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PaneldeEditores:

La Revista de Farmacologa de Chile tiene un panel de editores conformado por connotados farmaclogosnacionalesquesonmiembrosdelaSociedaddeFarmacologadeChileyacadmicosdelas principalesuniversidadeschilenas.

ComitEditorial:
Dr.RamnSotomayorZrate,EditorenJefe Dr.PabloJaraPicas,CoEditor Dr.HernnE.Lara Dra.VivianaNoriega Dr.JuanCarlosPrieto Dra.JacquelineSeplveda Dr.JuanPabloG.HuidobroToro Dra.KatiaGysling Dra.InsRuiz Dr.IvnSaavedraS. Dr.AlfonsoParedesV. Dr.RodrigoCastilloP. Dra.GabrielaDazVliz Dr.PatricioIturriagaVsquez

EvaluadoresAsociados:
Dr.HugoF.Miranda Dra.MaraEugeniaLetelier Dr.FrederickAhumada Dr.GonzaloBustosO. Dr.RalCorralesV. Dr.GuillermoDazAraya Dra.VernicaDonoso Dr.MarioFandez Dra.JennyFiedler Dr.MiguelReyesParada Dr.YedyIsrael Dr.RicardoMaccioni Dra.VernicaKramer Dr.SergioLavandero Dr.JuanDiegoMaya Dr.AntonioMorello Dra.MyriamOrellana Dra.MaraElenaQuintanilla Dra.TeresaPelissierS. Dr.JavierPuente Dr.LuisQuiones Dr.PatricioSazBriones Dra.CoraliaRivas Dr.LeonelRojo Dra.LutskeTampier Dra.GladysTapia Dra.M.AntonietaValenzuela Dra.M.AraceliValle Dr.LuisVidela Dr.RalVinet Dr.BruceK.Cassels Dr.SergioMora

RevistadeFarmacologadeChile DerechosReservadosSociedaddeFarmacologadeChile ISSN07188811 versinimpresa ISSN0718882X versindigital Todoslosderechosreservados.Ningunapartedeestapublicacinpuedeserreproducida,almacenadaensistemaalgunodetarjetasperforadas otransmitidaporotromedioelectrnico,mecnico,fotocopiador,registrador,etcterasinpermisoprevioporescritodelcomiteditorial. Rev.Farmacol.Chile(2012)5(2):1

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EDITORIAL

RamnSotomayorZrate,Ph.D EditorenJefe
Durante en ao 2012, la Revista de Farmacologa de Chile cumple 4 aos de publicaciones seriadas. Sin duda es un esfuerzo muy gratificante que nos ha permitido mantenernos como rgano nacional de la difusin de la farmacologa. Esteesfuerzonohaestadoexentodedificultades,yaquedurantelosdosprimerosaosdelarevistaelnmerode trabajos recibidos no eran suficientes para publicar ms de un nmero por ao. En la actualidad hemos logrado la edicin de volmenes temticos que cuentan con artculos originales de investigacin y revisin, que nos han permitido publicar 2 a 3 nmeros por ao. En este enorme esfuerzo han participado destacados cientficos nacionales e internacionales que han enviado manuscritos a publicar en los nmeros de Farmacologa Clnica, Neurofarmacologa y ahora de Fitofarmacologa. Sin embargo, si queremos en un futuro que nuestra revista este indexada en catlogos electrnicos como Scielo debemos duplicar este esfuerzo, ya que el nmero mnimo de artculosesde40publicadosporao. En representacin del comit editorial de la Revista de Farmacologa de Chile agradezco enormemente el esfuerzo desplegado para la edicin del segundo nmero del ao 2012 y solo me queda invitarlos nuevamente a enviar artculosoproponerunidadestemticasespecficasparaprximaspublicaciones.

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MaraEugeniaLetelier,MSc. EditorAsociado

EDITORIALDEFITOFARMACOLOGA

El desarrollo de la fitoterapia se ha focalizado por dcadas en la bsqueda de principios activos aislados presentes en plantas. Este planteamiento est basado en la presuncin que una planta tiene uno o muy pocos compuestos que determinan sus efectos teraputicos. Sin embargo, los sistemas de medicina tradicional ms antiguos como la medicina China y la Ayurvdica o tambin,la FitoterapiaEuropea y la medicina nativa Latinoamericana, creen que los distintos compuestos presentes en las plantas actan sinrgicamente. Por lo tanto, extractos totales o preparadospolivalentesherbalespresentaranmayoreficaciateraputicaquelosprincipiosactivosaislados. Actualmente existe un inters creciente por el desarrollo de fitofrmacos en base a extractos totales a nivel mundial.Algunasrazonesquepermitenexplicarestecrecimientosemencionanacontinuacin: 1. Se han realizado grandes esfuerzos econmicos y de tiempo para aislar y caracterizar diferentes compuestosdeplantasylosresultadosteraputicoshansidoslomoderados. 2. Las patologas en general son multifactoriales. Esto implica que diferentes dianas farmacolgicas pueden ser cubiertas para mejorar la eficacia teraputica. La asociacin de frmacos antioxidantes, al tratamiento deenfermedadesneurodegenerativasesunejemplo. 3. Fitofrmacos estn siendo tambin evaluados en su capacidad de disminuir reacciones adversas de frmacossintticos,mejorandotambindeestaformalaeficaciateraputicadelosfrmacossintticos. 4. El desarrollo de las nuevas tecnologas micas como mtodos de alto rendimiento abre nuevas posibilidades para evaluar mezclas de compuestos previamente aislados, como tambin de extractos totales.As,estastcnicaspermitirnestandarizarpreparadosherbalespolivalentes,comotambindefinir los mecanismos de accin de los mismos, debilidades que han permanecido en el tiempo, impidiendo la validacindelaaccinteraputicadeestetipodefitofrmacos,porfaltadeestudiosclnicos. Latinoamrica es el continente que posee la mayor diversidad de plantas medicinales y Chile, en forma especial, unaltoendemismo.Sinembargo,lasplantashansidoescasamenteexploradas,aunqueellasrepresentanunagran fuente potencial de frmacos. Si a esto le sumamos la necesidad imperiosa de cubrir las necesidades de salud de nuestra poblacin tercermundista, todo est dado para que aunemos fuerzas y lideremos el desarrollo de fitofrmacos. Finalmente, gracias a la directiva de la Sociedad de Farmacologa de Chile, como tambin al Comit Editor de la Revista de Farmacologa por su iniciativa de editar un nmero especial de productos naturales. Un sincero agradecimiento tambin a todos los profesionales que han contribuido con sus trabajos a hacer efectiva esta iniciativa.Ladiversidaddetemastratadosmostraraloslectorescuangrandeeselcaminoquefaltaporrecorrery lanecesidadqueexistedeformarequiposmultidisciplinariosparaenfrentarestedesafo.

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CONTENIDO

RevistadeFarmacologadeChile
AO2012VOLUMEN5NMERO1 COLUMNADEOPININ: LEGISLACINENCHILESOBREFITOFRMACOSYPLANTASMEDICINALES MirthaParadaV. ARTCULOSORIGINALES: SAFETYPROFILEANDWOUNDHEALINGPROPERTIESOFASTANDARDIZEDBuddlejaglobosaHope(MATICO) EXTRACTINSPRAGUEDAWLEYRATS MaraEugeniaLetelierycols. USODEMODELOSANIMALESENELESTUDIODEPLANTASMEDICINALESCONPROPIEDADESANSIOLTICASY ANTIDEPRESIVAS. GabrielaDazVlizySergioMora. ESTUDIODEUNEXTRACTOESTANDARIZADODEMAQUIRICOENDELFINIDINASENELMANTENIMIENTODEL BALANCEDEGLUCOSA. EvelynJaraycols. ARTCULOSDEREVISIN: POLIFENOLESCONEFECTOANTIHELICOBACTERPYLORI:FUENTESDEOBTENCINYSUPOTENCIALUTILIZACIN ENFITOMEDICAMENTOS,NUTRACUTICOSYALIMENTOSFUNCIONALES EdgarR.Pasteneycols. COMPUESTOS NEUROACTIVOS OBTENIDOS DESDE FUENTES NATURALES: CARACTERIZACIN FARMACOLGICADENEUROMODULADORESDELSNC. JorgeFuentealbaArcosycols. AVANCESENLASINVESTIGACIONESFARMACOLGICASYTOXICOLGICASCONELEXTRACTOACUOSODELA CORTEZADELRBOLDEMANGO(MangiferaindicaL.) GabinoGarridoyMariselaValds. MAQUI(Aristoteliachilensis):UNNUTRACUTICOCHILENODERELEVANCIAMEDICINAL JorgeR.Alonso

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COLUMNADEOPININ

LEGISLACINENCHILESOBREFITOFRMACOSYPLANTASMEDICINALES
MirthaParadaV.,Ph.D(c).
SubdepartamentodeRegistro,AgenciaNacionaldeMedicamentos,InstitutodeSaludPblicadeChile

INTRODUCCIN: Las plantas medicinales son un viejo recurso teraputico y han sido usadas como fuente de preparados medicamentosos,actualmentesesabequeestaprcticase debe a la presencia de principios activos o constituyentes conaccinteraputicaqueestnpresentesenellas. El hombre prehistrico observaba el comportamiento instintivo de los animales a la hora de curar sus heridas o paliar sus enfermedades, tambin aprendi a distinguir las especies comestibles y las txicas, para luego diferenciar entrelasplantasqueposeanefectosmedicinalesylasque no, es as como al hombre de Neanderthal se le encontraron en sus pertenecas granos de polen de seis distintas especies vegetales con propiedades medicinales y en Amrica los primeros indicios del uso de plantas medicinales se localiza en Monteverde, sitio arqueolgico ubicado a 36 Km de Puerto Montt, donde se encontr vestigios de boldo, una especie no endmica del lugar, lo queindicaelconocimientoteraputicodelasplantas. EnChileantesdelallegadadelosespaoles,losmapuches dentro de sus elementos teraputicos usaban las hierbas medicinales, y tenan conocimiento de ms de 200 plantas con propiedades teraputicas. de la poca como la mejor botica de ese entonces en Santiago, fabricaba un gran nmero de preparados con plantas medicinales, de estos unporcentajeconsiderableconplantasautctonas

chilenas, lo que consta en el catastro elaborado en el ao 1772 por el hermano Jos Zeitler quien se qued por un periodoenlafarmacialuegodelaexpulsindelosjesuitas. En la poca de la colonia la botica de los jesuitas, inaugurada en el ao 1647, referida por los historiadores Enlaactualidad,lasplantasmedicinalesdeusomscomn en Chile reconocen como origen las fuentes nativas usadas por los mapuches principalmente y especies asilvestradas tradas por los europeos y constituyen un importante recursoteraputico. MARCOREGULATORIO Tanto en los pases desarrollados como los que estn en vas de desarrollo el uso de medicamentos elaborados con plantas medicinales muestra un crecimiento acelerado en estos ltimos aos.Estas plantas son empleadas como materia prima por una amplia gama de empresas que utilizan con menor o mayor grado de industrializacin los compuestos que se derivan de ellas. Es as como se elaboran infusiones, aceites, extractos, polvos, fragancias, productos para el cuidado personal, suplementos dietticos,alimentosfuncionales,fitofrmacosy productos deusoindustrialydeaplicacinenlaagricultura.Seestima que el 30% de los frmacos que se comercializan y el 40% de los que se encuentran en pruebas clnicas, son derivadosdeplantasmedicinales.

Correspondenciaa:Q.F.MirthaParadaV.CandidataaDoctoraenCsFarmacuticasUdeChile.SubdepartamentoRegistro,AgenciaNacionaldeMedicamentos InstitutodeSaludPblicadeChile.Marathon1000,uoa,Santiago.Telfono:+56(2)5755311RedMinsal:255311.Correoelectrnico:mparada@ispch.cl

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En el mundo en general se estn haciendo esfuerzos para legislar en torno al tema y armonizar criterios en la regulacin de los Fitofrmacos. Por ejemplo, durante una reunin de la Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacuticos (RIPROFITO), en Guatemala en el ao 1996, se reconoci la necesidad de recopilar las dispersas legislaciones iberoamericanas sobre estos productos culminando con una obra que reuni normativas de 15 pases. Por otro lado, en Europa, la Comunidad Europea ha elaborado en estos ltimos aos una reglamentacin armonizada para los fitofrmacos y los productos naturales. En Chile se han realizado actividades que agrupan a entidades del mbito privadoproductivo, acadmico e institucional en relacin a las estrategias a seguir en la produccin de las plantas medicinales y a la regulacin de losproductosquedeelladerivan.ElFIA(Fundacinparala Innovacin Agraria) agrup a distintos sectores con el objetivo de establecer un vnculo permanente que permitiera una coordinacin y articulacin regional de los sectoresproductivo,acadmico,industrialypblico.Porsu parte el Ministerio de Salud ha promovido los cambios reglamentarios para garantizar el uso racional de los medicamentoselaboradosconplantasmedicinales. En estos ltimos aos los reglamentos han sido modificados y complementados de acuerdo a los requerimientos actuales. Por ejemplo el Reglamento del Sistema Nacional de Control de Productos Farmacuticos D.S. N 1876/95, fue modificado en 1999 por el DS N 855/98 creando la categora de Producto Farmacutico Complementarios, decreto que fue posteriormente derogado y reemplazado por el D.S. N 286 de 2001 que modific el DS 1876/95 y cre la categora de fitofrmaco. Actualmente el D.S. 1876 ha sido reemplazado por el D.S. N 3/10, que entra en vigencia el 26 de Diciembre de 2011 (que aprueba el Reglamento del Sistema Nacional de Control de Productos Farmacuticos de Uso Humano), donde se incluyen las definiciones de fitofrmacos y los requisitos para su regulacin, siendo el Instituto de Salud Pblicaquienlasdebeaplicar. El Instituto de Salud Pblica de Chile (ISP) es la entidad gubernamental encargada de implementar los cambios reglamentarios, ya que se trata de un servicio pblico funcionalmente descentralizado, que posee autonoma de gestin y est dotado de personalidad jurdica y de patrimoniopropio.DependedelMinisteriodeSaludparala aprobacin de sus polticas, normas y planes generales de actividades,ascomoenlasupervisindesuejecucin.

