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MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA FUNDAMENTAL
4. EDICIN
MXICO, D.F.
2013
1
Nombre:
AGUILERA PALACIOS DIANA NITZHUI
Boleta:
2012500011
Grupo:
4AM1
Carrera: INGENIERA EN SISTEMAS AMBIENTALES
Profesores:
NDICE
REGLAMENTO DEL LABORATORIO
Prctica No. 1
Propiedades de los aminocidos y protenas
Prcticas No. 2, 3, 4, 5, y 6
Cintica enzimtica y curva tipo de azcares
Efecto de la temperatura
Efecto del
pH
Efecto de la concentracin del sustrato
Inhibicin Enzimtica
Prctica No. 7
Reacciones de carbohidratos
19
21
24
27
29
33
Prctica No. 8, 9 y 10
Reacciones enzimticas de xido-reduccin
I)
Deshidrogenasa lctica
II)
Determinacin de la deshidrogenasa succnica
III
Determinacin de citocromo c y citocromo oxidasa
40
43
44
45
Prctica No. 11
Aislamiento del DNA de chcharo/haba y su
caracterizacin espectrofotomtrica
47
APNDICE I:
Medidas generales de seguridad en el laboratorio.
54
APENDICE II:
Caractersticas y cuidados en el manejo de los reactivos
Qumicos txicos empleados en el laboratorio
55
PRCTICA No. 1
PROPIEDADES DE LOS AMINOCIDOS Y DE LAS PROTENAS
INTRODUCCIN.
Las protenas son polmeros de alto peso molecular, compuestos por aminocidos unidos entre s por
enlaces peptdicos, que en soluciones acuosas se comportan como coloides. Presentan propiedades qumicas y
fsicas que dependen directamente de factores intrnsecos del propio polmero, como son su estructura y
composicin de aminocidos, o bien de factores extrnsecos, como pueden ser el pH, la temperatura, la
presencia de sales, etc.
Existen varios mtodos para la identificacin y cuantificacin de las protenas, pero la mayora tiene
como principio alguna reaccin qumica caracterstica de los grupos R de los diferentes aminocidos.
Puede decirse que las protenas reflejan las propiedades qumicas de los residuos de aminocidos que
contienen, por lo que la mayora de las reacciones coloridas de identificacin dependen de la existencia de un
aminocido especfico en ellas.
OBJETIVOS.
Realizar algunas reacciones coloridas especficas para la identificacin de los aminocidos que
constituyen a una protena.
Comprender la importancia de estas reacciones para distinguir las protenas.
Observar el efecto que producen algunos agentes fisicoqumicos sobre la solubilidad de las protenas.
MATERIAL
Gradilla
Tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Vaso de precipitados de 100 mL
Bao mara
Agitador de vidrio
Pinzas para tubo
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Hidrxido de sodio al 10%
Acetato de plomo al 5%
Ninhidrina al 1% en etanol al 96%
Insulina
Clara de huevo dil.
cido ntrico concentrado
Oxido rojo de mercurio
cido clorhdrico 0.1 N
Nitrito de sodio
Nitrato de plata al 2%
Cloruro de sodio al 5%
Etanol al 96%
1. REACCIN DE LA NINHIDRINA.
Es una reaccin caracterstica para grupos amino libres que se lleva a cabo a pH alcalino.
6
PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se adicionan 5 gotas de la
solucin de ninhidrina en etanol. Observar a temperatura ambiente la aparicin de un color azul o violeta
que se debe a la presencia de los grupos amino libres; si es necesario, calentar en bao mara 1 2 minutos
los tubos en los que no aparece el color.
b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla.
2. REACCIN DE MILLON.
El reactivo de Millon contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercricos en cido ntrico concentrado.
Debido a la presencia del grupo fenlico se produce un compuesto de color rojo. El aminocido tirosina da
positiva esta prueba.
PROCEDIMIENTO
a) Adicionar a 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) de 2 a 5 gotas del
reactivo de Millon y calentar en bao mara. La aparicin de un color rojo ser una prueba positiva.
b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones.
3. REACCIN DEL PLOMO PARA CISTEINA.
Es una reaccin caracterstica para grupos sulfhidrilos.
PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se adicionan 2 mL de NaOH al
10% y de 3 a 5 gotas de acetato de plomo al 5%, calentar hasta ver la aparicin de un precipitado acero o
negro.
b) Anotar en la tabla los resultados obtenidos.
4. REACCIN DEL BIURET.
Esta es una prueba general para protenas y pptidos de cadena no menor de 3 unidades de
aminocidos. Esta reaccin tiene utilidad en seguir el proceso de una hidrlisis protenica, ya que la reaccin
ser negativa cuando la hidrlisis sea completa.
PROCEDIMIENTO
a) A 1 mL de las soluciones problema (marcadas con un asterisco en la tabla) se adicionan 2 mL de NaOH al
10% y de 3 a 5 gotas del reactivo del biuret (solucin de CuSO 4 al 0.5%), mezclar bien. La formacin de
un color violceo o la precipitacin de hidrxido cprico ser una prueba positiva.
Si el color de la reaccin del biuret no se presenta inmediatamente, dejar reposar de 10 a 15 minutos.
b) Anotar en la tabla los resultados y observaciones
7
TABLA DE RESULTADOS
Gelatina
Albmina
Aspartame
Tirosina
Fenilalanina
Cistena
Agua
Reaccin de la
ninhidrina
*
*
*
*
*
*
Reaccin de
Millon
*
*
Reaccin para
grupos -SH
*
*
*
*
*
*
*
*
PROCEDIMIENTO.
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:
TUBO No.
Clara de huevo
8
3.0
3.0
3.0
3.0
1.0
1.0
Regulador de
acetatos 0.1M pH
4.7 (mL)
1.0
Agua
1.0
Observaciones
6. PRECIPITACIN
DIELCTRICA.
DE
PROTENAS
POR
MODIFICACIN
DE
LA
CONSTANTE
Existen ciertas sustancias orgnicas como alcoholes, teres y cetonas que reducen la constante dielctrica de
las soluciones acuosas de protenas, disminuyendo as su afinidad por el solvente, haciendo que las protenas
se disuelvan menos.
TUBO No.
2.0
2.0
Etanol (mL)
1.0
Agua
1.0
Observaciones
TUBO No.
Clara de huevo filtrada dil.
