EQ 902- Turma A Laboratrio de Engenharia Qumica IV

Experimento II: Biosseparao

Professor responsvel: Everson Alves Miranda Experimento realizado em: 03/04/2013

Grupo H: Carlos Eduardo Amorim Cames Jssica Marcon Bressanin Marina Lazarini Verzola Nayla Takahashi Aoki Sayonara Soares de Freitas Carneiro 080926 091652 092309 095908 092969

Campinas, 10 de abril de 2013

Sumrio
1. 2. 3. 4. 4.1. 4.2. 5. RESUMO ......................................................................................................................................... 3 NOMENCLATURA .......................................................................................................................... 4 INTRODUO ................................................................................................................................ 6 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................................. 11 Purificao de IgG humana ..................................................................................................... 11 Isoterma de adsoro de BSA ................................................................................................. 12 RESULTADOS E DISCUSSES ..................................................................................................... 13 5.1. Memria de Clculo ............................................................................................................. 13 Purificao de IgG humana ......................................................................................... 13 Isoterma de adsoro de BSA ..................................................................................... 14

5.1.1. 5.1.2. 5.2.

Resultados e Discusso ....................................................................................................... 16 Purificao de IgG humana ......................................................................................... 16 Isoterma de adsoro de BSA ..................................................................................... 18

5.2.1. 5.2.2. 6. 7. 8.

CONCLUSES ............................................................................................................................... 25 SUGESTES PARA CONTINUAO DO TRABALHO ................................................................. 25 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................................... 26

1. RESUMO No presente relatrio estudou-se a purificao da IgG humana oriunda de uma mistura com BSA bovina por meio de cromatografia de troca inica. Condies do fenmeno de adsoro da BSA na fase estacionria da coluna cromatogrfica, DEAESepharose, tambm foram estudadas atravs da construo de isotermas a partir dos modelos de Langmuir no-linear, Langmuir linearizado e Langmuir-Freundlich. Obteve-se, no estudo dos ajustes, os seguintes valores para as constantes: Kd=0,0486mg/mL e Qm=97,7578 mg/mL para Langmuir no-linear, Kd=0,1494 mg/mL e Qm=114,9425 mg/mL para Langmuir linearizado e Kdlf=1,4534 (mg/mL)n, Qm=233,2909 mg/mL e n=0,3645 para o modelo de Langmuir-Freundlich. Conclui-se que o melhor ajuste aos dados experimentais o do terceiro modelo. Os dados tambm foram comparados com outros da literatura com experimento similar para fins de estudo.

2. NOMENCLATURA : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : absorbncia medida para a amostra [adimensional] absorbncia medida para a amostra na duplicata [adimensional] absorbncia mdia da amostra [adimensional] concentrao de BSA na soluo me [mg/mL] concentrao inicial de BSA na amostra [mg/mL] concentrao de BSA na soluo da amostra no equilbrio [mg/mL] concentrao de protena na amostra [mg/mL] coeficiente de Bradford [mg/mL] diluio feita na amostra [adimensional] constante de dissociao efetiva [mg/mL] constante do modelo de Langmuir-Freundlich [(mg/mL)n] massa de protena na soluo de alimentao [mg] massa de protena presente na amostra da etapa de dessoro [mg] massa de protena que entrada coluna de adsoro [mg] massa de protena presente na amostra da etapa de lavagem [mg] massa inicial de BSA na amostra do ensaio de isoterma [mg] massa de BSA na soluo da amostra no equilbrio [mg] massa de BSA adsorvida no gel DEAE-Sepharose [mg] massa de protena presente na amostra [mg] massa de protena que deixa a coluna de adsoro [mg] coeficiente de cooperatividade [adimensional] massa de BSA adsorvido por volume de adsorvente [mg/mL] capacidade mxima do adsorvente em adsorver o soluto [mg/mL] recuperao de protena [%]

: : :

volume da amostra presente na cubeta [mL] volume de BSA usado na preparao das amostras [mL] volume de soluo tampo usado na preparao das amostras [mL]