DEFINICIONES Y REQUISITOS PARA REGISTRO DE FITOFRMACOSYPLANTASMEDICINALESDSN3/10: En el artculo 10 se hace referencia a las especialidades farmacuticas, de acuerdo a su naturaleza, la letra d) de esteartculoserefierealosfitofrmacos. Elartculo14deestedecretodefinealosfitofrmacos.
Cuadro1:DefinicindeFitofrmaco

Artculo 14: Son fitofrmacos, aquellas especialidades farmacuticas cuyos ingredientes activos provienen de las partes areas o subterrneas de plantas u otro material vegetal y estn debidamenteestandarizados

Elartculo27hacemencinalosmedicamentosherbarios tradicionalescuyadefinicinsedetallaenelcuadro2.
Cuadro2:DefinicindeMedicamentosHerbariosTradicionales

Artculo 27: Se entender por medicamentos herbarios tradicionales, aquellos constituidos por las plantas o partes de plantas, frescas o desecadas, enteras o trituradas, envasadas y etiquetadas artesanalmente y rotuladas con la denominacin utilizada por la costumbre popular en el mbito de las tradiciones culturales chilenas, que hayan sido reconocidas en la respectiva norma tcnica aprobada por decreto supremo del Ministerio, a la que alude en el prrafo siguiente. Se entendern registrados para los efectos de su libre venta y distribucin, por el slo hecho que la SEREMI competente haya autorizado el establecimiento donde se almacenan, elaboran, fraccionan o envasan o se realizan otras actividades propias de su procedimiento, debiendo cumplir las siguientescondiciones: a. Debern estar en un listado contenido en una norma tcnica aprobada por decreto supremo del Ministerio, dictada en uso de sus atribuciones legales tcnico normativas, la que sealarladenominacin,propiedadesteraputicasyusosde cada una de ellas, debiendo ser empleadas como auxiliares sintomticos. b. Estar envasadas artesanalmente como especies vegetales aisladas,nomezcladas. c. Consignar en sus rtulos slo aquellas propiedades reconocidaseneldecretoaludidoprecedentemente

En el cuadro 3 se aprecia el listado de plantas autorizadas como medicamentos herbarios tradicionales mediante resoluciones exentas N 522 y 190, de fechas 16 de agosto de2007y31demarzode2008,respectivamente.

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Cuadro3:ListadodeMedicamentosHerbariosTradicionales

61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60.

AcaenasplendensHook.EtArn. Acantholippiadeserticola(Phil.)Moldenke AchilleamillefoliumL. Agathosmabetulina(Bergius)Pill. AloebarbadensisMill. AloysiacitrodoraPalu ArctiumlappaL. Aristoteliachilensis(Mol.)Stuntz ArnicamontanaL. ArtemisiaabsinthiumL. BauhiniaforficataLinksubsp.pruinosa(J.Vogel) FortunatoetWunderlin BetulapendulaRoth BoragoofficinalisL. BuddlejaglobosaHope CalceolariathyrsifloraGrah. CalendulaofficinalisL. Capsellabursapastoris(L.)Medik. ChenopodiumchilenseSchrad. CentauriumcachanlahuenB.L.Rob. CestrumparquiLHerit. CichoriumintybusL. CitrusaurantiumL. CrataegusmonogynaJacq. CuscutachilensisKerGawl. CynarascolymusL. DrimyswinteriJ.R.etG.Forster Durvilleaantarctica(Chamissso)Arito Ecballiumelaterium(L.)A.Rich. Elytrigiarepens(L.)Nevski EphedrachilensisK.Presl EquisetumbogotenseKunth EucalyptusglobulusLabill. FabianaimbricataR.etP. Flaveriabidentis(L.)O.Kuntze FoeniculumvulgareMill. FuchsiamagellanicaLam. FumariaofficinalisL. GeumchiloenseBalb.exSer. Gunneratinctoria(Mol.)Mirb. HaplopappusbaylahuenRemy HypericumperforatumL. JuglansregiaL. JuniperuscommunisL. LampayamedicinalisF.Phil. Laretiaacaulis(Cav.)Gill.etHook. LavandulaangustifoliaMill. Libertiasessiliflora(Poepp.)Skottsb. LinumusitatissimumL. Lomatiahirsuta(Lam.)DielsexMacbr. Lumachequen(Mol.)A.Gray MalvasylvestrisL. MargyricarpuspinnatusKuntze MarrubiumvulgareL. MatricariarecutitaL. MaytenusboariaMol. MelissaofficinalisL. Menthaxpiperita MenthapulegiumL. MorusnigraL. MuehlenbeckiahastulataI.M.Johnst.

OcimumbasilicumL. OleaeuropaeaL. Otholobiumglandulosum(L.)Grimes PaspalumvaginatumSwartz PerseaamericanaMill. Petasitesfragrans(Vill.)C.Presl PeumusboldusMol. PimpinellaanisumL. PinusradiataD.Don PlantagolanceolataL. PlantagomajorL. PolypodiumfeuilleiBertero PorlieriachilensisJohnst. Pseudognaphaliumviravira(Mol.)A.Anderb. PunicagranatumL. QuillajasaponariaMol. QuinchamaliumchilenseMol. RhamnusfrangulaL. RibescucullatumH.etA. RosamoschataHerrm. RosmarinusofficinalisL. RumexconglomeratusMurria. RutachalepensisL. SalixhumboldtianaWilld. SalviaofficinalisL. SambucusnigraL. SchinusareiraL. SeneciofistulosusPoepp.exLess. SennaalexandrinaMiller Sennastipulacea(Aiton)Irv.etBarneby SolanumligustrinumLodd. SpartiumjunceumL. Tanacetumparthenium(L.)Sch.Bip. Taraxacumofficinaleagg.Weber ThymusvulgarisL. TiliacordataMill. TrigonellafoenumgraecumL. TristerixtetrandrusMart TropaelummajusL. UrticadioicaL. ValerianaofficinalisL. VerbascumthapsusL. VerbenalitoralisH.B.K ZeamayzL.

Ademsenelprrafosegundodelosrequisitosdelregistro sanitario, artculo 28, se seala: Las solicitudes de registro sanitario debern ser presentadas ante el Instituto, cumpliendo con los requisitos generales y especiales que se determinan en este Ttulo. Los requisitos generales de registro comprenden aspectos administrativos, de informacin tcnica, de calidad farmacutica y de seguridad y eficacia clnica del producto farmacutico a registrar, que son de comn aplicacin a todos los registros; por su parte, los requisitos especiales derivan de la naturaleza de ellos y de cuya procedencia y veracidad debe responsabilizarse el profesional que suscribelasolicitud.

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Por su parte el artculo 40 menciona los requisitos especiales que debern cumplir los fitofrmacos, se describenenelcuadro4.
Cuadro4:Requisitosespecialesparafitofrmacos.

TEXTOS OFICIALES UTILIZADOS EN EL PROCESO DE EVALUACINDELREGISTROSANITARIO: En el proceso de evaluacin del Registro Sanitario se ocupan diversos textos considerados oficiales y que dan cuenta de diferentes aspectos importantes a tener en consideracin a la hora de evaluar un registro sanitario de esta naturaleza y asegurar de este modo que cumpla los requisitosdecalidad,seguridadyeficacia. Monografasdecalidad: Farmacopeas: En la que se encuentra la definicin qumica, caractersticas, identificacin, ensayos, valoracin,conservacin. Monografasdeeficaciayseguridad Comisin E: La que describe definicin, composicin, indicacin de uso, contraindicaciones, efectos adversos, interacciones, posologa, mtodo de administracin,accin. Monografasdeeficaciayfarmacologa/toxicologa Monografas ESCOP: Donde aparecen advertencias, precauciones, otras formas de interaccin, embarazo y lactancia, sobredosis, propiedades farmacolgicas, estudiosclnicos,farmacocintica,toxicidad. Monografas de calidad, eficacia y farmacologa / toxicologa Monografas de la OMS: La finalidad de estas monografas es favorecer la armonizacin en el uso de los fitofrmacos en lo referente a niveles de seguridad,eficaciaycontroldecalidad CLASIFICACINDELOSFITOFRMACOS Todo registro sanitario, debe tener un nmero y una letra que permita distinguir la categora a la que pertenece, es as como los fitofrmacos deben clasificarse de la siguiente manera: NN correlativo/ao registro: distinguir exclusivamenteafitofrmacos.

Artculo 40: Para el registro de fitofrmacos atendida su naturaleza,setendrnenconsideracinlassiguientesprecisiones: a. La seguridad deber ser avalada con la presentacin de estudios preclnicos, toxicolgicos en animales y clnicos fase I, mientras que la eficacia debe ser avalada con estudios clnicos fase II y III. En los casos en que exista informacin proveniente de literatura oficial de los diferentes organismos internacionales o extranjeros, tales como OMS, FDA o EMEA; almomentodesolicitarunregistrosanitario,estaseaceptar comovlidaenreemplazodelaanterior. b. Las solicitudes de registro debern ceirse a lo establecido en los requisitos generales del registro, con las siguientes reglas especiales: b.1. No se requerir la presentacin de estudios de equivalencia teraputica al momento de su registro o en sus posterioresmodificaciones. b.2. Se deber incluir la descripcin del proceso de fabricacin. b.3. Su denominacin genrica corresponder a la denominacin taxonmica botnica del vegetal que aporta el olosingredientesactivos. b.4. La expresin de su frmula cualicuantitativa deber incluir: el tipo de preparacin vegetal empleada, tales como extracto seco, extracto fluido, extracto blando, polvo u otro; seguido de la o las partes del vegetal que se emplean, ms su nombre cientfico con su concentracin y su equivalencia en unmarcadorvegetal,cuandocorresponda. b.5. No podrn incluir sustancias estupefacientes o psicotrpicas,nimezclasconmedicamentosalopticos. b.6. La identidad y pureza de los componentes se establecer de acuerdo con lo que dispongan las farmacopeas o las fuentes de informacin cientfica internacionales o extranjeras, debiendo presentarse la correspondiente validacindelametodologaanalticapropuesta. b.7. La metodologa analtica para la evaluacin del producto terminado as como sus materias primas deber aparecer en alguna de las farmacopeas oficialmente aceptadas en nuestro pas o en fuentes de informacin cientfica extranjeras o se deber presentar la correspondiente validacin de la metodologaanalticapropuesta. b.8. Debern cumplir con las especificaciones de producto terminadodeacuerdoalaformafarmacuticaenqueellosse presenten, sin embargo podr exceptuarse la valoracin del o los principios activos en el producto terminado, reemplazndose sta por la valoracin del marcador vegetal especfico. b.9. No se considerarn fitofrmacos los productos que contienenprincipiosactivosaisladososintticos,aunquesean preparadosdemateriaprimadeorigenvegetal.

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ARTCULOORIGINAL

SAFETYPROFILEANDWOUNDHEALINGPROPERTIESOFASTANDARDIZEDBuddlejaglobosa Hope(MATICO)EXTRACTINSPRAGUEDAWLEYRATS

MaraEugeniaLetelier ,RodrigoJones ,CarolinaLpez1,KarinaPalma1,PaulaAracena1,2,Ivn Razmilic3,XimenaPolanco4,HermineVogel5


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LaboratoryofPharmacologyandToxicologyA,DepartmentofPharmacologicalandToxicologicalChemistry,FacultaddeCienciasQumicasy Farmacuticas,UniversidaddeChile,Santiago,Chile. 2 FacultyofMedicine,UniversidadCatlicadelaSantsimaConcepcin,Concepcin,Chile. 3 InstituteofChemistryofNaturalResources,UniversidaddeTalca,Talca,Chile. 4 LaboratoriosXimenaPolanco,Santiago,Chile. 5 DepartmentofHorticulture,FacultaddeCienciasAgrarias,UniversidaddeTalca,Talca,Chile.


ABSTRACT

BuddlejaglobosaHope(matico)isaChileanplantusedbynativemedicinemainlyin thetreatmentofwoundhealingandasan antiinflammatory agent. We have developed a standardized hydroalcoholic extract from matico leaves, in terms of total polyphenolic content. This extract may be useful in accelerating the wound healing process. To this end, we studied the in vivo effects of this extract in a rat model, in terms of general homeostasis. Data showed that oral treatment of adult male Sprague Dawleyratswiththisextract,forupto12days,didnotaltertheirhemogramandclinicalchemistryparameters.Inaddition,we showedthattopicaltreatmentwiththesameextractwasabletoacceleratewoundhealingintheseanimals,mostlikelythrough shortening the inflammatory stage of the healing process. Altogether, our data demonstrate that local effects of this particular standardizedmaticoextractarelikelytoretaintheirwoundhealingpropertieswhilenotalteringthegeneralhomeostasisofthe animals.Wediscusstheseresultsintermsofthepossiblepharmacologicalapplicationsofthisextract.

Keywords:BuddlejaSafetyRats,SpragueDawleyWoundHealing
PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCTION Buddleja globosa Hope (matico) is a widely used plant in Chilean traditional medicine, mainly due to its anti inflammatory and wound healing properties (14). In vitro studies report that active principles found in extracts from matico leavesdisplayantioxidantactivity.Noteworthy,this antioxidant activity appears to be correlated with the contentofpolyphenolsoftheseextracts(5,6). Since oxidative stress is a hallmark of inflammatory processes (7), the antiinflammatory activity displayed by matico extracts may be explained in terms of their antioxidantactivity.

Also, these extracts have been reported to promote fibroblast proliferation in vitro (4), which in addition to the antioxidant activity, may account for the wound healing propertiesassociatedwiththeseextracts. There are several studies showing the therapeutic potential of matico extracts (1, 4, 813). On the basis of these studies, it is possible to apply such therapeutic potential of matico extracts to the treatment of diverse pathologies. Nonetheless, development of phytodrugs based on these extracts first requires the use of an extract obtained through a standardized process, in order to obtainreproducibledata.

