Universidade de Aveiro Departamento de Biologia 2010

Tnia Maria dos Santos Oliveira

PCR em tempo real: mtodos e aplicaes

o jri
Presidente Prof. Doutor Antnio Jos Arsnia Nogueira
Professor Associado com Agregao do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Arguente Principal

Prof. Doutor Francisco Manuel Andrade Corte Real Gonalves

Professor Associado com Agregao da Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra

Orientador

Prof. Doutor Lus Manuel Souto de Miranda

Professor Auxiliar Convidado do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Agradecimentos

O desenvolvimento deste trabalho trouxe-me mais-valias pessoais e profissionais incontornveis e marcantes. Sem a colaborao e disponibilidade de diversas pessoas e entidades tal no seria possvel. Um agradecimento ao Professor Lus Souto pelo tempo disponibilizado e exigncia com que orientou este trabalho e transmisso de conhecimentos. Agradeo tambm Mestre Helena Moreira pelo incentivo que me deu ao longo da elaborao da minha tese. Agradeo Dr. Paula Magalhes do IBMC, Dr. Vera do Laboratrio de Biologia Molecular do Servio de Sangue do HUC, Dr. Paula do Laboratrio de Hematologia do Hospital dos Coves, Mestre Patrcia Pereira do Laboratrio de Biologia do RNA da Universidade de Aveiro e Dr. Clia Nogueira do Instituto de Microbiologia da Faculdade de Medicina. A todas estas pessoas agradeo a sua disponibilidade para me receberem nos respectivos laboratrios dotados de equipamentos de PCR em tempo real, com o intuito de me esclarecerem dvidas e de me auxiliarem a aprofundar e conciliar conhecimentos na matria. Aos meus colegas de trabalho, que me ajudaram a conciliar os horrios de forma a poder ter tempo para a realizao da minha tese. Aos meus pais e avs agradeo todo o carinho, pacincia e apoio incondicional no s ao longo da elaborao deste trabalho, mas ao longo de todo o meu percurso. Finalmente, ao meu namorado agradeo e guardo, acima de tudo, o empenho com que me incentivou a desenvolver este trabalho, a pacincia com que aceitou a minha indisponibilidade, e a forma com que sempre me ajudou a ultrapassar todas as dificuldades que foram surgindo.

palavras-chave

PCR em Tempo Real; vantagens; equipamentos; aplicaes.

Resumo

A reaco em cadeia da polimerase (PCR) uma tcnica fundamental nos laboratrios actuais, que revolucionou a deteco de RNA e DNA. Recentemente, uma nova tcnica designada PCR em tempo real, evoluiu da tcnica de PCR convencional, com o objectivo de minimizar as suas numerosas limitaes. Esta tcnica, tambm conhecida como PCR Quantitativa ou PCR em tempo real Quantitativa um mtodo de quantificao e amplificao simultnea do DNA. A PCR em tempo real baseada na deteco e quantificao de um composto fluorescente (durante as primeiras fases da PCR), assentando num princpio bsico de que o aumento significativo da quantidade de produto da PCR est correlacionado com a quantidade inicial do controle. A PCR em tempo real apresenta inmeras vantagens relativamente PCR tradicional. A recolha de dados ocorre durante a fase exponencial de crescimento da PCR, sendo por tal uma anlise rpida e simples. Trata-se de uma tcnica sem influncia da amplificao no especfica, podendo a amplificao ser controlada em tempo real. O risco de contaminao baixo devido ausncia de processamento ps-PCR dos produtos resultantes. Alm do mais, esta tcnica requer apenas 3 picogramas de material, o que cerca de 1000 vezes menos material gentico face a ensaios convencionais. Finalmente, uma tcnica mais especfica, sensvel e reprodutvel. No entanto, a PCR em tempo real apresenta algumas desvantagens designadamente, o elevado custo do equipamento e as elevadas exigncias tcnicas e cientficas requeridas para o correcto manuseamento e manuteno do equipamento. A tcnica da PCR em tempo real pode ser aplicada tanto em utilizaes mais tradicionais da PCR como em novas aplicaes s quais a PCR convencional responde de forma pouco ou menos eficaz, em reas to diversas como, sade, forense e agricultura. As principais aplicaes esto relacionadas com a quantificao da expresso gnica, controle de qualidade e validao de ensaios, quantificao viral, deteco de agentes patognicos, toxicologia forense quantificao de danos no DNA, genotipagem, determinao pr-natal do sexo de clulas, dosagem gnica, oncologia clnica, quantificao de protenas, microbiologia, anlise e quantificao de DNA mitocondrial e de DNA nuclear, qualidade do DNA, estudo da presena de nveis de OGM nos alimentos, certificao, entre muitas outras aplicaes possveis. O principal objectivo desta tese de Mestrado visou apresentar o estado da arte da tcnica da PCR em tempo real, nomeadamente, descrio da tcnica, comparao com a PCR convencional, apresentao das vantagens e desvantagens, caracterizao e anlise das plataformas implantadas no mercado e anlise e discusso detalhada de aplicaes reais e potenciais.

Keywords

Real-Time PCR; advantages; equipments; applications.

Abstract

The polymerase chain reaction (PCR) is a key technique in worldwide laboratories, which revolutionized the detection of RNA and DNA. Recently, a new technique, named Real-Time PCR, emerged from the traditional PCR, aiming to remove many of the limitations of standard end-point PCR. This technique, also known as Quantitative PCR, Real-Time Quantitative PCR, or RTQ-PCR is a method of simultaneous DNA quantify and amplification. The Real-Time PCR is based on the detection and quantitation of a fluorescent reporter (during the early phases of the PCR), being the first significant increase in the amount of PCR product (threshold cycle) correlated to the initial amount of target template. Real-Time PCR provides distinct advantages over traditional PCR detection. The data collection occurs during the exponential growth phase of PCR, being a quick and simple procedure. That is not influenced by non-specific amplification and the amplification can be monitored in real-time. The contamination risk is low due to the absence of post-PCR processing of products. Furthermore, this technique only requires 3 picogram of material which is 1000-fold less sample comparing to the conventional assays. Finally, it is most specific, sensitive and reproducible technique. However, Real-Time PCR present some disadvantages, namely the high equipment cost, the setting up requires high technical skill and support and is not ideal for multiplexing. Real-Time PCR can be applied to traditional PCR purposes as well as new applications that would have been less effective with traditional PCR, in several areas such as health, forensics and agriculture. Some applications are related to quantitation of gene expression, array verification, quality control and assay validation, viral quantitation, forensics toxicology, pathogen detection, DNA damage measurement, genotyping, among others. The main goal of this Master thesis is describe the state of the art of the RealTime PCR, namely, showing a overview of the technique and its procedure and comparing with the conventional PCR technique, presenting their advantages and disadvantages, characterizing and analysing the main platforms used in the national and international market and analysing and discussing potential and real applications.

ndice
Resumo Abstract ndice Lista de Tabelas Lista de Figuras Lista de Siglas Plano Geral da Dissertao ............................................................................................... 13 Objectivos ........................................................................................................................... 13 Introduo .......................................................................................................................... 14 1. PCR convencional .......................................................................................................... 15 1.1. Contextualizao histrica ................................................................................ 15 1.2. Princpios da tcnica ....................................................................................... 18 1.3. Deteco do produto da PCR .......................................................................... 24 1.4. Aplicaes da PCR ......................................................................................... 27 1.5. Variantes da PCR ............................................................................................ 28 2. PCR em tempo real........................................................................................................ 30 2.1. Contextualizao histrica ................................................................................ 30 2.2. Princpios da tcnica ....................................................................................... 30 2.3. Tecnologias e mtodos de deteco ................................................................ 33 2.4. Anlise dos resultados obtidos ........................................................................ 44 2.5. Quantificao dos resultados da qPCR ........................................................... 47 2.6. Tempo dispendido numa anlise qPCR .......................................................... 48 3. PCR convencional vs PCR em tempo real................................................................... 49 3.1. Vantagens e Limitaes da tcnica de PCR convencional ............................... 49 3.2. Vantagens e Limitaes da tcnica de PCR em tempo real ............................ 49 4. Equipamentos da PCR em tempo real........................................................................ 51 4.1. Principais plataformas ...................................................................................... 51 4.2. Discusso crtica dos equipamentos................................................................ 53 5. Aplicaes da PCR em tempo real ............................................................................... 56 5.1. Aplicaes na rea da sade ............................................................................. 56 5.2. Aplicaes na rea forense ................................................................................ 67 5.3. Aplicaes na rea da agricultura/indstrias agro-alimentares ........................ 74 Concluses .......................................................................................................................... 77 Bibliografia ......................................................................................................................... 79 Webgrafia ........................................................................................................................... 86 Anexos ................................................................................................................................. 87

Lista de Tabelas
Tabela 1 - Componentes envolvidos no processo de clonagem Tabela 2 - Distino entre gis de agarose e de poliacrilamida Tabela 3 - Variantes da tcnica de PCR convencional Tabela 4 - Caractersticas distintivas entre as sondas de sequncia especfica e os corantes intercalantes

Lista de Figuras
Figura 1 - Desenho esquemtico de uma experincia tpica de clonagem Figura 2 - Figura esquemtica de um ciclo da tcnica da PCR Figura 3- Amplificao exponencial do gene na PCR Figura 4 Desenho esquemtico da actividade da Taq DNA polimerase Figura 5 (a) - Representao da molcula dATP utilizado na PCR Figura 5 (b) - Representao da molcula dTTP utilizado na PCR Figura 5 (c) - Representao da molcula dGTP utilizado na PCR Figura 5 (d) - Representao da molcula dCTP utilizado na PCR Figura 6 - Aparelho de electroforese em gel Figura 7 - Visualizao do produto da PCR em gel de agarose Figura 8 - Gel de poliacrilamida Figura 9 - Clonagem de um gene recorrendo a um plasmdeo Figura 10 - Representao grfica das fases da PCR em tempo real Figura 11 - Representao grfica dos resultados da amplificao em tempo real em funo de diferentes teores de molculas de DNA iniciais Figura 12 (A) - Representao da molcula SYBR Green intercalada na dupla cadeia de DNA Figura 12 (B) - Mtodo de funcionamento da molcula Figura 13- Curvas de Tm para cada um dos corantes (LCGreen Plus e SYBR Green) Figura 14- Curvas de melting dos corantes SYBR Green e LCGreen Plus Figura 15- Cintica dos corantes SYBR Green e EvaGreen Figura 16- Representao esquemtica da sobreposio espectral do quencher (molcula receptora) e reprter (molcula dadora) Figura 17- Representao de um oligonucletido com estrutura terciria tipo hairpin-loop utilizado como molecular beacons Figura 18 Representao esquemtica da estrutura e modo de funcionamento das oligosondas primer Sunrise e Scorpion Figura 19 - Hibridao das sondas TaqMan Figura 20 Hidrlise das sondas TaqMan Figura 21 - Representao do mtodo de aco da sonda FRET

Figura 22 - Curva HRM Figura 23 - Representao grfica da curva padro determinada aps sucessivas anlises de amostras com concentrao conhecida de DNA Figura 24 - Mecanismo de metilao do DNA

Lista de Siglas
A - Adenina ABI Applied Biosystems C Citosina CT Cycle threshold - Limiar da fase exponencial dATP Desoxiadenosina trifosfato dCTP Desoxicitosina trifosfato dGTP- Desoxiguanosina trifosfato DNA Deoxyribonucleic acid - cido desoxirribonucleico dNTPs - Desoxirribonucletidos trifosfatados dTTP Desoxitimidina trifosfato FRET Fluorescence ressonance energy transfer - Transferncia de energia de fluorescncia G- Guanina HRM High resolution melting - Dissociao de alta resoluo MDA Multiple displacement amplification mRNA RNA mensageiro pb Pares de bases PCR- Polymerase chain reaction - Reaco em cadeia da polimerase qPCR/RTQ-PCR PCR em tempo real RNA Ribonucleic acid- cido ribonucleico SNP Single nucleotide polymorphism- Polimorfismo num nucletido nico STRs - Short tandem repeats T- Timina TAE Tris-acetato-EDTA Taq - Thermus aquaticus TBE Tris-borato-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine - Tetrametiletilenodiamina Tm- Temperatura de melting UV Radiao ultravioleta

Plano Geral da Dissertao

O estudo apresentado nesta tese intitula-se PCR em tempo real: mtodos e aplicaes e por tal, visa apresentar o estado da arte relativamente tcnica da PCR em tempo real. A presente dissertao est estruturada em 5 captulos. No primeiro captulo ser abordada a tcnica da PCR convencional, que serve de base tcnica da PCR em tempo real, descrevendo-se os princpios da tcnica, discutindo-se vantagens e desvantagens da mesma e apresentando-se diversas variantes da tcnica. O segundo captulo corresponde a uma reviso da literatura relativamente tcnica da PCR em tempo real. Apresentar-se- uma resenha histrica, os fundamentos da tcnica, os procedimentos principais (mtodos qumicos de fluorescncia, sondas e corantes). O terceiro captulo est reservado comparao das tcnicas da PCR convencional e PCR em tempo real e discusso das suas vantagens e desvantagens. As plataformas/equipamentos disponveis no mercado so apresentadas e discutidas no quarto captulo. O quinto captulo diz respeito apresentao e discusso das principais aplicaes da tcnica, sendo analisadas detalhadamente diversos estudos publicados recentemente em revistas cientficas. O presente trabalho encerrado com as principais concluses.

Objectivos
Os principais objectivos que acompanharam a concretizao desta dissertao foram de uma forma geral, apresentar o estado da arte da tcnica da PCR em tempo real, e em particular, conhecer os princpios da tcnica, procedimentos, equipamentos e aplicaes, identificar e compreender as situaes em que a tcnica mais aplicvel e distinguir correctamente a tcnica PCR em tempo real da tcnica PCR convencional e demais tcnicas derivadas desta.

Introduo
O sculo XX foi marcado por diversas descobertas cientficas. Contudo a descoberta da molcula de DNA, nomeadamente a sua estrutura e a sua funo, ter sido uma das maiores revolues no domnio da Biologia, visto ter possibilitado a compreenso dos mecanismos fundamentais da vida. Tal facto aumentou a vontade de conhecer e compreender o genoma, estando j completamente sequenciados os genomas de diversas espcies, incluindo o do Ser Humano. O estudo do genoma possibilitou e, ainda possibilita, a anlise, discusso e compreenso dos fenmenos da hereditariedade, da variabilidade inter e intra-especfica, da erradicao e/ou controlo de doenas, entre outros aspectos (Pelt-Verkuil et al., 2008). O aumento gradual do conhecimento da complexidade da molcula de DNA e a constante exigncia de meios de diagnstico cada vez mais rpidos, fiveis e especficos, conduziram ao desenvolvimento de diversas tcnicas de quantificao do DNA ao longo dos ltimos 50 anos. Destacam-se a Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR) e as numerosas variantes recentemente desenvolvidas, entre as quais se evidencia a PCR em tempo real que tem como principal particularidade a monitorizao em tempo real da amplificao (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). Devido rapidez, sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade da tcnica, a PCR em tempo real hoje em dia fundamental em investigao mdica, forense ou biotecnolgica. As suas aplicaes estendem-se desde a genotipagem e a quantificao da expresso gnica at toxicologia forense e biossegurana. Esta amplitude de aplicaes demonstrada pelo crescimento quase exponencial das publicaes cientficas baseadas nesta tcnica desde a sua criao em 1993 (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008; Oliveira, 2009).

1. PCR convencional 1.1 Contextualizao histrica

Aps a descoberta da estrutura e funo da molcula do DNA, vrios cientistas interessaram-se pelo desenvolvimento de mtodos de deteco e quantificao dos cidos nucleicos. As primeiras tcnicas basearam-se em ensaios de hibridizao. Apesar de este procedimento permitir a deteco de quantidades de material na ordem dos picogramas e de ser um teste sensvel, fivel e relativamente rpido, apresentava como maior limitao o recurso a sondas radioactivamente marcadas, o que trazia implicaes para a sade, requeria autorizaes legais e dispositivos eficientes e era na globalidade um processo dispendioso. Por tal, foi desenvolvido uma segunda gerao de mtodos de deteco de hibridizao (colorimtrica, qumico-luminescente e qumico-fluorescente) baseados em materiais no radioactivos, de forma a substituir os materiais radioactivos. Contudo estas tcnicas no apresentavam sensibilidade to elevada como nos primeiros sistemas. At aos dias de hoje, uma variedade de tcnicas baseadas no princpio bsico da hibridizao foram desenvolvidas (por exemplo: hibridizao Southerne Northern-blot) sendo

frequentemente aplicadas na investigao fundamental e em diagnsticos clnicos. Contudo a rpida evoluo no domnio da sade e das cincias forenses exigiu o desenvolvimento de novas tcnicas que permitissem a deteco rpida e fivel de quantidades nfimas de molculas, como os cidos nucleicos. De forma a ultrapassar as limitaes da sensibilidade que eram inerentes aos protocolos de deteco e hibridao do cido nucleico, uma nova tcnica foi desenvolvida: a tcnica da PCR ou tcnica da Reaco em Cadeia da Polimerase (Pelt-Verkuil et al., 2008). A PCR foi concebida pelo Qumico Americano Kary Mullis em 1983 (Saiki et al., 1985). Mullis desenvolveu um processo atravs do qual o DNA poderia ser multiplicado artificialmente atravs de ciclos repetidos de duplicao cuja reaco seria catalisada pela DNA polimerase. Esta tcnica baseia-se na amplificao exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de um conjunto de clulas, correspondendo a um mecanismo de sntese artificial de DNA num processo em cadeia que imita a replicao do DNA. Trata-se de um mtodo rpido e eficiente para amplificao de sequncias especficas a partir de uma mistura complexa de sequncias genmicas ou DNA complementar. Pequenas quantidades de material gentico podem ser amplificadas milhes de vezes e em

poucas horas, permitindo assim uma deteco rpida e fivel dos marcadores genticos de doenas infecciosas, cancro ou doenas genticas, entre outras aplicaes. Pode ainda ser aplicada no mapeamento gentico, na clonagem de genes, em testes de paternidade e na construo de rvores filogenticas. Assim sendo, esta tcnica revolucionou vrias reas tais como, a Biologia Molecular, a Patologia, a Farmcia, a Botnica e a Medicina Forense (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). Mullis viu reconhecido a importncia da sua criao atravs da arrecadao do prmio Nobel da Qumica, que compartilhou com o Qumico Canadiano Michael Smith, por ter estabelecido a base dos oligonucletidos para o estudo das protenas. A incorporao dos ciclos trmicos na tcnica foi uma clara e determinante inovao na deteco e amplificao de grandes quantidades de DNA (Mackay et al., 2007; PeltVerkuil et al., 2008). O desenvolvimento da tcnica da PCR optimizou o processo de clonagem devido a no necessitar de microrganismos vivos e permitir um aumento exponencial da quantidade de DNA amplificado de forma rpida e segura.

Figura 1 - Desenho esquemtico de uma experincia tpica de clonagem

(Adaptado de http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Hospedeiros/Hospedeiros.html, acedido a 10.11.2009).