3. INTRODUO Tanto quanto definir as vastides do Universo ou a natureza subatmica de todas as coisas, tambm a interpretao qumica das mecnicas da vida rdua tarefa para a Cincia. Na matria biolgica onde se encontram as molculas de maior complexidade, bem como os mais intrincados processos pelos quais se d a manuteno do que vivo. O entendimento da bioqumica est em plena expanso e junto a tal crescimento surgem novas tecnologias e processos que fornecem vias s demandas diversas do mundo globalizado. Dentro do contexto das indstrias de bioprocessos, no apenas a produo de uma espcie qualquer requer a compreenso das ricas dinmicas da bioqumica: por vezes, produzir etapa mais simples. A separao e purificao posterior pode representar o verdadeiro desafio, posto que so sutilezas complexas que distinguem as molculas de material biolgico, e sua fragilidade intrnseca exige uma srie de cuidados inexistentes no manejo de produtos de outras indstrias, como as de qumica inorgnica. O presente experimento props o estudo de uma das operaes unitrias de separao, a adsoro, aplicada para separar uma mistura de BSA bovina e Imunoglobina G humana. BSA bovina um tipo de albumina, matria componente do plasma sanguneo principalmente de mamferos. A imunoglobina G, por outro lado, um anticorpo que junto s outras Igs constitui aproximadamente 20% de todas as protenas do sangue humano. Trata-se de um complexo protico formado por 4 cadeias peptdicas, duas cadeias pesadas e duas leves, dispostas em Y. A figura abaixo ilustra a sua estrutura1.

Figura 1. (a) Estrutura da Imunoglobina G humana, (b) Esquemtica das cadeias peptdicas. A imunoglobina G de grande importncia mdica, podendo ser ministrada no tratamento de diversas mazelas do corpo humano, dentre elas as deficincias imunolgicas. Seu excesso tambm nocivo: em casos de doenas alergnicas, a extrao extracorprea da IgG empregada por meio de adsoro. A mistura BSA bovina e IgG humana serve como exemplo de uma situao possvel de bioprocesso. Tm-se duas substncias com grandes semelhanas: ambas so compostas por cadeias proteicas, tm fragilidade temperatura e agitao mecnica, ambas tm grande massa molecular... A estratgia para separ-las exige conhecimento mais detalhado de suas caractersticas. Um possvel caminho, escolhido para os fins de estudo, reside nos diferentes caracteres eletrostticos das duas substncias. As cadeias peptdicas contm stios com diversas caractersticas (polares ou apolares, hidroflicas ou hidrofbicas...) que tm comportamentos variando em funo do meio no qual se encontram. Radicais com grupos OH, por exemplo, podem manifestar carter cido (sofrendo a desprotonao) quando em ambiente bsico. Um critrio usado para avaliar a qualidade eletrosttica dessas molculas chamado ponto isoeltrico (pI). Trata-se de um valor de pH em que a carga lquida da molcula 0. Nessa circunstncia, o ambiente propiciou molcula a manifestao de tantas regies com uma polaridade quanto polaridade oposta em mesma quantidade. Abaixo do pI a molcula ter carga lquida total positiva, acima, negativa. ento se aproveitando

dessa mutabilidade em funo do pH que se pode distinguir a mistura a ser separada em uma coluna cromatogrfica por meio dos fenmenos de adsoro. A adsoro um fenmeno de concentrao interfacial de determinado espcime - adsorbato - sobre um adsorvente. Tal concentrao se deve a qualidades especficas do par adsorbato-adsorvente, e o fenmeno ento classificado segundo a natureza de tal interao. Para fins quantitativos, existem modelos matemticos que procuram representar a adsoro. Dentre os mais usados, h o modelo de Langmuir. Este modelo de grande utilidade, dada sua simplicidade terica e necessidade de poucas informaes experimentais. Para sua validade, ele parte das seguintes suposies2: As molculas adsorvidas formam apenas uma nica camada; Cada stio de adsoro equivalente em termos de energia de adsoro; No h interaes entre as molculas adsorvidas.