Corresponding author: Mara Eugenia Letelier, MSc. Laboratory of Pharmacology and Toxicology A, Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Chile. Sergio Livingstone Pohlhammer 1007, Independencia, Santiago, Chile 8380492. Tel: 562 9782885,Fax:5629782996,Email:mel@ciq.uchile.cl

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We have obtained a standardized hydroalcoholic extract from matico leaves, using a vegetable drug that displays reproducible total polyphenol content (14, 15). We have also shown that this matico extract behaves as an in vitro antioxidant: i) inhibiting oxygen consumption elicited by Cu2+/ascorbate, a superoxide anion generating system (6), and ii) preventing lipid peroxidation and thiol loss in rat 2+ liver microsomes exposed to Cu /ascorbate (6). In the present work, we conducted an in vivo study to assess the effectsofthismaticoextractonthegeneralhomeostasisof a rat model. To this end, adult male SpragueDawley rats were subjected to an acute treatment (up to 12 days) with the extract, administered in three oral doses per day. General homeostasis of the animals was followed in terms of hemogram and clinical chemistry data. Our study showed that this extract failed to elicit alterations of the generalanimalhomeostasis. To evaluate that this matico extract still exhibited therapeutic potential, we assessed its ability to accelerate the wound healing process in vivo. With this purpose, we used a skin wound model in SpragueDawley rats to assess the effect of topical treatment with this matico extract in wound healing time. Animals topically treated with this extract significantly decreased the wound healing time, in comparisonwiththosethatdidnotreceivetreatment.This effect was apparently due to a shortening of the inflammatory stage, as assessed by COX2 levels, and the accelerationofcellularproliferationrate,asevaluatedwith a proliferation marker (Ki67). We discuss the possible relationship between the antioxidant properties of this extractandtheobservedinvivobenefits. MATERIALANDMETHODS 1. Material. Extracts from Buddleja globosa Hope (matico) leaves were provided by the plantbased pharmaceutical laboratory,LaboratoriosXimenaPolanco(Chile).Extraction process details are proprietary information of the company. General chemical and organoleptic characteristics of these extracts are shown in Table 1. FolinCiocalteus reagent and catechin were from Sigma Aldrich (USA). Rabbit antibodies against rat and human Ki 67 and COX2 were from Affinity BioReagents (USA). All otherreagentswereofthebestgradeavailable. 2. Determination of total polyphenols. The total polyphenol content of the extract was determined as previouslydescribed(5),usingcatechinasastandard. 3.Animals.MaleSpragueDawleyrats(200230g)werefed with normal pellet diet and water ad libitum, in a 12:12 light/dark cycle at 21C. Animals were maintained in the vivarium of the Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Chile. All procedures were

performedaccordingtotheGuidefortheCareandUseof LaboratoryAnimals(NRC,USA). 4. Acute toxicity protocol. Dosage of the matico extract was calculated from proprietary information of Laboratorios Ximena Polanco. Doses were diluted in deionized water for oral delivery per gavage. Rats were distributed into 2 experimental groups: Control (deionized water) and matico extract (three daily doses of 18.4mol equivalents catechin/Kg). Animals were treated with the extract for up to 12 days. At different stages of treatment (detailed in the text), rats from each group were anaesthetized with ether and sacrificed by exsanguination through cardiac puncture. Blood samples were used for hemogram and clinical chemistry. This protocol was approved by the Bioethical Committee of the Facultad de CienciasQumicasyFarmacuticas,UniversidaddeChile. 5. Wound healing protocol. Rats were distributed in 2 experimental groups: Control (untreated) and Experimental (matico extract). Animals were anesthetized with i.p. ketamine and xylazine (90 and 10mg/Kg, respectively) and a 1cmskin incision was performed witha #4 blade in the dorsocervical area of each animal. The Experimental Group was treated topically with the matico extract, in a dose of 18.4molequivalents catechin/Kg, every 8 hours for up to 7 days. At different stages of treatment (detailed in the text), rats were sacrificed by decapitation and skin biopsies were obtained for histochemical and immunohistochemical analysis. This protocol was approved by the Bioethical Committee of the Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, UniversidaddeChile. 6. Hemogram study. Hemogram parameters were determined at the Clinical Laboratory Centro Mdico Baquedano (Chile). Parameters analyzed were red blood cell count (RBC), hematocrit, hemoglobin, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), and white blood cell, lymphocyte and platelet counts. 7. Clinical chemistry study. Clinical chemistry parameters were determined at the Clinical Laboratory Centro Mdico Baquedano (Chile). Parameters analyzed were: calcium, phosphorus, glucose, blood ureic nitrogen, cholesterol, total protein, albumin, total bilirubin, acid phosphatase (AP), lactate dehydrogenase (LDH), and glutamyl oxaloacetictransaminase(GOT). 8. Histomorphological analyses. Hematoxylineosin staining and analyses were performed in skin biopsies. These samples were also used to measure epidermal thicknessatthewoundarea.
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9. Immunohistochemical analysis. COX2 and Ki67 staining (chromogenic detection) and analyses were performed in skin biopsies. Analysis for positive cells was performed in the wound area (proximal staining) and about 400m from the wound area (distal staining). Distal staining was used as an internal control for basal COX2 andKi67staining. 10.StatisticalAnalyses.Resultswereanalyzedonthebasis of the normal distribution of data from Control rats for each parameter, which was confirmed by DAgostino & Pearson normality test. Differences between control ranges for each hemogram and clinical chemistry parameter and ranges obtained by each treatment were analyzed by Wilcoxon Signed Rank tests. Analyses of immunochemical markers were performed using twoway ANOVA with Bonferroni posttest. All described statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5.0. Significancesweresetata95%confidencelevel. RESULTS 1. Effects of orally administered matico extract on hemogramandclinicalchemistry. Throughout the entire treatment with the matico extract, all hemogram parameters remained unchanged and within normal (control) ranges, as assessed by Wilcoxon Signed Rank tests (p>0.05). Table 2 summarizes these findings, including hemogram data found at the end of each study. Most clinical chemistry parameters also remained unchanged throughout all treatments (p>0.05). These data aresummarizedinTable3,whichincludesresultsobtained at the end of each study. According to Wilcoxon Signed Rank tests, plasma lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (GOT) were significantly decreased (p<0.05, Table 3) following treatment with the maticoextract. 2. Woundhealingstudy 2.1. Macroscopic observations and tissue morphology. Macroscopic progression of the wound healing process during the 7day protocol employed is shown in Figure 1. Woundhealingofanimalstreatedtopicallywiththematico extract appears to progress at a higher speed than that of untreated animals (Figure 1). Skin biopsies were obtained at different stages of the protocol for histomorphological and immunohistochemical analyses in order to further assessdifferencesbetweenuntreatedandtreatedanimals. Figure 2 shows hematoxylineosin staining daily images of skin biopsies. This staining demonstrated that there is a significant increase in fibroblast infiltration in the animals treated topically with the extract (arrowheads in Figure 2). This leads to an acceleration of the wound healing that is evidentevenatthefirstdayoftheprocess.

Table1.Characterizationofthematicoextract

2.2.Immunohistochemicalanalyses. We used COX2 as an inflammation marker and Ki67 as a proliferationmarker.Toevaluatechangesinlevelsofthese markers, the values displayed at 400m from the wound area (distal) were used as basal expression levels. Figure 3 (COX2) and Figure 4 (Ki67) show the difference in expressionbetweentheproximal(atthewound)anddistal areas. COX2 levels displayed a peak that was reached at 24 hours following wounding the animals undergoing treatment with the matico extract. This COX2 peak was reached at 48 hours in the case of animals without treatment (Figure 3). Noteworthy, COX2 levels at the end ofthestudywiththematicoextractwassignificantlylower (p<0.05) than that of untreated animals (p<0.05). Figure 4 shows that Ki67 positive nuclei also display peaks at 24 and 48 hours for treated and untreated animals, respectively. Finally, we measured epidermis thickness in animalstreatedornotwiththematicoextract.Asshownin Figure5,thicknessoftheepidermallayerincreasedintime following wounding of the animals, reaching a maximum after 2 or 3 days in the cases of treated or untreated animals,respectively.

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Table2.Hemogramdatafollowingtreatmentofrats withastandardizedmaticoextract.

Table3.Clinicalchemistrydatafollowingtreatmentofrats withastandardizedmaticoextract.

Data were obtained from blood samples of 412 rats per group following treatment of animals with the matico extract for 12 days, as detailed in Material and Methods. Ranges presented correspond to the 95% confidenceintervalsforeachparameter.RBC:Redbloodcells;MCV:mean corpuscular volume; MCH: mean corpuscular hemoglobin; MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration; ESR: erythrocyte sedimentation rate.pvalueswereobtainedfromWilcoxonSignedRankanalysesforeach parameter. Data were obtained from serum samples of 412 rats per group following treatment with the extract for 12 days, as detailed in Material and Methods. Ranges presented correspond to the 95% confidence intervals for each parameter. AP: alkaline phosphatase; LDH: lactate dehydrogenase;GOT:aspartateaminotransferase.pvalueswereobtained from Wilcoxon SignedRank analyses for each parameter. *p<0.05 comparedtocontrol.

DISCUSSION In order to propose the use of an herbal extract as a therapeuticstrategy,severalstepsmustbetakentoensure the safety and efficacy of such extract. Matico extracts have been widely used by Chilean traditional medicine in antiinflammatory and wound healing therapies. We have standardized a hydroalcoholic extract from matico leaves, in terms of total polyphenol content. This extract displays reproducibleantioxidantpropertiesinbiologicalsystemsin vitro,aswehavepreviouslydescribed(6). The present work was aimed to establish the safety of oral treatment with this matico extract, using an acute toxicity rat model. To this end, we assessed general animal homeostasis, by evaluating hemogram and clinical chemistry at different stages of a 12day treatment. Noteworthy, we used a high dose of extract (55.2mol equivalents of catechin/Kg/day), considering proprietary informationfromthemanufacturer.

This treatment led to negligible changes in general homeostasis, with the exception of a decrease in plasma activities of LDH and GOT. These activities are usually considered as markers of hepatic damage, due to their release to the blood stream from damaged tissue. Thus, their decrease may be the consequence of hepatoprotection provided by this matico extract. It is possible this protection is the result of the antioxidant activity of this extract, as it has been shown for other herbal extracts displaying activities as hepatoprotectors (16,17).Wearecurrentlytestingthishypothesis. We also assessed whether the matico extract retained its therapeutic properties. To this end, we evaluated its wound healing properties in a rat model when topically administered. We found no evident adverse effects on the skin of animals topically treated with the extract. Moreover, the extract led to acceleration of the wound healing process that was evident not only macroscopically but also in terms of tissue morphology, and inflammation and proliferation markers. Taken together, our data show that the hydroalcoholic matico extract most likely led to the acceleration of the inflammatory phase, which was accompanied with an acceleration of the proliferation
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phase of wound healing. This process may be associated with the redox state of the skin tissue, since defects in wound repair of skin tissue, usually leading to keloid formation, have been associated to excessive or uncontrolled oxidative stress (18). Our data show that untreated animals displayed delayed wound repair, as

assessed by measuring epidermal thickness. Taken together, these results may indicate that the antioxidant nature of the matico extract is likely minimizing oxidative stress processes during wound healing, which leads to a fasterrepairoftheskin.

Figure1.Effectofthematicoextractonthemacroscopicprogressionofskinwoundhealing.

Animals subjected to a skin wound protocol were treated topically with the standardized matico extract in three daily doses, as detailed in Material and Methods.Representativephotoimages(n=4)ofuntreated(toprow)andtreated(bottomrow)animalsareshown,takenatthebeginning(Initial)and2or7days ofthetreatment.

In summary, the standardized hydroalcoholic matico extract was found to be safe and retained its wound healing properties in a rat model. The extract appears to be safe when orally or topically administered, even at a dose higher than that recommended by the manufacturer. Thisisofparticularrelevanceforherbalextracts,whichare mainly administered either orally or topically in traditional

medicine. Moreover, it is very possible that the mechanisms underlying these properties are associated to its high content of polyphenols, compounds of acknowledged antioxidant activity. This local effect of the matico extract can be exploited for the treatment other conditions for which matico extracts have been employed formillennia,suchasalocalantiinflammatoryagent.

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Figure2.Effectofthematicoextractontheskintissuemorphologyduringtheprogressionofwoundhealing.

Skin biopsies from animals subjected to the wound healing protocol were stained with hematoxylineosin for analysis of tissue morphology, as detailed in Material and Methods. Representative images (n=4) of untreated (top row) and treated (bottom row) of stained biopsies are shown, at different stages of the treatment,asdepictedatthetop.Arrowheadsindicatethesiteswerecellularproliferationcanbeobservedatthewoundregion.

Figure3.EffectofthematicoextractonskinCOX2levelsduringthe progressionofwoundhealing. Figure4.EffectofthematicoextractonskinKi67levelsduringthe progressionofwoundhealing.

Skin biopsies were obtained at different stages of the wound healing protocol and stained with a COX2 antibody, as detailed in Material and Methods. Presenceof COX2positivecells was recorded atthe wound site (proximal region) or at 400 m from the wound site (distal region). Data represent the fold change in the difference of COX2 positive cells (proximalminusdistalregions),consideringthedifferenceobservedatthe beginningofthetreatmentastheunit.Datacorrespondtothemeanofat least 4 independent experiments SEM. *p<0.05 compared to samples from untreated animals, as evaluated by twoway ANOVA and Bonferroni posttest.

Skin biopsies were obtained at different stages of the wound healing protocol and stained with a Ki67 antibody, as detailed in Material and Methods.PresenceofKi67positivenucleiwasrecordedatthewoundsite (proximal region) or at 400 m from the wound site (distal region). Data represent the fold change in the difference of Ki67 positive nuclei (proximalminusdistalregions),consideringthedifferenceobservedatthe beginningofthetreatmentastheunit.Datacorrespondtothemeanofat least 4 independent experiments SEM. *p<0.05 compared to samples from untreated animals, as evaluated by twoway ANOVA and Bonferroni posttest.