Antes da descoberta da PCR, a clonagem prvia e a respectiva replicao na clula do hospedeiro eram requisitos fundamentais para a sntese de DNA. Na verdade, a clonagem era e continua a ser um processo relativamente complexo que envolve a seleco de um plasmdeo adequado (vector) para a insero de um determinado gene (DNA dador). Tanto o DNA dador como o vector tm sequncias de DNA especficas, nas quais as endonucleases de restrio vo cortar as cadeias do DNA num local especifico. Posteriormente, mistura-se o fragmento de DNA (contendo o gene que vai ser clonado), o plasmdeo (no qual o gene ser inserido) e a endonuclease de restrio escolhida. A enzima escolhida dever cortar o plasmdeo num s local, e sendo assim este poder ento receber uma poro adicional de DNA. Em seguida, incubam-se os fragmentos de DNA e os plasmdeos cortados e abertos, com a enzima ligase que por sua vez liga fragmentos de DNA e plasmdeos. Sendo assim, desta ligao vai resultar um plasmdeo recombinante que contm o fragmento de DNA desejado. No final do processo, as clulas que adquiriram os plasmdeos dizem-se transformadas (Fig.1; Pelt-Verkuil et al., 2008). Na tabela 1 encontram-se sumariados todos os componentes envolvidos no processo de clonagem. Tabela 1 - Componentes envolvidos no processo de clonagem. Componente da clonagem
DNA dador Endonuclease de restrio

Funo
Fonte do DNA ou gene a ser clonado Enzima utilizada para cortar tanto o DNA do dador como o do vector em locais especficos, de modo a que o DNA do dador possa ser inserido no vector Plasmdeo ou bacterifago utilizado para introduzir o gene a ser clonado numa clula hospedeira Enzima utilizada para ligar as extremidades livres e adaptveis do DNA do vector e do dador, e assim formar um vector recombinante Geralmente uma bactria ou uma clula de levedura. Os vectores recombinantes introduzem -se nas clulas hospedeiras de modo a obter maiores quantidades da molcula de DNA recombinante

Vector Ligase do DNA

Clula hospedeiro

1.2. Princpios da tcnica

A reaco da PCR envolve trs fases: a fase de desnaturao pelo calor, a fase de annealing e a fase de extenso (Fig. 2). Na primeira fase ocorre a separao da dupla hlice de DNA por aquecimento a uma temperatura elevada (94C-96C), originando duas cadeias separadas (Pelt-Verkuil et al., 2008). A fase de hibridao dos primers (oligonucletidos iniciadores) ocorre entre 50C e 54C. Durante esta fase adicionado o par de primers que se recombinam com as duas cadeias de DNA separadas com elevada especificidade. O par de primers liga-se exactamente sequncia complementar de DNA, indicando os pontos inicial e final da nova cpia de DNA que ir ser sintetizada na fase seguinte (Pelt-Verkuil et al., 2008). Durante a fase de extenso do DNA a temperatura elevada at ao intervalo 72C a 76C, que coincide com a temperatura a que a DNA polimerase tem o seu mximo de actividade. Aquela enzima reconhece os stios onde os primers se recombinaram com o DNA alvo e liga-se a eles. A enzima sintetiza a cadeia complementar utilizando os nucletidos trifosfatados que esto livres e em excesso na soluo da reaco (dNTPs). A extenso comea sempre na zona 3 do primer. A DNA polimerase sintetiza exclusivamente na direco 5-3. Consequentemente, na construo da cadeia complementar da sequncia alvo de DNA, os nucletidos livres na soluo so somente adicionados zona 3 dos primers (Pelt-Verkuil et al., 2008). No fim de um ciclo de PCR obtm-se duas novas cadeias de DNA para cada alvo da dupla cadeia. Assim, duas novas cadeias so sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo da tcnica de PCR, fazendo com que se d um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cpias do que havia no incio (Fig. 3) (Delidow et al., 1993). O produto da reaco da PCR denominado amplico (Pelt-Verkuil et al., 2008).

Figura 2 - Figura esquemtica de um ciclo da tcnica da PCR

(Adaptado de http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, acedido a 25.11.2009).

Figura 3 - Amplificao exponencial do gene na PCR

(Adaptado de http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, acedido a 25.11.2009).

Para a realizao da tcnica de PCR necessrio o DNA molde e uma mistura de reagentes, denominada de Master Mix. Esta mistura tem como componentes essenciais a enzima DNA polimerase, iniciadores da reaco (primers), desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs), tampo, catio bivalente Mg 2+ e catio monovalente K + (KCl) (Chen e Janes, 2002; Roche, 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008).

 Iniciadores (Primers)

Os primers so oligonucletidos responsveis por iniciar a reaco da PCR. Estes so adicionados soluo e aps a descida da temperatura, ocorre a sua hibridizao com as sequncias complementares presentes nas molculas do DNA molde. Os iniciadores utilizados na PCR servem para localizar a sequncia alvo. Os quatro nucletidos (G guanina, C citosina, A adenina e T timina) utilizados na PCR correspondem aos nucletidos presentes na sequncia dos primers, compostos por um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada (Pelt-Verkuil et al., 2008). Os fragmentos de DNA a amplificar no devem exceder as 3000 pares de bases (pb) e idealmente devero ser inferiores a 1000 pb. Por sua vez, a correcta dimenso dos primers tambm determinante para o sucesso da aplicao da tcnica, devendo aqueles apresentar cerca de 18 a 30 pb. Estas sequncias de oligonucletidos devero ter um tamanho suficiente para que a probabilidade de hibridar com outras regies que no a desejada, seja reduzida. A concentrao dos primers na soluo tambm afectar o resultado final da PCR, isto , baixa concentrao induz m polimerizao e concentraes excessivas induzem o aparecimento de produtos inespecficos e formao de dmeros de primers (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). Durante a reaco da PCR, a temperatura considerada um factor fundamental, contribuindo, por exemplo, para quebrar as ligaes entre os nucletidos do primer e da cadeia de DNA ou para prevenir a ocorrncia de incompatibilidades caso os primers sejam excessivamente longos. A temperatura na qual 50% das molculas do conjunto primer/DNA esto desemparelhadas e as outras 50% esto ainda hibridizadas denomina-se temperatura de melting (Tm). Se o primer tiver menos de 25 nucletidos, a Tm pode ser estimada recorrendo Regra de Wallace, sendo dada pela frmula Tm=4(G+C) + 2(A+T) C, em que G, C, A, T correspondem ao nmero de cada um dos nucletidos no primer. Esta temperatura vai determinar por sua vez a temperatura de annealing, que diz respeito temperatura qual ocorre a juno dos primers. Frequentemente esta temperatura seleccionada de acordo com a Tm consensual sendo lhe diminudo 2 a 4C (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008).

 Polimerase

A escolha da DNA polimerase determinada pelos objectivos da experincia. Existem no mercado uma larga variedade de enzimas, que diferem em termos de estabilidade trmica, fidelidade e direco de processamento da polimerizao. A polimerase mais popular a Taq polimerase (Fig.4) extrada da bactria termfila Thermus aquaticus, que vive em guas a 75C. A Taq DNA polimerase uma protena com cerca de 94 kDa com actividade de polimerizao 5-3 que mais eficiente no intervalo 70C a 80C. A enzima bastante termo-estvel, apresentando um tempo de meia vida de aproximadamente 35-40 minutos a 95C. Desta forma, esta enzima poder ser adicionada no incio da reaco e permanecer activa durante todos os ciclos de amplificao (Chen e Janes, 2002; Yazd et al., 2009).

Direco da polimerizao

Figura 4 Desenho esquemtico da actividade da Taq DNA polimerase.

(Adaptado de Roche, 2003).

A Pfu DNA polimerase uma enzima termoestvel, isolada da Pyrococcus furiousus, com actividade de polimerizao 3-5 que mais eficiente no intervalo a 75C. O tempo de meia vida a 95C superior a 120 minutos (Chen e Janes, 2002; Kima et al., 2008). A Vent polimerase isolada da arqueobactria termofila Thermoccocus litoralis, que habita em fundos ocenicos com temperaturas superiores aos 98C. Esta enzima distingue-se da Taq polimerase pelo facto da actividade de polimerizao ocorrer na direco 3-5 e de ser bastante mais termoestvel visto apresentar um tempo de meia vida a 95C de cerca de 400 minutos (Chen e Janes, 2002; Yazd et al., 2009).

 dNTPs

Os desoxirribonucletidos trifosfatados dNTPs: dATP- desoxiadenosina trifosfato (Fig. 5 (a)); dTTP - desoxitimidina trifosfato (Fig. 5 (b)); dGTP - desoxiguanosina trifosfato (Fig. 5 (c)) e dCTP - desoxicitosina trifosfato (Fig. 5 (d)) so seleccionados de acordo com o emparelhamento ao molde, e so ligados cadeia por ligaes fosfodister. Os quatro nucletidos devem conter a mesma concentrao, para que no ocorram erros de incorporao. As elevadas concentraes de dNTPs normalmente vo aumentar este tipo de erros, mas por sua vez, concentraes demasiado baixas fazem diminuir o rendimento da reaco (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008).

Figura 5 (a) Representao da molcula de dATP utilizado na PCR (Extrado de

http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxyadenosine_triphosphate, acedido a 12.10.2010).

Figura 5 (b) Representao da molcula de dTTP utilizado na PCR (Extrado de

http://en.wikipedia.org/wiki/Thymidine_triphosphate, acedido a 12.10.2010).

Figura 5 (c) Representao da molcula de dGTP utilizado na PCR (Extrado de

http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxyguanosine_triphosphate, acedido a 12.10.2010).

Figura 5 (d) Representao da molcula de dCTP utilizado na PCR (Extrado de

http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycytidine_triphosphate, acedido a 12.10.2010).

 Tampo

O tampo utilizado para manter o pH estvel durante a reaco. Normalmente utiliza-se o tampo Tris-HCl, com o pH ajustado entre 8,3 - 8,8 temperatura ambiente e a uma concentrao de 10 mM (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). MgCl2 A actividade das DNA polimerases termoestveis depende da existncia na soluo de caties bivalentes livres, normalmente Mg2+, sendo por tal o MgCl2, um co-factor essencial na reaco. Vrios componentes da reaco ligam ao Mg2+, incluindo os primers, o DNA a ser amplificado, produtos da PCR e os dNTPs. A concentrao do io magnsio deve exceder a concentrao de dNTPs, atendendo ao facto da ligao entre ambos os reagentes ocorrer na proporo de 1:1 e devido ao io actuar como co-factor enzimtico na PCR, ao tornar-se substrato da DNA polimerase. Desempenha ainda um papel de auxlio na ligao do primer ao DNA molde. Tipicamente, a concentrao molar do io pode variar entre 1.5 a 4.0 mM, dependendo esta da concentrao molar de grupos fosfatos, do kit utilizado e do nvel de degradao do DNA. Contudo, deve realar-se que baixas concentraes deste io corresponde normalmente a reduzidas quantidades do produto final, assim como, excessivas concentraes de Mg2+ tornam a PCR pouco especfica. (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). KCl

O recurso a sais, como o KCl, fundamental para fornecer a fora inica necessria durante a reaco. Regra geral, os tampes apresentam cerca de 50 mM de KCl, estando optimizados para fragmentos de DNA superiores a 500 pb. Para fragmentos mais reduzidos de DNA, a concentrao de KCl deve ser aumentada para 70-100 mM, uma vez que torna mais eficiente a PCR. Note-se que a concentrao do sal influencia a Tm do conjunto primer/DNA molde e por conseguinte a temperatura de annealing (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008).

1.3. Deteco do Produto da PCR

O produto da reaco da PCR normalmente visualizado atravs de electroforese em gel. Outros mtodos analticos podem ser aplicados com a finalidade de deteco dos produtos da PCR, tais como, Southern blotting, ensaio ELAHA (enzyme-linked amplicon hybridization assay), ensaio ELOSA (enzyme-linked oligosorbent assay), entre outros (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). A electroforese em gel consiste na separao de molculas com carga elctrica no nula, geralmente usada para separar protenas e molculas de DNA e RNA. Durante a aplicao de uma diferena de potencial assiste-se migrao de partculas que originam um conjunto de bandas. A visualizao destas bandas realizada atravs de radiao ultravioleta e s possvel devido adio de um composto fluorescente apropriado que, ao interagir com o DNA, se torna fluorescente. A seleco do composto determinante, na medida em que uns compostos se ligam preferencialmente ao DNA em vez do RNA e outros mostram maior afinidade ao DNA de cadeia dupla face ao de cadeia simples. O brometo de etdio um exemplo de um composto fluorescente, que apresenta caractersticas mutagnicas e que largamente utilizado para a deteco de DNA em gis (Oliveira, 2009). Outro exemplo o nitrato de prata que utilizado em gis de poliacrilamida. O tamanho do produto depois estimado por comparao das bandas com marcadores de massas moleculares previamente conhecidas (Chen e Janes, 2002). O gel de agarose amplamente utilizado pese embora outros gis se possam utilizar, tais como a poliacrilamida. O gel utilizado depende do tamanho das molculas a separar. Regra geral, utiliza-se gel de poliacrilamida para separar protenas ou molculas de DNA de pequenas dimenses (at 500 pb) e agarose para molculas de DNA maiores. O gel de agarose fcil de elaborar e forma poros de maiores dimenses sendo adequado a molculas de maior massa molecular. O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resoluo, permitindo distinguir fragmentos que diferem numa s base, ou que tendo o mesmo nmero de bases, tm diferentes conformaes (Pelt-Verkuil et al., 2008). Agarose

O polissacardeo agarose um composto slido quimicamente estvel temperatura ambiente que pode ser extrado a partir de algas marinhas. A agarose forma uma matriz

porosa (cujo tamanho do poro pode ser controlado) e atravs do qual as molculas de cidos nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente da carga elctrica, massa (pb) e conformao das molculas. A velocidade de migrao depende ainda da sua composio nucleotdica, da concentrao da matriz de agarose utilizada, do campo elctrico aplicado ao sistema (V/cm) e ainda da composio do tampo utilizado na electroforese. Regra geral, as molculas com menor massa migram mais rapidamente do que as de maior massa, dado que as de maior massa tm tendncia a ficar retidas na matriz de agarose. A migrao das partculas ocorre no sentido do plo positivo, dado que as molculas de DNA so carregadas negativamente (Lo et al., 2006; Miguel, 2007; PeltVerkuil et al., 2008). A Figura 6 ilustra um equipamento de electroforese em gel. O gel de agarose, previamente carregado com os produtos da reaco da PCR, colocado na cuba com a soluo tampo. Uma corrente elctrica aplicada e o DNA migrar do terminal negativo (fio preto) at ao terminal positivo. A Figura 7 ilustra o resultado final de uma electroforese com gel de agarose com as respectivas bandas. O gel produzido recorrendo-se ao uso de tampo TBE ou TAE, cuja percentagem do sistema gel-tampo depende do respectivo comprimento dos fragmentos de DNA. A matriz do gel composta geralmente por cerca de 1 a 2% de agarose, dependendo do tamanho dos produtos da PCR (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008).

Figura 6 - Aparelho de electroforese em gel.

(Extrado de http://pt.wikibooks.org/wiki/Ficheiro:Gel_electrophoresis_apparatus.JPG, acedido a 26.11.2009).

Figura 7 - Visualizao do produto da PCR em gel de agarose

(Adaptado de http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, acedido a 26.11.2009).

 Poliacrilamida

A poliacrilamida corresponde mistura de dois polmeros, a acrilamida (C3H5NO) e a bis-acrilamida (N,N- Metileno-bis-acrilamida), na proporo de 19:1 respectivamente. Diferentes relaes entre as concentraes destas molculas vo permitir a criao de diferentes gradientes de separao. A preparao de um gel de poliacrilamida envolve a mistura da acrilamida e a bis-acrilamida em concentraes adequadas, num suporte de vidro, e a posterior adio de TEMED (N,N,N,N-Tetrametiletilenodiamino) e persulfato de amnio, que actuam como catalisadores da polimerizao. A mistura, dissolvida no tampo de corrida desejado, colocada rapidamente numa cuba de montagem semelhante utilizada para agarose com o objectivo de polimerizar. Os poos so formados com recurso a um pente (Fig. 8). Aps a polimerizao, coloca-se o gel na cuba, cobre-se com o tampo, carrega-se com as amostras e com o marcador e aplica-se a corrente elctrica (Pelt-Verkuil et al., 2008).

Figura 8 Gel de poliacrilamida

(Adaptado de http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/jpg/electrophoresis6.gif, acedido a 21.04.2010).

A tabela 2 sumaria as principais diferenas entre os gis de agarose e de poliacrilamida. Tabela 2 - Distino entre gis de agarose e de poliacrilamida. Agarose
Forma poros de maiores dimenses Gis Horizontais Separar protenas ou molculas de DNA de maiores dimenses Molculas de maior massa molecular No desnaturante Corar o DNA com brometo de etdio

Poliacrilamida
Forma poros de menores dimenses Gis Verticais e Horizontais Separar molculas de DNA de pequenas dimenses (at 500 pb) Molculas de menor massa molecular Pode ser ou no desnaturante Corar o DNA com brometo de etdio ou com nitrato de prata

1.4. Aplicaes da PCR

A PCR pode ter diversas aplicaes, tais como (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008): 1. DNA fingerprint: tcnica forense, na qual pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime so amplificadas para serem analisadas. 2. Testes de parentesco: podem ser determinadas relaes genticas atravs da comparao de dois ou mais DNA fingerprints. 3. Mutaes pontuais: frequentemente geradoras de polimorfismos genticos, podem ser detectadas por aco das enzimas de restrio ou atravs da sequenciao. 4. Doenas infecciosas por agentes patognicos diversos: a amplificao do DNA do agente possibilita um diagnstico precoce mesmo antes da ocorrncia de infeces. 5. Diagnstico pr-natal ou pr-implantacional herdadas). 6. Diagnstico e prognstico de doenas genticas: o estudo dos genes relacionados com essas doenas permite quer o diagnstico, quer a evoluo das mesmas. 7. Anlise de DNA antigo: diversas investigaes amplificaram com sucesso material gentico de insectos extintos h mais de 20 milhes de anos fossilizados em mbar. 8. Clonagem de genes baseado no isolamento de um gene de um organismo e a sua insero noutro organismo (Fig. 9). A PCR (passo 2) utilizada para obter mltiplas cpias (passo 3) a partir de um nico gene contido no DNA do organismo A (passo 1). O gene ento inserido num plasmdeo (passo 4 e 5) e posteriormente o plasmdeo inserido no organismo B (passo 6). Este organismo devido sua expresso gnica gerar mltiplas cpias do gene inicial (passo 7). (particularmente para doenas

Figura 9 Clonagem de um gene recorrendo a um plasmdeo

(Adaptado de Sarmento et al., 2006, acedido a 21.04.2010).