A frmula tem a estrutura descrita abaixo:

onde Q* a concentrao de adsorbato na interface, Qm a concentrao limite adsorvida e C* a concentrao de adsorvente na fase lquida. Os dados so coletados no equilbrio termodinmico do sistema, e para uma mesma temperatura, diferentes concentraes iniciais resultaro em diferentes concentraes adsorvidas. Tal conjunto de pontos experimentais descreve uma isoterma de adsoro. Abaixo, a figura demonstra o comportamento tpico de uma isoterma de Langmuir.

Figura 2. Isoterma de adsoro tpica para o modelo de Lagmuir. As idealidades pressupostas pelo modelo de Langmuir podem no representar bem um sistema real, pois muitas vezes h formao de mltiplas camadas de adsorbato, a superfcie do adsorvente pode no ser energeticamente uniforme e o adsorbato pode inteferir em suas adjacncias, a depender das caractersticas do sistema estudado. Em vista disso, outro modelo terico foi tambm estudado no experimento, o Langmuir-Freundlich:

aplicao do fenmeno de adsoro, indispensvel a construo de isotermas, pois estas demonstraro o comportamento do sistema. Por meio das isotermas possvel identificar a capacidade mxima de adsoro. A cromatografia um procedimento para a resoluo de misturas e separao de componentes baseando-se nas diferentes interaes entre a mistura carregada por uma fase mvel e a fase estacionria por onde elui. Diferentes interaes entre os constituintes da mistura a ser separada resultaro em diferentes tempos de residncia na coluna cromatogrfica. A cromatografia pode ser classificada segundo o seu princpio de funcionamento. A citar:

Cromatografia de partio, baseada na diferena de solubilidade entre os Cromatografia de troca inica, baseada nas interaes eletrostticas Cromatografia de afinidade, baseada na associao especfica de Cromatografia de excluso, explorando a diferena de tamanho entre os

componentes da mistura na fase mvel e na fase estacionria; diferentes entre os componentes da mistura e a fase estacionria; molculas aderidas fase estacionaria e quelas na fase mvel; componentes da mistura na fase mvel a percorrer a porosidade da fase estacionria. No caso do experimento, a cromatografia realizada a de troca inica (por se basear nas diferentes interaes eletrostticas das protenas envolvidas). A fase estacionria a DEAE-Sepharose, a fase mvel o tampo de Tris-HCl e a mistura a ser separada o BSA e a IgG humana. O mtodo de Bradford um mtodo utilizado para quantificao de protenas solubilizadas em uma dada amostra de soluo. Seu princpio de atuao se baseia na interao do corante Coomassie brilliant blue BG-250 em soluo cida e macromolcula de protenas. Quando tal interao ocorre entre o BG-250 e as protenas, o corante se estabiliza de forma aninica e sua absorbncia altera-se de 465nm para 595nm. Essa alterao, por sua vez, altera a colorao da soluo de castanho para azul, proporcionalmente concentrao de protena na amostra.

4. MATERIAIS E MTODOS Os materiais utilizados neste experimento foram os seguintes: Sepharose; protena. 4.1. Purificao de IgG humana Equipamento de agitao rotatria; Pipetas automticas e tubos Eppendorf para determinaes analticas; Soluo estoque contendo albumina de soro bovino (BSA) em tampo Soluo tampo Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 (tampo de adsoro e Soluo tampo Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 contendo 0,5 mol/L de NaCl Soluo de NaOH a 50 mmol/L para regenerao da coluna Espectrofotmetro na faixa visvel de comprimento de onda; Soluo (reagente de Bradford) para a determinao da concentrao de Coluna cromatogrfica contendo 1,0 mL de gel DEAE-Sepharose; Soluo de BSA adicionada em tampo Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0; Sistema cromatogrfico de baixa presso; Tubos do tipo Eppendorf de 1,5 mL contendo 50 microlitros de gel DEAE-

Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0; equilbrio do gel) (tampo de eluio); cromatogrfica;