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Figure5.Effectofthematicoextractonepidermalthicknessduringthe progressionofwoundhealing.

5. LETELIER ME, CORTES JF, LEPE AM, JARA JA, MOLINABERRIOS A, RODRIGUEZCetal.Evaluationoftheantioxidantpropertiesandeffects on the biotransformation of commercial herbal preparations using rat liver endoplasmic reticulum. Bol Latinoam Caribe Plantas Med Aromat. 2009;8:110120. 6. LETELIER ME, MOLINABERRIOS A, CORTESTRONCOSO J, JARA SANDOVAL J, HOLST M, PALMA K et al. DPPH and oxygen free radicals asprooxidantofbiomolecules.ToxicolInVitro2008;22:279286. 7. DE LA VILLEHUCHET AM, BRACK M, DREYFUS G, OUSSAR Y, BONNEFONTROUSSELOT D, CHAPMAN MJ et al. A machinelearning approach to the prediction of oxidative stress in chronic inflammatory disease.RedoxRep.2009;14:2333. 8. BACKHOUSE N, DELPORTE C, APABLAZA C, FARIAS M, GOITY L, ARRAU S, et al. Antinociceptive activity of Buddleja globosa (matico) in several modelsofpain.JEthnopharmacol.2008:119:160165.

Skin biopsies were obtained at different stages of the wound healing protocol and stained with hematoxylineosin, as in Figure 2. Data represent the fold change in the difference skin thickness (proximal minus distalregions),consideringthedifferenceobservedatthebeginningofthe treatment as the unit. Data correspond to the mean of at least 4 independent experiments SEM. *p<0.05 compared to samples from untreated animals, as evaluated by twoway ANOVA and Bonferroni post test.

9. HOUGHTON PJ. Ethnopharmacology of some Buddleja species. J Ethnopharmacol.1984;11:293308. 10. LIAO YH, HOUGHTON PJ, HOULT JR. Novel and known constituents from Buddleja species and their activity against leukocyte eicosanoid generation.JNatProd.1999;62:12411245. 11. MENSAH AY, HOUGHTON PJ, BLOOMFIELD S, VLIETINCK A, VANDEN BERGHE D. Known and novel terpenes from Buddleja globosa displaying selective antifungal activity against dermatophytes J Nat Prod.2000;63:12101213. 12. MENSAH AY, SAMPSON J, HOUGHTON PJ, HYLANDS PJ, WESTBROOK J, DUNN M et al. Effects of Buddleja globosa leaf and its constituents relevanttowoundhealing.JEthnopharmacol.2001;77:219226. 13. PARDOF,PERICHF,VILLARROELL,TORRESR.Isolationofverbascoside, an antimicrobial constituent of Buddleja globosa leaves. J Ethnopharmacol.1993;39:221222. 14. VOGEL H, RAZMILIC I, POLANCO X, LETELIER ME. Effect of different provenances and production conditions on antioxidant properties in Buddleja globosa leaves. Bol Latinoam Caribe Plantas Med Aromat. 2010;9:333342. 15. VOGEL H, JELDRES P, RAZMILIC I, DOLL U. Morphological characters, yields and active principles in wild and cultivated accessions of the Chilean medicinal plant Buddleja globosa Hope. Indust Crops Prod. 2011;34:13221326. 16. VOGEL H, GONZALEZ M, FAINI F, RAZMILIC I, RODRIGUEZ J, MARTIN JS et al. Antioxidant properties and TLC characterization of four Chilean Haplopappusspecies known as bailahuen. J Ethnopharmacol. 2005; 97:97100. 17. TUREL I, OZBEK H, ERTEN R, ONER A, CENGIZ N, YILMAZ O. Hepatoprotective and antiinflammatory activities of Plantago major L. IndianJPharmacol.2009;41:120124. 18. BLAI TM, BRAJAC I. Defective induction of senescence during wound healing is a possible mechanism of keloid formation. Med Hypotheses. 2006;66:649652.

ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by the Agricultural Innovation Fundgrant#FIAESC20051A042. Theauthorsdeclarenoconflictsofinterest. REFERENCES:
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ARTCULOORIGINAL

USODEMODELOSANIMALESENELESTUDIODEPLANTASMEDICINALESCONPROPIEDADES ANSIOLTICASYANTIDEPRESIVAS. (Theuseofanimalmodelsinthestudyoftheanxiolyticandantidepressantpropertiesof medicinalplants)

GabrielaDazVliz,M.Sc.,M.Ed.ySergioMora,Q.F.

LaboratoriodeFarmacologadelComportamiento.ProgramadeFarmacologaMolecularyClnica,InstitutodeCienciasBiomdicas,Facultadde Medicina.UniversidaddeChile.

RESUMEN

Lalimitadaeficaciadelosfrmacosactualmenteenusoparatrataralgunostrastornosdeansiedadydepresinhadespertadoel inters en la bsqueda de nuevas herramientas teraputicas en el campo de las plantas medicinales, usadas como tales en le medicina popular. En el presente trabajo se evaluaron las propiedades tipo ansioltico y/o tipo antidepresivo de tres plantas autctonas de Latinoamrica, recurriendo a la aplicacin de modelos de ansiedad y depresin en ratas. La administracin intraperitoneal de Annona muricata provoc efectos ansiolticos y antidepresivos, Salvia elegans produjo efectos sedantes y antidepresivos, mientras que Acantolippia deserticola demostr propiedades ansiolticas. Los resultados permiten validar el uso populardelasplantasestudiadas.

PalabrasClaves:ansiedad,depresin,plantasmedicinales,modelosanimales,laberintoencruzelevado,natacinforzada.
PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCCIN La ansiedad y la depresin son consideradas estados emocionalesnormalesquecontribuyenalaadaptacinyla supervivencia. Sin embargo, constituyen tambin los trastornos psiquitricos ms frecuentes en la poblacin. Se estima que ms del 20% de los adultos sufren de estos trastornosenalgnperiododesusvidas(Buller,B.,2001). La Organizacin Mundial de la Salud (WHO, 1999) ha predichoque,enelao2020,ladepresinseconvertiren la segunda causa de muerte prematura o incapacidad laboral. A mediados del siglo XX, gracias a numerosos descubrimientos cientficos, fue posible disponer de frmacos de accin ms selectiva sobre ansiedad y depresin patolgicas, lo cual permiti mejorar significativamente la calidad de vida de los pacientes psiquitricos.

Sin embargo, despus del gran entusiasmo original, la medicina basada en evidencia se ha enfrentado a muchas desilusiones. Aproximadamente dos tercios de los pacientes ansiosos o deprimidos responden a los tratamientos disponibles en la actualidad aunque la magnitud de la mejora no siempre es satisfactoria. En los ltimos 20 aos no se han obtenido frmacos ms eficaces que las benzodiacepinas o los antidepresivos inhibidores selectivosdelarecaptacindeserotonina. En el campo del tratamiento de la ansiedad, las benzodiacepinas, usadas como tratamiento de primera eleccin en estados de ansiedad aguda, fallan en estados de ansiedad crnica y han sido paulatinamente desplazadas por los antidepresivos que no solo son eficaces en el tratamiento de la depresin sino que tambin en el tratamiento a largo plazo de trastornos de ansiedad.

Correspondencia a: Gabriela DazVliz, Laboratorio de Farmacologa del Comportamiento. Programa de Farmacologa Molecular y Clnica, Instituto de Ciencias Biomdicas, Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Av. Salvador 486, telfono 2741560, fax 2741628, email gdiaz@med.uchile.cl

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Debido a la limitada eficacia, acompaada de numerosas reacciones adversas, de los frmacos ansiolticos y antidepresivos actualmente en uso, ha surgido la necesidad de desarrollar medicamentos ms nuevos, ms eficaces y mejor tolerados. Esto ha llevado a que, en los aos recientes, se haya reactivado el inters en los productos herbarios como medicinas alternativas o complementarias en el tratamiento de trastornos psiquitricos. Existe la sensacin que algunas de las drogas naturales que fueron injusta e innecesariamente desechadas han vuelto lentamente (Babic, D., 2007). La medicina popular de muchas regiones del mundo ha recurrido desde siempre a las plantas medicinales para aliviar trastornos afectivos o emocionales. Adems, la bsqueda y desarrollo de nuevas terapias de trastornos psiquitricos basadas en plantas medicinales ha progresado significativamente en las ltimas dcadas (Zhang,Z.J.,2004).Estosehavistoreflejadoenelcreciente nmerodeproductosherbceosquehansidointroducidos en la prctica psiquitrica y en el gran nmero de plantas medicinales cuyo potencial teraputico ha sido demostrado en una variedad de modelos experimentales de psicopatologas (Zhang, Z.J., 2004). La utilizacin de los modelos animales ha servido no solo como mtodo de tamizaje de plantas potencialmente eficaces y seguras, sinoquetambinpermitevalidarcientficamenteelusoen medicinapopulardeestosproductos. En nuestro laboratorio de Farmacologa del Comportamiento, hemos estado interesados en verificar las potenciales propiedades ansiolticas y/o antidepresivas de plantas medicinales autctonas de Latinoamrica, recurriendo a la aplicacin de modelos animales previamente validados en la literatura cientfica. En el presenteestudiosemuestranlosresultadosobtenidoscon tres extractos hidroalcohlicos de plantas de diferente procedencia geogrfica: Annona muricata (Costa Rica), Salviaelegans(Mxico)yAcantholippiadesertcola(Chile). MATERIALESYMTODOS 1.Plantasempleadas: 1.1. Annona muricata (Annonaceae), guanabana o graviola, es un rbol de hoja perenne endmico del Caribe, Mxico, Centro y Sudamrica, estrechamente relacionado con la chirimoya. En los ltimos aos, el extracto de guanbana ha sido ampliamente aclamado como posible agente anticancergeno (Monografa Graviola). Recientes estudios apoyan los efectos antitumorognicos y antimetastsicos de esta planta (Torres, M.P., 2012; George, V.C., 2012). Los frutos y las hojas de Annona muricata son usados en medicina tradicional por sus propiedades tranquilizantes y sedantes.

Adems, se ha sugerido que el fruto de esta planta posee efectos antidepresivos posiblemente inducidos por alcaloides isoquinolnicos agonistas de receptores 5HT1A (Hasrat,J.A.,1997). 1.2 Salvia elegans (Lamiaceae), mirto, perritos rojos, limoncillo o flor del cerro, es un arbusto perenne nativo de Mxico ampliamente usado en medicina tradicional. Sus partes areas se emplean para aliviar trastornos del sistema nervioso central y se le denomina como tnico del sistema nervioso para liberar estrs y tensin(Aguilar,A.,1994). 1.3 Acantholippia desertcola (Verbenaceae), ricarica, es un arbusto menor muy aromtico que crece abundantementeenelnortedeChile(28004000msm).En los pueblos altiplnicos (San Pedro de Atacama, Toconao, Socaire) se utilizan sus ramas y hojas para tratar dolores estomacales, problemas renales y trastornos circulatorios (MHT). Diversas especies del genero Acantholippia han sido usados en medicina popular por sus efectos analgsicos, antiinflamatorios y afrodisiacos (Gmez, R., 1991). Estudios preliminares sugieren propiedades ansiolticas del infuso de A. desertcola y de sus aceites esenciales(Leoncini.,R.,2006). 2. Animales: En los experimentos conductuales se utilizaron ratas Sprague Dawley machos (200250 g de peso) procedentes del Bioterio del Programa de Fisiopatologa,ICBM,FacultaddeMedicina,Universidadde Chile. Estos animales fueron mantenidos en grupos de 6 por caja con libre acceso a comida y agua, temperatura de 22 1 C y ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas. El protocolo experimental fue aprobado por el Comit de Biotica en Investigacin Animal de la Facultad de Medicina, UniversidaddeChile. 3. Tratamiento:Los extractos liofilizados de A. muricata, S. elegans y A. desertcola fueron disueltos en agua bidestilada y administrados a las ratas por va intraperitoneal (ip) en dosis de 12,5, 25 y 50 mg/kg. Diazepam, 1 mg/kg ip, fue usado como ansioltico de referencia (control positivo), mientras que fluoxetina, 10 mg/kg ip, e imipramina, 12,5 mg/kg ip, fueron utilizados como antidepresivos de referencia. Se administr agua bidestilada(1ml/kg)comocontrolnegativo. 4.Ensayosconductuales 4.1 Monitoreo de la actividad motora espontnea. El registrodelaactividadmotoraespontneaesfundamental para tener una primera aproximacin de los eventuales efectos conductuales de una droga desconocida. Esto permite evaluar la respuesta del animal al ser expuesto a un ambiente desconocido donde, segn el tratamiento o estado basal, puede desarrollar hipo o hipermotilidad.
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Treinta minutos despus de la inyeccin ip, cada rata fue colocada en una caja de acrlico transparente (30 cm x 30 cmx30cm)alinteriordeunacmaraaisladadesonido.La cajasecolocsobreunaplataformadeactividad(Lafayette Instruments Co., USA) conectada a un amplificador y un contador electromecnico que registraba la motilidad total del animal. El periodo de observacin total fue de 30 min, duranteelcualseanotlaconductacada5minparatener un registro de la evolucin de la actividad motora a travs del tiempo. Los resultados se expresan como numero de cuentasdurantelos30mindeobservacin. 4.2ModeloAnimaldeAnsiedadlaberintoencruzelevado. Este ensayo ha sido ampliamente validado para medir ansiedad en roedores (Pellow S., 1985; Lister, R.G., 1987). Se basa en la aversin que sienten estos animales por los espacios abiertos y en altura. Se utiliza un aparato en forma de cruz, formado por dos brazos abiertos (50 cm x 10cm),dosbrazoscerrados(50 cmx10cmx40cm)yuna plataforma central (10 cm x 10 cm), dispuesto de tal manera que los brazos del mismo tipo se oponen entre si. El laberinto, construido en acrlico negro, est situado a unaalturade70cmdesdeelpiso.Unahoradespusdela inyeccin ip, cada animal fue colocado en el centro del laberinto, enfrentado a uno de los brazos cerrados. Durante 5 minutos se registra el nmero de entradas a los brazos abiertos y cerrados del laberinto y el tiempo de permanencia en cada uno de estos brazos (Pellow, S., 1986).Laentradaacadabrazosedefinecomoelmomento en que el animal coloca las cuatro patas en el brazo respectivo. Los resultados se expresan como porcentaje de entradas a los brazos abiertos y porcentaje de tiempo de permanenciaenestosbrazos.Elaumentodelaexploracin y la mayor permanencia en los brazos abiertos se consideran como reflejo de una actividad farmacolgica tipoansioltica. 4.3 Modelo Animal de Depresin de Natacin Forzada. Este es, probablemente, el modelo farmacolgico ms utilizado para evaluar actividad antidepresiva (Cryan, J.F., 2002). Se basa en el principio de la desesperanza aprendida, que establece que todo organismo que es sometidoauneventoestresantequenopuedecontrolary del cual no puede escapar desarrolla, inicialmente, ansiedad y posteriormente, si el evento se mantiene en el tiempo, depresin. Cuando los roedores son colocados en un cilindro con agua, al cabo de cierto tiempo desarrollan inmovilidad la cual reflejara la cesacin de la conducta orientada al escape. El mtodo fue originalmente desarrollado por Porsolt (1977) y modificado por Lucky (1997). El aparato consiste en un cilindro de acrlico transparente (50 cm de alto x 20 cm de dimetro) que se completa hasta los 30 cm de altura con agua a temperatura ambiente (25C). Habitualmente el ensayo se realiza en dos das; durante el primero, se realiza el entrenamiento o aprendizaje, en el que cada animal es