1.5. Variantes da PCR

A versatilidade da tcnica da PCR convencional permitiu o desenvolvimento de numerosas variantes. A tabela 3 procura apresentar e caracterizar sumariamente algumas variantes da tcnica de PCR convencional. Tabela 3 - Variantes da tcnica de PCR convencional. Sigla
MPCR

Designao inglesa
PCR multiplex

Designao portuguesa
PCR mltiplo

Caracterizao sumria
Utiliza mais do que um par de primers na mesma reaco Destinada a reduzir a contaminao dos produtos da reaco Visualizao da amplificao medida que a reaco ocorre Amplificar o DNA obtido por meio da transcrio reversa de RNA Baseia-se na intensidade do produto final amplificado, tentando verificar at que ponto determinado produto aumenta ou diminui em relao a um gene de referncia Baseia-se na anlise do polimorfismo dos fragmentos de DNA amplificado aleatoriamente Recorre a sequncias oligonucleotdicas iniciadoras complementares de sequncias de DNA repetitivas Usada para estudar a diversidade da comunidade microbiana e dinmica

Exemplos
Polimorfismos biallicos autossomais (Turchi et al., 2004) Anlise gentica de impresses digitais (Lagoa et al.,
2008)

N-PCR

PCR nested

qPCR/R TQ-PCR RT-PCR

PCR in real time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Semi-qantitative PCR

PCR em tempo real PCR por Transcriptase Reversa PCR semiquantitativo

Quantificao de DNA em amostras VF forenses (Schulz et

al., 2006)

Deteco de diferentes espcies de RNA do vrus respiratrio (Valassina et al.,

1997)

PCRSQ

Identificao do PRKAA1 no cromossoma 5, que um potencial responsvel do gene do cancro do colo do tero
(Huang et al., 2006)

RAPDPCR

REPPCR

Random Amplified Polymorphic DNA Repetitive Extragenic Palindromic

Identificao do genoma do actinomiceto em regies conservadas (Mehling et al., 1995) Caracterizao molecular de isolados de Salmonella
(Albufera et al., 2009)

Sequncias Palindrmicas Extragnicas Repetitivas

ERICPCR

Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus

BOXPCR

BOX-PCR

Consenso de sequncias enterobacteria nas intergnicas e repetitivas -

Identificao do destino da E.coli quando ocorre o abate de porcos (Namvar e Warriner

,2006)

Utiliza somente um oligonucletido iniciador, devido orientao invertida das repeties no genoma

Investigar o parentesto gentico do Bacillus anthracis entre 25 espcies de Bacillus

(Kima et al., 2002)

RACEPCR

Rapid amplification of cDNA end

AS-PCR

Allele specific PCR

PCR aleloespecfica PCR inverso

Facilita o isolamento de sequncias das extremidades 5 e 3 dos cDNAs, permitindo obter cDNAs completos Distino entre alelos que diferem num nico nucletido Clonagem de sequncias de DNA adjacentes a uma sequncia conhecida a partir de um molde circular Indica a presena ou no de uma modificao gentica Utiliza um nico primer para garantir que a amplificao linear O DNA genmico tratado com duas enzimas de restrio e os fragmentos ligados a adaptadores Se existirem dois amplicons com uma variao da sequncia de nucletideos nos stios de reconhecimento das enzimas de restrio, geram diferentes padres de fragmentos Utiliza parcialmente uma sequncia degenerada de um protocolo de PCR, com duas diferentes temperaturas de annealing Utiliza apenas um primer em vez de dois primers

Amplificao de cDNA e de DNA de Isochrisis Galbana pela sequenciao de enzimas lipolticas (Godet et al., 2007) Determinao quantitativa da relao entre mutaes de genes normais ras no sangue de pacientes com leucemia
(Horikoshi et al., 1994)

iPCR

Inverse PCR

Genotipagem do grupo sanguneo ABO (Kobayashi e

Akane, 2000)

PCR Screen LMPCR AFLPPCR

PCR screening

PCR de rastreio PCR mediada por ligao Anlise do polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrio

Identificao do tipo I do vrus do herpes humano (Yu et

al., 2009)

Ligation mediated PCR Amplified fragment-length polymorphismPCR

Deteco de aductos de DNA ao nvel da sequncia do DNA (Pfeifer et al., 1993) Identificao e tipagem de espcies de Candida (Lopes et
al., 2007)

RFLPPCR

Restriction Fragment Length Polymorfism PCR

Diferenciao de larvas califordeos (Diptera, Calliphoridae) em cadveres humanos (Schroeder et al., 2003)

DOPPCR

Degenerate oligonucleotide primedPolymerase Chain Reaction Anchored Polymerase Chain Reaction

Anchore d PCR

Estudo do cancro familiar da prstata recolhe algumas alteraes genticas nicas, quando comparamos com os tumores espordicos da prstata (Verhagen et al., 2000) Estudo de clulas T humanas receptoras de transcries
(Ferradini et al., 1993)

2. PCR em tempo real 2.1. Contextualizao histrica

O sucesso da amplificao de DNA pela tcnica da PCR convencional est dependente de diversos factores, como a presena de inibidores, a quantidade de DNA, o estado de degradao do DNA, entre outros. Assim, a necessidade de monitorizar em simultneo a quantidade e qualidade do DNA amplificado levou ao desenvolvimento de uma variante da tcnica da PCR convencional: a PCR em tempo real. A PCR em tempo real, tambm conhecida como PCR quantitativa ou PCR em tempo real quantitativa ou simplesmente qPCR ou RTQ-PCR, foi descrita pela primeira vez em 1993, por Higuchi e seus colaboradores. Montaram um sistema ao qual acoplaram uma cmara de vdeo, de modo a monitorizar a PCR durante todos os ciclos. Este mecanismo permitia-lhes detectar o aumento da fluorescncia durante a reaco, devido ligao do brometo de etdio s molculas de DNA de dupla cadeia recm-sintetizadas (Higuchi et al., 1993). O procedimento semelhante ao da tcnica da PCR convencional diferindo essencialmente numa caracterstica inovadora: a possibilidade de quantificao em tempo real do DNA amplificado, em cada ciclo de amplificao. Neste mtodo, as fases de amplificao, deteco e quantificao so totalmente automatizadas, ocorrendo em simultneo e em tempo real (Heid et al., 1996). O sucesso da tcnica rapidamente levou ao seu aperfeioamento. Para tal contriburam, por exemplo, o desenvolvimento de sondas de oligonucletidos de dupla-hlice e a descoberta de que a Taq polimerase possui actividade exonuclease 5-3. Na ltima dcada diversas plataformas de instrumentao foram criadas e comercializadas, no entanto, a maioria composta por um termociclador, com sistema ptico para a excitao e recolha da emisso da fluorescncia e um computador com software prprio para a aquisio de dados e anlise final da reaco (Mackay et al., 2007).

2.2. Princpios da tcnica

O procedimento da tcnica de PCR em tempo real segue o princpio geral da PCR convencional. Assim, apresenta as trs fases caractersticas da PCR: a fase de crescimento exponencial, fase de crescimento linear e fase estacionria. A primeira fase bastante

especfica e precisa. Na fase de crescimento linear os produtos da reaco so consumidos e iniciam o processo de degradao. A fase estacionria corresponde ao final da anlise devido ao elevado nvel de degradao dos produtos da PCR. Os compostos fluorescentes adicionados ao DNA geram um sinal de fluorescncia que directamente proporcional quantidade de produto amplificado ao longo das diferentes fases e que podem ser representados graficamente como demonstrado na Figura 10.

Fluorescncia

Limiar da fase exponencial

Nmero de ciclos

Figura 10 Representao grfica das fases da PCR em tempo real.

(Adaptado de Kubista et al., 2006).

A fase de crescimento exponencial considerada a melhor para se estudar a reaco devido elevada eficincia registada, uma vez que a relao entre a quantidade de produto e do input de DNA mais consistente. Por este motivo os dados de fluorescncia so geralmente recolhidos desde o incio do processo de amplificao. A interpretao dos resultados obtidos pelos equipamentos obriga a que se definam conceitos especficos, como baseline, ponto CT e threshold. A baseline corresponde ao limiar mnimo de deteco de fluorescncia do instrumento sendo considerado rudo de fundo do equipamento. O ponto CT, denominado na literatura como cycle threshold, corresponde ao nmero de ciclos necessrios para que a fluorescncia da reaco seja detectvel. Trata-se de um ponto a partir do qual a fluorescncia detectada ultrapassa o limiar da fase exponencial, conhecido tambm na literatura como threshold, definido automtica e arbitrariamente pelo software do equipamento em funo da baseline. O valor mnimo de CT dependente da quantidade de molculas presente no

incio do processo de amplificao, o que significa que um menor nmero de molculas inicialmente representa um maior nmero de ciclos requeridos para gerar um aumento exponencial do sinal da fluorescncia que seja significativamente superior baseline (Heid et al., 1996; Kubista et al., 2006; Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). Na maioria dos protocolos da PCR em tempo real, o valor CT varia entre 17 ciclos (aproximadamente 10 milhes de molculas iniciais) e 37 ciclos (aproximadamente 1 molcula inicial) como demonstrado na Figura 11 (Pelt-Verkuil et al., 2008).

Fluorescncia

Figura 11 Representao grfica dos resultados da amplificao em tempo real em funo de diferentes teores de molculas de DNA iniciais (Adaptado de Pelt-Verkuil et al., 2008). A eficincia (E) da amplificao fundamental para o sucesso da tcnica. Esta deve variar idealmente entre os 90% e 100% (-3.6 > declive > -3.1), podendo ser determinada atravs de mtodos diversos. O mais simples baseia-se na equao: E = 10(-1/declive)-1. A eficincia da amplificao pode ser influenciada por diversos factores, incluindo o comprimento do amplico, existncia de estruturas secundrias na amostra, qualidade dos primers usados, procedimentos laboratoriais incorrectos, presena ou utilizao de inibidores da PCR (hemoglobina, ureia, heparina, glicognio, gorduras, ies clcio, etc.), presena ou utilizao de promotores da PCR (glicerol, DMSO, BSA, protena gene 32, Taq Extender, E.coli ss DNA binding), entre outros (Pelt-Verkuil et al., 2008).

2.3. Tecnologias e mtodos de deteco

A anlise in vitro dos produtos da amplificao por PCR em tempo real concretizada atravs da utilizao de compostos fluorescentes. Diversos protocolos tm sido desenvolvidos para permitir a deteco dos produtos da PCR, ao longo da amplificao. Todos os protocolos requerem o uso de um termociclador de PCR em tempo real especfico, bem como capilares de vidro onde se desenvolve a reaco em cadeia da polimerase. Estes equipamentos incluem ainda um sistema ptico, uma fonte de iluminao ultra-violeta e um detector de fluorescncia. O termociclador procede s oscilaes de temperatura necessrias para a concretizao dos trs ciclos da PCR. As variaes da temperatura so obtidas atravs da circulao de ar aquecido a partir de uma bomba de calor e controlada numa cmara tcnica. Esta reaco ocorre em capilares de vidro de borosilicato, que apresentam uma superfcie especfica elevada para que ocorra um equilbrio rpido entre a temperatura do ar e os componentes da reaco. Desta forma, um ciclo de amplificao pode ser concludo em menos de 30 segundos. As propriedades pticas do vidro de borosilicato esto optimizadas para a quantificao da fluorescncia. A unidade ptica do aparelho constituda por trs canais de deteco que medem a luz emitida em comprimentos de onda diferentes. Os resultados da fluorescncia medida podem ser monitorizados a cada instante no computador que se encontra ligado ao sistema (Silva et al., 2007).

Os mtodos qumicos de fluorescncia utilizados na PCR em tempo real so hoje em dia diversificados, recorrendo todos eles a um composto fluorescente cujo sinal passvel de ser detectado por um laser do termociclador ao longo do processo. De acordo com a literatura, estes mtodos podem ser agrupados em dois grandes grupos de acordo com o tipo do composto fluorescente e respectivo comportamento durante o processo. Sero considerados os seguintes grupos de compostos: corantes intercalantes e sondas de sequncia especfica (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008).

Corantes intercalantes Os corantes intercalantes so fluorocromos sem especificidade para uma sequncia particular de DNA, que se intercalam na dupla cadeia de qualquer produto da PCR permitindo a sua deteco. Contudo o correcto design dos primers confere elevada especificidade da deteco e quantificao a estes mtodos. Neste domnio, a primeira tecnologia desenvolvida foi patenteada pela Molecular Probes, Inc, em 1990, sendo denominada de SYBR Green. Recentemente foram desenvolvidas novas molculas: a LCGreen Plus (Idaho Technology) e a EvaGreen (Biotium Inc). SYBR Green

A tecnologia SYBR Green baseia-se num conjunto de molculas com a capacidade de se ligar de forma covalente dupla cadeia de DNA e quando excitadas emitem uma fluorescncia verde que medida e convertida numa quantidade de DNA (Fig. 12(A)). Esta tecnologia beneficia do facto das molculas SYBR Green no interferirem com a actividade da maioria das nucleases e das DNA polimerases e de aquelas apresentarem elevada afinidade com a dupla cadeia de DNA, o que bastante til na deteco de amostras de DNA com um baixo nmero de cpias (Mackay et al., 2007). No incio do processo a fluorescncia reduzida, visto que as molculas SYBR Green livres no esto ligadas ao DNA de dupla cadeia e como tal, o sinal produzido mnimo. Ao longo do processo, aps a deteco dos primers, quantidades crescentes dos fluorocromos ligam-se dupla cadeia de DNA pr-sintetizada pela enzima Taq DNA polimerase. No fim da fase de extenso de cada ciclo, a fluorescncia monitorizada e quantificada e, consequentemente o DNA amplificado determinado (Fig. 12(B)) (Correia, 2007; Mackay et al., 2007). A literatura refere que o correcto desenho dos primers torna-se determinante na especificidade do DNA a amplificar. Contudo, alguns estudos demonstraram que a SYBR Green liga-se preferencialmente a produtos da PCR cuja temperatura de melting seja superior, indicando a sua potencial preferncia por regies ricas em guanina e citosina. Desta forma, a especificidade dos resultados deve ser validada atravs de uma anlise da temperatura de melting (Correia, 2007; Mackay et al., 2007).

Como acontece com qualquer ligao da molcula de DNA, o SYBR Green pode causar mutaes e trata-se de um possvel agente cancergeno, no entanto mais seguro e mais fcil de eliminar comparativamente ao brometo de etdio (Mackay et al., 2007).
A B
Luz emitida

Polimerase

Figura 12 (A) - Representao da molcula SYBR Green (azul) intercalada na dupla cadeia de DNA (verde); (B) - Mtodo de funcionamento da molcula
(Extrado de (A) - http://www.fleury.com.br/Medicos/SaudeEmDia/ManualHematologia/pages/PCRQuantitativoemTempoRealTimePCR.aspx, acedido a 26.11.2009; (B) - http://homepages.strath.ac.uk/~dfs97113/BB310/lect403.html, acedido a 14.12.2009).

A tecnologia SYBR Green apresenta como principais vantagens a grande sensibilidade, o reduzido custo e a facilidade de manuseamento. Em contrapartida, apresenta como principal desvantagem a possibilidade de ligao a todo o DNA em cadeia dupla, durante a reaco de polimerizao, incluindo os dmeros de iniciadores e outros produtos no especficos, o que se pode traduzir numa subestimao da concentrao do fragmento alvo. Alm disso, a deteco com SYBR Green exige uma optimizao extensiva, uma vez que no especfico para uma determinada sequncia de DNA. Desta forma, torna-se imperativo o acompanhamento dos ensaios de forma a validar os resultados (Mackay et al. 2007; Oliveira 2009).

LCGreen Plus

O corante LCGreen Plus exibe uma elevada sensibilidade para produtos da PCR com temperaturas de melting reduzidas e destina-se preferencialmente para anlises HRM (tema tratado posteriormente) (Wittwer et al., 2003; Herrmann et al., 2007). A adio do corante LCGreen Plus, promove um aumento da temperatura de fuso do DNA, cerca de 1-3C. Este corante beneficia da capacidade de deteco de heteroduplexes (Fig.13) formados durante a PCR. Por tal, este corante est optimizado para deteco de variantes da sequncia de DNA (SNPs, inseres/deleces) (Wittwer et al., 2003; Herrmann et al., 2007).

Figura 13 - Curvas de Tm para cada um dos corantes (LCGreen Plus e SYBR Green)
(Adaptado de http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00009/BTN_A_00011265_O_ILF_9537a.jpg, acedido a 23.03.2010).

O corante LCGreen Plus diferencia-se do corante SYBR Green, pela capacidade de saturar a molcula toda e de ser contnuo, possibilitando a distino e discriminao entre diferentes curvas de melting (Fig. 14). A anlise das curvas de melting geradas com corante SYBR Green limitada quando esto presentes mltiplos duplexes na soluo. Produtos com temperaturas de melting superiores so preferencialmente detectados e os heteroduplexes no so observados a concentraes do corante compatveis com a PCR (Wittwer et al., 2003; Herrmann et al., 2007).

Figura 14 - Curvas de melting dos corantes SYBR Green e LCGreen Plus (Adaptado de
http://www.genengnews.com/media/images/articles/block_4352.jpg, acedido a 23.03.2010).

EvaGreen

O corante EvaGreen foi desenvolvido recentemente sendo utilizada quer pela Applied Biosystems, quer pela BioRad, visto lhe ser reconhecido numerosas vantagens. Entre elas, destacam-se a intensidade da fluorescncia resultante da ligao do EvaGreen ao DNA que vrias vezes superior ao de SYBR Green (Fig.15), a menor inibio para o processo de PCR e a extrema robustez e estabilidade, tanto termicamente como hidroliticamente, sob condies alcalinas ou cidas. Alm disso, a absoro e emisso de EvaGreen semelhante ao SYBR Green, o que significa que a mesma configurao ptica para SYBR Green tambm se pode usar para EvaGreen (Ihrig et al., 2006).

Fluorescncia relativa

Nmero de ciclos

Figura 15 - Cintica dos corantes SYBR Green e EvaGreen (Adaptado de

http://www.gencompare.com/qpcr.htm, acedido a 13.04.2010).

Sondas de sequncia especfica

As sondas, lineares ou em ala, so oligonucletidos que requerem um fluorocromo que adicionado a uma sonda com especificidade para uma dada sequncia de DNA e que detectam exclusivamente a dada sequncia em todos os produtos da PCR. Estas tecnologias permitem que o resultado possa ser monitorizado em tempo real, atravs do computador da plataforma de instrumentao.

A transferncia de energia de um marcador fluorescente para um segundo, conceito denominado na literatura inglesa como Fluorescence resonance energy transfer (FRET), uma propriedade que depende da interaco molecular entre dois fluorocromos (molcula reprter e molcula quencher) e determinada pela distncia fsica entre as duas

molculas. A emisso de energia do reprter (molcula dadora) absorvida pelo do quencher (molcula receptora) levando ou extino da fluorescncia ou ao autoquenching. Este efeito de quenching mtuo (entre as duas molculas) determinado pela sua sobreposio espectral (comprimento de onda a que ambas emitem ou absorvem radiao) e pela distncia fsica entre ambas (Fig. 16). A distncia crtica entre os dois fluorocromos pode variar desde poucas unidades de Angstroms (o equivalente dimenso de um nico nucletido) at ao comprimento de diversos nucletidos que determina a quantidade obtida de quenching. Uma vez excedida esta distncia crtica, a fluorescncia da molcula reprter deixar de ser absorvida (Watrob et al., 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008).
Dador
Excitao Excitao
Emisso

Receptor

Emisso

Figura 16 Representao esquemtica da sobreposio espectral do quencher (molcula receptora) e reprter (molcula dadora) (Adaptado de Pelt Verkuil et al., 2008). O princpio FRET usado em sistemas de deteco que recorrem a molecular beacons, a partir dos quais oligonucletidos so desenhados especificamente para exibir estrutura terciria tipo hairpin-loop, isto , uma forma particular de ala cujas extremidades esto ligadas uma outra entre si e a parte mediana tem aspecto de uma presilha (Fig.17) (Watrob et al., 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008).
Nucletidos especficos do produto da PCR

Reprter

Quencher

Figura 17 Representao de um oligonucletido com estrutura terciria tipo hairpin-loop utilizado como molecular beacons (Adaptado de http://www.bio.davidson.edu/Couses/genomics/method/beacon1.gif,
acedido a 10.02.2010).

As molculas reprter e quencher esto posicionadas em ambas as extremidades do oligonucletido permitindo assim, que os fluorocromos estejam bastante prximos um do outro. Os molecular beacons no hibridizados retm a estrutura hairpin-loop, o que demonstra que nenhum sinal fluorescente emitido pela molcula reprter absorvido devido forte proximidade da molcula quencher. Os molecular beacons hibridizados at uma dada regio complementar do DNA alvo adoptam uma estrutura linear, em vez da estrutura hairpin-loop, com a consequncia de que ambas as molculas fluorescentes permanecero espacialmente afastadas. Este facto provocar uma significativa reduo da actividade de absoro da molcula quencher, e consequentemente a fluorescncia escapar e ser registada (Watrob et al., 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008). Na prtica, esta tecnologia tem sido utilizada para quantificar e caracterizar DNA alvo amplificado, bem como, monitorizao de polimorfismos genticos em organismos (exemplo: SNPs ou polimorfismos de nucletidos nicos) (Pelt-Verkuil et al., 2008). Existem vrios tipos de molecular beacons, nomeadamente, os primers Scorpion e Sunrise ou tecnologias derivadas daquelas, como as sondas TaqMan. Sondas primers Scorpion e Sunrise Os primers Scorpion no requerem a extenso da cadeia complementar, bloqueando a sua extenso para assegurar que a estrutura em ala da sonda apenas quebrada durante a hibridizao especfica. Num primeiro passo, o primer Scorpion extendido no DNA alvo, seguindo-se a sua desnaturao e respectiva dissociao. Posteriormente durante a reaco da PCR, a sonda Scorpion, na presena da sequncia alvo, provoca a separao do fluorforo e do quencher, com o respectivo aumento da fluorescncia emitida. J os primers Sunrise requerem a duplicao da cadeia oposta para que a estrutura hairpin possa ser desfeita. Este fenmeno separa os marcadores eliminando o quenching de uma maneira similar s sondas hairpin (Fig. 18) (Pelt-Verkuil et al., 2008).