Por meio de um sistema de cromatografia de baixa presso modelo C 10/10 com um coluna de 1,0 cm de dimetro interno por 10,0 cm de altura (GE Healthcare, EUA) empacotada com 1,0 mL de gel DEAE-Sepharose, foi eluda a soluo tampo de Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 a uma vazo de 0,8 mL/min. Aps a estabilizao do adsorvente, 1,0 mL de soluo contendo IgG e BSA foi injetado na coluna. Da sada da coluna, durante todo o procedimento, so colhidas alquotas de 1,0ml para a anlise indicativa. Uma vez que se verificou a sada completa de um dos componentes da mistura indicado pelo primeiro pico do grfico impresso pelo equipamento uma soluo de de 0,5 mol/L de NaCl no tampo de equilbrio foi ento eluda, e verificou-se a sada do segundo pico no grfico impresso (Figura X). Para

a recuperao da coluna, eluiu-se por fim uma soluo bsica de NaOH e posteriormente, gua. 4.2. Isoterma de adsoro de BSA

Em tubos Eppendorf, preparou-se 1,0 mL de solues de BSA nas concentraes 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7 e 8,68 mg/mL, por meio de diluio da soluo estoque (8,6800 mg/mL) fornecida em tampo de adsoro (25 mmol/L Tris-HCl pH 7,0). As solues proticas (1,0 mL) foram introduzidas noutros tubos Eppendorf contendo o gel de troca-inica, e colocadas sob agitao rotatria branda durante 45 minutos. Aps a agitao, passaram-se as solues para cubetas e determinou-se, em duplicata, a concentrao de cada uma segundo a metodologia de Bradford: adicionouse 100L da soluo protica e 1ml do reagente de Bradford em cada recipiente, agitando-se para a homogeneizao da soluo e aguardando-se dez minutos antes da realizao das medidas de absorbncia. Vale lembrar que uma das solues no continha BSA, apenas o tampo e o reagente de Bradford para que se pudesse estabelecer o zero. As medidas foram tomadas a 595nm de comprimento de onda.

5. RESULTADOS E DISCUSSES 5.1. Memria de Clculo

5.1.1. Purificao de IgG humana A partir dos dados de absorbncia obtidos para as amostras no experimento de cromatografia e dos volumes coletados nas etapas de alimentao, lavagem e dessoro, foi possvel obter a massa de protena em cada caso e fazer um balano de massa global. Os dados experimentais esto apresentados na Tabela 1. A absorbncia a 280 nm foi medida duas vezes e o valor mdio foi obtido segundo a Equao 3. Como exemplo, utilizou-se o valor medido para a alimentao:

Assim, valendo-se do Mtodo de Bradford, determinaram-se as concentraes de cada amostra atravs da curva de calibrao do espectrofotmetro. Devem-se considerar tambm as diluies realizadas, uma vez que a curva de calibrao s apresenta caracterstica aproximadamente linear para valores de absorbncia inferiores a 0,6. Para a alimentao, tem-se:

A massa foi ento calculada conforme a Equao 5:

Dessa maneira, fez-se o balano de massa:

Logo, a recuperao total de protena dada pela Equao 8:

5.1.2. Isoterma de adsoro de BSA Durante o experimento, os volumes utilizados de soluo tampo e de BSA foram fornecidos. Estes nmeros, quando somados, completam o volume de 1 mL. A quantidade de vezes na qual a soluo foi diluda tambm foi informada, alm das absorbncias para as solues de cada cubeta, a concentrao da soluo me e o coeficiente de Bradford. Os volumes e absorbncias de cada amostra, bem como as diluies, esto reunidos na Tabela 3 em Resultados e Discusso. A massa inicial de BSA foi calculada utilizando a concentrao de BSA da soluo me e o volume de BSA, seguindo a equao 9:

A concentrao da soluo me fornecida de 8,68 mg/mL. Considerando o primeiro volume da Tabela 3, tem-se que:

Com este resultado, calculou-se a concentrao inicial de BSA para cada 1 mL de mistura de soluo tampo e me utilizados.