1:3
(mL)
Cloruro mercrico 5% (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.125
0.125
0.125
0.125
0.125
Agua (mL)
Observaciones
10
8. DETERMINACIN
INSULINA
DEL
PUNTO ISOELCTRICO DE LA
El punto isoelctrico (pI) de una protena es el pH en el cual la protena presenta su mnima solubilidad, su
carga neta es cero y no migra en un campo elctrico. Tericamente, es el pH para el cual la carga neta, la
suma de la carga de todos sus grupos disociables (como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc.) es igual a
cero. La superficie de la protena siempre posee una carga elctrica, que depende del pH, de los electrolitos
presentes y del solvente, pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones entre todos estos
factores, para el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas y la carga neta
es cero. En estas condiciones las molculas de protenas pueden formar agregados que precipitan. A valores
de pH por arriba y por abajo del pI, todas las molculas poseen una carga neta negativa y positiva,
respectivamente, y se rechazan entre s. Por lo tanto, el pI coincide con solubilidad mnima de las protenas.
PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de 5 tubos como se indica a continuacin, haciendo las mediciones de insulina con una
jeringa:
TUBO No.
cido actico
0.2 M (mL)
Acetato de sodio
0.2 M (mL)
Insulina
40 U/mL
0.23
0.02
6U
(0.06 mL)
0.15
0.10
6U
(0.06mL)
0.05
0.20
6 U
(0.06mL)
0.01
0.24
6U
(0.06 mL)
0.00
0.25
6 U
(0.06 mL)
pH
Observaciones
2. Objetivos.
3. Resultados obtenidos en forma de tabla, para cada experimento.
4. Interpretacin y conclusiones de cada una de las reacciones.
5. Clculos.
6. Discusin.
7. Conclusiones generales.
8. Bibliografa.
9. Preguntas extra.
PREPARACIN DE REACTIVOS
1) Reactivo de Millon.- El reactivo se prepara aadiendo 60 g de xido de mercurio a una mezcla de 45 mL
de HNO3 concentrado y 50 mL de H2O. Cuando el xido de mercurio se ha disuelto, se aaden 50 mL de
una solucin de nitrito de sodio al 30%. El reactivo de Millon contiene nitritos y nitratos mercricos.
2) Nitrito de sodio al 30%.- Pesar 30 g de nitrito de sodio y llevar a 100 mL con agua destilada.
3) Soluciones de aminocidos al 1%.- Pesar 1 g del aminocido a preparar y llevar a 100 mL con agua
destilada. Si no se disuelve fcilmente, adicionar algunas gotas de solucin de NaOH o HCl para mejorar su
solubilidad. Calentar un poco si es necesario.
4) Soluciones de las protenas al 5%. Pesar 5 g de la protena a preparar y llevar a 100 mL con agua
destilada.
5) Ninhidrina al 1% en etanol al 96%. Pesar 1 g de ninhidrina y disolver en 100 mL de etanol al 96%.
6) Reactivo de biuret.- Pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 mL con agua destilada.
7) Acetato de plomo al 5%.- Pesar 5 g de acetato de plomo y llevar a 100 mL con agua destilada.
8) NaCl al 5%.- Pesar 5 g de cloruro de sodio y llevar a 100 mL con agua destilada.
9) Nitrato de Plata al 2%.- Pesar 2 g de nitrato de plata y llevar a 100 mL con agua destilada.
10) Cloruro Mercrico al 5%.- Pesar 5 g de cloruro mercrico y llevar a 100 mL con agua destilada.
11) Solucin fresca de clara de huevo.- Separar la clara de un huevo y diluir con el doble de volumen de
agua destilada (dil. 1:3). Filtrar la a travs de gasa o algodn.
12) cido Clorhdrico 0.1 M.- Medir 8.3 mL de HCl concentrado (37%) y llevar a un litro con agua destilada
en un matraz aforado.
13) cido Actico 0.2 M.- Medir 11.55 mL de cido actico glacial y llevar a un litro con agua destilada en
un matraz aforado.
14) Acetato de sodio 0.2 M.- Pesar 16.4 g de acetato de sodio anhidro o 27.2 g de acetato de sodio trihidratado
y llevar a un litro con agua destilada en un matraz aforado.
15) Solucin comercial de Insulina 40U/mL u 80U/mL.- Mantener en refrigeracin.
BIBLIOGRAFA
1. Rendina, G. 1974. Tcnicas de bioqumica aplicada. Ed. Interamaricana. Mxico. Argentina. Espaa. Pp
59- 63.
2. Stryer, L. 1993. Bioqumica. 3a ed. Tomo I. Ed. Revert. Barcelona. Bogot. Buenos Aires. Mxico. pp 1570
12
PRCTICA No. 2
CINTICA ENZIMTICA Y CURVA TIPO DE AZCARES REDUCTORES
INTRODUCCIN
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones biolgicas. Al igual que otros catalizadores aumentan la
velocidad a la que se alcanza el equilibrio, pero no afectan el equilibrio final de la reaccin. Facilitan la
reaccin proporcionando una ruta con menor energa libre de activacin para la transformacin de sustrato a
producto que en la reaccin no catalizada.
Las enzimas son altamente especficas y su actividad puede modificarse por diferentes factores tales como
temperatura, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, inhibidores, etc.
La cintica enzimtica comprende el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y de las
condiciones que las modifican, as como los mecanismos de reaccin.
Una de las enzimas ms conocidas y ms ampliamente estudiadas es la sacarasa, -fructofuranosidasa o
invertasa, que puede hidrolizar diferentes sustratos, presentando una mxima actividad con la sacarosa.
La velocidad de la reaccin de hidrlisis de la sacarosa puede medirse observando el cambio de rotacin
ptica, o bien, valorando el poder reductor de los productos formados en un tiempo definido.
En la siguiente reaccin se muestra la accin de la invertasa sobre la
sacarosa y se seala el sitio de accin sobre otros carbohidratos.
OBJETIVO GENERAL
Analizar algunos factores que modifican la velocidad de la reaccin catalizada por la invertasa y
caracterizar de esta manera a dicha enzima.