Primer Sunrise Primer Scorpion

Figura 18 Representao esquemtica da estrutura e modo de funcionamento das oligosondas primer Sunrise e Scorpion (Adaptado de Pelt-Verkuil et al., 2008). Sondas TaqMan A tecnologia TaqMan uma variao dos molecular beacons, desenvolvida por Perkin Elmer e descrita por Holland e colaboradores, em 1991, que lanou a base das oligosondas fluorognicas. Esta destina-se deteco de sequncias especficas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR (Holland et al., 1991; Pelt-Verkuil et al., 2008). A deteco e monitorizao da actividade exonucleotdica 53 da Taq DNA polimerase fundamental nesta tecnologia, sendo utilizados para tal, dois primers especficos de uma determinada sequncia de DNA e uma sonda Taqman homloga regio do fragmento de DNA entre os primers (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). A sonda apresenta na extremidade 3 uma molcula que aceita a energia da molcula reprter e a dissipa na forma de luz ou calor, designada na literatura como quencher e na extremidade 5 um fluorocromo reprter (Heid et al., 1996; Pelt-Verkuil et al., 2008). A proximidade fsica da molcula reprter e do quencher no princpio da anlise suprime a deteco da fluorescncia daquele pela transferncia de energia Frster (PeltVerkuil et al., 2008; Oliveira, 2009). Na fase de hibridao do PCR, as sondas vo-se ligar sequncia alvo com a qual apresentam uma total complementaridade (Fig. 19). Posteriormente, as sondas TaqMan hibridizam e so detectadas pela enzima Taq DNA polimerase que a hidrolisa pela sua actividade exonucleotdica 5-3 (Fig. 20). Este processo conduz separao do quencher da molcula reprter, durante a extenso

resultando num aumento exponencial da intensidade de fluorescncia at um ponto onde pode ser detectado, ultrapassando o limiar CT (Novais e Pires-Alves 2004; Ferro 2005; Pelt-Verkuil et al., 2008). possvel ento estabelecer uma relao inversa entre o nmero de molculas de DNA iniciais na reaco e o valor de CT, que a base para os clculos na PCR em tempo real. (Alonso et al., 2003).

Figura 19 - Hibridao das sondas TaqMan. R: molcula reprter (emite fluorescncia), Q: Quencher (absorve fluorescncia da sonda intacta) (Adaptado de
http://www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico_2009/13_PCR_tempo_real.pdf, acedido a 26.11.2009).

Figura 20 Hidrlise das sondas TaqMan. R: molcula reprter (emite fluorescncia), Q: Quencher (absorve fluorescncia da sonda intacta) (Adaptado de
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Pierce/realtimepcr.htm, acedido a 10.02.2010).

O recurso sonda TaqMan provou ser um mtodo muito especfico para determinar a presena ou ausncia de sequncias especficas. Trata-se de uma tecnologia bastante rpida, com elevada sensibilidade e preciso e menor risco de contaminao. Alm do mais, uma tcnica que pode ter viabilidade de automatizao, no necessita de processamento da amostra psPCR e permite que diversos tipos de anlises sejam realizados simultaneamente. Contudo um mtodo relativamente dispendioso, pelo facto de exigir duas molculas (reprter e quencher) ligadas s extremidades da sonda, e complexo em termos de planeamento pois requer uma amplificao e uma hidrlise eficientes (Novais e Pires-Alves 2004; Mackay et al., 2007; Oliveira, 2009).

Sondas de hibridizao FRET (mtodo non-quenching)

Outra aplicao do princpio FRET no tem por base a absoro da fluorescncia da molcula reprter, mas sim o aumento da fluorescncia da molcula reprter. Corresponde no essencial a um par de oligonucletidos (sondas) que esto marcados com um composto fluorescente. Nesta metodologia uma molcula dadora transfere energia para uma molcula receptora, que por seu turno emite fluorescncia com intensidade crescente. Para tal, uma das sondas marcada com fluorforo na extremidade 3, e a outra sonda marcada com outro fluorforo na extremidade 5. As sequncias das duas sondas so escolhidas por forma a que estas hibridizem em locais adjacentes do DNA alvo. Aps hibridizarem, os dois fluorforos esto posicionados na proximidade um do outro. Quando o fluorforo excitado emite fluorescncia e por sua vez excitar o fluorforo da outra sonda que emitir tambm fluorescncia. A sonda receptora s ir absorver a fluorescncia emitida pela primeira, quando as duas sondas se encontrarem ligadas a uma curta distncia na cadeia de DNA (Fig. 21) (Ferro 2005; Carvalho 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). O recurso a sondas de hibridizao apresenta diversas vantagens, nomeadamente, elevada especificidade do mtodo (a fluorescncia o resultado directo da hibridizao de duas sondas independentes), a no dependncia da aco da actividade exonucleotdica da polimerase, pode-se acompanhar a temperatura de melting das sondas e a facilidade do desenho, sntese e optimizao (Carvalho, 2007). As sondas de hibridizao FRET tm sido utilizadas com sucesso em protocolos da PCR em tempo real destinados a determinar a presena ou ausncia de focos de mutao nos produtos da PCR (Pelt-Verkuil et al., 2008).

Figura 21 Representao do mtodo de aco da sonda FRET (Adaptado de

http://www.medunigraz.at/zmf/mb/image_fret.html, acedido a 10.02.2010).

A tabela 4 apresenta um sumrio das caractersticas mais distintivas entre as sondas de sequncia especfica e dos corantes intercalantes. Tabela 4 Caractersticas distintivas entre as sondas de sequncia especfica e os corantes intercalantes. Sondas de sequncia especfica Elevada sensibilidade e especificidade Possibilidade de sesenho de novas sondas sempre que necessrio Complementares a uma determinada zona do fragmento amplificado e so marcadas com um fluorforo Especifico para o fragmento que se deseja detectar Exemplos: TaqMan (sonda de hidrlise); Primers Scorpion (sondas de hibridao). Corantes intercalantes Baixa especificidade Maior simplicidade Intercalam-se na dupla cadeia de DNA em formao Inespecfico para o fragmento que se pretende detectar Exemplos: SYBR Green, LCGreen Plus e EvaGreen

2.4. Anlise dos resultados obtidos

A anlise das curvas de melting uma abordagem clssica largamente utilizada para proceder anlise dos resultados obtidos na PCR em tempo real. Estas curvas representam a temperatura em funo da fluorescncia e dependem do tamanho e composio em bases do produto amplificado. Frequentemente obtm-se atravs de aumentos sucessivos da temperatura nos poos da reaco at se perder a fluorescncia devido desnaturao do DNA. Quando se atinge a temperatura de melting da sequncia alvo observa-se uma quebra abrupta da fluorescncia; caso se observem diminuies adicionais da fluorescncia tal pode representar contaminao ou insuficiente especificidade dos parmetros do PCR. A temperatura de melting de cada produto de amplificao depende do seu contedo em guanina e citosina (G+C), comprimento e caractersticas da sequncia, permitindo distinguir diferentes produtos da PCR. Este mtodo tem sido utilizado para avaliar a extenso de potenciais ligaes no especficas do corante a qualquer produto de dupla cadeia, incluindo dmeros de primers (artefacto originado pela interaco de dois primers durante a fase de extenso do PCR, com subsequente formao de um produto da PCR pela extenso a partir da extremidade 3 de um ou de ambos os primers) e produtos de amplificao no especficos (Espy et al., 2006; Mackay et al., 2007). As principais vantagens das curvas de melting esto relacionadas com a possibilidade da confirmao da(s) sequncia(s) do(s) produto(s) da PCR, com a sua alta especificidade (cada produto tem a sua prpria temperatura de melting), com o reduzido risco de contaminao (o capilar utilizado fechado), com o facto de diferenciar produtos da PCR especficos dos inespecficos e com a possibilidade de caracterizar polimorfismos de insero/deleco, genotipar SNPs e detectar mutaes (Espy et al., 2006; Carvalho, 2007; Mackay et al., 2007).

Anlise HRM
A anlise HRM (High Resolution Melting) um mtodo ps-PCR bastante recente, homogneo, rpido, simples e que se realiza em sistema fechado, que foi desenvolvido tendo por base as enormes potencialidades da anlise clssica das curvas de melting. uma

tcnica que consiste na caracterizao de amostras de DNA de acordo com seus comportamentos de dissociao durante a transio de DNA dupla cadeia para DNA de cadeia simples com o aumento da temperatura, recorrendo a corantes fluorescentes intercalantes que se ligam ao DNA de dupla cadeia, sendo o fenmeno monitorizado atravs da PCR em tempo real. Estes corantes apresentam baixa toxicidade para a reaco, podendo portanto ser usados em concentraes elevadas a fim de saturar toda a dupla cadeia de DNA das amostras. Isso significa, que os sinais de fluorescncia medidos tm maior fidelidade (sensibilidade e resoluo), aparentemente devido menor proporo de redistribuio de corante das regies desnaturadas para aquelas ainda em dupla cadeia. Durante a PCR, quando ocorre a desnaturao do DNA a fluorescncia desaparece originando a curva de melting. As diferenas da composio de bases do DNA podem ser detectadas e comparadas atravs da curva e temperatura de melting (Tm). A anlise dos dados feita com um software especfico (Reed, et al., 2004; Krypuy, et al., 2006; Herrman et al., 2007; Tesoriero, 2008; Villela et al., 2010). Entretanto, para o sucesso de ensaios de HRM so exigidos certos requisitos, nomeadamente (Tesoriero, 2008): Utilizao de equipamentos com elevada intensidade e elevada sensibilidade ptica; Captura de dados com rapidez; Controlo rigoroso e muito preciso; Anlise de fragmentos de DNA at 250 pb. Produtos maiores podem ser analisados, porm com menor resoluo; Anlise exclusiva do(s) produto(s) da PCR, uma vez que amostras contaminadas (com produtos inespecficos, dmeros de primers, entre outros) podem tornar os resultados de HRM difceis de interpretar; Utilizao de amostra suficiente; Manuteno das concentraes das amostras similares ps-amplificao, uma vez que a concentrao dos fragmentos de DNA afecta a Tm dos mesmos; Uniformidade entre as amostras. Todas as reaces devem ter o mesmo volume e devem conter a mesma concentrao do corante;

Para cada sequncia existe uma dada curva padro e temperatura de melting especficas (Fig. 22). Tal facto, faz com que esta tcnica apresente uma vasta gama de aplicaes, nomeadamente deteco de mutaes, triagem de heterozigotias, genotipagem, caracterizao de blocos de hapltipos, anlise de metilao de DNA, mapeamento de DNA, prevalncias allicas numa populao e identificao de espcies (Herrman et al., 2007; Tesoriero, 2008; Villela et al., 2010).

Fluorescncia (%)

Temperatura (C)

Figura 22 Curva HRM. O grfico demonstra um decrscimo na fluorescncia quando ocorre a passagem da estrutura em cadeia dupla para a cadeia simples. Vermelho = homozigtico com guanina; verde = homozigtico com adenina; azul = heterozigtico
(Adaptado de http:// www.appliedbiosystems.com, acedido a 12.12.2010).

2.5. Quantificao dos resultados da qPCR

Aps a deteco e amplificao do DNA necessrio quantific-lo. A tcnica da PCR em tempo real permite que a quantificao do DNA possa ser realizada de forma absoluta ou relativa. Assim, recorre-se frequentemente a dois mtodos para quantificar os resultados da PCR em tempo real: o mtodo da curva padro e mtodo da comparao do limiar da fase exponencial (Ma et al., 2006; Pelt-Verkuil et al., 2008). Na quantificao absoluta determina-se o nmero exacto de molculas (nmero de cpias de DNA ou nanogramas de DNA). Regra geral, trata-se de um mtodo de determinao da concentrao inicial de uma dada amostra de concentrao desconhecida a partir de uma curva padro, obtida aps diversas anlises precisas e consistentes em amostras de concentrao conhecida. Para tal, o valor de CT (de uma dada amostra de concentrao desconhecida) projectado num grfico CT em funo do logaritmo da concentrao de DNA, onde est representada a curva padro, e a partir da qual se extrapola a concentrao de DNA da amostra em questo (Fig. 23). Existem outros mtodos para a quantificao absoluta, como por exemplo mtodos que recorrem a derivadas secundrias (Ma et al., 2006; Pelt-Verkuil et al., 2008).

Figura 23 Representao grfica da curva padro determinada aps sucessivas anlises de amostras com concentrao conhecida de DNA (a-e) (Adaptado Butler, 2005). O mtodo mais utilizado para quantificao relativa o da comparao do limiar da fase exponencial (threshold), sem recurso a curvas padro. Este mtodo consiste na comparao dos valores CT das amostras com um controle. Os valores de CT de ambos (amostra e controle) so normalizados a um gene endgeno apropriado. O mtodo comparativo CT tambm conhecido como o mtodo 2CT, onde CT=CTamostra CTreferncia. Nesta equao CTamostra o valor de CT para qualquer amostra normalizada (ao gene apropriado) e CTreferncia o valor de CT para o controlo normalizado (ao gene apropriado). Para que o clculo de CT seja vlido, a eficincia da amplificao da

amostra alvo e da referncia endgena deve ser aproximadamente igual. Tal pode ser estabelecido visualizando a variao do CT de acordo com a diluio do modelo (Livak e Schmittgen, 2001; Ma et al., 2006; Pelt-Verkuil et al., 2008). A quantificao relativa aplicvel na quantificao da expresso gnica (quando esta medida em valores mltiplos de expresso) e tem sido utilizada na monitorizao da actividade do sistema imunitrio aps transplantao de rgos (Sabek et al., 2002).

2.6. Tempo dispendido numa anlise qPCR

Regra geral, a preparao da amostra o passo que requer mais tempo no protocolo, dependendo da experincia em questo. A sntese do DNA requer duas horas, bem como a anlise da PCR em tempo real; a anlise da curva de melting demora aproximadamente 30 minutos. O tempo total dispendido nestes trs passos totaliza aproximadamente quatro horas e meia (Ma et al., 2006).

3. PCR convencional vs PCR em tempo real 3.1. Vantagens e Limitaes da tcnica de PCR convencional
O segredo do sucesso da tcnica de PCR convencional reside na capacidade que esta tem em amplificar uma sequncia precisa de DNA aliada sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade, especificidade e versatilidade. Desta forma, no necessrio isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que este se encontre misturado com o DNA de outras espcies), uma vez que a especificidade da PCR dada pelos primers. Esta uma tcnica rpida, barata, segura e no requer muito espao em laboratrio. Em termos de equipamento requer simplesmente um termociclador (Delidow et al., 1993; Miguel, 2007). Todavia, a tcnica de PCR convencional tambm apresenta algumas limitaes, tais como, a necessidade de conhecer antecipadamente a sequncia de DNA a amplificar, para que possam ser sintetizados primers especficos. Outras desvantagens prendem-se com o facto da grande facilidade com que ocorre a contaminao da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma tcnica muito sensvel) e a extenso limitada da sequncia que possvel amplificar ( difcil aplicar a PCR a sequncias maiores do que 5000 pb). Pode tambm ocorrer incorporao errada de bases durante a replicao. Outros factores

importantes e que podem influenciar a tcnica de PCR dizem respeito pureza, qualidade e quantidade do DNA alvo, pureza dos nucletidos e a concentrao da soluo de dNTP`s, visto que concentraes desiguais de dNTP`s podem provocar uma reduo na fidelidade da DNA polimerase (Miguel, 2007).

3.2. Vantagens e Limitaes da tcnica de PCR em tempo real

A tcnica de PCR em tempo real apresenta como principais vantagens: simplicidade, especificidade, elevada sensibilidade no que se refere utilizao de uma sonda ou de um corante apropriado, rapidez, reduo do risco de contaminao psamplificao, elevado potencial de produo, introduo contnua de novos qumicos, deteco de quantidades relativamente pequenas de DNA alvo (3 picogramas de material, o que cerca de 1000 vezes menos material gentico), facilidade de quantificao, utilizao de uma instrumentao de maior fiabilidade e uma melhoria nos protocolos tem

feito com que a tecnologia de PCR em tempo real seja a tecnologia de referncia para a deteco de DNA. Na verdade, esta tecnologia baseada na reaco de hibridizao FRET permite a eliminao de alguns passos intermdios, favorecendo a automatizao e a capacidade da anlise em simultneo de um grande nmero de amostras. Esta tcnica inclui um menor risco de contaminao, pois os sistemas so fechados e no exigem manipulao do contedo de reaco aps a concluso da PCR. Uma vantagem adicional o acompanhamento do restante produto no tubo de reaco, encurtando assim consideravelmente o tempo de ensaio. Finalmente, os resultados obtidos podem ser rpida e facilmente confirmados atravs da anlise das curvas de melting (Watzinger et al., 2006; Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). Em contrapartida apresenta algumas desvantagens, nomeadamente, o facto de no ser ideal para multiplex, a sua utilizao requer uma elevada competncia profissional e assistncia tcnica muito especializada e finalmente uma tecnologia com um custo inicial muito elevado devido ao preo do equipamento, o que impede que muitos laboratrios estejam equipados com esta tecnologia. Felizmente, o preo destes instrumentos est a ser reduzido em virtude da evoluo tecnolgica das lmpadas dos equipamentos que esto a incorporar LEDs em detrimento do laser, halogneo ou tungstnio. Nesta tcnica recorre-se frequentemente a corantes interligantes, que tm a desvantagem de se ligar a qualquer outro produto da dupla cadeia, incluindo dmeros de primers e outros produtos de amplificao no especficos, originando assim emisso de fluorescncia que pode no corresponder ao DNA alvo (Alonso, 2008). Outra desvantagem deve-se

incompatibilidade da tcnica com alguns qumicos que emitem fluorescncia (Watzinger et al., 2004).

4. Equipamentos da PCR em tempo real

Os equipamentos de PCR em tempo real podem detectar e analisar simultaneamente mais do que um sinal de fluorescncia, permitindo assim a identificao de diferentes sequncias de gene alvo numa nica reaco. Na actualidade, o mercado dispem de uma grande diversidade de plataformas instrumentais.

4.1. Principais plataformas

O modelo ABI 7500 Fast da Applied Biosystems (ABI), comparativamente ao ABI 7300 e ao ABI 7500, mais rpido na execuo da PCR em tempo real (30 minutos), recorre a uma menor quantidade de reagente e possui um software mais verstil e com mais funcionalidades, aumentando o nmero de aplicaes aos quais se destina. O modelo ABI 7500 para identificao humana muito til em casos de testes de paternidade. No entanto s til para anlises de identificao humana, no compensando adquirir este tipo de equipamento para executar anlises com outras finalidades. O modelo 7900 Fast HT, relativamente aos anteriores, dispe de um maior nmero de poos, maximizando o nmero de anlises que se podem executar em simultneo; o software muito abrangente, funcional e prtico (apresenta tecnologia touchscreen). A maior desvantagem prende-se com a dimenso e consequente peso, podendo tornar-se limitativo em laboratrios com espao reduzido. O modelo ABI StepOnePlus til no caso de se dispor de sondas e primers que so optimizados em diferentes temperaturas de aquecimento/arrefecimento; recorre a tecnologia tctil o que o torna bastante prtico

(http://www.appliedbiosystems.com). O modelo LightCycler 480 da Roche Applied Science, quando comparado com o ABI 7900 Fast HT da ABI bastante superior no que diz respeito ao espectro de excitao, pois o primeiro mais abrangente (430-630 nm) face ao segundo equipamento que corre apenas nos 488 nm. Esta plataforma possui software com elevada flexibilidade, reagentes optimizados para cada anlise, menores dimenses e bastante til em investigao cientfica (principalmente Gentica) e investigao clnica em hospitais como, por exemplo, deteco de doenas genticas ou avaliao de teraputicas. Este equipamento dotado de um software que permite realizar anlise HRM, para a identificao de mutaes

genticas desconhecidas, quantificao gentica, genotipagem e a quantificao absoluta. Sendo assim, devido a todas estas capacidades, conclui-se que este equipamento um dos mais completos e sofisticados que existem no mercado, respondendo com eficcia a um largo espectro de investigaes. Relativamente ao LightCycler 1.5 e ao LightCycler 2.0 tratam-se de modelos mais simples do que o descrito anteriormente, dado possurem menos quantidade de poos e de o seu software ser menos abrangente. O modelo LightCycler 1536 muito idntico ao LightCycler 480, contudo possui um maior nmero de poos (1536) e est optimizado para situaes em que se dispe de um volume reduzido de amostra. elevada de O equipamento optimizao visto desde do que a Cobas TaqMan apresenta elevada com a fiabilidade, rapidez e automatizao total proporcionando uma trabalho todos os laboratorial, passos at da PCR consequente rentabilizao do tempo dispendido pelos tcnicos laboratrio, esto dos automatizados, preparao obteno

resultados (www.roche-applied-science.com). Os modelos da Stratagene (MX4000, MX3000P e MX3005P) apresentam uma soluo inovadora ao incorporar no prprio equipamento um computador

(http://www.stratagene.com). O modelo SmartCycler da Cepheid bastante til em casos de trabalho de campo (exemplo: anlise in situ de amostras de sangue/saliva relativos a um suspeito), pois este pequeno e porttil. Este possui ainda a capacidade de fazer a anlise das amostras de forma independente. No entanto, o facto de possuir poucos poos, limita o nmero de anlises que se podem executar em simultneo e por tal no to til em situaes de numerosas amostras (http://www.cepheid.com). O modelo Rotor-gene-6000 da Corbet apresenta as caractersticas bsicas comuns aos equipamentos das marcas concorrentes e possui como maior desvantagem o software que complexo e pouco intuitivo (http://www.corbettresearch.com). O modelo Rotor Gene Q da Qiagen apresenta um desempenho trmico e ptico excepcionais devido ao formato rotativo do rotor. O equipamento est dotado de tecnologia passvel de garantir a estabilidade e igualdade da temperatura em todos os tubos, bem apresenta um espectro de luz alargado, desde os UV at aos infravermelhos. Possui manuteno reduzida e mxima convenincia devido ao design robusto do equipamento.