A concentrao final de BSA no equilbrio foi obtida a partir da multiplicao entre a absorbncia mdia, o coeficiente de Bradford e o fator de diluio, de acordo com as equaes 3 e 4, apresentadas previamente. Assim, para o primeiro ponto, temse:

Considerando que os volumes finais de cada amostra so de 1 mL, a massa pode ser determinada pela equao 11, que similar 9:

A massa adsorvida de BSA , ento, obtida atravs da diferena entre a massa inicial e final do mesmo, como relacionado pela equao 12.

A massa de BSA adsorvida para a primeira amostra :

Com esta informao, foi possvel calcular a quantidade de soluto adsorvido por unidade de volume adsorvente, segundo a equao 13.

Um modelo matemtico sugerido para realizar o ajuste dos pontos da equao o de Langmuir, apresentado na equao 14. Ele pode ser utilizado para determinar os parmetros Qm (capacidade mxima de adsoro) e Kd (constante de dissociao). Para este modelo, fez-se uso do software Origin 8.0 .

A forma linearizada deste modelo tambm pode ser utilizada no clculo dos parmetros Qm e Kd. Ela apresentada na equao 15.

Para a primeira amostra, a razo entre C* e Q* dada por:

Outro modelo sugerido para o ajuste dos pontos e determinao dos parmetros Qm e Kd o de Langmuir Freundlich, apresentado na equao 10. Este ajuste tambm foi realizado no Origin 8.0 .

5.2.

Resultados e Discusso

5.2.1. Purificao de IgG humana A Tabela 1 apresenta os dados experimentais coletados na purificao da IgG humana: Tabela 1. Absorbncias medidas nas etapas de purificao da protena IgG humana. Volume Diluio A1 A2 (mL) Alimentao 1 100 0,1408 0,1342 0,1375 Lavagem 10 1 0,5046 0,4914 0,498 Dessoro 10 1 0,7447 0,7038 0,72425 Etapa

A purificao foi feita com adsoro de BSA em gel (DEAE-Sepharose). O perfil cromatogrfico foi obtido no prprio equipamento. A imagem foi digitalizada e apresentada na Figura 3.

Tempo

Figura 3. Perfil cromatogrfico da adsoro de BSA em DEAE-Sepharose.

A primeira curva representa a lavagem, j que certa quantidade de protena BSA est adsorvida na coluna e a protena IgG humana permanece em soluo. J o segundo pico representa a etapa de dessoro, na qual toda a protena que foi adsorvida, BSA, eluiu da coluna juntamente com a soluo tampo e com o cloreto de sdio. De acordo com a Memria de Clculo anterior, as concentraes e massas de protena obtidas so mostradas na Tabela 2: Tabela 2. Concentrao e massa de protena calculadas para as etapas de purificao. Etapa Cprotena mprotena Alimentao 2,1395 2,1395 Lavagem 0,0775 0,7749 Dessoro 0,1127 1,1269 O balano de massa mostrou que a recuperao total de protena foi de 88,89%. Como a recuperao no foi de 100%, significa que nem toda a protena foi dessorvida da coluna, pois a soma das protenas que constavam na lavagem e na dessoro no equivale massa que entrou na coluna. O sistema foi submetido a uma soluo tampo de pH aproximadamente 7. As protenas possuem pontos isoeltricos, nos quais a carga lquida de cada protena neutra. O ponto para o IgG humano encontra-se em torno de pH 7 e 8, j para o BSA, o pH de 5,3. Assim, nas condies de operao, o IgG praticamente neutro e o BSA possui carga negativa. O gel DEAE-Sepharose, por sua vez, possui carga positiva em pH 7. Assim, atravs da troca inica, o BSA interage com o gel e adsorve em sua superfcie, sem que ocorra interao entre o IgG humano e o gel3.