13
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Gradillas
Espectrofotmetro
Tubos para espectrofotmetro
Bao mara a ebullicin
Vaso de precipitados de 100 mL
Cronmetro
Baos mara a 37, 50 y 75 C
Bao con hielo
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Solucin de glucosa 0.005 M- fructosa 0.005 M
Sacarosa 0.20 M
Acetato de sodio 0.05 M
cido actico 0.05 M
Regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7
Hidrxido de sodio 2 N
Tartrato de sodio
Reactivo de cido 3,5-dinitrosaliclico al 1% (3,5 DNS)
Solucin de invertasa 10 g/mL
PROCEDIMIENTO GENERAL
1.-PREPARACIN DE LOS TUBOS PROBLEMA
a) Etiquetar perfectamente los tubos como se indica en cada uno de los experimentos.
b) Preparar la serie de tubos siguiendo las indicaciones del cuadro; adicionar cuidadosamente el sustrato, el
regulador y el agua.
c) Preincubar los tubos 5 minutos a la temperatura indicada en el cuadro.
d) Adicionar la enzima e incubar durante 5 minutos (medidos con cronmetro) sin sacar los tubos del bao
de incubacin. El tiempo de incubacin se inicia al momento de adicionar la enzima.
e) Hacer la adicin de la enzima con exactitud y con intervalos de 30 segundos entre cada tubo. Limpiar la
pipeta exteriormente antes de agregar la solucin enzimtica.
f) Detener la reaccin en el momento justo en que lleguen a trmino los 5 minutos de incubacin, adicionando
1 mL de 3,5-DNS siguiendo el mismo orden en que se adicion la enzima y retirndolos del bao.
14
g) Una vez reunida toda la serie de tubos, desarrollar color colocando los tubos en un bao mara durante 5
minutos contados a partir del momento en que empiece la ebullicin. Transcurrido este tiempo enfriar
rpidamente los tubos, sumergindolos en un bao con hielo.
h) Diluir cada tubo con 4 mL de agua destilada y mantenerlos en bao con hielo.
i) Leer todos los tubos en un espectrofotmetro a 540 nm. Ajustar a cero el aparato con el tubo testigo.
2.-PREPARACIN DEL TUBO TESTIGO
a) Etiquetar perfectamente un tubo como TESTIGO.
b) Adicionar el sustrato, el regulador y el agua, siguiendo las indicaciones del cuadro correspondiente.
c) Preincubar e incubar el mismo tiempo y a la misma temperatura de los problemas.
d) Adicionar al tubo, sin sacar del bao, 1 mL de 3, 5-DNS y acto seguido, adicionar la enzima y mezclar,
evitando as la actividad enzimtica.
e) Reunir el tubo testigo con los tubos problema para desarrollar color como se indica en el paso 1f.
f) Usar este tubo para ajustar a cero el espectrofotmetro, a una longitud de onda de 540 nm.
3.-CALCULO DE LAS UNIDADES DE INVERTASA
Interpolar en la curva tipo los valores de absorbencia obtenidos en cada experimento para conocer la cantidad
correspondiente de micromoles de azcar reductor, y con este dato, calcular la actividad de la enzima en
Unidades de Invertasa o Unidades Internacionales (UI), considerando que: una unidad de invertasa (UI) es la
cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un micromol de sacarosa en un minuto.
o = actividad =
[moles sacarosa]
min.
= U. I
15
OH
O
OH
HO
HO
OH
HO
OH
HO
OH
Invertasa
OH
HO
-D-Glucopiranosa
H2O
OH
OH
O
HO
OH
OH
HO
OH
Sacarosa
HO
-D-Fructofuranosa
-D-Fructofuranosa
COOOH
OH
HO
OH
OH
3, 5 DNS
(Amarillo)
CH2OH
D- Glucosa
COOH
NO2
O2N
92C
COO-
COOOH
OH
HO
OH
OH
OH
CH2OH
D-Gluconato
H 2N
NO2
NH2
O2 N
ROJO A mx = 540 nm
Este experimento tiene por objeto obtener una curva de calibracin, mediante la cual se puedan transformar
las lecturas de absorbencia obtenidas en los experimentos de cintica enzimtica, en micromoles de azcar
reductor, para de esta manera obtener la actividad de la enzima invertasa en unidades Internacionales (UI).
PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:
CURVA TIPO DE AZCARES REDUCTORES.
TUBO No.
Blanco
Problemas
0.1
0.2
0.4
0.8
1.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agua (mL)
1.0
0.9
0.8
0.6
0.2
0.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Glucosa 0.005 M
Fructosa 0.005 M (mL)
Sacarosa 0.20 M (mL)
Desarrollo de color
Dilucin
Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
(moles)/ 2.0 mL.
INFORME
1.- Introduccin.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
17
4.- Clculos.
5.- Curva tipo de azcar reductor. Grfica de absorbencia contra concentracin de azcar reductor, en
moles/2.0 mL.
6.- Escriba la reaccin qumica llevada a cabo, con frmulas.
7.- Discusin.
8.- Conclusiones.
9.- Bibliografa.
10.Preguntas extra.
PRCTICA No. 3
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN
18
INTRODUCCIN
Como en las reacciones qumicas, la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima aumenta al
incrementarse la temperatura, hasta alcanzar una temperatura crtica (que vara de enzima a enzima),
denominada temperatura ptima; sin embargo, despus de esta temperatura la velocidad de la reaccin
empieza a disminuir y a temperaturas ms altas la enzima se inactiva por completo, generalmente por
desnaturalizacin.
El aumento de actividad enzimtica a temperaturas moderadas est asociado con un aumento en el nmero de
colisiones efectivas entre la enzima y el sustrato, ya que la temperatura proporciona la energa de activacin
suficiente para que el sistema alcance el estado activado.
El parmetro usado ms frecuentemente para describir el aumento de velocidad con la temperatura es el Q 10, el
cual representa el nmero de veces que la actividad enzimtica se incrementa al aumentar 10 C la
temperatura.
OBJETIVO.
1. Demostrar que las reacciones enzimticas son afectadas por la temperatura.
2. Calcular el valor de la energa de activacin de la reaccin catalizada por la invertasa.
PROCEDIMIENTO
NOTA: Para lograr el objetivo de esta prctica las temperaturas de preincubacin e incubacin se
deben mantener constantes durante el experimento. Al agregar el 3,5-DNS, retirar inmediatamente el
tubo de su bao correspondiente y sumergirlo en hielo.
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla.
Terminado el experimento (una vez desarrollado el color), ajustar a cero el espectrofotmetro con el testigo de
25C. Tomar las lecturas de todos los tubos y restar la lectura del tubo testigo a la del problema
correspondiente.
19
EFECTO DE LA TEMPERATURA.
TUBO
Testigos
Problemas
T1
T2
T3
T4
T5
T6
Sacarosa
0.2 M (mL)
Regulador de acetatos
0.005 M,
pH 4.7 (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agua (mL)
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75 0.75
0.75
0.75
Temperatura de
Preincubacin (C)
5 min
25
37
50
75
92
25
75
92
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.25
0.25
0.25
0.25
25
37
50
75
92
25
75
92
Enzima 10 g/mL
(mL)
Temperatura de
Incubacin (C)
5 min
Inactivacin
37
0.25 0.25
37
Dilucin
Velocidad
(unidades de
invertasa)
20
50
Desarrollo de color
Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
( moles)
50
INFORME
1.-Introduccin.