Contudo o recurso a um rotor apontado como sendo tambm uma desvantagem, visto no ser to prtico para trabalhar (http://www.qiagen.com). O modelo Mastercycler ep realplex da Eppendorf possui como principal trunfo a capacidade de deteco at uma molcula de DNA, o que o torna numa ferramenta altamente eficiente e poderosa, comparativamente com os outros modelos j analisados. (http://www.eppendorf.com). Relativamente aos modelos da BioRad, importa salientar o CFX96 que possui a particularidade de estar optimizado para a deteco de mutaes, para a utilizao do corante EvaGreen e para a anlise HRM, e finalmente apresenta ainda um preo competitivo (http://www.bio-rad.com). Caracterizao tcnica e informaes complementares so fornecidas nos Anexos deste documento.

4.2. Discusso crtica dos equipamentos

A grande capacidade de anlise (em termos do nmero de amostras) dos principais modelos da ABI, BioRad, Stratagene e alguns da Roche (como por exemplo o LightCycler 1536) pode ser bastante til em laboratrios com elevadas exigncias relativamente ao nmero de amostras a processar em simultneo. Contudo, a termociclagem nestes instrumentos mais lenta face aos outros equipamentos com menor capacidade, como o caso do LightCycler 1.0 e LightCycler 2.0, ambos da Roche e do SmartCycler II da Cepheid. Tal facto deve-se ao uso de material na fase slida para o aquecimento do bloco principal destes equipamentos. Os instrumentos com grande capacidade esto optimizados para o processamento de um grande volume de testes, enquanto que os instrumentos mais rpidos e com menor capacidade promovem uma maior flexibilidade do fluxo de trabalho. Assim, o volume de trabalho e seu processamento podem ser um critrio fundamental na seleco do sistema (Espy et al., 2006). A plataforma Cobas TaqMan da Roche bastante especfica para o diagnstico clnico, integrando na sua estrutura um software especfico que permite que o resultado obtido seja impresso imediatamente aps anlise, o que uma mais-valia em termos de rapidez e eficincia. Alm do mais um equipamento muito sensvel, estando optimizado por exemplo para a deteco do vrus da hepatite B ou C mesmo em quantidade nfimas. O

CFX96 da BioRad uma ptima escolha especialmente, se os principais testes estiverem direccionados para a deteco de mutaes. Trata-se de um equipamento cuja anlise muito rpida (aproximadamente 40 minutos) e que apresenta a possibilidade de se recorrer ao EvaGreen como corante e de se poder realizar adicionalmente a anlise HRM para, por exemplo, comparar os produtos da PCR. O Rotor-Gene da Corbett utiliza tubos de plstico standard (e por tal mais baratos), bem como ar para a transferncia de calor gerando uma velocidade de 72 rotaes por minuto. Este instrumento apresenta uma velocidade intermdia porque necessita de mais tempo para o aquecimento da resistncia at ao centro dos tubos. Os modelos SmartCycler da Cepheid e LightCycler da Roche usam por sua vez estruturas especializadas para a rpida transferncia de calor e pode completar a PCR em 30 a 40 minutos. Alguns minutos adicionais so requeridos aos modelos LightCycler para executar a anlise da curva de melting. Todos os instrumentos suportam a maioria ou mesmo todos os compostos fluorescentes usados no mbito das sondas TaqMan e molecular beacons. Presentemente, apenas os modelos LightCycler suportam sondas de hibridizao baseadas no princpio FRET. A quantificao do material gentico alvo possvel realizar em todos instrumentos (Espy et al., 2006). Importa ainda realar que as plataformas da BioRad no requerem consumveis exclusivos desta empresa e o software dos seus equipamentos livre podendo ser descarregado em qualquer computador (http://www.bio-rad.com/). A aquisio destes equipamentos deve portanto responder a diversas consideraes, como por exemplo, os requisitos de espao fsico, custo do equipamento e reagentes, manuteno/assistncia tcnica, fiabilidade, possibilidade de actualizaes, volume de testes, tipos de sondas de deteco preferenciais, requisitos da preparao das amostras, tempo mdio consumido em cada anlise e software utilizado. Com o objectivo de responder optimizao do processo (no que respeita preparao das amostras e tempo mdio de anlise) algumas das empresas desenvolveram instrumentos semi-automatizados para a extraco de cido nucleico para uso em cadeia com os equipamentos da PCR em tempo real. Destacam-se os modelos MagNa Pure LC e MagNA Pure Compact para utilizar com as plataformas LightCycler, o modelo GeneExpert para utilizar com o SmartCycler II, e o modelo ABI Prism 6700 para utilizar nos equipamentos da srie Prism da ABI (Espy et al., 2006).

O custo mdio de cada equipamento e a exigncia de profissionais altamente especializados e treinados para desenvolver e validar os testes da PCR em tempo real so porventura os principais motivos para que esta tecnologia ainda esteja confinada essencialmente a laboratrios de referncia (Espy et al., 2006). O progresso nas reas da investigao cientfica, clnica e forense a que se tem assistido no passado recente em Portugal, faz com que cada vez mais laboratrios estejam a apostar na introduo de novos e modernos equipamentos, como por exemplo as plataformas instrumentais para a PCR em tempo real. As instituies de investigao cientfica portuguesas (hospitais, universidades, instituto de Medicina Legal, empresas, entre outras) esto equipadas principalmente com plataformas das marcas BioRad, Applied Biosystems e Roche Applied Science. Tal facto dever-se- provavelmente ao prestgio internacional destas empresas no seu segmento, qualidade dos seus equipamentos e representao comercial em Portugal.

5. Aplicaes da PCR em tempo real

O desenvolvimento da tcnica da PCR em tempo real abriu novas perspectivas para diversas reas de aplicaes, tais como, sade, forense e agricultura. Neste captulo procurar-se- apresentar e discutir algumas investigaes cientficas publicadas recentemente aplicadas s reas da sade, da investigao forense e da agricultura, recorrendo tcnica da PCR em tempo real.

5.1. Aplicaes na rea da sade

Entre muitas aplicaes pode-se salientar as seguintes: Determinao pr-natal do sexo de clulas Com interesse crescente, esta aplicao determinante em situaes de fertilizao in vitro em seres humanos portadores de genes especficos.

- Diagnstico gentico pr-implantacional (PGD) De acordo com Martinhago et al. (2010) fundamental serem implementados planos de preveno de doenas genticas em casais portadores destas. O diagnstico gentico pr-implantacional tem sido largamente utilizado em casais com um histrico reprodutivo de sucesso e/ou em fase de reproduo assistida. Sabe-se que tanto os cromossomas X como os Y so responsveis por mais de 200 doenas hereditrias. Aps a fertilizao in vitro, a simples seleco do sexo dos embries antes da transferncia do tero pode prevenir a ocorrncia de doenas genticas quando os casais so portadores dos genes responsveis pelas mesmas. O objectivo deste estudo foi desenvolver um mtodo rpido de diagnstico gentico pr-implantacional (PGD) utilizando a tcnica da PCR em tempo real e a determinao do sexo de embries humanos, e compar-la tcnica de fluorescncia de hibridizao in situ. Depois de terem sido realizadas biopsias foram recolhidos 98 blastmeros a partir de 40 embries, que foram posteriormente analisados por PCR em tempo real e pela

tcnica de hibridizao in situ. Neste estudo desenvolveu-se um mtodo rpido e seguro para o diagnstico sexual de uma nica clula humana (blastmeros e clulas bucais), utilizando a tecnologia de PCR em tempo real.

- Diagnstico precoce do sexo fetal no plasma materno De acordo com Alberry et al. (2009) a tcnica de PCR em tempo real determinante na deteco do sexo fetal no plasma materno. Neste estudo foram recolhidas amostras de sangue materno a partir de 138 gestaes, que foram divididas em 3 grupos: gestaes normais (77), pr-eclmpsia (tenso arterial elevada acompanhada pela eliminao de protenas pela urina ou de reteno de lquidos que ocorre entre a 20. semana de gravidez e o final da primeira semana depois do parto) (49) e restrio do crescimento fetal (12). Foram avaliados os nveis normais de DNA fetal livre no plasma materno e posteriormente comparados com os nveis em gestaes complicadas com disfuno placentria manifestado por pr-eclmpsia e/ou restrio do crescimento fetal. O gene DYS14 (especfico do cromossoma Y) foi quantificado e comparado no plasma materno usando a tcnica de PCR em tempo real. Verificou-se que o DNA fetal livre em gestaes normais aumentou com a idade gestacional. Os resultados obtidos foram significativamente maiores no grupo preclmpsia e no grupo restrio de crescimento fetal comparativamente aos de uma gravidez normal. Concluiu-se que o DNA fetal livre um potencial marcador de disfuno da placenta durante a gravidez. Continuam ainda a ser necessrios mais estudos prospectivos para investigar o seu papel na previso de complicaes da gravidez e da sua gravidade.

Danos no DNA Os danos no DNA podem comprometer a integridade das clulas. A aco de determinadas toxinas, hidrocarbonetos e agentes mutagnicos, bem como de radiao UV e gama, esto entre os principais responsveis pelo aparecimento de danos na estrutura do DNA. De acordo com Campan et al. (2009) a tcnica de PCR em tempo real pode ser utilizada com sucesso para detectar e quantificar a sensibilidade de metilao no DNA genmico. A metilao do DNA (Fig. 24) uma modificao qumica da estrutura do nucletido, que desempenha um papel importante na determinao de como o DNA lido

e interpretado por uma clula. Ou seja, o processo pelo qual os grupos metil (CH3) so adicionados ao carbono na posio 5 da citosina, de forma a impedir que o DNA seja destrudo por enzimas de restrio.

Figura 24 Mecanismo de metilao do DNA (Extrado de http://lgmb.fmrp.usp.br/dgfto/apostilas/APOSTILA-GENETICAECANCER.doc, acedido a 2.11.2010).

Desta forma a metilao de DNA o mecanismo que permite que genes especficos se manifestem dentro de clulas normais especializadas. O que as diferencia a manifestao de um ou de outro gene durante o desenvolvimento e em toda a sua vida para desactivar genes desnecessrios. Em clulas cancergenas, a metilao anormal do DNA responsvel por desactivar genes que normalmente evitariam divises celulares desadequadas e/ou desnecessrias. Atravs deste mecanismo, a clula perde a capacidade de preveno de danos, com a consequncia do potencial aparecimento de cncro. As alteraes de metilao do DNA em clulas tumorais incluem a perda da metilao em sequncias normalmente metiladas (hipometilao) e a adio de sequncias metiladas em locais geralmente no metilados (hipermetilao). Neste estudo verifica-se uma elevada sensibilidade e especificidade de metilao. Tal significa que este processo pode ser utilizado na deteco de biomarcadores de baixa frequncia de metilao do DNA, o que evidencia presena de doena. Ao mesmo tempo, a preciso quantitativa da tcnica de PCR em tempo real e a flexibilidade de design de bissulfitos dependentes, permitem uma avaliao quantitativa das reaces de metilao de baixa frequncia. Genotipagem

Processo que permite analisar uma parte ou a totalidade do genoma. A partir da genotipagem possvel saber se um dado ser vivo ter maior ou menor propenso para desenvolver (manifestar) uma determinada caracterstica de interesse. Martnez-Serra et al. (2009) utilizou a tcnica da PCR em tempo real para detectar a mutao V617F e as mutaes hereditrias dos factores pr-trombticos F5 e F2. Durante os ltimos anos foi descrito o aparecimento da mutao V617F adquirida do gene Janus Qinase 2 (JAK2) em pacientes com diferentes ocorrncias trombticas. Trata-se de uma mutao pontual, onde ocorre a substituio de uma guanina por uma timina no exo 14 do gene JAK2, levando substituio de uma valina por fenilalanina na posio 617 da protena codificada (JAK2 V617F). O estudo foi realizado com o equipamento LightCycler 2.0 e consistiu primeiramente na amplificao simultnea por PCR em tempo real dos trs genes a serem genotipados, num tubo de 20 l fechado, usando um par de primers juntamente com as sondas de hibridizao FRET correspondente para cada gene. Foram analisadas 41 amostras, das quais 19 foram positivas (46,34%) para a mutao V617F. Das amostras positivas para a mutao V617F foi encontrada uma amostra heterozigtica para F2 (5,26%) e uma amostra heterozigtica para F5 (5,26%), da resulta que 10,52 % das amostras testadas combinam com a mutao V617F. Os resultados foram obtidos de forma rpida e fivel, o que permite uma poupana significativa de tempo. Concluiu-se que a tcnica de PCR em tempo real combinou com sucesso a genotipagem de F5 e F2 com a avaliao da carga de mutao JAK2 (V617F) representando uma nova conquista no campo do diagnstico molecular. Dosagem gnica Neste domnio podem ser relevantes o estudo de cpias extra do cromossoma, duplicaes de segmentos gnicos, descontrolo do sistema de regulao de expresso, entre outros. O aumento da dosagem genica pode ser provocado devido a trissomias, a amplificao genica, entre outros motivos; as monossomias ou as deleces gnicas so exemplos de alteraes que conduzem reduo do efeito de dosagem gnica. No estudo de Zaczek et al. (2010) a tcnica de PCR em tempo real foi utilizada para analisar o cancro de mama e do ovrio, onde foram encontradas algumas mutaes de um mesmo gene. Este estudo teve como objectivo desenvolver um mtodo de PCR em

tempo real para a deteco de aberraes da topoisomerase II alfa (TOP2A) e avaliar a sua utilidade no cancro de mama. O grupo de estudo foi composto por um conjunto de 83 pacientes com cancro de mama. Verificou-se que nos tumores estudados a dosagem mdia do gene TOP2A foi de 1,08; foram encontradas amplificaes do gene TOP2A em 12 tumores (1,45%). Neste estudo conclui-se que a tcnica de PCR em tempo real mostrou ser uma tcnica rpida e fcil de executar e que o mtodo de dosagem do gene TOP2A mostrou ser um forte factor de prognstico no cancro da mama. Expresso de genes Medir a expresso gnica fundamental em muitas reas de pesquisa biomdica contempornea, que vo desde a cincia bsica a aplicaes na indstria e na medicina; na maioria dos estudos de expresso gnica, os investigadores esto interessados em determinar os nveis de expresso relativa do gene testado face a amostras controlo. De acordo com Lu et al. (2010) a maioria dos sistemas da PCR empregam as configuraes pr-determinadas e patenteadas que diferem de um sistema para outro. Ainda no se sabe se estas diferenas podem afectar os valores da expresso gnica. Neste estudo foram comparados dois equipamentos de PCR em tempo real, o ABI 7500 e o LC480, usando para essa comparao reagentes apropriados.Foram analisados quatro genes (IL-8, ID-1, COX2 e CXCR2) numa linha celular humana do cancro de mama e constatou-se que dois deles apesar de terem sido detectados pelo equipamento ABI 7500 no foram detectados pelo equipamento LC480. Depois de se ter alterado alguns dos parmetros e dos reagentes utilizados no equipamento LC480, foi possvel detectar a expresso destes dois genes, mas o nvel foi muito inferior ao que foi detectado pelo equipamento ABI 7500, em particular para o gene ID-1. Testaram-se ainda mais trs pares de primers do gene ID-1 sendo que dois desses pares de primers apresentaram valores de expresso maior no sistema LC480, mas ainda significativamente inferiores aos valores obtidos no equipamento ABI 7500. Estes resultados sugerem diferenas importantes nestes dois equipamentos de PCR em tempo real, o que pode resultar em diferenas significativas nos resultados apresentados.

 Oncologia clnica Utilizada na deteco e quantificao cromossomal de translocaes por PCR em tempo real em oncologia clnica. O estudo de ChangXin et al. (2010) teve como o objectivo o desenvolvimento de um ensaio especfico e fivel para a deteco das clulas tumorais (CTC) no sangue perifrico (PB) de pacientes com cancro da mama. Neste estudo foram avaliados pela tcnica de PCR em tempo real 94 pacientes com cancro de mama, 35 pacientes com tumor de mama benigno, 40 indivduos saudveis e 25 pacientes com outros tumores slidos, para a deteco de survinin, hTERT e hMAM mRNA no PB de pacientes com cancro de mama. Os resultados obtidos mostraram que a sensibilidade da survinin, hTERT e hMAM mRNA no PB de pacientes com cancro de mama foi de 36,2%, 59,6% e 33%, respectivamente. Foram detectados survinin e hTERT no PB dos pacientes com tumores slidos (que no cancro de mama), contudo hMAM e mRNA foram detectados apenas em pacientes com cancro da mama. A sensibilidade dos trs marcadores juntos no teste em paralelo foi de 70,2% e a especificidade combinada dos trs marcadores foi de 100%. Concluiu-se que survivin, hTERT e ensaios hMAM mRNA so mtodos valiosos para a deteco de CTC de pacientes com cancro de mama. Com a combinao dos trs marcadores para a deteco de CTC do cancro de mama, o teste em paralelo aumenta a sensibilidade da anlise. Trata-se de uma ferramenta simples, no invasiva e complementar na deteco precoce de clulas tumorais micro-metastticas em pacientes com cancro de mama. Assim, o uso da tcnica de PCR em tempo real poder ser uma opo com potencial aplicabilidade clnica na deteco precoce do cancro da mama, complementando outros mtodos j existentes na monitorizao da doena. Quantificao de protenas De acordo com Hou et al. (2007) a ligao especifica de protenas ao DNA um passo fundamental para muitas actividades celulares, tais como, a regulao da transcrio, replicao do DNA, recombinao, restauro e restrio. A deteco de protenas de ligao

ao DNA, bem como a identificao de stios especficos de ligao, fundamental para a compreenso dos mecanismos e das funes celulares da expresso do gene. Neste estudo combinou-se a exonuclease III (ExoIII) com a PCR em tempo real para a quantificao de protenas e a respectiva ligao ao DNA, para um ensaio que no necessita de anticorpos contra as protenas-alvo. Foram projectadas para monitorizar as actividades de protenas DNA ligantes, sondas da dupla cadeia de DNA. Quando uma protena alvo estiver presente, ele liga-se especificamente s protenas desse local e produz um obstculo fsico para a ExoIII, que vai proteger o DNA de reverter a digesto por ExoIII. O restante DNA do modelo nico pode ser detectado quantitativamente pela tcnica de PCR em tempo real. Por outro lado, na ausncia da protena-alvo as regies desprovidas de primer sero degradadas pela ExoIII, no podendo ser amplificadas pela PCR em tempo real. Neste estudo foi detectada a vinculao de 10 factores de transcrio diferentes em extractos brutos de clulas. Conclui-se que a tcnica de PCR em tempo real fcil de aplicar e que tem potencialidades na quantificao de protenas. Quantificao viral Exemplos desta aplicao dizem respeito deteco da hepatite B, hepatite C, herpes, HIV, vrus influenza A (H1N1), entre outros.

