drastis. Konsentrasi CD4+ dihubungkan dengan konsentrasi CD8 . Menyebabkan rasio CD4+ / CD8 terbalik pada HIV / AIDS

TECHNIC PEMERIKSAAN .
CD4+ Cara Immunophenotypng menggunakan Flow Cytometri dan Cell sorter

PRINSIP :
Menggabungkan gg g kemampuan p alat untuk mengindentifikasi karakteristik masingmasing-masing permukaan cell dengan kemampuan memisahkan cell yang y g berada dalam suatu suspensimenurut p karakteristik masingmasing -masing dengan menggunakan satu atau lebih Probe yang sesuai secara automatis melalui suatu celah yang y g diteruskan oleh seberkas sinar laser.

IMMUNOPHENOTYPING ( IMMUNOLOGI MARKERS ) SEL :

DEFINISI : P t d Immunologi Pertanda I l i dari d i struktur t kt / antigen permukaan sel baik sel normal maupun sel abnormal .

Immunophenotyping Hematolog

- Methode Immunoflourescent - Methode Immunoenzymatic

Cara Immunoflourescent :
K Keuntungan t : - Cepat - Bisa double flourescent dua warna - Banyak di gunakan Kerugian : - Flourescent tidak tahan lama - Sulit memvisualisasikan morfologi sel

Methode Immunoflourescent

-Immunoflourescent Labelling Sel Suspension - Monoklonal antibodi - Flourochrome ( FITC, Rhodamine, Pycoerythrine )

Methode Immunoenzymatic .
1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang 2. Lebelling Immunoenzyme pada preparat 3. Reaksikan dengan kromogenic substrate

Keuntungannya
- Label permanent - Morfologi sel dapat divisualiasikan secara simultan dengan antigen - Menggunakan mikroskope cahaya .

Kerugiannya
- Lebelling perlu waktu lama - Sulit untuk labelling ganda.

Si Sinar l laser

Cell

detector Detector dicatat sebagai karakteristik cell yang bersangkutan Identifikasi jenis cell aktivitas cell Jumlah cell dalam populasi campuran

cell

Sinyal elektronik

3. Memantau Pasien HIV Dengan Viral Load

PT Roche Indonesia Divisi Diagnostics

Pendahuluan
Diketahui bahwa AIDS disebabkan oleh Human

Immunodeficiency Virus (HIV(HIV-1). Dengan merusakkan sel sel-sel dari sistem kekebalan, virus HIV menghancurkan kemampuan tubuh untuk melawan infeksi dan jenis kanker tertentu. Target dari virus HIV adalah sel darah putih yang disebut sel CD4+ CD4+. Infeksi HIV menyebabkan jumlah sel CD4+ menurun. Bila jumlah selsel-sel CD4+ berkurang sampai pada tingkat tertentu, maka sistem kekebalan tubuh menjadi lemah. Bila jumlah CD4+ t turun dibawah dib h 200 200, atau t apabila bil infeksi i f k i oportunistik t i tik atau kanker timbul, maka seseorang dengan infeksi HIV disebut sebagai AIDS (Acquired y Syndrome). y ) Immunodeficiecy Untuk mengetahui status infeksi HIV, ada dua pemeriksaan laboratorium yang penting yaitu jumlah CD4+ dan viral load HIV.

Apakah Viral Load HIV ?

Viral Load HIV adalah jumlah partikel virus HIV yang ditemukan

dalam setiap mililiter darah. Semakin S ki b banyak kj jumlah l h partikel tik l virus i HIV did didalam l d darah, h semakin cepat selsel-sel CD4+ dihancurkan dan semakin cepat pasien kearah AIDS. Seperti S ti t tampak k pada d grafik fik dib dibawah hi ini i:

Apakah Viral Load HIV ?

Pemeriksaan Viral Load bila dikombinasi dengan

pemeriksaan jumlah CD4+ dan dipantau dari waktu ke waktu memungkinkan halhal-hal sebagai berikut :
Mengetahui bagaimana tubuh memerangi HIV Memperkirakan resiko kearah AIDS Mengetahui g efektifitas dari terapi p Viral Load memberikan tanda sejauh mana keberhasilan suatu terapi, menjaga agar virus HIV dalam kontrol dan ditekan selama mungkin dengan pengobatan pengobatan.

Apakah kegunaan pemeriksaan CD4+ dan VL?

Pemeriksaan jumlah CD4+ dan Viral Load dilakukan untuk

mendapatkan gambaran yang lengkap mengenai sistem kekebalan tubuh melawan virus. Jumlah selsel-sel CD4+ dan titer Viral Load memberikan pedoman dalam menentukan dimulainya pengobatan antianti-viral. Tujuannya j y adalah untuk menjaga j g agar g j jumlah CD4+ tinggi gg dan titer VL rendah. Untuk itu pemantauan jumlah CD4+ dan titer VL HIV sebelum dan selama pengobatan akan menunjukkan bagaimana respon terhadap terapi.