2.-Objetivos.
3.-Resultados en forma de tabla.
4.-Clculos.
5.-Grfica de velocidad en unidades internacionales contra la temperatura en grados centgrados. Indicar en
la grfica obtenida, la temperatura ptima para la invertasa.
6.-De acuerdo con la ecuacin de Arrhenius
k = Ae-a/RT
Si se construye una grfica colocando en las ordenadas el logaritmo natural de la velocidad de la reaccin y
en las abscisas la inversa de la temperatura, en grados absolutos, es posible calcular la energa de
activacin si se saca la pendiente de la curva. (Para tener un mayor nmero de puntos, interpole en la
grfica de T contra vo la temperatura de 5 en 5 grados hasta la temperatura ptima y obtenga las
velocidades correspondientes.)
7.-Calcular la energa de activacin del sistema invertasa-sacarosa.
8.-Discusin.
9.-Conclusiones.
10.-Bibliografa.
11.-Preguntas extra.
21
PRCTICA No. 4
EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN
INTRODUCCIN
En trminos generales las enzimas solo son activas en un margen limitado de pH y en muchos casos este es
estrecho y definido
La actividad enzimtica en funcin del pH est determinada por los siguientes factores:
a)
b) Cambios en el estado de ionizacin en los grupos del sitio activo y/o del sustrato y
c)
OBJETIVO
El alumno determinar el efecto de la variacin del pH sobre la velocidad de reaccin para los procesos
catalizados por enzimas.
22
EFECTO DEL pH
TUBO
T
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
4.5
2.5
3.5
4.5
5.5
6.5
Agua (mL)
0.75
0.75 0.75 0.75 0.75
Preincubacin a temperatura ambiente durante
5 minutos
0.5 mL DNS
+ 0.5 mL
0.5
0.5
0.5
0.5
Enzima 10 g/mL
Enzima
(mL)
0.75
Sacarosa
0.2 M (mL)
0.5 mL de
Regulador de pH
0.5
Dilucin
Absorbencia
Concentracin de de
azcar reductor
(moles/2 mL)
Velocidad (unidades
de invertasa)
pH
INFORME
1.- Introduccin.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
4.- Clculos.
5.- Grfica de velocidad inicial en unidades de invertasa contra pH.
6.-Indicar en la grfica anterior el pH ptimo.
7.- Discusin.
8.- Bibliograf
PRCTICA No. 5
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN
23
INTRODUCCIN
Si se modifica la concentracin de sustrato y todas las dems condiciones permanecen constantes, se observa que
a una concentracin de sustrato baja, la velocidad de la reaccin es proporcional a la concentracin del sustrato y
la reaccin por lo tanto, es de primer orden. Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta la
velocidad de reaccin tambin aumenta pero deja de ser proporcional a la concentracin de sustrato, en esta zona
el orden de reaccin es mixto. Con un aumento posterior de la concentracin del sustrato, la velocidad de la
reaccin llega a ser independiente de la concentracin de sustrato y se aproxima asintticamente a una velocidad
constante (Vmx). En este intervalo de concentracin de sustrato, la reaccin es de orden cero y se dice que la
enzima se encuentra saturada con su sustrato.
OBJETIVO
Observar el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin enzimtica y determinar la
constante de Michaelis-Menten por los mtodos conocidos, as como su aplicacin.
PROCEDIMIENTO
Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla:
TUBO No.
Testigo
Problemas
24
0.50
0.05
0.10
0.15
0.30
0.50
0.8
Regulador de
acetatos 0.005 M,
pH 4.7 (mL)
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
Agua (mL)
0.50
0.90
0.80
0.70
0.60
0.50
0.20
0.5
0.5
Sacarosa
0.2 M (mL)
Preincubacin
Enzima 10 g/mL
(mL)
Incubacin
Inactivacin
0.5
0.5
0.5
0.5
Desarrollo de color
Dilucin
Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
(moles)/3.5 mL
Velocidad
(unidades de
invertasa)
Concentracin de
sustrato
(moles/L = M)
25
INFORME
1.2.3.4.5.6.7.8.9.-
Introduccin.
Objetivos.
Resultados en forma de tabla.
Grficas de velocidad en unidades de invertasa o internacionales contra concentracin de sustrato en moles/l.
Clculo de la constante de Michaelis-Menten por el procedimiento grfico de Lineweaver-Burk.
Discusin.
Conclusiones.
Bibliografa.
Preguntas extra.
26
PRCTICA No. 6
INHIBICIN ENZIMTICA
INTRODUCCIN
La mayora de las enzimas pueden ser inhibidas por diversas sustancias qumicas. A partir del estudio de los
inhibidores de las enzimas se ha obtenido una informacin valiosa acerca de la especificidad de las enzimas por
sus sustratos, de la naturaleza qumica de los grupos funcionales en el sitio activo y del mecanismo de la
actividad cataltica. Los inhibidores enzimticos han sido tambin tiles para dilucidar las rutas metablicas en la
clula.
Existen dos tipos de inhibidores enzimticos: irreversibles y reversibles. Los inhibidores irreversibles son
aquellos que se combinan covalentemente a un grupo de la enzima. Los inhibidores reversibles son aquellos que
se combinan en forma no covalente en la enzima libre y/o al complejo enzima-sustrato disminuyendo la actividad
cataltica de la enzima.
Los inhibidores reversibles se dividen en: competitivos, no competitivos e incompetitivos (acompetitivos).
Los inhibidores competitivos.- Estos inhibidores tienen una estructura qumica similar a la del sustrato por lo cual
pueden competir con el sustrato por unirse al sitio activo, pero una vez unidos, no pueden ser transformados por
la enzima. Este tipo de inhibicin puede ser revertida simplemente aumentando la concentracin del sustrato.
Inhibidores no competitivos.- Estos inhibidores se unen slo a la enzima o al complejo enzima-sustrato en un
sitio diferente al sitio activo.
Inhibidores incompetitivos (acompetitivos).- Estos inhibidores se unen slo al complejo enzima-sustrato.
OBJETIVO
Determinar el tipo de inhibicin producido por una sustancia (anilina) sobre la actividad de la invertasa.
27
PROCEDIMIENTO
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla.