- Preparao de controlos positivos para vrus raros ou emergentes De acordo com Whiley et al. (2010) foi desenvolvido um mtodo simples para preparar controlos positivos de reaces da PCR em tempo real para vrus raros ou emergentes. Esse mtodo universal recorre a dois oligonucleotdeos sintticos e um controlo de cido nucleico viral irrelevante como um modelo de iniciao. Neste estudo, foram preparados controlos para a gripe A (H1N1) e ensaios metapneumovrus humanos (MPVH) RT-PCR. O vrus parainfluenza tipo 2 do RNA e o DNA do vrus herpes equina foram utilizados como modelos de iniciao. A caracterstica sigmoidal das curvas de amplificao da tcnica de PCR em tempo real foi analisada na influenza A (H1N1) e ensaios MPVH RT-PCR. Foram observados CT comparveis em ambos os testes quando se usou a mesma concentrao do modelo de iniciador.

Concluiu-se que este mtodo fornece uma medida provisria na preparao dos controlos positivos da reaco de PCR em tempo real, pelo que estes ensaios podem ser rapidamente introduzidos na procura de vrus raros ou emergentes, na ausncia de material de controlo do tipo selvagem. O sistema verstil e pode ser facilmente adaptado a praticamente qualquer modelo viral.

- Deteco do vrus da imunodeficincia humana tipo 1 (HIV-1) De acordo com Pau et al. (2010) a tcnica de PCR em tempo real foi desenvolvida para detectar o DNA do HIV-1 proviral no sangue total. Foram analisadas amostras de sangue de 22 HIV-1 seropositivos e de 20 seronegativos. A amplificao do gene humano RNase P serviu como controlo interno para monitorizar a eficincia da extraco do DNA e da PCR. A eficincia de amplificao do HIV-1 foi de 100%. A elevada eficincia de amplificao e os ciclos curtos da PCR foram, em parte devido curta sequncia amplificada, eliminando a sequncia da sonda de ligao entre os primers. Sendo assim, este ensaio pode ser til como um teste alternativo de confirmao numa variedade de locais de testagem de HIV.

O estudo de Kondo et al. (2009) descreve um novo mtodo para quantificar o HIV1 do grupo M do DNA proviral por PCR em tempo real usando a sonda TaqMan. Para solucionar a diferena de eficincia entre os diferentes subtipos de amplificao foram utilizados primers degenerados e uma sonda MGB. O presente ensaio previu uma boa linearidade e preciso no intervalo das 4 mil a 5 mil cpias de DNA proviral em 0,5 mg de DNA celular. O intra-ensaio e os coeficientes inter-ensaio foram <31,6% e <30,1%, respectivamente. Em 19 ensaios clnicos HIV-1 de seis subtipos (A, B, C, CRF01_AE, F e G), os valores de quantificao pela PCR em tempo real, auxiliado pela anlise da distribuio de Poisson dos resultados da PCR na diluio final (R2 = 0,988). Este ensaio caracterizado pelo uso de primers degenerados que tenham sido validados por comparao com um teste baseado na distribuio de Poisson. O ensaio de PCR em tempo real altamente sensvel, linear, reprodutvel, exacto e independente dos subtipos do grupo M. O ensaio ser muito til para o estudo de relaes entre o HIV-1 e as cargas provirais e para a determinao da eficcia a longo prazo da terapia anti-retroviral

para o subtipo B, assim como espcies do subtipo no-B. Sendo assim, a carga proviral considerada relevante na monitorizao do nmero de clulas sanguneas perifricas infectadas e na avaliao da propenso a patologias associadas ao HIV-1.

- Diagnstico de citomegalovrus (CMV) Sun et al. (2010) aplicou a tcnica da PCR em tempo real com a finalidade de diagnosticar o citomegalovrus (CMV). Neste estudo foram submetidos 117 pacientes monitorizao de vigilncia do CMV. A terapia com valganciclovir foi efectuada aps a deteco da virose. A carga viral foi considerada elevada. No estudo foi observada virose por CMV em 54% (63/117) dos pacientes, incluindo 77% do R/D+, 63% dos R+/D+, 43% dos R+/D, e 10% dos pacientes R-/D-. Globalmente, 23% (15/63) dos pacientes apresentavam virose recorrentemente. Aos 12 meses ps-transplante, a doena CMV ocorreu em 0,85% (1/ 117) dos pacientes (R +/D+ receptor). Nenhum paciente (0/30) do R/D+ teve a doena por CMV. Os pacientes com virose por CMV tratados preventivamente no diferiram significativamente daqueles que nunca desenvolveram virose por CMV, no que diz respeito a infeces bacterianas ou fngicas, rejeio, taxa de mortalidade e probabilidade de sobrevivncia aos 12 meses (> 0,05 para todas as variveis). Os resultados acima tambm no diferiram para os pacientes com alta (> 1,9 logs) versus carga viral baixa (<1,9 logs) (> 0,05 para todos os resultados). Concluiu-se que a tcnica da PCR em tempo real funcionou adequadamente no diagnstico da carga viral de CMV em diferentes grupos.

- Adenovrus aves (FADV) De acordo com Romanova et al. (2009) a tcnica da PCR em tempo real foi utilizada na deteco e quantificao do adenovrus das aves (FADV) em tecidos de galinha, usando FADV-9 como um modelo. O ensaio teve um intervalo dinmico de 7 logs e um limite de deteco mnimo de 9,4 cpias do genoma viral. Demonstrou ser altamente especfico no produzindo qualquer sinal positivo para outros genomas virais testados (vrus da doena de Mareks, vrus da varola aviria e o vrus da laringotraquete infecciosa). A sensibilidade da tcnica de PCR

em tempo real foi comparvel com a nested PCR e demonstrou ser 100 vezes mais sensvel que a PCR convencional. O ensaio foi validado atravs de testes de DNA de tecidos de galinhas infectadas com FADV-9 em diferentes dias ps-infeco. FADV-9 DNA foi detectado no fgado, bolsa de Fabricius e tecidos da tonsila cecal num intervalo de 102 a 107 cpias por 100 ng de DNA total. Grandes quantidades de DNA viral estavam presentes nas tonsilas cecais aps uma semana de inoculao, tornando este tecido uma fonte ideal de amostra para o diagnstico da infeco FADV. Este ensaio revelou ser uma ferramenta de diagnstico de carga viral com elevada sensibilidade, especificidade e rapidez. Microbiologia Esta aplicao diz respeito implementao da tcnica para a

identificao/determinao de bactrias, resistncia a antibiticos, entre outros.

- Deteco de microrganismos em feridas De acordo com Melendez et al. (2010) as feridas crnicas podem causar morbilidade e incapacidade substanciais. A infeco em feridas crnicas clinicamente definida por mtodos de rotina de cultura que pode demorar vrios dias para obter um resultado final, e no pode descrever completamente a comunidade de organismos ou biomassa dentro dessas feridas. As abordagens moleculares de diagnstico correspondem a uma promessa para uma avaliao mais rpida e completa. Neste estudo foi desenvolvido um conjunto de procedimentos tendo por base a PCR em tempo real para a identificao rpida de bactrias de amostras de tecido. O painel de ensaios de 14 metas comuns, clinicamente relevantes, com agentes patognicos aerbios demonstrou um elevado grau de sensibilidade e especificidade, utilizando um painel de organismos associados em comum com infeco crnica. Foram avaliadas 39 amostras de 29 feridas crnicas e os resultados foram comparados com os obtidos por cultura. Conforme revelado pela cultura e PCR, os organismos mais frequentes foram Staphylococcus aureus resistentes meticilina (MRSA), seguido por Streptococcus agalactiae (estreptococos do grupo B) e Pseudomonas aeruginosa. A sensibilidade dos testes de PCR foi de 100% e 90% quando os resultados da cultura quantitativa e qualitativa

foram utilizados como padro de referncia, respectivamente. Os ensaios permitiram a identificao do DNA bacteriano a partir de mais de 10 organismos que no foram revelados pelas culturas quantitativas ou qualitativas. Sob condies ideais, o tempo de resposta para os resultados da PCR no ultrapassa as 4 a 6 horas. A tcnica de PCR em tempo real revelou ser um mtodo rpido e barato que pode ser facilmente introduzido na prtica clnica para a deteco de organismos a partir de amostras de tecido. Assim justifica-se a caracterizao da microbiota anaerbica pela tcnica de PCR em tempo real de feridas crnicas.

- Deteco directa da bactria Helicobacter pullorum-like em alimentos De acordo com Gonzlez et al. (2008) a tcnica de PCR em tempo real foi desenvolvido para a deteco directa da bactria Helicobacter pullorum-like em alimentos, que ocasionalmente associada com a doena entrica humana. Algumas experincias demostraram que a tcnica de PCR em tempo real foi especfica e reprodutvel, com um nvel de deteco de 1 unidade formadora de colnia (UFC)/g. Foi ento aplicado o ensaio para determinar as taxas de contaminao em 30 amostras de trs tipos de produtos de carne de frango obtidos em cinco pontos de venda em Espanha (Valncia), na qual todas as amostras foram inicialmente consideradas como cultura negativa para Helicobacter mesmo aps um perodo de enriquecimento. Foi detectado DNA H.pullorum semelhante em sete das dez carcaas de frango e hambrguer de frango numa amostra (sem enriquecimento), bem como numa amostra de fgado (depois de enriquecimento). A sequenciao por PCR dos trs produtos seleccionados aleatoriamente confirma concordncia (99% de semelhana) com o gene rDNA 16S H. pullorum. As vantagens da PCR em tempo real sobre os testes de PCR convencional apresentam um nvel de deteco melhorado, velocidade de teste e validao da especificidade pela anlise do ponto de fuso. O facto de que as bactrias esto presentes com frequncia em carcaas de frango expostas em lojas de retalho destaca a importncia da monitorizao das taxas de contaminao. O ensaio descrito neste trabalho permite uma melhor avaliao do risco potencial humano causado por H. pullorum.

 Transplantes A tcnica da PCR em tempo real tem vindo a ser utilizada crescentemente nos casos da rejeio de transplantes, devido ao facto de se tratar de um mtodo no-invasivo. De acordo com Aquino-Dias et al. (2008) a funo tardia do enxerto (DGF) ocorre com frequncia em transplantes de rim de doadores falecidos. Utilizando a tcnica de PCR em tempo real, examinou-se a expresso de molculas citolticas como perforina, granzima B e FAS-ligante, juntamente com o inibidor de protease serpin-9. Foi medida tambm a expresso de FOXP3, um gene caracterstico de clulas T-reguladoras conhecido por estar envolvido na RA (rejeio aguda). Estes estudos foram conduzidos em moncitos do sangue perifrico, clulas urinrias e 48 bipsias de vigilncia do rim, num total de 35 pacientes com DGF. Destes pacientes, 20 tiveram diagnstico histopatolgico de RA, enquanto outros 28 tinham caractersticas de necrose tubular aguda (NTA). A expresso de genes citolticos e apoptticos associadas no tecido da bipsia, leuccitos do sangue perifrico e clulas urinrias foi significativamente maior nos pacientes com RA do que em pacientes com NTA. Parmetros diagnsticos associados com a expresso do gene FOXP3 foram mais precisos em leuccitos do sangue perifrico e em clulas de urina com sensibilidade, especificidade, e o valor preditivo negativo e a repetibilidade de avaliao entre 94 e 100%. Este estudo mostrou que a quantificao de genes seleccionados em leuccitos do sangue perifrico e em clulas urinrias de pacientes transplantados renais com a DGF podem fornecer um diagnstico preciso e til no-invasivo da RA.

5.2. Aplicaes na rea forense

A PCR em tempo real apresenta alguns benefcios na rea forense, devido importncia da quantificao de DNA humano e DNA mitocondrial, deteco de parmetros qualitativos (tais como, inibidores da PCR e nveis de degradao do DNA) e anlise de resultados de genotipagem. Entre as principais aplicaes apresentam-se as seguintes:

 Relaes de parentesco o recurso utilizado para identificao humana em casos forenses quando o material biolgico se encontra degradado ou no apresenta DNA nuclear (fragmentos de cabelo sem folculo, por exemplo). A tcnica consiste na sequenciao de determinadas regies do mtDNA (variveis de pessoa para outra) permitindo a identificao do indivduo. Algumas pessoas, entretanto, podem apresentar mais do que um nucletido numa determinada posio dessa sequncia, fenmeno esse conhecido como

heteroplasmia. No estudo de Zuccarelli et al. (2010) foi desenvolvido uma triagem rpida para detectar indivduos de ascendncia americana nativa materna ou paterna. A estratgia deste trabalho consistiu na tipagem de SNPs por PCR em tempo real, seguida de uma anlise HRM. Aps a extraco, o DNA foi quantificado por RT-PCR e as amostras foram depois submetidas a duas reaces multiplex para determinar o mtDNA dos americanos nativos e o cromossoma Y pelo HRM. Um conjunto de primers acompanha as substituies de nucletidos que definem o haplogrupo mitocondrial C e sub-haplogrupos A2, B2 e D1, enquanto os outros primers incluem Y-SNPs M3, M269 e U179 que permitem discriminar diferentes haplogrupos. Em todos os casos os amplicons apresentaram menos de 125 nucletidos de forma a aumentar a resoluo mxima. A preciso dos resultados obtidos foi estabelecida por meio do sequenciamento dos amplicons. O trabalho proposto facilita e acelera o processo de seleco que pode impedir uma anlise detalhada de sequenciao de amostras em particular, ou para mais investigaes epidemiolgicas moleculares em que as influncias de origem continental podem ser relevantes. Quantificao de DNA nuclear A quantificao de DNA nuclear uma importante aplicao da tcnica da PCR em tempo real. De acordo com Whittle e Sumita (2008) a quantificao de DNA forense um importante passo inicial que precede amplificao dos loci STR. Foi desenvolvida a

quadruplex em PCR em tempo real para quantificar quatro alvos de DNA: (1) o gene RB1 humano no DNA nuclear, (2) o gene DAZ presente no cromossoma Y humano, (3) o gene presente em ATPase8 do DNA mitocondrial humano e (4) um controlo interno artificial positivo para revelar a possvel inibio da PCR. Recorre-se ao uso de primers marcados com quatro diferentes fluorforos em conjunto com um nico quencher usando o antiprimer quenching, baseado na PCR em tempo real, na qual os amplicons resultantes tm um tamanho inferior a 127 pb. Este estudo concluiu que o protocolo da PCR em tempo real mostrou ser muito sensvel para menos de dez cpias para os quatro alvos, na ausncia de inibio da amplificao. A amplificao permaneceu sensvel na presena de um excesso de DNA no-humano. Quantidade e qualidade de DNA A quantidade e qualidade do DNA nas amostras forenses so dois factores limitantes na seleco da tcnica a usar. De acordo com Giardina et al. (2009) a amplificao do genoma total (WGA Whole Genome Amplification) pode eliminar as limitaes decorrentes da baixa quantidade de DNA. O objectivo deste trabalho consistiu na avaliao da aplicabilidade da amplificao de deslocamento mltipla para a genotipagem do SNP, realizando uma anlise comparativa das amostras de amplificao do DNA genmico. O MDA (multiple displacement amplification) um mtodo no-PCR baseado na tcnica de amplificao do DNA. Este mtodo amplifica rapidamente uma quantidade mnima de amostras de DNA para a anlise genmica. A reaco comea pelo aquecimento aleatrio de primers para a sntese do DNA, e realizada por uma enzima de alta fidelidade, preferencialmente a uma temperatura constante. Comparando com as tcnicas de amplificao de PCR convencional, o MDA gera produtos com menor frequncia de erro. Este mtodo tem sido actualmente usado na amplificao do genoma inteiro (WGA) e tornou-se um mtodo promissor no genoma da clula individual e a base da sequenciao de estudos genticos. Um painel de 26 SNPs TaqMan especificamente projectado para um reduzido nmero de cpias (LCN) e/ou o DNA genmico severamente degradado foi colocado em 100 amostras de DNA genmico, bem como ampliado. Foram efectuadas trs diluies (1; 0,1 e 0,01 ng) em cada uma das 100 amostras de DNA.

Os resultados de genotipagem de ambas as amostras de DNA genmico foram comparadas com os gentipos de referncia das mesmas amostras obtidas pela sequenciao directa. As amostras de DNA genmico apresentaram taxas de concordncia de 100% para as trs diluies, enquanto os ndices de concordncia das amostras de DNA foram de 100% para as diluies de 1 ng e 0,1 ng e 99,923% para a diluio de 0,01 ng. Alm disso, 10 amostras de DNA artificialmente degradadas que no deram resultados quando analisadas por mtodos actuais forenses, tambm foram amplificadas pelo MDA e genotipadas com 100% de concordncia. Concluiu-se que a anlise comparativa das amostras de DNA genmico mostraram que um grande nmero de SNPs pode ser introduzido exactamente a partir de apenas 0,01 ng de modelo. Descobriu-se que a exactido das chamadas taxas MDA foram apenas ligeiramente inferiores s do DNA genmico. Na verdade, quando 10 g de DNA foram utilizados em MDA, obteve-se 99,923% de concordncia, indicando assim uma taxa de erro de genotipagem de 1/1299 (7,7 10-4). Isto bastante similar taxa de erro de genotipagem de STRs utilizados na anlise forense actual. Tal eficincia e preciso de tipagem do SNP do DNA amplificado sugere que o MDA tambm pode gerar grandes quantidades equivalentes de DNA do genoma, a partir de uma quantidade mnima de DNA. Estes resultados mostram pela primeira vez que o material MDA adequado para SNPs baseados em protocolos forenses e, em geral, quando as amostras no do resultados STRs interpretveis.

- Anlise do mRNA post-mortem Segundo Partemi et al. (2010) a anlise do mRNA post-mortem apresenta actualmente um elevado interesse devido s suas potenciais aplicaes na rea forense, especialmente por causa de diversos factores que afectam a qualidade das amostras de RNA. A degradao do RNA post-mortem um processo complexo, que no foi ainda estudado de forma sistemtica. O objectivo deste trabalho foi determinar as potencialidades da anlise do RNA post-mortem do tecido cardaco como ferramenta forense para investigar a causa da morte, com especial ateno para as situaes de suspeita que a causa da morte esteja relacionada com acidentes cardio-vasculares.

Neste estudo foi analisado tecido cardaco de 16 indivduos com funo cardaca normal, de 9 indivduos com longos intervalos post-mortem (L-PMI) e de 7 doadores de orgos com PMIs muito curtos (S-PMI). O tecido do ventrculo direito foi homogeneizado e a transcriptase reversa do RNA foi isolada. O cDNA resultante foi utilizado em reaces de PCR em tempo real para a quantificao da expresso de genes de beta-glucuronidase (GUSB), xido ntrico sintase 3 (NOS3), colagnio 1 (COL1A1) e colagnio 3 (COL3A1). A percentagem de amostras de RNA de alta qualidade foi maior nas amostras com S-PMI (7 de 7) do que em amostras com L-PMI (4 de 9, p <0,05). A comparao dos nveis de mRNA em amostras de RNA no-degradadas, evidenciou semelhanas entre os grupos PMI-L e S-PMI para GUSB, COL1A1 e COL3A1. A expresso do gene NOS3 no subgrupo L-PMI foi inferior a metade do que no S-PMI. Estes resultados sugerem que o mRNA de alta qualidade pode ser extrado do post-mortem de coraes humanos, somente em alguns casos. Alm disso, os dados mostraram que os nveis de mRNA so independentes do PMI, embora haja mRNAs em que os nveis de expresso so muito susceptveis a tempos de isquemia. Em concluso, o estabelecimento de relaes entre a integridade do mRNA, a expresso e o PMI pode permitir a utilizao de vrios mRNAs como ferramentas forenses e contribuir para a determinao da causa da morte, com uma especial ateno para as doenas cardiovasculares. Amostras forenses A rea forense rica na diversidade de tipos de amostras, tais como sangue, osso, saliva, urina, fezes, entre outras. A tcnica de PCR em tempo real frequentemente utilizada para identificar amostras forenses devido s suas principais vantagens, nomeadamente, necessidade de pequenas quantidades de amostra e rapidez na obteno dos resultados.