Absorbncia

5.2.2. Isoterma de adsoro de BSA A Tabela 3 abaixo apresenta os volumes utilizados de BSA e de soluo tampo na preparao das amostras, bem como as absorbncias medidas para essas: Tabela 3. Volumes usados para a preparao das amostras e absorbncias medidas. Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Volume Tampo Diluio A1 A2 Amdia BSA (L) (L) 58 942 1 -0,0121 0,0203 0,0041 115 885 1 0,0616 0,0315 0,04655 173 827 1 0,1023 0,0849 0,0936 230 770 1 0,1729 0,1579 0,1654 346 654 10 0,0943 0,0584 0,07635 461 539 50 0,114 0,0937 0,10385 576 424 100 0,0386 0,0429 0,04075 691 309 100 0,1026 0,0586 0,0806 806 194 100 0,104 0,1199 0,11195 1000 0 100 0,2094 0,1376 0,1735

A partir dos valores de absorbncia, foi possvel calcular a concentrao de BSA nas amostras, como explicado em Memria de Clculo: Tabela 4. Concentrao inicial de BSA nas amostras, concentrao de BSA em equilbrio e as massas calculadas. Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mo, BSA (mg) 0,5034 0,9982 1,5016 1,9964 3,0033 4,0015 4,9997 5,9979 6,9961 8,6800 Co, BSA (mg/mL) 0,5034 0,9982 1,5016 1,9964 3,0033 4,0015 4,9997 5,9979 6,9961 8,6800 C*BSA (mg/mL) 0,0006 0,0072 0,0146 0,0257 0,1188 0,8080 0,6341 1,2541 1,7419 2,6997 m*BSA (mg) 0,0006 0,0072 0,0146 0,0257 0,1188 0,8080 0,6341 1,2541 1,7419 2,6997 mBSA, adsorvida (mg) 0,5028 0,9910 1,4871 1,9707 2,8845 3,1935 4,3656 4,7437 5,2541 5,9803

Conhecendo o volume do adsorvente, foram calculados os parmetros Q*, bem como C*/Q*, como demonstrado anteriormente. A Tabela 5 apresenta os valores calculados:

Tabela 5. Parmetros Q* e C*/Q* calculados para cada amostra. Amostra Q* (mg/ml) 1 10,0560 2 19,8191 3 29,7415 4 39,4133 5 57,6896 6 63,8705 7 87,3122 8 94,8749 9 105,0828 10 119,6068 C*/Q* 0,0001 0,0004 0,0005 0,0007 0,0021 0,0126 0,0073 0,0132 0,0166 0,0226

A partir dos dados da tabela acima, construiu- se o grfico da isoterma de Langmuir linearizada:

0.0300 0.0250 0.0200 C*/Q* 0.0150 0.0100 0.0050 0.0000 0.0000

y = 0.0087x + 0.0013 R = 0.9517

0.5000

1.0000

1.5000 C* (mg/mL)

2.0000

2.5000

3.0000

Figura 4. Isoterma de Langmuir linearizada.

A partir dos coeficientes linear e angular, foi feita a determinao dos parmetros Qm e Kd, apresentados na Tabela 6:

Tabela 6. Coeficientes da linearizao e parmetros Qm e Kd. A B 0,0087 0,0013

Qm (mg/mL) 114,9425 Kd (mg/mL) 0,1494

A isoterma de adsoro segundo o modelo de Langmuir foi construda atravs do software Origin 8.0.

Figura 5. Isoterma de adsoro segundo o modelo de Langmuir.

Na Tabela 7, so mostrados os parmetros do modelo de Langmuir obtidos nos ajustes realizados no Origin 8.0

Tabela 7. Parmetros do modelo de Langmuir. Modelo Langmuir Parmetro Kd (mg/mL) Valor 0,0486 0,84 Erro 0,0231 Qm (mg/mL) 97,7578 7,7498

Ao observar o comportamento dos dados experimentais e a tendncia da curva, nota-se que o ajuste no reflete uma boa aproximao entre estes. Um parmetro que ilustra esta relao o , que ser posteriormente comparado entre os modelos.