La solucin de inhibidor (anilina 1.6 mM) ser proporcionada por
el profesor.
EFECTO DE INHIBIDORES
TUBO No.
Sacarosa
0.2 M (mL)
Inhibidor en
regulador de
acetatos
pH 4.7 (mL)
Agua (mL)
Testigo
1
0.50
0.05
0.10
0.15
0.30
0.50
0.80
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.90
0.80
0.70
0.60
0.50
0.20
0.5
0.5
Preincubacin
Enzima 10 g/mL
(mL)
Incubacin
Inactivacin
Desarrollo de color
Dilucin
Problemas
0.5
0.5
0.5
0.5
Absorbencia
= 540 nm
Azcar reductor
(moles)
Velocidad
(unidades de
invertasa)
Concentracin de
sustrato
(moles/L = M)
28
INFORME
1.2.3.4.5.-
Introduccin.
Objetivo.
Resultados en forma de tabla.
Clculos.
Grficas de velocidad en unidades de invertasa contra concentracin de sustratos en presencia y ausencia del
inhibidor.
6.- Determinar grficamente el valor de Km y el tipo de inhibicin.
7.- Discusin.
8.- Conclusiones.
9.- Bibliografa.
10.Preguntas extra.
PREPARACIN DE REACTIVOS
1) Sacarosa 0.35 M.-Disolver 119.56 g de sacarosa y llevar a 1000 mL con agua destilada.
2) Regulador de acetatos 0.05 M, pH 4.7.- Mezclar 1 litro de cido actico 0.05 M (2.88 mL de cido actico
glacial en 1000 mL de agua destilada), con 1 litro de acetato de sodio 0.05 M (6.8 g de acetato de sodio en
1000 mL de agua destilada), verificar el pH y ajustar si es necesario.
3) Reactivo de 3,5-dinitrosaliclico.- Disolver en caliente 5 g de cido 3,5-dinitrosaliclico en 100 mL de NaOH
2 N (8 g de NaOH en 100 mL de agua destilada). Adicionar 150 gramos de tartrato de sodio a 250 mL de
agua destilada y calentar hasta disolucin, mezclar las dos soluciones y ajustar el volumen final a 500 mL con
agua destilada.
4) Glucosa 0.005 M- Fructosa 0.005 M.- Pesar 0.9 g de glucosa y 0.9 g de fructosa, mezclarlas y llevar a 1000
mL con agua destilada.
5) Solucin de invertasa 10 g/mL.- Pesar 1 mg de invertasa y disolver en 100 mL de regulador de acetatos 0.05
M, pH 4.7
6) Regulador de fosfatos 0.2 M, pH 7.5.- Pesar 27.8 g NaH2PO4 y llevar a 1000 mL con agua destilada. Pesar
53.6 g de Na2HPO4.7H2O y llevar a 1000 mL con agua destilada; mezclar 16.0 mL de solucin A con 84 mL
de solucin B y ajustar a 200 mL con agua destilada.
NOTA: Como alternativa se puede preparar la siguiente solucin de citrato-fosfato para utilizar la misma
solucin durante todo el experimento:
7) Anilina 0.8 mM.- Pesar 0.744 g de anilina y llevar a 1000 mL con regulador de acetatos (pH 4.7). Agitar
fuertemente para que se disuelva totalmente.
29
BIBLIOGRAFA
1. Alexander, R., Griffiths, J., Wilkinson, M. 1985. Basic biochemical methods. Wiley & Sons. pp 29- 34, 41- 43,
56- 69.
2. Clark, J. m. 1966. Bioqumica experimental. Edo Acriba, pp 106- 115, 131- 138.
3. Horton, R., Moran, L., Ochs, R., Rawn, D. y Scrimgeour, G. 1995. Bioqumica. Prentice Hall
Hispanoamericana. pp 5.1- 5.12.
4. Rendina, G. 1974. Tcnicas de bioqumica aplicada. Ed. Interamericana. pp 161- 177.
5. Stryer, L. 1993. Bioqumica. Ed. Revert. Vol I. pp 183- 206.
30
PRCTICA No. 7
REACCIONES DE CARBOHIDRATOS
INTRODUCCIN
Los carbohidratos se definen como polihidroxialdehdos, polihidroxicetonas o aquellos compuestos que
por hidrlisis los producen. Los carbohidratos se clasifican con base en su estructura qumica, por el nmero de
unidades en: monosacridos, oligosacridos y polisacridos.
En los monosacridos, la unidad de carbohidrato, puede ser una aldosa (polihidroxialdehdo) o cetosa
(polihidroxicetona) y stas a su vez se clasifican con base al nmero de carbonos, en triosas y triulosas, tetrosas y
tetrulosas, pentosas y pentulosas, hexosas y hexulosas, heptosas y heptulosas, etc. para finalmente reclasificarse
cada una de ellas por el nmero de sus centros quirales.
Los oligosacridos estn constituidos de 2-10 monosacridos unidos a travs del enlace glicosdico que
puede ser hidrolizado por enzimas o por cidos en ciertas condiciones.
Los polisacridos son carbohidratos que contienen un gran nmero de monosacridos unidos por enlaces
glicosdicos; son hidrocoloides, no forman verdaderas soluciones, no tienen color ni sabor y su peso molecular
puede llegar hasta varios millones. Los polisacridos son polmeros lineales o ramificados constituidos por un
solo tipo de monosacridos (homopolisacridos) o por diferentes monosacridos (heteropolisacridos).
OBJETIVO
Analizar las propiedades caractersticas de los carbohidratos, derivadas de su estructura, realizando
algunas reacciones generales de identificacin.
MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Gradillas
Bao mara a ebullicin
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Glucosa slida y al 2%
Arabinosa al 2%
Maltosa al 2%
Sacarosa slida y al 2%
Fructosa al 2%
Glucgeno slido y al 0.2%
Almidn slido y al 2%
Dextrina slida y al 2%
Amilosa al 0.2%
-naftol
Etanol al 96%
cido sulfrico concentrado
Floroglucinol
HCl concentrado y diluido 1:3
Resorcinol
Sulfato de cobre
Hidrxido de potasio
Tartrato de sodio
Yodo elemental
Yoduro de potasio
31
1. ACCIN DE LOS
CARBOHIDRATOS.