colocado durante 15 minutos en el cilindro, 24 horas antes del ensayo de natacin. La droga a ensayar se administra entresocasiones:inmediatamentedespusdelperiodode entrenamiento de 15 minutos, 6 y 0,5 horas antes del ensayo de natacin. Este ltimo tiene una duracin de 5 minutos, tiempo en el cual un observador entrenado mide la duracin en segundos de la conducta de escalamiento, definida como el movimiento hacia delante de las patas anteriores sobre las paredes de la cmara, la conducta de natacin, definida como el movimiento de desplazamiento en la cmara de natacin, incluyendo el cruce de un cuadrante a otro y la inmovilidad, considerada cuando el animal no hace mayores intentos por escapar, excepto los movimientos necesarios para mantener el hocico fuera del agua. Los resultados se expresan en trminos de porcentajes de tiempo gastados en escalamiento, natacin e inmovilidad. Los aumentos en la duracin de las conductas activas, escalamiento y natacin, y la consiguiente disminucin del tiempo de inmovilidad son consideradoscomoperfilesconsistentesconunefectotipo antidepresivo(Cryan,J.F.,2002). 5. Estadstica: Los datos se expresan como el promedio error estndar (ES) de 8 a 11 ratas por cada dosis inyectada. Las comparaciones estadsticas entre grupos se hicieron aplicando un ensayo de ANOVA seguido del ensayo a posteriori de NewmanKeuls. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando p fue igual o menorde0,05.
Tabla1.Actividadmotoraespontnea

Los datos corresponden al promedio ES de 811 ratas en cada dosis inyectada. * p<0,001 comparado con los controles inyectados con agua (ANOVAseguidodeNewmanKeulsparacomparacionesmltiples).

RESULTADOS Actividad motora espontnea: En la Tabla 1 se muestran los efectos de la administracin de los extractos de A. desertcola, A. muricata y S. elegans, sobre la actividad motora espontnea de la rata, comparada con el solvente (aguabidestilada).TodaslasdosisdeS.elegansprodujeron una significativa disminucin de la actividad motora sin que se estableciera una relacin dosis efecto. Por su parte, los extractos de A. desertcola y A. muricata solo produjeron una disminucin significativa de la motilidad conlaadministracindeladosismsalta(50mg/kg).
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Exploracindellaberintoencruzelevado:Enlafigura1se presentan los efectos de A. Muricata y A desertcola en el ensayo del laberinto en cruz elevado (LCE). Ambos extractos aumentaron la exploracin y la permanencia en los brazos abiertos del LCE. Todas las dosis administradas produjeron efectos significativos sobre estos parmetros conductuales y no se apreciaron diferencias significativas con respecto a los efectos inducidos por diazepam 1 mg/kg. Respecto al extracto de S. elegans, ste no indujo efectossignificativossobrelaexploracindelLCE.
Figura1.

Ensayodenatacinforzada:EnTabla2sepuedenapreciar los efectos de los extractos de las plantas estudiadas, fluoxetina e imipramina sobre la duracin de las conductas activas, escalamiento y natacin, y sobre el tiempo de inmovilidadenelensayodenatacinforzada.Losextractos de A. muricata y S. elegans produjeron una disminucin significativadeltiempodeinmovilidad,demanerasimilara fluoxetina e imipramina, acompaada de un aumento significativo de la conducta de natacin, semejante al inducido por fluoxetina. La conducta de escalamiento, que aument con imipramina, no fue modificada significativamente por ninguno de los extractos. Adems, se observa que el extracto de A. desertcola no produjo efectos significativos sobre ninguna de las conductas relacionadasconelensayodenatacinforzada.
Tabla2.Ensayodenadoforzadoparaevaluarefectoantidepresivo.

Ensayo de Laberinto en Cruz Elevado para evaluar efecto ansioltico. Efecto de los extractos de plantas y diazepam sobre el porcentaje de entradas a los brazos abiertos del laberinto y sobre el porcentaje de tiempodepermanenciaenellos.LosdatoscorrespondenalpromedioES de 811 ratas en cada dosis inyectada. * p<0,05 comparado con los controles inyectados con agua (ANOVA seguido de NewmanKeuls para comparacionesmltiples). Los datos corresponden al promedio ES de 811 ratas en cada dosis inyectada. * p<0,05 comparado con los controles inyectados con agua (ANOVAseguidodeNewmanKeulsparacomparacionesmltiples).

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DISCUSIN En el presente estudio se investigaron los efectos de tres extractos de hojas provenientes de plantas autctonas de Latinoamrica utilizadas en medicina popular por sus propiedades tranquilizantes y antidepresivas, Annona muricata,AcantholippiadesertcolaySalviaelegans. Los resultados del monitoreo de la actividad motora espontnea mostraron marcados efectos depresores en ratas, despus de la administracin aguda de dosis nicas de 12,5, 25 y 50 mg/kg del extracto de S. elegans, demostrando el notable efecto sedante de esta planta. En cambio, los extractos de A. desertcola y A. muricata disminuyeron significativamente la motilidad solo con la dosismsaltautilizada,esdecir50mg/kg. A pesar de sus significativos efectos sedantes, el extracto de S. elegans no demostr efectos tipo ansioltico en el modelo del laberinto en cruz elevado, mientras que los extractos de A. muricata y A. desertcola aumentaron significativamentetantolasentradascomolapermanencia en los brazos abiertos del laberinto aun luego de dosis que carecan de efecto depresor sobre la actividad motora. Estos datos sugieren que el modelo animal de ansiedad utilizado en este estudio, el laberinto en cruz elevado, es capaz de discriminar entre efectos sedantes y ansiolticos. Desconocemos el mecanismo por el cual se producen los efectos ansiolticos de estas plantas; sin embargo, considerando que el laberinto en cruz ha demostrado ser un buen modelo para evaluar ansiolticos benzodiacepnicos, como diazepam, podramos sugerir la mediacindelaminocidoGABAendichosefectos. El modelo de depresin utilizado en este trabajo, la natacin forzada, permiti identificar efectos tipo antidepresivo luego de la administracin de los extractos de A. muricata y S. elegans. Todas las dosis de ambos extractos disminuyeron el tiempo de inmovilidad y, simultneamente, aumentaron la conducta de natacin sin afectarlaconductadeescalamiento.Elperfildelosefectos conductuales de los extractos en el ensayo de natacin forzada es compatible con el perfil del antidepresivo de referencia fluoxetina. En efecto, tal como haba sido observado anteriormente (Page M.E. 1999), la disminucin de la inmovilidad inducida por fluoxetina era acompaada por un aumento de la natacin, mientras que la conducta de escalamiento no fue afectada por esta droga. Se ha demostrado que la natacin en la rata es una conducta sensible a frmacos serotoninrgicos, tales como fluoxetina, inhibidor selectivo de la recaptacin de serotonina.Encambio,laconductadeescalamientoesms sensible a frmacos con accin selectiva sobre la transmisin catecolaminrgica, tales como los antidepresivos tricclicos del tipo imipramina (Detke, M.J., 1995; Cryan, J.F., 2000). En consecuencia, el modelo de

natacin forzada permite sugerir la participacin de mecanismos serotoninrgicos en los efectos tipo antidepresivos de A. muricata y S. elegans, aunque, obviamente, se requieren otro tipo de estudios para confirmar este mecanismo de accin. En nuestro laboratorio hemos demostrado los posibles efectos antidepresivos de otras plantas aplicando el mismo ensayo de natacin forzada. Por ejemplo Casimiroa edulis (Rutaceae)cuyoefectoantiinmovilidadvaacompaadode aumento del escalamiento y no de la natacin (Mora, S., 2005a)yAloysiapolystachya(Verbenaceae)que,juntocon disminuir la inmovilidad, aumenta la duracin de las dos conductas activas, escalamiento y natacin (Mora, S., 2005b). En conclusin, la aplicacin de modelos animales nos ha permitido identificar las propiedades psicotrpicas de tres plantas medicinales de uso muy frecuente en la poblacin y, en consecuencia, validar en forma objetiva su uso en el tratamiento de trastornos emocionales como la ansiedad y la depresin. Salvia elegans parece poseer potentes efectos sedantes y antidepresivos, mientras que, Acantholippia desertcola demostr interesantes propiedades tipo ansioltico en dosis que no provocan sedacin y, finalmente, Annona muricata result activa como ansioltico y como antidepresivo, incluso en dosis que no deprimen la actividad motora. Sin duda, se requieren mayores estudios preclnicos para confirmar o extender estos resultado y para evaluar el riesgo de potencialesreaccionesadversasenhumanos. Enlaliteraturacientficasehandescritonumerosasplantas usadas en medicina popular como ansiolticos o antidepresivos. Adems, un porcentaje importante de la poblacin recurre a estos productos para aliviar sntomas psiquitricos con la creencia que por ser naturales son alternativas ms seguras que los medicamentos psicotrpicos comnmente usados. Sin embargo, las plantas pueden producir reacciones adversas potencialmente graves o interactuar con otros medicamentos. Probablemente, con la excepcin del Hypericum perforatum (hierba de San Juan) para tratar la depresin, Ginkgo biloba, utilizado para deterioros orgnicos cerebrales y Piper methysticum (Kavakava), usado como ansioltico, se considera que la actual evidencia cientfica es insuficiente para asegurar la eficacia y la seguridad en las dems especies informadas (Medina E.). En muchos casos se continan realizando investigaciones farmacolgicas y clnicas que deberan aumentar nuestro conocimiento en este mbito y permitirn obtener nuevas herramientas teraputicas que substituyan o complementen los frmacos actualmente en uso para tratar los trastornos psiquitricos. Quizs, en un futuro no tan lejanos, el uso de plantas medicinales en Psiquiatranoservistocomoalgoexcepcional.
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ARTCULOORIGINAL

ESTUDIODEUNEXTRACTOESTANDARIZADODEMAQUIRICOENDELFINIDINASENEL MANTENIMIENTODELBALANCEDEGLUCOSA. (StudiesofastandardizedextractofMaquifruitrichindelphinidinsinthemaintenanceof glucosebalance)

1 1 EvelynJara ,Ph.D,JorgeHidalgo ,M.D.,CarlosFlores2,Ph.D,MoissPrez3B.Q.,Alejandro Yez3,Ph.D,AnglicaHidalgo1,Ph.D,LuisQuiones4,Ph.D,JuanLuisHancke1,Ph.D,Rafael Burgos1,M.V.,M.Sc

InstitutodeFarmacologayMorfofisiologa,UniversidadAustraldeChile,Valdivia,Chile. CentrodeEstudiosCientficos(CECS),AvenidaArturo 3 4 Prat514,Valdivia5110466,Chile. InstitutodeBioqumicayMicrobiologa,UniversidadAustraldeChile,Valdivia,Chile. CQF,Centrode InvestigacionesFarmacolgicasyToxicolgicasICBM,FacultaddeMedicina,UniversidaddeChile,Santiago,Chile.

RESUMEN

Las antocianinas son polifenoles con actividad antioxidante, a las cuales se les ha atribuido una serie de actividades biolgicas beneficiosasparalasaludhumana,lascualesincluyenprevencinoreduccindelriesgodeenfermedadcardiovascular,diabetes mellitus (DM), artritis y cncer. En este trabajo se muestra que un extracto estandarizado de Maqui rico en delfinidinas, disminuye los niveles basales de glucosa sangunea despus de 4 meses de tratamiento en un modelo de ratas diabticas inducido por inyeccin de estreptozotocina (STZ). Igualmente, este extracto fue capaz de aumentar la sensibilidad a glucosa cuando fue sometido a evaluacin en una prueba de tolerancia a la glucosa en ratas diabticas. Adems, en un estudio piloto fase I, el extracto rico en delfinidinas disminuy la glucosa postprandial y la insulina en pacientes con tolerancia a la glucosa alterada, modificando la forma de las curvas de insulina y glucosa, sugiriendo su uso potencial para pacientes prediabticos, as comoenenfermedadesasociadasalmetabolismodecarbohidratos.Finalmente, delfinidina, laprincipalmolculapresenteenel extracto estandarizado de Maqui, inhibi el transporte de glucosa dependiente de sodio (Na+), lo cual explicara en parte la disminucindelaconcentracindeglucosasanguneaenratasdiabticasinducidasconSTZyenpacientesprediabticos.