Tambm foi construda a isoterma de adsoro segundo o modelo de LangmuirFreundlich atravs do software Origin 8.0.

Figura 1. Isoterma de adsoro segundo o modelo de Langmuir- Freundlich. Na Tabela 8, so mostrados os parmetros do modelo de Langmuir- Freundlich obtidos nos ajustes realizados no Origin 8.0 Tabela 8. Parmetros dos modelos d e Langmuir- Freundlich. Modelo Langmuir- Freundlich Parmetro Valor Erro Qm (mg/mL) 233,2909 81,4639 KdFL(mg/mL)n 1,4534 0,8870 n 0,3645 0,0561 2 0,99 -

Este modelo traz maior aproximao entre o conjunto de dados experimentais e a tendncia da curva, apresentando o parmetro
2

muito prximo de 1. Entretanto, os

erros dos parmetros foram relativamente grandes. Tal fato se deve natureza do modelo, pois os termos exponenciais amplificam a propagao dos erros encontrados nos conjuntos de dados de modo muito mais intenso do que o que se pde observar nos ajustes anteriores. Neste caso, ento, o sexto ponto experimental foi desconsiderado, pois seu erro j notadamente destacvel quando aplicado nos outros modelos aqui impossibilitou a aplicao do ajuste do modelo no software Origin 8.0 . possvel fazer uma anlise do coeficiente de cooperatividade, n. De acordo com a literatura5, se n for maior do que 1, o grau de cooperatividade positivo. Quando a cooperatividade positiva, significa que h uma tendncia de aglomerao das molculas, ou seja, a presena de uma molcula adsorvida atrai outras. Caso seja menor do que 1, negativo. Quando a cooperatividade negativa, h uma tendncia de isolamento de molculas ligantes. Se o valor de n for igual a 1, significa que a adsoro aleatria6. O coeficiente de cooperatividade para este procedimento foi 0,3645, o que representa uma cooperatividade negativa. Assim, quando BSA adsorvido no gel, menor a probabilidade de adsoro de outras molculas nesta superfcie. Ao se comparar os trs modelos baseando-se na aproximao entre o conjunto de dados experimentais e as curvas ajustadas, possvel notar que o modelo de melhor ajuste o de Langmuir- Freundlich, com coeficiente de correlao igual a 0,99, seguido pelo de Langmuir linearizado, igual a 0,95, e ento, pelo de Langmuir no linear, com valor de 0,84. Esta constatao concorda com a teoria, pois o modelo de Langmuir- Freundlich considera o parmetro de cooperatividade, que por sua vez interpreta melhor o comportamento no ideal da adsoro. J o modelo de Langmuir, tanto linear quanto no linear, pressupe caractersticas de idealidade, descritas anteriormente, que podem no corresponder ao que ocorre na adsoro do experimento. Uma possvel explicao para a diferena entre os ajustes do modelo de Langmuir linearizado e no linearizado o fato de que, para realizar o ajuste no software Origin 8.0 foram necessrios fornecer valores iniciais para os parmetros Qm e Kd, uma vez que o ajuste feito por um processo iterativo. Assim, os valores escolhidos podem no ter sido adequados, afetando a qualidade desse ajuste. Na Figura 5, pode- se

observar um distanciamento entre o conjunto de dados experimentais e o modelo no linearizado de Langmuir. Para comparar o DEAE-Sepharose com outro adsorvente, encontrou-se na literatura4 valores dos parmetros Qm e Kd da isoterma de equilbrio para a adsoro do BSA em quitosana. Neste procedimento, as partculas da resina ficaram em contato com a soluo por 7 dias, em mistura. A estrutura da quitosana reticulada encontra-se na Figura 7:

Figura 7. Estrutura da quitosana reticulada. Neste estudo, foram feitas isotermas de Langmuir no linear em diferentes valores de pH. Aquele que mais se aproxima ao experimento realizado com DEAE o pH igual a 6,9. A Figura 8 apresenta as isotermas obtidas na literatura, porm, a curva e os dados que importam para esta discusso so apenas para pH igual a 6,9.