Bagaimanakah Viral Load HIV diukur ?

Viral Load HIV menggunakan suatu teknologi yang canggih dan

sensitif untuk menghitung jumlah materi genetik virus HIV yang pemeriksaan VL y yang g akurat dan ada dalam darah. Suatu p sensitif harus dapat mendeteksi secara konsisten, mempunyai spesifitas yang tinggi dan reprodusibilitasnya baik dari tes ke tes. Viral Vi l Load L d HIV di diperiksa ik d dengan menggunakan k teknologi t k l i PCR (Polymerase Chain Reaction = Reaksi Rantai Polimerase).

Bagaimanakah Viral Load HIV diukur ?

PCR adalah suatu paten teknologi yang menghasilkan

turunan/kopi yang berlipat ganda dari sekuen nukleotida dari organisme target target, yang dapat mendeteksi target organisme dalam jumlah yang sangat rendah dengan spesifitas yang tinggi.
Target Sekuen Rantai DNA

Kromosom

Bagaimanakah Viral Load HIV diukur ?

Proses PCR ini disebut amplifikasi atau

penggandaan. Dalam proses amplifikasi target sekuen digandakan berulang berulang-ulang sehingga didapat jutaan kopi/turunan yang dinamakan amplikon.
Amplikon direaksikan dengan reagensia spesifik,

sehingga dapat dihitung jumlah partikel virus HIV dalam setiap p mililiter darah y yang g diperiksa. p
Hasil pemeriksaan dilaporkan sebagai copies/ml

atau dalam perhitungan matematik logaritma atau log. Misalnya hasil pasien X adalah 173.000 copies/ml = log 5,24. 2

Proses Amplifikasi
No. of C l Cycles No. Amplicon C i of Copies fT Target t

1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

1 2 3 4 5

2 4 8 16 32 64 1,048,576 1 073 741 824 1,073,741,824

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle l = 32 A Amplicon li

6 cycle = 64 Amplicon

6 20 30

7 cycle = 128 Amplicon

Bagaimanakah Viral Load HIV diukur ? Proses Deteksi :

Denaturasi dan Hibridisasi

Deteksi

Preparasi dan Amplifikasi

Mengapa Penting mengetahui Viral Load HIV ?

Sebelum pengobatan dimulai, Viral Load HIV diperiksa

bersamaan dengan jumlah CD4+ untuk menentukan kapan pengobatan p g harus dimulai. Apabila p titer VL rendah, , maka keputusan mulainya pengobatan dapat ditunda. Tetapi bila meningkatnya titer VL sangat tinggi disarankan untuk mulai pengobatan dengan highly active antiretroviral therapy (HAART). (HAART) Bila pengobatan anti anti-viral sudah dimulai, kesuksesan pengobatan dapat dipantau dengan memeriksa VL HIV. Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV. Bila titer VL HIV tidak menjadi turun atau sampai dengan tidak terdeteksi selama masa pengobatan, maka Dokter akan merekomendasikan untuk mengganti dengan obat yang berbeda.

Kapan Viral Load HIV harus diperiksa p ?

Pemeriksaan awalan atau baseline : pada

saat kunjungan pertama ke Dokter akan dianjurkan periksa jumlah CD4+ dan Viral Load untuk menentukkan kapan harus dimulainya terapi. Pemeriksaan setelah terapi dimulai : direkomendasikan agar pemeriksaan diulang dalam waktu 2 2-4 minggu setelah terapi dimulai untuk melihat respon pengobatan. Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dalam kurun waktu 44-6 bulan atau sampai dengan VL tidak terdeteksi terdeteksi. Pemeriksaan selama terapi : direkomendasikan untuk periksa VL dan jumlah CD4+ setiap 33-4 bulan sekali untuk memantau t efektifitas f ktifit terapi. t i Pemeriksaan bila belum dilakukan terapi : bila pemeriksaan VL yang pertama sangat rendah dan j jumlah CD4+ sangat g tinggi, gg maka Dokter tidak akan mulai terapi. Walaupun terapi belum dimulai, setiap 33 -4 bulan harus periksa VL untuk mengetahui bagaimana tubuh melawan virus. Bila titer

Apakah arti hasil Viral Load HIV ?