PalabrasClaves:Antocianinas,DiabetesMellitus,TestdeToleranciaalaGlucosa.
PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCCIN

minerales, folato y fibra, sus propiedades biolgicas son principalmente debido al alto contenido de polifenoles presentes en ellas. stos, estn constituidos por flavonoides (antocianinas, flavonoles y flavonoides), taninas condensadas (proantocianidinas), taninas hidrolizables (elagitaninos y galotaninos) y cidos fenlicos [3]. Dentro de los polifenoles, son las antocianinas las cuales han demostrado poderosos efectos antioxidantes, anticarcinognicosyantiinflamatorios[47].

La investigacin sobre la composicin y actividad biolgica defrutasyvegetaleshaestablecidoquelaingestadestas posee un gran impacto sobre la salud humana, bienestar y la prevencin de varias enfermedades [1]. Estas ltimas incluyen enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y otras asociadas con envejecimiento, obesidad y ciertos tipos de cncer, como esofagial y digestivo [2]. Aunque muchas frutas y vegetales contienen micro y macro nutrientes que incluyen vitaminas,

Correspondencia a: Dra. Evelyn Jara, Laboratorio de Farmacologa Molecular, Instituto de Farmacologa, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile,P.O.Box567,Valdivia,Chile.CorreoElectrnico:jaraevelyn@gmail.comAbreviaciones:Estreptozotocina(STZ),DiabetesMellitus(DM),TestdeToleranciaOral alaGlucosa(OGTT)

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Los compuestos fenlicos presentes en berries son bien conocidos por su capacidad antioxidante [8]. De hecho, stos pueden regular la actividad de enzimas que metabolizan y modulan receptores nucleares, expresin gnica y vas de sealizacin, as como la reparacin del dao oxidativo del DNA [8,9]. Aunque las acciones de los berries han sido estudiadas in vitro, sus polifenoles son pobremente absorbidos [10,11]. Sin embargo, stos pueden ser metabolizados y convertidos por la microflora del colon en otras molculas relacionadas que pueden persistir in vivo y acumularse en los tejidos, contribuyendo entonces a los diferentes efectos biolgicos antes mencionados[12]. Aristotelia chilensis es una planta cuyo fruto es considerado un potente antioxidante natural [13]. A. chilensis se ubica geogrficamente desde la IV a la XI regin, hasta los 2.500 m.s.n.m., tambin en el archipilago de Juan Fernndez y Argentina. Habita en lugares con suelo rico en materia orgnica, siendo una especie colonizadora de lugares abiertos. Muchas veces forma comunidades puras las que reciben el nombre de macales. A. chilensis pertenece a la familia Elaeocarpaceae y es comnmente conocida como maqui, clon, queldron, y koelon. Esta fruta contiene ms pulpa que otras bayas de esta regin, y su sabor es descrito como astringente pero fresco. Tanto las hojas, como los frutos comestibles de A. chilensis se han utilizado para el tratamiento de diversas dolencias como dolor de garganta, lceras,fiebre,hemorroides,inflamacin,diarrea,lesiones, migraas y para la cura de cicatrices [14, 15, 16]. Los araucanos fabricaban chicha del jugo fermentado, el cual tambin era utilizado como elemento colorante para dar tinte a vinos. Durante los ltimos aos, se han realizado algunas investigaciones del fruto encontrndose en el jugo olafraccinfenlicapropiedadesantioxidantes,pudiendo ser til como antiaterognico [13]. Las antocianinas presentes en el fruto de maqui constituyen el 0.2% y han sido asociadas a una gran capacidad antioxidante. En el fruto han sido reconocidos ocho pigmentos correspondientes a 3glucsidos, 3,5diglucsidos, 3 sambubisidos y 3sambubisido5glucsidos de delfinidina y cianidina, siendo la principal antocianina delfinidina 3sambubisido5glucsido (34% de antocianinas totales). El promedio total de contenido de antocianinas es 137.6 +/ 0.4mg/100g de fruta fresca (211.9+/0.6mg/100gdefrutaseca)[17]. El jugo de maqui puede inhibir la oxidacin de la lipoprotena de baja densidad (LDL) y proteger a las clulas endoteliales contra el estrs oxidativo intracelular, siendo considerado til como antiaterognico [13]. Extractos metablicos de los frutos de maqui, han mostrado un efecto protector preventivo en estudios in vivo de isquemia/reperfusin en corazn de ratas, que se atribuye a la reduccin de la oxidacin lipdica y estrs oxidativo

[18]. Recientemente, la administracin oral de antocianinas y delfinidina 3sambubisido5glucsido, redujeron de manera dosis dependiente los niveles de glucosa sangunea en ayunas en un modelo de ratones obesos C57BL/6J, y disminuy la produccin de glucosa en clulas de hgado de rata. El compuesto puro tambin fue capaz de incrementar la captacin de glucosa en miotubos L6[19]. En el presente artculo, describimos el efecto de un extracto estandarizado de Maqui, conteniendo un 25% de delfinidinas totales en el mantenimiento del balance de glucosa en un modelo de ratas diabticas y pacientes prediabticos. MATERIALESYMTODOS 1. ExtractodeMaqui El extracto de Maqui (Aristotelia chilensis) fue fabricado y proporcionado por Indena SpA, Italia. El extracto fue estandarizado aun mnimo de 35% de antocianinas totales y un 25% de delfinidinas totales. Delfinidina (>98%) fue obtenidadesdeExtrasynthase(Lyon,France). 2. Estudiosenanimales 2.1 InduccindediabetesporinyeccindeSTZ: La diabetes fue inducida mediante una inyeccin nica de STZ(Calbiochem,Darmstadt,Germany)disueltaentampn citrato (pH 4.5) en una dosis de 55 mg/Kg en Rattus norvegicus machos (250300 grs). Los animales controles normales(CN,n=5)fueronmantenidosenayunasdurante la noche e inyectados con tampn citrato como vehculo. Los animales diabticos fueron divididos en dos grupos. El Grupo I (n=5) fue analizado 16 semanas despus de la induccin de diabetes. El Grupo II fue estudiado despus de 16 semanas de inducida la diabetes y luego de la administracin de 20 mg/Kg (n=5) de extracto de Maqui. Todos los animales fueron alimentados con dieta estndar de laboratorio y agua ad libitum. Los animales fueron proporcionados por la Pontificia Universidad Catlica de Chile y fueron mantenidos en un ciclo de 12 horas luz oscuridada22C. 2.2. TestdeToleranciaalaGlucosa: ElTestdeToleranciaOralalaGlucosa(OGTT)fuerealizado 30minutosdespusdeltratamientoconextractodeMaqui enratascontrolesnormalesyenratasdiabticasinducidas porinyeccindeSTZ.Laglucosa(2,0g/kgdepesocorporal) fue administrada va inyeccin intraperitoneal despus de 12 hrs de ayuno. La glucosa sangunea fue determinada a los 0, 30, 60, 120 y 240 minutos despus del cambio de la concentracin de glucosa utilizando el mtodo enzimtico deglucosaoxidasa(Wienerlab)a490nm.
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3. Estudiosenhumanos Se utiliz un estudio aleatorio, doble ciego, controlado con placebo,quefueaprobadoporelComitdeticaCientfica del Servicio de Salud Metropolitano Occidente, Ministerio de Salud de Chile, incluyendo un seguro mdico para los pacientes en el Hospital Clnico de la Universidad de Chile, ProfesorJosJoaqunAguirre;HospitalSanJuandeDios.El estudio fue realizado en el Centro de Investigaciones Farmacolgicas y Toxicolgicas (IFT), de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile (www.ift.cl). Todos los pacientes participantes del estudio firmaron un consentimiento informado. Ninguno de ellos fue informado de su cdigo de grupo asignado. Los mdicos participantes del estudio no manejaron los productos y no conocieron el tratamiento asignado a cada paciente. Dos sobres conteniendo cada tratamiento por paciente fueron asignados: uno de ellos fue almacenado en caso de emergencia por el Centro de Investigaciones Farmacolgicas y Toxicolgicas, y otro por el Investigador principal. Los dos sobres permanecieron sellados hasta el dadelanlisisdelosdatos. 3.1.IntervencinyProcedimientos: Se reclutaron 12 pacientes voluntarios sanos que fueron divididos en 2 grupos, con edades entre 18 y 55 aos, que no recibieran ninguna terapia farmacolgica aguda ni crnica, un ndice de masa corporal (IMC) inferior a 30 Kg/m2,conglucosaplasmticaenayunas<110mg/dLyun TestdeToleranciaalaGlucosaalterado(110a125mg/dL), registrado luego de 120 minutos tras la administracin de 75 gramos de carbohidratos (cocinados con arroz grado 1) [2024]. Los pacientes con antecedentes de drogas y/o abuso de alcohol y fumadores (ms de 3 cigarros cada 7 das) fueron excluidos del estudio. Tambin fueron excluidos del estudio los pacientes que tomaban suplementos vitamnicos 7 das antes de la administracin de los productos de prueba, aquellos pacientes con un cambio reciente en sus hbitos alimenticios o de ejercicio, con terapia farmacolgica crnica o medicamentos que afectaran la actividad enzimtica heptica 28 das antes al inicio del estudio, pacientes con alergia a algn medicamento, con Diabetes Mellitus o hospitalizados durante los ltimos 60 das o con arritmia o cualquier insuficiencia renal crnica (creatinina sangunea > 1,5 mg/dL). Adems, fueron excluidos del estudio pacientes con alergia al man y almendras o con cualquier otra enfermedad crnica o limitante, incluyendo alcoholismo o con cualquier otra enfermedad o condicin que el mdico considerara en que el voluntario no cumpla con las condicionesparaparticiparenelensayo. Lospacientescumplieronloscriteriosdeinclusinyfueron divididos aleatoriamente en el grupo tratado con extracto de Maqui o placebo. La apariencia del producto de prueba

y el placebo fueron idnticos, siendo imposible su reconocimiento visual o a travs de su aroma. El xito del ensayo doble ciego fue validado antes de comenzar con el estudio en un grupo de 10 voluntarios. Al finalizar el tratamiento, se realiz una encuesta sencilla preguntando a los participantes del estudio si reconocan haber recibido elproductodepruebaoelplacebo. En cada sesin, los pacientes recibieron un vaso de agua (250 mL) conteniendo el placebo o 200 mg del producto disueltos en agua como dosis nica despus de un perodo de 12 h de ayuno. Posteriormente, los pacientes fueron cruzados en un segundo perodo y recibieron el producto contrario. Cada vez, los grupos tratados con el producto y el placebo recibieron una comida 30 minutos antes de su administracin (definida como una cantidad fija de 75 g de arroz blanco grado 1 cocido, preparado por un nutricionista).Elestudiofueconducidodurante4semanas. El perodo de lavado/intervalo de tiempo entre las diferentes administraciones fue de 6 das (Sesin 1 = Placebo; Sesin 2 = 200 mg extracto de Maqui). Los tratamientosyprocedimientosempleadosenlospacientes estuvieron en conformidad con los acuerdos internacionales[25]ylasbuenasprcticasclnicas[26]. En cada sesin se obtuvieron muestras sanguneas. La primera muestra fue tomada como lnea base, 10 minutos antes (tiempo10) del tratamiento con extracto de Maqui o placebo (tiempo 0); la segunda muestra fue tomada 15 minutos despus de la ingesta del producto (tiempo +15). La comida fue servida 30 minutos despus de la administracin de extracto de Maqui o placebo. La tercera muestra sangunea fue obtenida en el mismo momento (tiempo +30). A continuacin, las muestras de sangre fuerontomadasconsecutivamentealostiempos,+60,+90, +120 y +180 minutos despus de la administracin del producto o placebo. La glucosa sangunea fue medida en plasma por el mtodo enzimtico de GODPAP. Mientras tanto, la insulina fue medida por inmunoensayo (MEIA, Abbott). Las reacciones adversas fueron evaluadas por un mdico y todas las observaciones fueron registradas durante el tratamiento, las cuales fueron clasificadas como pocas,moderadasogravesenunformularioasignadopara cadapacienteconsuestadogeneraldesalud. 4.Manejoderatonesyaislamientodetejidos Los ratones C57Bl/6J fueron obtenidos desde Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Los ratones fueron mantenidos en el Centro Libre de Patgenos para ratones del Centro de Estudios Cientficos (CECS), Valdivia, Chile. Previoalosexperimentos,losratonestuvieronlibreacceso al agua y comida. Los animales fueron sacrificados por dislocacin cervical de acuerdo a las regulaciones de IACUC. El yeyuno fue separado, abierto longitudinalmente
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a lo largo del borde mesentrico y lavado con tampn fosfatosalino(PBS). 4.1.Absorcin electrognica de Dglucosa en yeyuno de ratn: Se montaron dos secciones de yeyuno de ratn en Cmaras de Ussing, los cuales fueron mantenidos en tampn Ussing NaCl, 120 mM; NaHCO3, 25 mM; KH2PO4, 0,8mM;MgCl2,1,2mM;CaCl2,1,2mM)suplementadocon 10 mM de Dglucosa en el lado seroso. La temperatura fue mantenida a 37C y la solucin fue constantemente gaseada con CO2 al 5%. Una vez que la preparacin entregunregistroestabledelosparmetroselctricos,se agreg 10 mM de Dglucosa al lado apical de la preparacin para estimular el transporte de Dglucosa acoplado a sodio (SGLT1). El efecto de delfinidina sobre el transporte de glucosa acoplado a sodio fue determinado por la aplicacin de esta molcula a una concentracin de 50 M en el lado mucoso de la preparacin. La diferencia de potencial elctrico transepitelial (Vm) fue registrada utilizando un amplificador VCC MC2 (Physiological Instruments).Losvaloresdecorrientedecortocircuito(Isc) y resistencia transepitelial (Rte) fueron calculados a partir de los datos experimentales utilizando la ley de Ohm [27]. LosresultadosfueronexpresadoscomolaintensidaddeIsc (A/cm2). 5.Estadstica Para establecer las diferencias entre los parmetros plasmticos de cada aplicado a los voluntarios, se realiz un test de varianza multifactorial (ANOVA) con una significancia estadstica de P0,05. Los parmetros de variacin considerados en el estudio fueron: producto administrado, perodo de administracin, secuencia y efecto residual. El protocolo sigui las recomendaciones y gua de la FDA, para el diseo y anlisis estadstico del estudio. RESULTADOS Extracto de maqui disminuye la hiperglicemia basal en ratasdiabticasdespusde4mesesdetratamiento. Recientemente, la atencin se ha centrado en los constituyentes de la dieta que pueden ser beneficiosos para la prevencin y el tratamiento de la diabetes. Aunque hay algunos frmacos que han sido utilizados como regmenes teraputicos para las enfermedades metablicasrelacionadasalaobesidad,haypocaevidencia de que los factores alimenticios propios puedan ser directamentebeneficiososparamodularlasensibilidadala insulina[28].