CIDOS
REACCIONES
DE
CARACTERIZACIN
DE
Los cidos fuertes inorgnicos calientes deshidratan a las hexosas formando derivados furnicos como el
hidroximetil-furfural, que puede posteriormente descomponerse y formar otros compuestos como el cido
levulnico y el cido frmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural. Estas reacciones
son la base de las pruebas de Molish, Seliwanoff, Tollens y Bial para caracterizar carbohidratos, ya que el
producto deshidratado del carbohidrato se condensa con el reactivo correspondiente (alcohol aromtico)
produciendo compuestos coloridos caractersticos.
a) REACCIN DE MOLISH-UDRANSKY
FUNDAMENTO
La prueba de Molish est basada en la formacin de furfural o derivados de ste a partir de los
carbohidratos, que se condensan con el alfa-naftol, dando un producto violeta.
Es una reaccin muy sensible puesto que soluciones de glucosa al 0.001% y sacarosa al 0.0001% dan
positiva la prueba. Esta prueba tambin es positiva para aldehdos, cetonas y algunos cidos como el frmico,
oxlico, lctico y ctrico.
PROCEDIMIENTO
a) Colocar en el tubo de ensayo
correspondiente 1 mL de las soluciones a
probar marcadas con asterisco en la tabla
correspondiente.
b) Agregar 2 gotas del reactivo de Molish y
mezclar.
b) REACCIN DE TOLLENS
FUNDAMENTO
La prueba de Tollens es una reaccin caracterstica para pentosas y est basada en la formacin de
furfural a partir de pentosas y su posterior condensacin con el floroglucinol, dando un color rojo cereza.
PROCEDIMIENTO
32
c) REACCIN DE SELIWANOFF
FUNDAMENTO
La reaccin de Seliwanoff es una reaccin para diferenciar cetosas de aldosas; aunque ambas dan la
reaccin, las cetosas la dan rpido y las aldosas lentamente.
Esta reaccin se basa en la formacin de furfural o en un derivado de ste y su posterior condensacin
con el resorcinol dando un color rojo fuego para cetosas y rosa para aldosas.
PROCEDIMIENTO
a) Colocar
en
el
tubo
de
ensayo
correspondiente, 1 mL de las soluciones a
probar marcadas con asterisco en la tabla.
b) Agregar 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff y
mezclar.
c) Calentar en bao mara a ebullicin.
d) Tomar lecturas de la coloracin a intervalos
de 1 minuto durante los primeros 5 minutos.
El reactivo de Fehling est constituido por dos soluciones que se mezclan al momento de usarse
(Solucin A de sulfato de cobre y solucin B de tartrato de sodio-potasio en medio alcalino) con lo que se obtiene
el tartrato de cobre, que es el que se reduce.
El poder reductor de los oligo y polisacridos depende del nmero de carbonilos potencialmente libres
que no estn involucrados en enlaces glicosdicos.
PROCEDIMIENTO
PREPARACION DEL TESTIGO
a)
b)
c)
d)
a)
b)
c)
d)
Colocar en el tubo correspondiente 1 mL de las soluciones a probar marcadas con asterisco en la tabla.
Agregar 0.5 mL del reactivo de Fehling A y 0.5 mL del reactivo de Fehling B y mezclar.
Calentar en bao mara a ebullicin durante 5 minutos.
Una prueba positiva es un precipitado rojo ladrillo.
3. REACCIN DEL YODO
FUNDAMENTO
El yodo es atrapado por los polisacridos formando clatratos, y dependiendo de la estructura del
polisacrido, da una coloracin caracterstica; si el polisacrido es lineal se obtendr una coloracin azul pero si
es ramificado la coloracin obtenida va del prpura al rojo.
PROCEDIMIENTO
a) Colocar en el tubo de ensayo correspondiente
1 mL de las soluciones a probar (marcadas con
asterisco en la tabla).
b) Agregar una gota de lugol y mezclar.
c) Anotar el color producido en fro.
Blanco (agua)
Glucosa
Arabinosa
Maltosa
Sacarosa
Fructosa
Glucgeno
Almidn
Molish
*
*
Tollens
*
*
*
*
*
Seliwanoff
*
*
*
*
*
34
Fehling
*
*
Solubilidad
*
*
*
Yodo
*
*
*
*
*
Dextrina
INFORME
1.2.3.4.5.6.7.8.-
Introduccin.
Objetivo.
Fundamento de las reacciones con frmulas.
Resultados en forma de tabla.
Interpretacin de cada una de las reacciones.
Conclusiones.
Bibliografa.
Preguntas extra.
35
PREPARACIN DE REACTIVOS
1)
2)
3)
4)
5)
6)
PRCTICAS No. 8, 9 y 10
REACCIONES ENZIMTICAS DE XIDO-REDUCCIN
INTRODUCCIN
Todas las manifestaciones vitales requieren energa, la cual se obtiene de la oxidacin gradual de los
alimentos a travs de reacciones de xido-reduccin, es decir, reacciones en las cuales se transfieren
electrones o hidrgenos desde un compuesto, el donador de electrones o agente reductor, a un aceptor de
electrones o agente oxidante.
Las grandes cantidades de energa que liberan las reacciones biolgicas de xido reduccin
constituyen de hecho la principal fuente de energa disponible para el trabajo de la clula.
El ATP es el portador intermediario de energa entre las oxidaciones biolgicas que la liberan y los
diversos sistemas que la utilizan.
Las reacciones de xido-reduccin llevadas a cabo por la clula son catalizadas por enzimas que
actan como intermediarios hasta llegar al aceptor final de electrones que es el oxgeno.
OBJETIVOS.
El alumno realizar una serie de experimentos en los que pondr de manifiesto la actividad de algunas
enzimas que participan en reacciones de xido reduccin, la importancia de los cofactores y el efecto de
algunos inhibidores.
MATERIAL
Tubos de ensaye
Pipetas de 1, 5 y 10 Ml
Bureta de 25 Ml
Vasos de precipitados
Mortero y pistilo
Equipo de diseccin
Matraz erlenmeyer de 125 Ml
Bao mara
Gradillas
Arena lavada
Tubos de centrfuga
Centrfuga
Recipientes para hielo
Balanza granataria
SOLUCIONES Y REACTIVOS
NaCl al 0.9%
Na2HPO4 0.06 M, pH 7
KCN 0.5%
Lactato de sodio al 1%,pH 7.0
Azul de metileno 0.002 M
-naftol al 0.15%
Aceite vegetal
Succinato de sodio 0.1 M, pH 7
Malonato de sodio 0.1 M, pH 7
p-feniln diamina al 1 %
N,Ndimetil-p-feniln-diamina
al 0.5%
Nota:
PROCEDIMIENTO
1. OBTENCIN DEL SISTEMA DESHIDROGENASA LCTICA (LDH)-NAD+
A. Obtencin de la coenzima NAD+
a) Obtener 6 g de msculo de una pierna de pollo. Se puede utilizar msculo previamente congelado.
b) Cortar el msculo en fragmentos pequeos.
c) Colocarlos en un matraz erlenmeyer con 24 mL de agua.
d) Hervir durante 5 minutos y ajustar con agua destilada al volumen original.
e) Pasar la preparacin a un mortero con aproximadamente 1 g de arena y triturar el msculo hasta
homogeneizar.
f) Centrifugar a 2,500 rpm durante 15 minutos.
g) Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como "Coenzima NAD+".
h) Desechar el precipitado en una bolsa de plstico proporcionada por el profesor.