Meningkat atau menurunnya hasil titer Viral

Load lebih dari 1/10 kali lipat atau lebih besar dari 1 1 log log maka dikatakan ada perubahan hasil yang berarti. Hasil Viral Load tidak terdeteksi adalah bila titer HIV sangat rendah sehingga tidak dapat terbaca oleh reagensia. Jumlah virus didalam darah sangat sedikit atau hasil VL tidak terdeteksi membuat resiko kearah AIDS dan juga resiko resisten terhadap obat menjadi rendah. Bila hasil yang sudah tidak terdeteksi menjadi terdeteksi kembali, maka pemeriksaan harus diulang untuk meyakinkan hasilnya. Bila hasil ulangan tetap meningkat dari pemeriksaan sebelumnya maka Dokter akan melihat faktor kemungkinannya dan dapat berarti bahwa pengobatan sekarang sudah tidak efektif lagi dan harus dilakukan modifikasi b t

Polymerase Chain Reaction

PT Roche Indonesia

2004

Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR adalah p paten teknologi g y yang g dapat p membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target. Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi. Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.

Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR dapat p digunakan g untuk berbagai g aplikasi p penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik. Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi

Tahapan Proses PCR

Pre PCR :
Preparasi reagensia Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA

PCR : proses amplifikasi lifik i

Denaturasi (pemisahan rantai DNA) Annealing (penempelan primer) Extension (pemanjangan oleh enzim)

Post PCR :
Deteksi/ Analisa Hasil PCR

Sekuen Target
Target Sequence

DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme

DNA Strand

Supercoiled DNA Strand

Double Helix DNA Strand

Chromosome

Komponen Basa DNA

DNA B Base N Nomenclature l t
Base Adenine (A) Nucleoside Adenosine Nucleotide Adenosine Triphosphate Abbreviation dATP Base Ring Structure Purine

Guanine (G) Thymine (T)

Guanosine Thymidine

Guanosine Triphosphate Thymidine Triphosphate p p

dGTP dTTP

Purine Pyrimidine

Cytosine (C)

Cytidine

Cytidine Triphosphate

dCTP

Pyrimidine

Perbedaan antara RNA dan DNA

Diff Difference between b t RNA and d DNA
RNA S Sugar Rib Ribose Adenine (A) Bases Cytosine (C) Uracil (U) Guanine (G) No. of strands Heat stable? Usually single No DNA D Deoxyribose ib Adenine (A) Cytosine (C) Thymine (T) Guanine (G) Double Yes

Sekuen Nukleotida
H d Hydrogen B Bonds d

Cytosine (C) Adenine (A) Thymine (T) Guanine (G) Guanine (G) Thymine (T) Adenine ( (A) ) Cytosine (C)

Deoxyribose Phosphoric Acid (Sugar molecule) (Phosphate molecule)

Ikatan Basa, , Gula dan Kelompok Fosfat

Phosphate M l Molecule l

Deoxyribose S Sugar M l Molecule l Bases

3 Hydrogen B d Bonds Sugar-Phosphate Backbone

PROSES PCR 1 Denaturasi oleh panas

Target Sequence

Target Sequence

2 Penempelan p p pasangan g p primer berlabel biotin di kedua ujung Sekuen Target

3 - Taq q DNA Polymerase y mengkatalisa g pemanjangan Primer sebagai Komplemen Nukleotida

Akhir Siklus PCR keke-1 Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target

Target Amplifikasi : Siklus PCR diulang

No. of Cycles 1 2 3 4 5 cycle l = 32 A Amplicon li 5 6 20 No. Amplicon Copies of Target 2 4 8 16 32 64 1 048 576 1,048,576 1,073,741,824

1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle y = 8 Amplicon p

4 cycle = 16 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

30

Deteksi/Analisa Hasil PCR

Elektroforesis gel agarosa (horizontal) Eleftroforesis g gel p poliakrilamid ( (vertikal) ) Enzym labelling oligonucleotide BiotinBiotin -labelled oligonucleotide DigoxigeninDigoxigenin -labelled oligonucleotide Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

RT PCR 1 - Primer berlabel biotin menempel pada Sekuen Target RNA

2 - rTth DNA Polymerase y mengkatalisa g pemanjangan Primer dengan Nukleotida komplemennya

3 Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA) terhadap Sekuen Target

PCR Step 1 Denaturasi oleh Panas

Target RNA Sequence

Biotin cDNA

PCR Step 2 Penempelan Primer pada cDNA

PCR Step 3 - rTth DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer

rTth DNA Polymerase

Akhir Siklus keke-1 PCR Hasil tiruan Untai Ganda DNA (Amplikon) dari Sekuen Target g

Akhir Siklus keke-2 PCR rTth DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer

PCR Amplifikasi p Exponensial p : Setiap Siklus Baru menghasilkan jumlah berlipat ganda dari Amplikon
Single strand RNA

1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid)

2 cycle = 2

3 cycle = 4

4 cycle = 8

5 cycle = 16

6 cycle = 32

7 cycle = 64

Untuk para klinisi dalam memantau progresivitas penyakit, diperlukan pemeriksaan : CD4 CD 4+ (immunophenotyping) Vi l Load Viral L d (PCR)