Nosotros observamos, que el extracto de Maqui rico en delfinidinas disminuy significativamente la concentracin basal de glucosa sangunea en ratas diabticas inducidas por inyeccin de STZ con respecto al grupo de animales control despus de 4 meses de tratamiento con una concentracin de extracto de Maqui de 20 mg/kg (Figura 1). La concentracin basal de glucosa disminuy aproximadamente 4 veces entre el grupo de ratas control (100,25 11,6 mg/dL) yel grupo de ratas diabticas (475 91,3 mg/dL). Por otra parte, las ratas del grupo control tratadasconextractodeMaquinopresentaroncambiosen laconcentracindeglucosasangunea(Figura1).
Figura1.ExtractodeMaquidisminuyelahiperglicemiabasalenratas diabticas.

Ratas diabticas inducidas con STZ fueron tratadas con 20 mg/Kg de extractodeMaquidurante4mesesylaconcentracindeglucosaensuero fue determinada mediante el mtodo de glucosa oxidasa. Los resultados sonelpromedioE.E.,n=5.*P<0.001.

Se realiz un Test de Tolerancia a la Glucosa, en el cual el extractodeMaquifueadministrado30minutosantesdela carga de glucosa (2,0 g/kg de peso corporal). En primer lugar, no se observaron cambios en la concentracin de glucosa sangunea de ratas control normales tratadas con 20 mg/Kg de extracto de Maqui luego de la administracin de glucosa por medio de inyeccin intraperitoneal (Figura 2A). Sin embargo, se pudo observar en ratas diabticas tratadas con 20 mg/Kg de extracto de Maqui una disminucindelosnivelesdeglucosabasales(Figura2B). Los resultados del Test de Tolerancia a la Glucosa mostraron claramente que el extracto de Maqui es capaz de aliviar la resistencia a la insulina en el grupo de ratas diabticas. La disminucin de la glucosa en sangre fue significativamente mayor en el grupo de ratas diabticas tratadas con el extracto de Maqui a los 240 minutos luego de la administracin de glucosa va intraperitoneal (Figura
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2B). Por otra parte, el peso corporal de las ratas diabticas tratadas con el extracto de Maqui no vari con respecto al grupo control, durante 16 semanas de tratamiento (Tabla 1). Adicionalmente, los niveles de triglicridos en ratas diabticas tratadas con extracto de Maqui se mantuvieron sin cambios con respecto al grupo control diabtico (datos nomostrados).
Figura2.EfectodelextractodeMaqui(EM)sobrelosnivelesdeglucosa postprandialenratascontrolnormalesyratasdiabticas.Testde ToleranciaalaGlucosa.

Los resultados obtenidos demuestran que el extracto de Maqui es capaz de reducir la hiperglicemia basal y mejorar la capacidad de metabolizar la glucosa en ratas con diabetes tipo 2. En este sentido, se ha descrito que un alto consumo de frutas y hortalizas, principalmente antocianinas estn asociados con una reduccin en la incidenciadeestetipodediabetes[29].
Tabla1.Pesocorporalenratasdiabticastratadasconvehculooextracto deMaquipor4meses.

LosvaloressonelpromedioE.E.,n=5

(A).Nivelesdeglucosasanguneaenratascontrolesnormal(CN)yenratas control normales tratadas con vehculo o con 20 mg/Kg de extracto de Maqui, respectivamente. (B) Niveles de glucosa en ratas diabticas (RD) y en ratas diabticas tratadas con vehculo o con 20 mg/Kg de extracto de Maqui,respectivamente.LosresultadossonelpromedioE.E.,n=5.**P< 0.01. E and G indican la administracin de extracto y glucosa, respectivamente.

El extracto de Maqui modifica la forma de las curvas de glucosaeinsulina. El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de una administracin oral nica de extracto Maqui sobre los niveles postprandiales de glucosa e insulina en individuos conintoleranciaalaglucosa. Es conocido que pacientes con intolerancia a la glucosa poseen doble riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2 yasociadoaeventoscardiovasculares[30].Porlotanto,las medidas o tratamientos que apunten a reducir la incidencia de la diabetes y los eventos clnicos en estos pacientessondesumarelevancia. Los resultados obtenidos muestran que la administracin nica del extracto de Maqui conduce a alteraciones en la forma de las curvas de insulina (Figura 3A) y de glucosa (Figura 3B). Sin embargo, la comparacin estadstica entre el rea bajo la curva del extracto de Maqui y placebo no mostr diferencias estadsticamente significativas en las determinaciones de insulina (ANOVA). A pesar de esto, los pacientes que recibieron 200 mg de extracto redujeron significativamente la glucosa postprandial despus de 30 minutos de la administracin de una comida, en comparacin con aquellos pacientes que solo recibieron placebo (Figura 3B). Fue posible tambin observar, que los resultados cinticos muestran un retardo en el tiempo en elquesealcanzaelmximoenlaconcentracindeinsulina y glucosa en los pacientes tratados con extracto de Maqui
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(Figura3A),locualcorrelacionaconunadisminucintarda enlosnivelesdeglucosa(Figura3B).
Figura3.EfectodelextractodeMaquisobrelasconcentracionesde insulinayglucosapostprandialesenpacientesconintoleranciaala glucosa.TestdeToleranciaalaGlucosa.

transportador facilitativo de hexosas, GLUT2 [31]. En este trabajo, se utilizaron las mediciones en Cmaras de Ussing para caracterizar el efecto de delfinidina sobre el transporte activo de glucosa intestinal (SGLT1). Los yeyunosderatonesfueronmontadosenlascmaras,hasta que stos alcanzaron un estado estacionario. A continuacin, se adicion glucosa a una concentracin de 10 mM en el lado mucoso, induciendo un aumento en la Isc (mximo despus de 3 minutos), representando un incremento en la actividad de SGLT1. Cuando delfinidina fue agregada al bao por el lado mucoso, se produjo una marcada inhibicin de la Isc (Figura 4A), inhibiendo el transporte de glucosa en aproximadamente 60% (Figura 4B).
Figura4.DelfinidinainhibeeltransportedeDglucosaacopladoasodioen yeyunoderatn.

En cada tiempo, ambos grupos placebo y extracto, recibieron 30 minutos antesunacomida(definidayfijadaen75gdearrozgrado1cocinados).La glucosa plasmtica preprandial fue medida en el tiempo base ( 10 minutos) y las concentraciones postprandiales (al final de 180 minutos) fueron calculadas usando el Test de Tolerancia de Glucosa Estndar. Las muestras sanguneas fueron obtenidas en cada sesin. Los resultados son elpromedioE.E.,n=8.*P<0.05,conrespectoalplacebo.


A) Registro de voltaje transepitelial (Vte) de unapieza de yeyunoderatn montado en Cmara de Ussing. En 1 se indica el momento en que la concentracin de Dglucosa en el lado mucoso es aumentada de 0 a 10 mM. La deflexin negativade Vte reflejael transporte electrognicode D glucosa acoplado a sodio, donde los cationes que acompaan al monosacrido alcanzan el lado seroso al ser transportados activamente por la Na+/K+ ATPasa. En 2 se indica el momento en que se adiciona delfinina 50 M en el lado mucoso. B) Resumen de las corrientes de cortocircuito (Isc) para los experimentos ejemplificados en A. Delfinidina produce una disminucin cercana al 40% (ii: corriente sensible a delfinidina) de la corriente de sodio inducida por Dglucosa 10 mM (i). Los valores son el promedio son el promedio E.E., n=4 de diferentes animales.

Delfinidina inhibe el transporte de glucosa dependiente desodio. En intestino, la entrada de glucosa puede involucrar al cotransportador de Na+/glucosa, SGLT1, o al

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DISCUSIN

enterocitos [36]. SGLT1 es parte funcional del sistema perifrico que censa glucosa exgena para mantener la homeostasis energtica [37]. La actividad de SGLT1 es altamentereguladaporalgunospptidosyhormonasenla membranadelamucosaoserosa[38,39,40].Laregulacin de SGLT1 involucra un mecanismo postprandial, seguido por un rpido ajuste de la abundancia de la protena en BBM y reclutamiento del transportador de glucosa GLUT2, lo cual depende de los niveles de azcar luminales [37]. La actividad de SGLT1 y GLUT2 se encuentra incrementada en diabetes tipo 2 [41,42], probablemente como resultado de su desregulacin. Los resultados presentados en este trabajo muestran que el extracto de Maqui rico en delfinidinas posee un efecto potencial en el mantenimiento del balance de glucosa en pacientes prediabticos. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a Indena, SpA, Italia por el extracto estandarizado de Maqui, y a Maqui New Life, S.A. por los fondos para investigacin entregados a la Universidad AustraldeChile. BIBLIOGRAFA:
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DM es el trastorno endocrino ms comn, siendo un problema importante de salud en todo el mundo. Este grupo de enfermedades metablicas se caracterizan por hiperglicemia, resultante de defectos en la secrecin y/o accin de insulina. La hiperglicemia crnica se asocia con dao a largo plazo, disfuncin e insuficiencia de varios rganos, especialmente los ojos, riones, nervios, corazn y vasos sanguneos. As, el estricto control del nivel de glucosa en sangre se considera esencial para retrasar y/o prevenir el desarrollo de complicaciones de la diabetes [32]. Basndose en los datos presentados en este estudio, el tratamiento con el extracto de Maqui rico en delfinidinas, produjo una reduccin significativa de la concentracin basal de glucosa en suero en ratas diabticas despus de 4 meses de tratamiento (*P<0,001). Igualmente, los resultados del Test de Tolerancia a la Glucosamostraronqueesteextractoescapazdedisminuir los niveles de glucosa en sangre en ratas diabticas. Los niveles de glucosa sangunea normales fueron reestablecidos a los 240 minutos despus de la administracindeglucosavaintraperitoneal. La diabetes mellitus tipo 2 y la obesidad se encuentran fuertemente asociadas [33]. Recientemente, se ha mostrado que las antocianinas podran afectar el desarrollo de la obesidad, al menos en algunos modelos animales [34,35]. En este trabajo, nosotros no observamos ningn tipo de proteccin contra la obesidad en ratas diabticasinducidasporinyeccinconSTZ. En este estudio, hemos demostrado que el extracto de Maqui rico en delfinidinas redujo significativamente la glucosa en sangre en pacientes con intolerancia a la glucosa. Los resultados muestran una diferencia estadsticamente significativa en los niveles de glucosa postprandrial a los 60 minutos y diferencia en la distribucin de las curvas promedios e individuales de insulina y glucosa, sugiriendo un efecto significativamente potencial del tratamiento con extracto de Maqui. Sin embargo, esto solo puede ser corroborado con un nmero mayordepacientesconintoleranciaalaglucosa,obienen un estudio que involucre a pacientes con enfermedades ms severas relacionadas al metabolismo de los carbohidratos, como diabetes mellitus o sndrome metablico. Notablemente, ninguno de los voluntarios que participaron en el estudio mostr reacciones adversas al tratamiento.Solounpacienteinformdereaccionesleves, tanto para el extracto de Maqui como para el placebo, sugiriendo que el extracto Maqui es seguro en la dosis a la cual fue administrado. Finalmente, se demostr que delfinidina pura, inhibi el transporte de glucosa (SGLT1) en la mucosa de yeyuno de ratn. En el intestino, los enterocitosdelamembranaderibeteencepillo(BBM)son elsitioprimario delaabsorcindelosazcaresdeladieta. El cotransportador de Na+/glucosa SGLT1, transporta glucosa y galactosa desde el lumen del intestino hacia los

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ARTCULODEREVISIN

POLIFENOLESCONEFECTOANTIHELICOBACTERPYLORI:FUENTESDEOBTENCINYSU POTENCIALUTILIZACINENFITOMEDICAMENTOS,NUTRACUTICOSYALIMENTOS FUNCIONALES. (PolyphenolswithantiHelicobacterpylorieffect:Sourcesanditspotentialusein phytomedicines,nutraceuticsandfunctionalfoods)


EdgarR.PasteneN.1*,Ph.D.,SonjaHebelG.1,2,B.Q.yApolinariaGarcaC.2,Ph.D.
LaboratoriodeFarmacognosia,DepartamentodeFarmacia,FacultaddeFarmacia,UniversidaddeConcepcin,Concepcin,Chile. 2 LaboratoriodePatogenicidadBacteriana,DepartamentodeMicrobiologa,FacultaddeCienciasBiolgicas,UniversidaddeConcepcin.