Lactato 1% (mL)
1.00
1.00
0.00
1.00
0.30
0.30
0.30
0.30
0.00
1.00
1.00
1.00
Coenzima NAD+
(mL)
LDH (mL)
1.00
0.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
0.00
0.5
0.5
No agitar los tubos
0.5
0.5
Nota: Iniciar las lecturas en los tiempos indicados cuando se observe decoloracin en el tubo nm.
1.
II)
DESHIDROGENASA SUCCNICA
a) Preparar una serie de 7 tubos de acuerdo a lo indicado en la tabla siguiente. Hacer observaciones
a los tiempos indicados anotando en el cuadro el grado de decoloracin con cruces.
TUBO No.
Succinato de sodio
0.1 M (mL)
0.50
0.50
0.00
0.50
0.50
0.50
1.00
Azul de metileno
0.002 M (mL)
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
0.30
Malonato de sodio
0.01 M (mL)
0.00
0.00
0.00
1.00
0.50
0.25
0.25
Agua (mL)
1.00
3.00
1.50
0.00
0.50
0.75
0.25
SDH-CIT (mL)
2.00
0.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
III)
a) Preparar una serie de 8 tubos de acuerdo a la tabla siguiente. Hacer observaciones a los tiempos
indicados anotando en el cuadro los cambios de color de las soluciones.
NOTA: Puede utilizarse solucin recin preparada de N, N dimetil p-feniln diamina al 0.5%.
TUBO No.
0.0
0.0
1.0
0.0
0.0
0.0
1.0
1.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.1
0.1
0.1
0.1
Agua (mL)
1.1
2.1
0.1
2.1
1.0
2.0
0.0
1.0
SDH-CIT (mL)
1.0
0.0
1.0
1.0
1.0
0.0
1.0
0.0
1.0
1.0
1.0
Mezclar
Leer color en cada tubo antes de iniciar la reaccin
p-feniln diamina 1% (recin
preparada) (mL)
1.0
1.0
1.0
0.0
1.0
INFORME
1.2.3.4.5.6.7.-
Introduccin.
Objetivos.
Resultados en forma de tabla.
Escriba con frmulas las reacciones que se efectuaron en esta prctica.
Interpretacin de cada tubo y global de cada serie.
Conclusiones.
Bibliografa.
PREPARACIN DE REACTIVOS
1) NaCl 0.9%.- Pesar 0.9 g de NaCl y llevar a 100 mL con agua destilada.
2) KCN 0.75%.- Pesar 0.75 g de KCN y llevar a 100 mL con agua destilada (dosis txica 4.3 mg/Kg de
peso).
3) Lactato de sodio 1%.- Pesar 1 g de lactato de sodio y llevar a 100 mL con agua destilada. Debe tener pH
7.0. En ausencia de lactato de sodio ste se puede preparar a partir de cido lctico y neutralizando la
solucin con bicarbonato de sodio slido, hasta pH 7.0.
4) Azul de Metileno 0.002 M.- Pesar 0.747 g de azul de metileno y llevar a 1000 mL con agua destilada.
5) Na2HPO412H2O 0.06 M.- Pesar 21.36 g de fosfato disdico y llevar a 1000 mL con agua destilada.
Ajustar a pH 7.0.
6) Succinato de sodio 0.1 M.- Pesar 11.8 g de cido succnico y llevar a 1000 mL con agua destilada.
Neutralizar la solucin con bicarbonato de sodio slido hasta pH 7.0.
7) Malonato de sodio 0.01 M.- Pesar 1.04 g de cido malnico y llevar a 1000 mL con agua destilada.
Neutralizar la solucin con bicarbonato de sodio slido hasta pH 7.0.
8) p-Feniln-diamina (base) al 1%.- Pesar 0.4 g de p-feniln-diamina y llevar a 40 mL con agua destilada
(DEBE PREPARARSE AL MOMENTO DE USARSE Y ESTAR A pH NEUTRO).
9) -naftol 0.15%.- Pesar 0.15 g de alfa-naftol y llevar a 100 mL con alcohol etlico 95%.
BIBLIOGRAFA
1. Conn, E. E. y P. K. Stump., Qutlines of Biochemistry., John Wiley and Sons, Inc., Fourth edition, pp.
287-288, 362-363, 375-392, (1976).
2. De Pierre, J. W. y L. Ernster. "Enzyme topology of intracellular membranes". Ann. Rev. Biochem.,
46:209-229. (1977).
3. Hinkle, E. R. McCarty. "Como fabrican ATP las clulas. Investigacin y Ciencia, 20:58-75. (1978).
4. Karp, G., Biologa Molecular, Mc Graw-Hill, Inc., USA (1987).
5. Lehninger, A. L., Principles of Biochemistry, 2a. Ed. Worth Publishers, Inc., pp. 415-417, 452-462,
542-567, (1993).
6. Martin, D. W., V. W. Rodwell, P. A. Mayes, D. K. Granner., Bioqumica de Harper., El Manual
Moderno. 10a. edicin (1986).
7. Rendina, G. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Ed. Interamericana. pp. 235-249. (1974).
8. Thorpe, W. V., H. G. Bray y P . S. James. Bioqumica. Ed. Continental, S.A. Mxico. pp. 195-208.
(1974).
PRCTICA No. 10
INTRODUCCIN
El cido desoxirribonucleico (DNA) es una molcula muy larga que contiene muchos miles de
desoxirribonucletidos de cuatro clases distintas, unidos en una secuencia que es caracterstica para cada
organismo y que consta, generalmente de dos cadenas. El genforo de las clulas procarinticas es una gran
molcula de DNA, dispuesta de modo compacto en una zona nuclear o nucleoide. Las clulas eucarinticas
contienen muchas molculas de DNA, combinadas con protenas y se hallan organizadas en la fibra de
cromatina en el interior del ncleo.