- Identificao presuntiva de lquido corporal em medicina forense De acordo com Zubakov et al. (2008) os fluidos do corpo humano, como o sangue e a saliva representam a fonte mais comum de material biolgico encontrado na cena de um crime. A identificao de tecidos na cincia forense pode revelar dados importantes para a reconstruo da cena do crime e pode, assim, contribuir para a resoluo de crimes.

Limitaes existentes dos testes para a identificao presuntiva de lquido corporal em medicina forense, que so geralmente baseadas na anlise de quimioluminescncia ou protenas, so esperadas atravs de mtodos baseados em RNA, desde que estejam disponveis marcadores estveis de RNA, com padres de expresso tecido-especfica. De forma a gerar conjuntos de marcadores de RNA estveis para a identificao fivel de manchas de sangue e saliva foram realizadas: (1) anlises de expresso do genoma inteiro num determinado tempo estimado em amostras de sangue degradado e amostras de saliva; (2) consulta de bases de expresso de dados para obter informaes adicionais sobre a especificidade dos tecidos, e (3) confirmao dos padres de expresso dos genes mais promissores pela tcnica de PCR em tempo real, incluindo tecidos forenses adicionais pertinentes, tais como smen e secreo vaginal. No geral, foram identificados nove marcadores estveis de mRNA de sangue e cinco marcadores para a deteco de mRNA da saliva mostrando sinais de expresso tecido-especfica em manchas com idade no superior a 180 dias. Todos os marcadores tiveram a capacidade de diferenciar sangue/saliva de amostras de smen. No entanto, nenhum deles conseguiu diferenciar a secreo vaginal, devido natureza complexa da secreo vaginal e semelhana biolgica da mucosa oral e vaginal. Em concluso, este estudo mostrou que a utilizao destes 14 marcadores estveis de mRNA em anlises de PCR em tempo real uma excelente ferramenta para a identificao de manchas de sangue e saliva.

- Autenticidade de amostras forenses De acordo com Frumki et al. (2009) tcnicas tais como, PCR, clonagem molecular e, recentemente, a amplificao do genoma (WGA), permitem a produo in vitro de quantidades ilimitadas de DNA artificial, com o perfil gentico desejado. Este DNA artificial pode ser aplicado em superfcies de objectos ou incorporado em tecidos humanos verdadeiros e implementados em cenas de crime. Alm disso, a genotipagem de ambas as amostras (naturais e artificiais) com Profiler Plus deu origem a perfis completos sem anomalias. Foi desenvolvido um teste de autenticidade, que distingue o DNA natural do DNA artificial com base na anlise de metilao de um conjunto de loci genmicos. No DNA natural, alguns loci so metiladas e outros no metilados, enquanto que em DNA artificial todos os loci no esto metilados. Todas as amostras de DNA foram quantificadas

atravs do mtodo de PCR em tempo real. O ensaio foi testado em amostras naturais e artificiais de sangue, saliva e superfcies tocadas, com sucesso total. Adoptando um ensaio de autenticidade para o tratamento de as amostras de casos como parte do procedimento judicial, necessria para manter a alta credibilidade da evidncia do DNA no Sistema Judicial. Neste trabalho foi demonstrado que o actual processo judicial no faz a distino entre amostras de saliva, sangue e superfcies tocadas com o DNA artificial, e as amostras de DNA correspondentes com in vivo.

No estudo de George et al. (2010) foi avaliada a utilidade das prteses de acrlico, como fonte de DNA para anlise forense. Foram recolhidas 38 amostras (21 amostras de indivduos do sexo masculino e 17 amostras de indivduos do sexo feminino) e armazenadas em diferentes perodos de tempo. As clulas epiteliais respeitantes das prteses foram recuperadas e extraiu-se o DNA genmico. Todas as amostras deram origem a uma quantidade suficiente de DNA para anlise, independentemente do tempo de armazenamento. A determinao do sexo foi realizada por amplificao da regio determinante do sexo no cromossoma Y (SRY) usando a tcnica de PCR em tempo real, com 100% de preciso, no tempo mnimo. Nenhuma das amostras do sexo feminino mostrou amplificao para o gene SRY, e no houve nenhuma evidncia de quimerismo que poderia levar falsa identificao com o gnero. No entanto, as concluses do estudo so limitadas aos indivduos normais. A preciso e a especificidade do SRY na identificao de gnero devem ser confirmadas atravs do alargamento do estudo em vrias condies que podem alterar a expresso do gene SRY. Genotipagem do grupo ABO porventura um dos mais importantes tpicos na rea forense. No entanto a aplicabilidade forense do grupo sanguneo ABO limitada, uma vez que existem apenas quatro fentipos ABO possveis (A, B, AB e O), e cerca de 40% da populao mundial apresenta o tipo O. Assim, a genotipagem do grupo ABO til apenas para excluir um suspeito como fonte de origem de material biolgico encontrado numa cena de um crime, no caso de incompatibilidade entre as amostras; por outro lado, se houver compatibilidade, no se pode concluir que o suspeito a fonte de origem do material biolgico.

De acordo com Ruan et al. (2010) a rpida e informativa genotipagem do grupo ABO tornou-se cada vez mais popular no uso forense. O grupo sanguneo ABO reconhecido como um dos mais importantes marcadores em testes forenses. Foi desenvolvido um sistema multiplex de PCR em tempo real para o gentipo ABO nos grupos grandes e nos subgrupos. Sete diferentes fluorforos foram combinados em um ou dois PCRs para determinar grandes grupos ou subgrupos ABO. O mtodo detectou correctamente 13 amostras de DNA de referncia. A anlise pode ser concluda com sucesso em menos de 100 minutos, com custo relativamente baixo e com reduzida quantidade de DNA. Apesar da informao limitada de genotipagem do grupo ABO, os mtodos desenvolvidos podem ser adaptados e optimizados para outras aplicaes em contextos forenses.

5.3. Aplicaes na rea da agricultura/indstrias agro-alimentares

A tcnica da PCR em tempo real pode ser utilizada em diversas aplicaes, tais como, quantificao do nmero de cpias de transgnicos (soja, milho, arroz, entre outros), resistncia a fungicidas, contaminao de alimentos, identificao de organismos geneticamente modificados, entre outras. Neste mbito diversos estudos tm sido desenvolvidos, particularmente em plantas, abrindo novas oportunidades para a investigao sobre interaces parasita-hospedeiro, diagnsticos, entre muitas outras.

- Presena de OGMs nos alimentos Kaur et al. (2010) desenvolveu um trabalho que teve como objecto de estudo alimentos processados e algumas amostras de milho comercializadas na Malsia. Foi avaliada a implementao de um sistema de PCR em tempo real para a triagem singleplex de oito sequncias alvo (lectina hmg, adh1, P35S, MON810 NK603, GA21 e MON863) e a quantificao de quatro milhos geneticamente modificados (GM) (NK603, GA21, MON810 e MON863). O efeito da utilizao de partculas de vidro de propriedade magntica para ligar o DNA sua superfcie tambm foi investigado em termos de quantidade de DNA, pureza, integridade, qualidade e o seu efeito geral sobre a amplificao do DNA.

Esteve presente material geneticamente modificado em 26,2% de alimentos e em 65% de amostras de milho. Todas as amostras continham MON810 geneticamente modificado seguido por NK603 (47,5%), GA21 (25%) e MON863 (2,5%). Constatou-se que o presente estudo representa uma metodologia rpida e fivel capaz de avaliar eficazmente a presena de nveis de organismos geneticamente modificados nos alimentos processados e no milho.

O estudo de Zhu et al. (2010) baseou-se na tcnica da PCR em tempo real com o objectivo de detectar e quantificar o DNA transgnico da Bacillus thuringiensis (comercialmente denominado como Bt) em milho hbrido (DKC42-23), que foi derivado do MON863 e que tambm possui o gene nptII. Os resultados mostraram que, sob cultivo contnuo de DKC42-23, foi detectado DNA transgnico no campo durante todo o ano. A utilizao do DNA de extractos de parcelas do solo de DKC42-23 revelou que o gene nptII poderia ser assumido e integrado naturalmente em clulas de Pseudomonas stutzeri pMR7, levando restaurao da resistncia aos antibiticos de P. stutzeri pMR7. No entanto, aps o cultivo de uma linhagem de soja em parcelas iguais para a estao seguinte de crescimento, a presena de DNA do transgene DKC42-23 foi reduzida a nveis no detectveis no final desse perodo de crescimento. Desta forma, as prticas de rotao de culturas no milho-soja possibilitam a reduo significativa da disponibilidade do DNA transgnico no solo, minimizando assim, os riscos que podem ser atribudos transferncia horizontal de genes. Em suma, os ensaios de PCR em tempo real mostraram ser teis na investigao da manuteno de DNA transgnico (derivado do MON863) no solo.

- Certificao De acordo com Lopparelli et al. (2007) o queijo mozarela obtido a partir do leite do bfalo (Bubalus bubalis) um produto tpico italiano certificado por meio do Conselho Europeu de Denominao de Origem Protegida (DOP). O queijo mozarela tambm pode ser obtido a partir do leite bovino ou misturas de leite de bfalo, mas neste caso, no pode ser vendido como produto DOP, e o seu rtulo deve informar os ingredientes reais. No entanto, o leite bovino em produtos DOP foi frequentemente detectado no passado, sugerindo adio fraudulenta ou contaminao acidental. Vrios mtodos baseados na

tcnica de PCR tm sido aplicados em proveito de um nmero elevado de testes, para detectar a presena de ingredientes no-declarados, tambm em lacticnios. No presente estudo, destaca-se a potencialidade da tcnica da PCR em tempo real para quantificar a adio de leite de bovinos em produtos de queijo de bfalo puro. Foi validado um procedimento baseado em dois compostos alvo: citocromo b mitocondrial de bovinos com a finalidade de detectar e quantificar o DNA de espcies bovinas e o gene da hormona de crescimento utilizado como marcador universal de referncia. Para tal, foram adquiridas em supermercados ou em lojas de lacticnios 64 amostras de queijo mozarela de bufala. Os resultados obtidos demonstraram que a maior parte das amostras comerciais foram contaminados com leite bovino. Em concluso, a tcnica da PCR em tempo real mostrou ser conveniente e eficaz na realizao de controlos de rotina visando a reduo de riscos para a sade pblica e mitigao de comportamentos fraudulentos.

Resumindo, a tcnica da PCR em tempo real apresenta uma grande diversidade de aplicaes. Na rea da sade pode ser aplicada na determinao pr-natal do sexo de clulas, danos no DNA, genotipagem, dosagem gnica, expresso gnica, oncologia clnica, quantificao de protenas, quantificao viral, microbiologia e transplantes. Na rea forense a tcnica da PCR em tempo real mostrou ser uma poderosa ferramenta na anlise e quantificao de DNA mitocondrial e de DNA nuclear, qualidade do DNA, toxicologia forense e genotipagem do grupo sanguneo ABO. Na rea da agricultura e indstria agro-alimentar a PCR em tempo real tem sido utilizada por exemplo, no estudo da presena de nveis de OGM nos alimentos e certificao. Muitas outras aplicaes poderiam ser abordadas neste state of the art, contudo, foram aprofundados e discutidos aquelas que so consideradas como as mais importantes no panorama actual.

Concluses
A tcnica da PCR em tempo real uma variante da PCR convencional, que permite a quantificao do DNA em tempo real, baseada na monitorizao da fluorescncia emitida durante a reaco. O interesse e importncia da tcnica em vrios domnios da Cincia (Medicina, Forense, Agricultura, Microbiologia, Gentica, entre muitas outras) tm vindo a crescer de forma significativa, sendo acompanhado pelo crescimento exponencial das publicaes cientficas relacionadas com esta tecnologia. A quantificao de DNA realizada atravs de dois mtodos: fluoroforos (compostos corantes que se intercalam na dupla cadeia de DNA) ou sondas (emitem fluorescncia quando hibridizam com o DNA complementar). Os corantes intercalantes so fluorocromos sem especificidade para uma sequncia particular de DNA, que se intercalam na dupla cadeia de qualquer produto da PCR permitindo a sua deteco. Contudo o correcto design dos primers confere a estes mtodos elevada especificidade de deteco e quantificao. As principais molculas so a SYBR Green, LCGreen Plus e EvaGreen. As sondas, (como por exemplo TaqMan, primers Scorpion, primers Sunrise, sondas de hibridizao FRET) so oligonucletidos que requerem um fluorocromo que adicionado a uma sonda com especificidade para uma dada sequncia de DNA e que detectam exclusivamente a dada sequncia em todos os produtos da PCR. Regra geral, os trabalhos de investigao recorrem preferencialmente a fluoroforos (menor especificidade e sensibilidade) e trabalhos na rea da sade optam frequentemente pelo uso de sondas (maior especificidade e sensibilidade). A RTQ-PCR requer equipamentos especficos (e hoje em dia ainda muito dispendiosos) que so constitudos no essencial por um termociclador, com sistema ptico para a excitao e recolha da emisso da fluorescncia e um computador com software prprio para a aquisio de dados e anlise final da reaco. A aquisio destes equipamentos deve responder a diversas consideraes, como por exemplo, fiabilidade, custo do equipamento e reagentes, volume de testes, tipos de sondas de deteco preferenciais, requisitos da preparao das amostras, tempo mdio consumido em cada anlise, manuteno/assistncia tcnica, requisitos de espao fsico, possibilidade de actualizaes e software includo. A anlise das principais plataformas permitiu inferir, por exemplo os modelos da ABI, BioRad, Stratagene e alguns da Roche (como por exemplo o

LightCycler 1536) so muito teis em laboratrios com elevadas exigncias relativamente ao nmero de amostras a processar em simultneo (devido ao elevado nmero de poos). Contudo outros equipamentos com menor capacidade, como so o caso do LightCycler 1.0 e LightCycler 2.0, ambos da Roche e do SmartCycler II da Cepheid so mais rpidos devido termociclagem superior. Se a optimizao do trabalho laboratorial for determinante, o equipamento Cobas TaqMan pode ser uma boa escolha visto apresentar elevada fiabilidade, rapidez e automatizao total. As principais vantagens da tcnica de PCR em tempo real so: simplicidade, especificidade, elevada sensibilidade no que se refere utilizao de uma sonda ou de um corante apropriado, rapidez, reduo do risco de contaminao ps-amplificao, elevado potencial de produo, introduo contnua de novos qumicos, deteco de quantidades relativamente pequenas de DNA alvo, facilidade de quantificao, utilizao de uma instrumentao de maior fiabilidade, possibilidade dos resultados obtidos serem rpida e facilmente confirmados atravs da anlise das curvas de melting. Contudo, apresenta como principais desvantagens, o facto de no ser ideal para multiplex, de requer uma elevada competncia profissional e assistncia tcnica muito especializada e o custo muito elevado dos equipamentos o que dificulta a aquisio desta tecnologia por muitos laboratrios. Nesta tcnica recorre-se frequentemente a corantes interligantes, que tm a desvantagem de se ligar a produtos no especficos de dupla cadeia, podendo assim originar emisso de fluorescncia que no corresponde ao DNA alvo. Outra desvantagem deve-se incompatibilidade da tcnica com alguns qumicos que emitem fluorescncia. A PCR em tempo real tem-se mostrado uma tcnica bastante fivel, poderosa e competente em diferentes reas, principalmente, na sade, forense e agricultura. Assim, as aplicaes da tcnica so muito diversas e incluem, por exemplo, determinao pr-natal do sexo de clulas, danos no DNA, genotipagem, dosagem gnica, expresso gnica, oncologia clnica, quantificao de protenas, quantificao viral, microbiologia, transplantes, anlise e quantificao de DNA mitocondrial e de DNA nuclear, qualidade do DNA, toxicologia forense, genotipagem do grupo sanguneo ABO, estudo da presena de nveis de OGM nos alimentos e certificao.

O presente trabalho, pela sua natureza eminentemente descritiva, comparativa e crtica, pretende-se constituir como uma base de referncia bibliogrfica para trabalhos de investigao e/ou acadmicos futuros relacionados com a tcnica da PCR em tempo real.

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Webgrafia
http://www.appliedbiosystems.com, Acedido a 20.10.09. http: //www.roche-applied-science.com, Acedido a 22.10.09. http://www.eppendorf.com, Acedido a 25.10.09. http://www.corbettresearch.com, Acedido a 8.11.09. http://www.qiagen.com, Acedido a 15.11.09. http://www.cepheid.com, Acedido a 01.12.09. http://www.bio-rad.com, Acedido a 14.12.09. http://nobelprize.org, Acedido a 16.12.2009. http://www.gencompare.com/qpcr.htm, Acedido a 23.03.2010. http://www.idahotech.com/LCGreen/, Acedido a 23.03.2010. http://www.gene-quantification.com, Acedido a 20.04.2010. http://www.uniscience.com.br/site/pdf/HRM.pdf, Acedido a 23.03.2010.

ANEXOS

Para a realizao da tcnica de PCR em tempo real necessita-se de um equipamento especfico. Desta forma, encontra-se neste anexo abaixo a descrio de cada um dos equipamentos das diferentes marcas existentes no mercado.

Anexo - Plataformas tecnolgicas disponveis no mercado de PCR em tempo real

Existem vrias empresas que comercializam o equipamento da PCR em tempo real, destacando-se: a Applied Biosystems, a Roche, a Stratagene, a Cepheid, a Corbett/Qiagen, a Eppendorf e a BioRad.

Applied Biosystems
A Applied Biosystems possui diferentes modelos de PCR em tempo real, nomeadamente: ABI 7300, ABI 7500, ABI 7500 Fast, ABI 7500 para identificao humana, ABI 7900 Fast HT com acessrios de automatizao, ABI StepOne, e ABI StepOnePlus.

 ABI 7300 Tabela 1- Caractersticas da ABI 7300 da Applied Biosystems Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software ABI 7300 Lmpada halognea de tungstnio Cmara CCD Baseada no Peltier Filtro de excitao simples Quatro filtros de emisso: FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/TAMRA e o ROX 96-poos ou tubos com 0,2 ml 1 Hora e 45 minutos 20- 100 l Sondas de hidrlise e SYBR Green I, no so possveis outras fluorescncias qumicas 4-canais ROX (opcional) 344945 cm 29 kg Anlise de expresso genica, quantificao absoluta, discriminao allica e ensaios +/-

Figura 1- Fotografia do equipamento ABI 7300 (Extrado de http://www.rci.rutgers.edu/~zylstra/abi7300.jpg, acedido a 26.01.2010).

Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Servio de Hematologia do Centro Hospitalar de Coimbra. ABI 7500

Tabela 2- Caractersticas da ABI 7500 da Applied Biosystems Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais ABI 7500 Lmpada halognea de tungstnio Cmara CCD Baseada no Peltier Filtro de excitao simples Cinco filtros de emisso: FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/TAMRA/Cy3, ROX/Texas Red e o corante Cy5 96-poos ou tubos com 0,2 ml 1 Hora e 45 minutos 20- 100 l Sondas de hidrlise e SYBR Green I, no so possveis outras fluorescncias qumicas 5-canais ROX (opcional) 344945 cm 34 kg Quantificao absoluta, quantificao relativa, discriminao allica, ensaios isotrmicos e ensaios +/-

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 2- Fotografia do equipamento ABI 7500 (Extrado de http://www.adnquebec.com/appareils.html, acedido a 27.01.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Laboratrio de Biologia do RNA da Universidade de Aveiro. ABI 7500 Fast

Tabela 3- Caractersticas da ABI 7500 Fast da Applied Biosystems Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais ABI 7500 Fast Lmpada halognea de tungstnio Cmara CCD Baseada no Peltier Cinco filtros de excitao Cinco filtros de emisso: FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/TAMRA/Cy3, ROX/Texas Red e o corante Cy5 96-poos para optimizar reaces de 10 l <30 minutos 10-30 l Sondas de hidrlise e SYBR Green I, no so possveis outras fluorescncias qumicas 5-canais ROX (opcional) 344945 cm

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura)

Peso Software

34 kg Quantificao absoluta, quantificao relativa, discriminao allica, isotrmicos, anlise da curva de melt e ensaios +/-

Figura 3- Fotografia do equipamento ABI 7500 Fast (Extrado de http://www.maniventures.com/img/pcr_system.jpg, acedido a 27.01.2010). Este equipamento encontra-se implementado na Universidade Nova de Lisboa. Este tipo de equipamento foi utilizado nas sesses prticas do Workshop PCR em Tempo Real da Indstria Alimentar Expresso Gentica em Junho de 2007, no Departamento de Biologia da Escola de Cincias da Universidade do Minho. ABI 7500 para identificao humana

O sistema ABI 7500 para identificao humana fornece uma avanada soluo em situaes como por exemplo, bancos de dados e testes de paternidade, produzindo resultados em menos de 2 horas. Este apresenta uma poderosa plataforma de cinco cores que calibrado para a mais ampla gama de corantes disponveis: FAM / SYBR Green I, VIC / JOE, TAMRA/CY3, ROX / Texas Red, e o corante CY5. O seu sistema ptico especializado permite uma calibrao fcil e precisa de novos corantes sem ser necessrio a adio de novos conjuntos de filtros.