Figura 8. Efeito do pH nas isotermas de equilbrio do BSA em quitosana. Os parmetros K e q0 da literatura tm as seguintes relaes com os parmetros do experimento:

Os valores obtidos para K e q0 foram 1,5 dm3/g e 165 g/dm0, respectivamente. Portanto, temos que Kd para a literatura seria igual a 0,667 mg/mL e Qm igual a 165 mg/mL. Comparando os valores de Qm e Kd acima com os obtidos nesse experimento, tem- se que o primeiro parmetro maior para a adsoro com quitosana. Isso significa que a quitosana tem maior capacidade mxima de adsoro de BSA quando comparada ao gel DEAE-Sepharose, levando- se em considerao as diferentes condies experimentais, como por exemplo, o tempo de espera at o equilbrio. Da mesma forma, o segundo parmetro tambm maior para o experimento da literatura: o par BSAquitosana tem uma maior constante de dissociao efetiva do que o par BSA- DEAESepharose.

6. CONCLUSES Na etapa experimental de purificao da protena IgG humana, obteve- se o perfil cromatogrfico. Como o experimento foi realizado em pH 7, a adsoro de BSA no gel DEAE- Sepharose ocorreu por troca inica. Assim, o primeiro pico do perfil, refere- se protena IgG humana, que permaneceu em soluo. Aps a etapa lavagem, obteve- se um segundo pico, referente ao BSA que estava adsorvido e eluiu da coluna juntamento com o cloreto de sdio. O balano de massa calculado para a purificao, mostrou que a recuperao de protenas foi 88,89%, pois mesmo com a lavagem e dessoro realizadas, parte dessas permaneceram adsorvidas na coluna. No experimento realizado em batelada, foi possvel obter dados para a construo da isoterma de adsoro. Com as absorbncias medidas nas amostras, foram calculadas as concentraes de equilbrio e construdos os grficos para realizar os ajustes dos modelos de isoterma: Langmuir linearizado, Langmuir no linearizado e Langmuir- Freundlich. Dentre esses, o ltimo o que melhor representou o comportamento dos dados experimentais, com bastante prximo de 1 e cooperatividade negativa (n< 1). Os modelos de Langmuir linear e no linear no apresentaram a mesma qualidade de ajuste, uma vez que levam em considerao a idealidade do sistema, que pode no ter sido plenamente obedecida no experimento realizado. O adsorvente utilizado na prtica experimental foi comparado com a quitosana, atravs de dados encontrados na literatura. O comportamento de ambos foi avaliado pelos valores de Qm e Kd em adsoro de BSA. A quitosana apresenta maiores valores para esses dois parmetros, indicando que esse material tem maior capacidade mxima de adsoro da protena em questo e maior constante de dissociao efetiva, levandose em conta as condies experimentais. 7. SUGESTES PARA CONTINUAO DO TRABALHO Uma sugesto para a prtica experimental realizar anlises na etapa de purificao de IgG humana para reconhecer quais os compostos contidos nas amostra, isto , a frao de BSA e a frao de IgG. Assim, possvel calcular, de fato, a purificao conseguida pela tcnica de adsoro.

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1) NELSON, D. L. COX, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry, 4ed. WH Freeman, NY: 2002. p. 175 2) DORAN, P. M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, U.K., London: 1995. p.234 3) SCOPES, R. K. Protein Purification, principles and practices. NY, Springer Verlag, 1994. 4) Yoshida H, Kataoka T: Adsorption of BSA on cross-linked chitosan - the equilibrium isotherm. Chem. Eng. J. Biochem. Eng. J. 41(1), B11-B15 (1989). 5) LUO, Q. E ANDRADE, J. D. Cooperative adsorption of proteins onto hydroxyapatite. Journal of Colloid and Interface Science, 200 (1998) 104-113. 6) S. Stankowski, Large ligand adsorption to membranes. III. Cooperativity and general ligand shapes, Biochim. Biophys. Acta, 777 (1984), pp. 167182