Las funciones del DNA consisten en almacenar la informacin gentica completa, necesaria para especificar
la estructura de todas las protenas y en cada una de las clases de RNA del organismo, en programar, tanto en
el tiempo como en el espacio, la biosntesis ordenada de los componentes de las clulas y de los tejidos, en
determinar la actividad de un organismo a lo largo de su ciclo vital y finalmente, en definir la individualidad
de un organismo dado.
OBJETIVOS
El alumno conocer y realizar un procedimiento de purificacin del DNA de una fuente vegetal.
El alumno obtendr el espectro de absorcin caracterstico del DNA.
MATERIAL
Mortero con pistilo
Vasos de precipitados de 250 Ml
Pipetas de 1, 5 y 10 Ml
Pipetas Pasteur
Tubos de centrfuga de 50 mL de
Polipropileno
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Tris-EDTA-NaCl
Amilasa
Dodecil sulfato de sdio
(SDS) al 10 %
Chiocharo, Guayaba o Haba
NaCl slido
Solucin concentrada de citrato salina
(SSC)
SSC diluida 1:1000
Cloroformo: alcohol isoamlico (24:1)
Etanol absoluto
PROCEDIMIENTO
A.- Obtencin de DNA a partir de Chcharo, Guayaba o Haba.
a) Antes de empezar, colocar en el congelador el frasco de etanol absoluto.
b) Pesar 15g de Chcharo, Guayaba o Haba.
c) Pasarlo a un mortero y adicionar 5mL de la solucin de tris- EDTA-NaCl (50mM:20mM:5mM) .
d) Triturar de 3 a 5 minutos
e) Adicionar 0.3 mL de amilasa (100mg/mL). Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Agitar
ocacionalmente.
f) Agregar 10 mL de una solucin saturada de NaCl y 5 mL de SDS al 10%.
g) Seguir triturando durante 5 minutos.
h)
INFORME
1.2.3.4.5.6.7.8.9.-
Objetivo.
Diagrama de flujo del procedimiento de obtencin del DNA.
Interpretacin de cada paso efectuado en la obtencin del DNA.
Espectro de absorcin del DNA.
Clculo de la concentracin del DNA obtenido, en g/mL tomando en cuenta el coeficiente de absorcin.
Determinacin de la concentracin del DNA obtenido, en mg/mL, con ayuda del nomograma.
Conclusiones
Pregunta extra.
Bibliografa.
PREPARACIN DE REACTIVOS
1) Solucin de tris-sacarosa-cloruro de magnesio.- Tris 0.01 M (PM 121.14); sacarosa 0.3 M (PM 342.30);
MgCl2 (PM 203.30). Pesar 1.21 g de tris, 102.66 g de sacarosa y 1.016 g de MgCl 2 y disolver en 1000 mL
de agua destilada en un matraz aforado.
2) Solucin de tris 0.4 M, pH 8.5.- Pesar 24.22 g de tris y disolverlo en aproximadamente 450 mL de agua
destilada en un matraz aforado, ajustar a pH de 8.5 y aforar.
3) Dodecil sulfato de sodio al 4%.- Pesar 20 g de dodecil sulfato de sodio (SDS) y llevar a 500 mL/cm de
agua destilada.
4) Solucin de EDTA salina, pH 8.0.- EDTA 0.1 M (PM 292.25); cloruro de sodio 0.15 M (PM 58). Pesar
2.922 g de EDTA y 0.87 g de NaCl y disolver en 80 mL con agua destilada. Ajustar el pH a 8.0 y llevar a
100 mL con agua destilada en un matraz aforado.
NOTA: Disolver el EDTA aadiendo NaOH concentrado y ajustar a pH de 8.0.
5) Solucin concentrada de citrato-salina.- Citrato de sodio 0.15 M (PM 294.10); cloruro de sodio 1.5 M
(PM 58). Pesar 11.028 g de citrato de sodio y 21.75 g de cloruro de sodio y disolver en 250 mL de agua
destilada en un matraz aforado.
6) Solucin diluida de citrato salina.- Preparar una dilucin 1:1000 de la solucin anterior. Mezclar 1 mL de
la solucin salina citrato concentrada con 999 mL de agua destilada.
7) Mezcla de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1).- Mezclar 24 mL de cloroformo con 1 mL de alcohol
isoamlico.
NOTA: Esta solucin se prepara en el momento de usarse.
BIBLIOGRAFA
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APNDICE I
MEDIDAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO.
De manera general puede considerarse que los riesgos que existen por el trabajo en el laboratorio pueden
evitarse con el uso de una buena tcnica de trabajo. De cualquier manera las muestras, los reactivos y
sustancias, el material y los aparatos que se utilicen deben ser manipulados de manera correcta pues los
accidentes leves que no se tratan correctamente pueden resultar de consecuencias graves.
En el laboratorio pueden presentarse accidentes tales como incendios o explosiones por el uso de solventes
flamables, por ello, este tipo de productos deben guardarse y usarse en lugares frescos y bien ventilados y a
prueba de fuego. No deben manejarse cerca de flamas y en lugares cerrados, donde los vapores puedan
acumularse y formar en el aire mezclas explosivas.
Los vapores de algunos reactivos usados en este curso de laboratorio son sumamente txicos, ya que pueden
penetrar a travs de la piel y causar erupcin y/o irritacin, tanto de sta como de los ojos, nariz y garganta,
por lo que deben medirse con propipeta, bulbos de hule o despachadores especiales para agregar reactivos
peligrosos y utilizarse en lugares bien ventilados.
En el manejo de los reactivos venenosos, corrosivos y custicos, aunque la mayora no tiene efecto de
absorcin en la piel, se debe tener cuidado ya que su ingestin es sumamente peligrosa, tal es el caso de los
cianuros, alcohol metlico, arsnicos, mercurio, etc. Por ello, debe insistirse en la importancia de rotular
correctamente los envases que los contengan y no beber ningn tipo de sustancia en el laboratorio.
En caso de ingerir cidos como el clorhdrico, ntrico, sulfrico, fosfrico y actico o hidrxidos como el de
sodio o de potasio, el tratamiento que se recomienda es el uso rpido de demulcentes como la leche o la clara
de huevo. El lavado gstrico y los hemticos estn contraindicados. La neutralizacin qumica (uso de lcalis
o cidos diluidos segn el caso), genera una reaccin exotrmica que empeora las lesiones existentes.
Se debe llamar al mdico o acudir a l en casos de ingestin, en el menor tiempo posible.