Figura 4- Fotografia do equipamento ABI 7500 para identificao humana (Extrado de http://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/htdocs/productMgr/images/AB-7500_big.jpg, acedido a 27.01.2010).

 ABI 7900 Fast HT com acessrios de automatizao

Tabela 4- Caractersticas da ABI 7900 Fast HT com acessrios de automatizao da Applied Biosystems Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais ABI 7900 Fast HT Laser de ies de rgon Cmara CCD Bloco de 9700 elementos de Peltier 488 nm 500-660 nm Deteco contnua dos comprimentos de onda SYBR Green I, FAM, VIC, JOE, NED, TAMRA e TET 96 e 384 poos 33 minutos (96 poos) ou 52 minutos (384 poos) 5-20 l Sondas de hidrlise e SYBR Green I, no so outras fluorescncias qumicas possveis 6-canais ROX (opcional) 6412584 cm 114 kg Quantificao absoluta, quantificao relativa, discriminao allica, isotrmica, ensaios +/- , elevada genotipagem, rentabilidade do SNP e expresso genica 70.000

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Preo

Este equipamento encontra-se implementado no Centro de Histocompatibilidade de Coimbra.

Figura 5- Fotografia do equipamento ABI 7900 Fast HT (Extrado de http://www.brown.edu/Research/CGP/img/core/ABI_Real_Time_PCR1_3C7E6E2.jpg, acedido a 27.01.2010).

ABI StepOne

Tabela 5- Caractersticas da ABI StepOne da Applied Biosystems Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais LED Trs filtros de emisso e fotodiodo Baseada no Peltier 480 nm Trs filtros de emisso: SYBR Green I/FAM, VIC/JOE e ROX 48-poos, 0,1 ml individual ou 8 tubos <40 minutos 10-30 l Sondas de hidrlise e SYBR Green I, no so outras fluorescncias qumicas possveis 3-canais ROX (opcional) 24,651,242,7 cm 23,6 kg Curva padro, curva padro relativa, Ct comparativo (DDCt), discriminao allica, anlise da curva de melt e ensaios +/-. ABI StepOne

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 6- Fotografia do equipamento ABI StepOne (Extrado de http://www.labindia.com/images/products/ab-products/Genomics/stepone.gif, acedido a 27.01.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado na empresa BioPortugal, Qumico, Farmacutica, Lda. ABI StepOnePlus

O sistema ABI StepOnePlus inclui a tecnologia de blocos VeriFlex, possuindo seis blocos Peltier independentes, que servem para o controlo preciso da temperatura e onde a funcionalidade da PCR reforada. Os blocos VeriFlex fornecem flexibilidade para sondas e primers que so optimizados em diferentes temperaturas de aquecimento/arrefecimento. O preo do equipamento aproximadamente de 19.000.

Figura 7- Fotografia do equipamento ABI StepOnePlus (Extrado de http://farm4.static.flickr.com/3512/3469525846_619aee793c.jpg, acedido a 27.01.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado no CCMAR- Centro de Cincias do Mar do Algarve.

Roche

A Roche possui diferentes modelos de PCR em tempo real, nomeadamente a LightCycler 480, a LightCycler 1.5, a LightCycler 2.0, a LightCycler 1536 e o Cobas Taqman. LightCycler 480

O sistema LightCycler 480 dotado de software que permite realizar anlise HRM ( High Resolution Melting) para a identificao de mutaes genticas desconhecidas, fazer a quantificao gentica, a genotipagem e a quantificao absoluta. Tem a mais-valia de podermos utilizar uma ampla gama de softwares, e associados a estes, recorrer-se aos reagentes mais adequados que possibilitam a optimizao da tcnica. Trata-se de um equipamento rpido, com capacidade para analisar vrias amostras em simultneo. Tabela 6- Caractersticas da LightCycler 480 da Roche Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos LightCycler 480 Lmpada de xnon de alta intensidade Cmara CCD Baseada no Peltier incorporando uma base trmica tecnolgica 430-630 nm, 5 filtros de posio em roda: 450, 483, 523, 558 e 615 nm 6 filtros de posio em roda: 500, 533, 610, 640 e 670 nm 96 a 384 poos <1 hora (96- poos) ou < 40 minutos (384-poos) 10-100 l (96- poos), 3-20 l (384-poos) Sondas de hidrlise, sondas de hibridizao, sondas simples, SYBR Green I, UPL 3-canais de hibridizao e 6-canais de sondas de hidrlise No exigido 54,56060 cm 55 kg Quantificao absoluta, Tm, compensao de cores, deteco qualitativa, anlise estatstica, quantificao relativa, elevada resoluo de melting, genotipagem, LIMS/ mdulo do cdigo de barras

Espectro de excitao

Filtros/Deteco de canais

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 8- Fotografia do equipamento LightCycler 480 (Extrado de http://www.yushing.com.tw/catalog/images/LightCyclerR-480-System.gif, acedido a 28.01.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, bem como no Centro de Histocompatibilidade de Coimbra. LightCycler 1.5

Tabela 7- Caractersticas da LightCycler 1.5 da Roche Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica LED 3 dodos de fotodeteco Ar aquecido 470 +/- nm 3 canais: 530, 640 e 710 nm 32 capilares de vidro 30 minutos 20 l Sondas de hibridizao, sondas de hidrlise, Molecular Beacons, SYBR Green I 2 canais de sondas de hibridizao No exigido 453040 cm 20 kg Quantificao absoluta, anlise de genotipagem, LightCycler 1.5

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

anlise da curva de melting, anlise multiplex Disponvel software de quantificao relativa

Figura 9- Fotografia do equipamento LightCycler 1.5 (Extrado de http://www.rochediagnostics.dk/images/prod/molecular/ras/lightcycler_1.5.gif, acedido a 28.01.2010).

LightCycler 2.0 Tabela 8- Caractersticas da LightCycler 2.0 da Roche Caractersticas LightCycler 2.0

Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

LED 6 dodos de fotodeteco Ar aquecido 470 +/- nm 6 canais: 530, 560, 610, 640, 670 e 710 nm 32 capilares de vidro 30 minutos 20 l ou 100 l Sondas de hibridizao, sondas de hidrlise, Molecular Beacons, SYBR Green I, sondas simples e UPL 4 canais de hibridizao e 2 canais de sondas de hidrlise No exigido 453040 cm 20 kg Quantificao absoluta, quantificao relativa, anlise de genotipagem, Tm, anlise multiplex, ensaios mais/menos, quantificao de cidos nucleicos

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 10- Fotografia do equipamento LightCycler 2.0 (Extrado de http://imagehost.vendio.com/a/10281990/aview/LightCycler2.0.6.jpg, acedido a 28.01.2010).

Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Laboratrio de Biologia Molecular do Servio de Fisiologia da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto e no Instituto de Microbiologia da Faculdade de Medicina de Coimbra. LightCycler 1536 O sistema LightCycler 1536 baseado na anlise do gene que s pode ser executada se os sinais forem gerados, capturados e analisados de uma forma altamente reprodutvel. baseado na arquitectura do sistema LightCycler 480. Est adaptado termicamente para o aquecimento e arrefecimento dos PCRs em tempo real num prato com 1536 poos de reaco individual. Suporta a combinao dos dois filtros de excitao com os dois filtros de deteco, que so optimizados para a deteco de corantes verdes intercalando assim, como o unicolor e bicolor -sondas de hidrlise de cor. Faz leitura ptica de forma especfica para os formatos de deteco de substncias qumicas, estando o equipamento preparado para gerar um resultado final com reduo significativa da complexidade geral dos esquemas experimentais, mesmo num cenrio de alto rendimento. Este sistema apresenta uma placa que vai permitir um desempenho trmico insupervel quando utilizamos volumes de reaco muito reduzidos (0,5-2 ml). Esta placa composta por duas componentes: uma unidade de condutor trmico e uma camada isolante que impede que a tampa aquecida do instrumento afecte a anlise.

Figura 11- Fotografia do equipamento LightCycler 1536 (Extrado de http://www.roche.com/lightcycler_1536_200px.jpg, acedido a 28.01.2010). Cobas TaqMan

O sistema Cobas TaqMan e o Cobas TaqMan 48 so utilizados em diagnsticos in vitro. Nestes sistemas a fase de amplificao, deteco e quantificao so totalmente automatizadas e ocorrem em simultneo.

Apresentam capacidade para 96 ou 48 amostras, permitindo a amplificao e deteco de ADN ou RNA de forma automtica e em tempo real. A existncia de 2 (TaqMan 48) ou de 4 (TaqMan) termocicladores independentes permite a realizao em simultneo de diferentes testes. Estes sistemas permitem automatizar todos os passos, desde a preparao da amostra at obteno dos resultados. Desta forma, optimizado o fluxo de trabalho laboratorial de forma flexvel e eficiente, minimizando assim o tempo de ocupao dos tcnicos de laboratrio. A utilizao de um padro de quantificao e o formato de tubo fechado, garantem a integridade dos resultados e a reduo do risco de contaminao, optimizando assim o fluxo de trabalho.

Figura 12- Fotografia do equipamento Cobas TaqMan (Extrado de http://www.roche.pt/files/image/cobas_taqman1(2).jpg, acedido a 3.02.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Hospital Egas Moniz, bem como no Servio de Imunohemoterapia do Hospital da Universidade de Coimbra.

Stratagene A Stratagene possui diferentes modelos de PCR em tempo real, sendo o MX4000, o MX3000P e o MX3005P. MX4000

Tabela 9- Caractersticas do MX4000 da Stratagene Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos MX4000 Lmpada de halogneo de tungstnio de quartzo 4 PMTs Estado slido resistente/bloco Peltier hbrido de conveno 4 filtros intercambiveis no intervalo 350-750 nm 4 filtros intercambiveis no intervalo 350-380 nm 96 poos, tubos com 0,2 ml, 8 tiras de 0,2 ml <1,5 horas 10-50 l Sondas de hidrlise, balizas moleculares, SYBR Green I, Scorpion e Amplifluor 4 canais ROX (opcional) 764651 cm 50 kg Anlise de expresso genica, discriminao allica, anlise da curva de melting Computador integrado

Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 13- Fotografia do equipamento MX4000 (Extrado de http://www.plantgenomics.iastate.edu/images/gtf/equipment/big/Strategenemx4000.jpg, acedido a 28.01.2010). MX3000P Tabela 10- Caractersticas do MX3000P da Stratagene Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao MX3000P Lmpada de halogneo de tungstnio de quartzo 1 digitalizador PTM Estado slido baseado no bloco Peltier 4 usurios definidos por rodas com filtros no intervalo 350-750 nm 4 usurios definidos por rodas com filtros no intervalo 350-700 nm (padro: FAM, Hex, ROX, Cy 3) 96 poos, tubos com 0,2 ml, 8 tiras de 0,2 ml <1,5 horas 10-50 l Sondas de hidrlise, balizas moleculares, SYBR Green I, Scorpions e Amplifluor 4 canais ROX (opcional) 334643 cm 20 kg Anlise de expresso genica, discriminao allica, anlise da curva de melting Computador integrado

Filtros/Deteco de canais

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 14- Fotografia do equipamento MX3000P (Extrado de http://www.gvsu.edu/cms3/assets/AA893C36DD1F-4ACA-4CD5C49C7BAF4890/downtown/DCP_0986.jpg, acedido a 28.01.2010).

MX3005P Tabela 11- Caractersticas do MX3005P da Stratagene Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao MX3005P Lmpada de halogneo de tungstnio de quartzo 1 digitalizador PTM Estado slido baseado no bloco Peltier 5 usurios definidos independentemente por rodas com filtros no intervalo 350-750 nm 5 usurios definidos independentemente por rodas com filtros no intervalo 350-700 nm (padro: FAM, Hex, ROX, Cy 5, Cy 3) 96 poos, tubos com 0,2 ml, 8 tiras de 0,2 ml <1,5 horas 10-50 l Sondas de hidrlise, balizas moleculares, SYBR Green I, Scorpions e Amplifluor 5 canais ROX (opcional) 334643 cm 20 kg Anlise de expresso genica, discriminao allica, anlise da curva de melting

Filtros/Deteco de canais

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Computador integrado

Figura 15- Fotografia do equipamento MX3005P (Extrado de http://www.uri.edu/research/gsc/images/eqp/Mx3005.jpg, acedido a 28.01.2010). Este equipamento encontra-se implementado na Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro, bem como no ISPA de Lisboa.

Cepheid A Cepheid possui um modelo de PCR em tempo real, denominado SmartCycler.

Tabela 12- Caractersticas do SmartCycler da Cepheid Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos SmartCycler 4 intensidades elevadas LEDs Fotodetectores de silicone Aquecimento de placas cermicas com ar forado

Espectro de excitao

4 canais (450-495 nm, 500-550 nm, 565-590 nm, 630650 nm) 4 canais (510-527 nm, 565-590 nm, 606-650 nm, 670750 nm) (padro: FAM, Cy3, TET, Alexa 532, Texas Red, Cy5, Alexa 647 e Eva Green) 16 tubos 20-40 minutos 25 ou 100 l Sondas de hidrlise, balizas moleculares, sondas de eclipse, SYBR Green I, Scorpions e primers Amplifluor 4 canais No exigido 303025 cm 10 kg Anlise de expresso genica, discriminao allica, anlise da curva de melting e extremidade, compacto e porttil para uso no campo

Filtros/Deteco de canais

Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 16- Fotografia do equipamento SmartCycler (Extrado de http://www.cepheid.com/media/images/systems-software/smartcycler-hero.gif, acedido a 28.01.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Laboratrio de Hematologia, Hospitais da Universidade de Coimbra e no Instituto de Microbiologia da Faculdade de Medicina de Coimbra.

Corbett

A Corbett possui um modelo de PCR em tempo real, a Rotor-Gene 6000. Rotor-Gene 6000 Tabela 13- Caractersticas do Rotor-Gene 6000 da Corbett Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Formato Rotor-Gene 6000 6 potncias elevadas LEDs PMT Aquecimento com ar fresco e centrifugao 360, 470, 530, 585, 625 e 680nm 460, 510, 555, 610, 660 e 712 nm 36 tubos de plstico com 0,2 ml ou 72 tubos de plstico com 0,1 ml; 72 ou 100 discos plsticos 40 minutos 10-100 l,10-50 l, 15-50 l, 10-25 l Sondas de hidrlise, balizas moleculares, sondas de hibridizao e SYBR Green I 6 canais No exigido 27,53742 cm 14 kg HRM (elevada resoluo de melt), associao/dissociao (i.e. melting/annealing) cintica, expresso relativa e medio da concentrao do cido nucleico

Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Figura 17- Fotografia do equipamento Rotor-Gene 6000 (Extrado de http://www.montrealbiotech.com/Products/ContentImages/Rotor-Gene%206000%20Realtime%20Rotary%20Analyzer.jpg, acedido a 28.01.2010).

Qiagen A Qiagen possui um modelo de PCR em tempo real, o Rotor Gene Q. Rotor Gene Q

O Rotor-Gene Q, combina vrios elementos de design optimizado para fornecer o excelente desempenho e resultados confiveis. Este permite a anlise simplificada para uma ampla gama de aplicaes: desempenho trmico e ptico excepcional, devido ao formato rotativo; uma gama ptica incomparvel que mede desde os UV at comprimentos de onda dos infravermelhos. Apresenta como aplicaes: anlise da expresso genica, deteco de organismos patognicos e genotipagem.

Figura 18- Fotografia do equipamento Rotor Gene Q (Extrado de http://www.bioactive.co.th/product.html?page=shop.product_details&flypage=flypage.tpl&product_id=45&category_id=39, acedido a 29.01.2010). Eppendorf A Eppendorf possui um modelo de PCR em tempo real, a Mastercycler ep realplex.

Tabela 14- Caractersticas do Mastercycler ep realplex da Eppendorf Caractersticas Mastercycler ep realplex

Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Formato Tempo (40 ciclos) Volume da reaco Fluorescncia qumica

96 LEDs 2 canais PMT Baseado no gradiente peltier 470 nm 520/550/580/605 nm 96 poos, tubos de 0,2 ml 30 minutos 5-100 Sistema aberto para todos os formatos suportados, excepto sondas de hibridizao 4 tubos No exigido 39,62641 cm 24 kg Dados brutos, anlise da curva de melting, quantificao/quantificao relativa, discriminao allica, ensaios mais/menos Faixa de gradiente de 24C Elevada sensibilidade (detecta at uma molcula de DNA), equipamento pode ficar ligado durante toda a noite Mastercycler ep realplex S com bloco de prata e dois filtros 28.900 Mastercycler ep realplex S com bloco de prata e quatro filtros 34.100

Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Software

Preo

Figura 19- Fotografia do equipamento Mastercycler ep realplex (Extrado de http://www.img.cas.cz/ge/FOTO/mastercycler.jpg, acedido a 28.01.2010).

Este equipamento encontra-se implementado no CIMAR do Porto.

BioRad A BioRad possui alguns modelos de PCR em tempo real, sendo a MiniOpticon, a CFX384, a CFX96 e a MyiQ2. MiniOpticon

Tabela 15- Caractersticas do MiniOpticon da BioRad Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Corantes passivos de referncia Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Faixa de gradiente Gradiente mximo Taxa mxima Preo 48 LEDs 5 fotodiodos MJ Mini 470-500 nm 523-700 nm At 2 No exigido 331832 cm 6,8 kg 35-99C 16C 2,5C/seg +/- 15.000 MiniOpticon

Figura 20- Fotografia do equipamento MiniOpticon (Extrado de http://www.rayelab.com/images/product/MiniOpticon.jpg, acedido a 29.01.2010). Este tipo de equipamento encontra-se implementado no Laboratrio de Anatomia Patolgica de Coimbra. CFX384

Tabela 16- Caractersticas do CFX384 da BioRad Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Faixa de gradiente Gradiente mximo Taxa mxima Preo 5 LEDs 5 fotodiodos C1000 450-650 nm 515-690 nm At 4 363346 cm 21,4 kg 30-100C 24C 2,5C/seg +/- 35.000 CFX384

Figura 21- Fotografia do equipamento CFX384 (Extrado de http://www.ddmag.com/uploadedImages/Articles/2009_05/BioRadCFX384.jpg, acedido a 23.03.2010).

 CFX96 Tabela 17- Caractersticas do CFX96 da BioRad Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Faixa de gradiente Gradiente mximo Taxa mxima Preo 6 LEDs 6 fotodiodos C1000 450-684 nm 515-730 nm At 5 363346 cm 21,4 kg 30-100C 24C 5C/seg +/- 30.000 CFX96

MyiQ2 Tabela 18- Caractersticas do MyiQ2 da BioRad Caractersticas Laser/Lmpada Detector Sistema de ciclos trmicos Espectro de excitao Filtros/Deteco de canais Canais de deteco suportados (anlise de mltiplos alvos na mesma amostra) MyiQ2 Lmpadas de halogneo tungstnio 12 bit CCD cmara iCycler 470-545 nm 515-585 nm At 2

Dimenses (AlturaComprimentoLargura) Peso Faixa de gradiente Gradiente mximo Taxa mxima Preo

392958 cm 17,6 kg 40-100C 25C 3,3C/seg +/- 20.000