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RESUMEN

Helicobacter pylori (H. pylori) infecta la mucosa gstrica de la mitad de la poblacin mundial, siendo el nico microorganismo conocido por su capacidad de colonizar exitosamente el estmago humano. Muchos estudios han permitido establecer que H. pylori es uno de los principales agentes etiolgicos de la gastritis crnica, lcera duodenal y del linfoma MALT. En 1994, la AgenciaInternacionalparalaInvestigacindelCncer(IARC/OMS),definiaH.pyloricomounagentecarcingenotipoI,porsu directaasociacinalcncergstricodeorigennogentico.EnChile,lainfeccinporH.pyloriposeeunaaltaprevalencia(~80%) y el rgimen de erradicacin habitualmente considera la aplicacin de una terapia mltiple, la cual combina dos (o tres) antibiticos y un inhibidor de la bomba de protones (PPI). No obstante, se espera que el desarrollo de resistencia a los antibiticos por parte de algunas cepas de H. pylori vaya en aumento. Lo anterior ha incentivado la bsqueda de nuevas substancias con propiedades antibiticas, as como otras que dificulten el asentamiento exitoso de la bacteria en la mucosa gstrica. En esta revisin se presenta brevemente algunos aspectos de la infeccin por H. pylori y sus mecanismos de dao a la mucosa gstrica, con nfasis en la produccin de especies reactivas del oxgeno y el nitrgeno (ERON). Con la descripcin de dichos mecanismos, y a la luz de recientes hallazgos en el campo de la fitofarmacologa, se persigue dirigir la atencin hacia nuevos blancos moleculares poco explorados. En particular, destaca un nmero importante de productos obtenidos del reino vegetal, pertenecientes a distintos grupos fitoqumicos como los terpenos, alcaloides y los polifenoles, para los cuales se ha descrito efectos antiH. pylori a travs de diferentes mecanismos. Por su presencia ubicua en muchas plantas que se emplean con fines medicinales y su consumo a travs de ciertos alimentos ricos en ellos, en este trabajo se discutir el rol de los polifenolesconefectosantiH.pylori.Estos,nosloposeenactividadantimicrobiana,antioxidanteygastroprotectora,sinoque tambin juegan un papel como agentes capaces de neutralizar ciertos factores de virulencia de H. pylori. Los antecedentes cientficos y los resultados de nuestros estudios sugieren que estos compuestos tendran una real utilidad al ser administrados comoagentesfitoteraputicos,nutracuticosoingredientesfuncionales.

PalabrasClaves:Helicobacterpylori,polifenoles,antioxidantes,ureasa,radicaleslibres. PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

1. EPIDEMIOLOGA Y PRINCIPALES MANIFESTACIONES CLNICASDELAINFECCINPORHelicobacterpylori. Helicobacter pylori (Hp) fue identificado por primera vez por Marshall y Warren en 1982 como una bacteria flagelada, microaerfila, Gramnegativa de forma bacilar y espiralada.

Hp destaca por su alta capacidad para colonizar el epitelio gstrico humano e in vitro necesita condiciones exigentes de cultivo, multiplicndose de manera lenta (35 das) con unatemperaturaptimade3537C,apHneutro(Warren 1983;Marshall,1984).

Correspondencia a: Dr. Edgar R. Pastene, Laboratorio de Farmacognosia, Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, P.O. Box 237, Universidad de Concepcin,Concepcin,Chile.emailedgar.pastene@gmail.com

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En los pases no desarrollados la infeccin es normalmente adquirida en la niez y en ausencia de tratamiento puede persistir toda la vida. Hp es un microorganismo cosmopolita, estimndose que ms de la mitad de la poblacinmundialestinfectada(EUROGAST,1993).Dicho agente puede ser aislado en personas tanto sintomticas como asintomticas. En individuos infectados en forma crnica, Hp constituira el principal agente etiolgico de enfermedades como la gastritis crnica, la lcera pptica, el adenocarcinoma y el linfoma asociado a la mucosa gstrica (MALT) (Blaser, 2004). El curso de la infeccin es muy variable y depende tanto de factores propios de la bacteria como del husped. La infeccin no slo altera en forma directa la mucosa gstrica, sino que, adems, modifica a nivel del antro gstrico la secrecin de polipptidos gastrointestinales con accin hormonal (p.e. gastrina), generando alteraciones en la fisiopatologa gstrica relevantes a la posterior ulceracin de la mucosa. En base a los antecedentes epidemiolgicos disponibles, la Agencia Internacional para la Investigacin del Cncer clasific a Hp como un carcingeno humano clase I (IARC., 1994). El cncer gstrico ocupa el segundo lugar entre las causasdemuerteporneoplasiasanivelmundial,yenChile representa la primera causa de muerte por tumores malignosenvarones,habindoseestabilizadoapartirdela dcadadelos80latasademortalidadcrudaenalrededor de20porcada100.000habitantes(Parkin,2002;2005). 1.1. Estrategias de tratamiento y prevencin de la infeccin 1.1.1. Tratamiento farmacolgico, IV Consenso de Maastricht. La evaluacin de nueva evidencia experimental, as como el tratamiento a utilizar en la erradicacin de este patgeno se evala cada cuatro o cinco aos por expertos en el denominado consenso de Maastricht. La triple terapia convencional que incluye un PPI y los antibiticos claritromicina y amoxicilina o metronidazol recomendado en el primer consenso ha demostrado una prdida de eficiencia debido a la alta resistencia bacteriana a claritromicina y con frecuencia slo permite como mximo un 70% de cura en los pacientes. Esta terapia provoca malestar en muchos pacientes, incluyendo cefaleas, nuseas, vmitos y sensacin de mareo, siendo responsable del abandono de lamismaycontribuyendoasalaresistenciabacteriana.La terapia actual recomendada se basa en la resistencia a claritromicina presente en cada zona geogrfica: cuando sta es menor a un 15 o 20% el tratamiento emprico recomendadodeprimeralneaeselyamencionado,conla adicin de bismuto como alternativa, en cambio cuando la resistencia es mayor, este ltimo componente es altamente recomendable y debe adicionarse si la triple terapia convencional falla, junto al reemplazo de la claritromicina por levofloxacino. Es favorable adems, utilizar altas dosis de PPI, dos veces al da y aumentar la

duracin del tratamiento, de 10 a 14 das, en vez de los 7 recomendadosanteriormente(Malfertheiner,2012). 1.1.2. Vacunas. Los estudios de vacunas utilizando diversos modelos animales han probado que el desarrollo de una estrategia de vacunacin es viable y que un candidato vacunal contra Hp es factible (revisado por Harris et al., 2006; Kabir et al., 2007; Del Giudice, 2009), pero an no se ha tenido xito. Se han realizado numerosos estudios en animales para determinar el devenir de la infeccin y para explorar la viabilidad de una vacuna para la prevencin o erradicacin de la infeccin por este microorganismo. Sin embargo, los modelos animales, con la posible excepcin de los monos, no han servido lo suficiente para aclarar dudas debido a los contradictoriosresultados(Kotiwetal.,2012). Segn el Departamento de Gestin de Informacin del Instituto Finlay (Cuba), organizacin cientfica que se preocupa de la investigacin y produccin de vacunas, todos los candidatos vacunales dirigidos contra Hp estn en fase experimental, y sealan que son varios los problemas a resolver antes de que se pueda llegar a desarrollar una vacuna contra este patgeno (http://www.finlay.sld.cu/ domingo, 20 de agosto de 2006, 22:39:22). Svennerholm y Lundgren (2007) en su minireview sobre el progreso del desarrollo de vacunas contra Hp concluyen que hay una gran necesidad de clarificar el principal mecanismo inmune protector contra Hp al igual que identificar un cctel de antgenos protectores fuertes, o cepas bacterianas recombinantes que expresen tales antgenos, los cuales podran ser administrados mediante un rgimen que origine una respuestainmuneefectivaenhumanos. Actualmente se sabe que la colonizacin del estmago por Hp induce una respuesta inmune fuerte pero no protectora, efectuada principalmente por las clulas Th1. Estas clulas producen interferon gamma, interleuquina2 y factor de necrosis tumoralbeta, el cual activa a los macrfagos y es responsable dela inmunidad mediada por clulas y de la respuesta protectora dependiente de fagocitos.Porelcontrario,lasclulasTh2producenIL4,IL 5, IL10 e IL13, las que estimulan las sntesis de anticuerpos y la activacin de eosinfilos e inhiben varias funciones de los macrfagos, proporcionando una respuesta protectora independiente de los fagocito. Por esto, se cree que la eficiencia de una potencial vacuna contra Hp depender de la induccin de la respuesta inmunehumoral(Malfertheiner,2012). 2. CARACTERSTICAS ESPECFICAS DE LA PATOLOGA MOLECULARDELAINFECCINPORHelicobacterpylori. 2.1.Evasindelarespuestainmuneeinflamatoria En la interaccin huspedHp, el movimiento del patgeno hacia la mucosagstrica sevefavorecido por la morfologa espiralada y los flagelos. Posteriormente, Hp se une a
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ciertos receptores de clulas del epitelio gstrico (Hessey, 1990; Logan, 1996), a travs de adhesinas del tipo BabA, SabA, AlpA, AlpB, OipA y HopZ, desencadenando la produccin de interleuquinas, como IL8 (proinflamatoria) y de otras quimioquinas, como la ENA78 (pptido activadordeneutrfilosderivadodeclulasepiteliales)yel GRO (encogen regulado por crecimiento). Un factor endgeno que, adicionalmente facilita la unin de Hp a las clulas epiteliales, es la glicoprotena denominada DAF (Decayaccelerating Factor, 70 kDa) (Servin, 2005; OBrien et al., 2006), la cual en presencia de Hp puede ser up regulada. Tras su adhesin a la mucosa, Hp secreta toxinas de naturaleza peptdica, como VacA y CagA, capaces de actuarlocalmentesobreelepitelioblanco.SibienHplogra asociarse al epitelio gstrico con bastante xito, una vez ah debe lidiar con la primera lnea de defensa constituida por la inmunidad innata. Este sistema consta de componentes de barrera (epitelios, defensinas y linfocitos T intraepiteliales), clulas efectoras circulantes (neutrfilos, macrfagos y clulas NK) y diversas protenas efectoras circulantes (complemento, colectina, factores de coagulacin, protena Creactiva y citoquinas como TNF, IL1, 10, 12, 15). Aunque algunos de estos componentes poseen receptores capaces de reconocer patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs), que llevan a la destruccin del agente extrao, Hp es capaz de vulnerarlos eficazmente. Por ejemplo, el TLR4 (un receptor del tipo Toll), que normalmente reconoce a los LPS bacterianos para activar a NFB, genera frente al LPS de Hp una respuesta que si bien es proinflamatoria, es notablemente ms dbil en comparacin con la de los LPS de otras bacterias entricas (menor reconocimiento). Del mismo modo, en contraste con las flagelinas secretadas por otros patgenos Gram negativos, como Salmonella o Escherichia coli, que activan consistentemente la respuesta proinflamatoria mediada por los receptores TLR5, la flagelina presente en Hp no es secretada y por ende se considera no inflamatoria (Gewirtz et al., 2004). A su vez, Hp es capaz de interferir con algunas de las respuestas inmunes locales; por ejemplo, inhibiendo la produccin de xido ntrico por parte de macrfagos y downregulando la expresin de receptores a quimioquinasenneutrfilosinfiltrantes. En forma adicional a la respuesta inmune innata, la infeccin por Hp induce una respuesta inmune caracterizada por la infiltracin de la mucosa con neutrfilos, linfocitos y otras clulas inflamatorias, y por la produccin local y sistmica de anticuerpos y de otros mediadores de la respuesta celular. Si bien las respuestas celulares y humorales son importantes en la patognesis de Hp, stas, como tal, son inefectivas para erradicar la infeccin. An ms, como resultado de la interaccin de linfocitos, neutrfilos, macrfagos y mastocitos, la respuesta inmunocelular es conducente a una amplificacin de la inflamacin inicial en el sitio infectado. Tras ser atradas al sitio de la lesin, las clulas infiltrantes

liberan mediadores como citoquinas, eicosanoides, y activadores de la cascada del complemento, capaces de perpetuar la inflamacin. Junto a dichos mediadores, las clulas referidas liberan al medio una diversidad de especies reactivas del oxgeno y nitrgeno (ERON), generando una condicin de estrs oxidativo crnico en el epitelio afectado. Las respuestas del husped permiten la activacinydiferenciacindelinfocitosTh0(CD4+),losque segn el patrn de citoquinas presentes en el medio y de las condiciones inmunes del individuo, logran diferenciarse enTh1,mediandounarespuestadetipocelular,obienTh2 con una respuesta de tipo humoral. La respuesta de tipo celular es mediada a travs de citoquinas tipo Th1 tales como IFN, IL2 y TNF, mientras que las citoquinas tipo Th2comolaIL4eIL5promuevenunarespuestadetipo humoral. Recientemente se ha comenzado a comprender cmo a travs de mecanismos que permiten a Hp evadir la respuesta inmune la bacteria logra perpetuar la inflamacindelamucosagstrica(Ganten,etal.,2007).Un ejemplo de esto ltimo lo constituye la habilidad que tienen ciertas cepas de Hp (60190; CagA+; VacA+) para inducir la apoptosis de linfocitos T a travs de la va intrnseca (mitocondrial) y no la extrnseca. Lo anteriormente expuesto se suma a reciente evidencia que pone en el centro del proceso inflamatoria a la citoquina IL32comounfactoramplificadordelaactivacindeNFkB y produccin de IL8. As, considera que el control efectivo del proceso inflamatorio promovido por Hp contribuira en forma importante en la prevencin de muchas complicaciones asociadas, incluyendo al cncer (Sakitani et al.,2012). 2.2.Helicobacterpyloriyevasindelestrsoxidativo Mencin aparte merecen las enzimas con que Hp est equipado para combatir las especies reactivas del oxgeno ydenitrgenoliberadasporclulasdelsistemainmunedel husped (revisado por Wang et al., 2006). Entre ellas, la msabundanteeslaalquilhidroperoxidoreductasa(AhpC), una enzima que dada su alta expresin en Hp evita la acumulacindelipoperxidosalinteriordelpatgeno. Las cepas de Hp mutantes para AhpC presentan una aumentada sensibilidad a diversas condiciones de estrs oxidativo (Olczak et al., 2002), sobreexpresan la protena activadora de neutrfilos (Olczak et al., 2003), y presentan una menor actividad catalasa (Wang et al., 2004). Junto a lo anterior, Hp dispone de actividad superxido dismutasa para la remocin de radicales superxido generados por clulas del sistema inmune (Comtois et al., 2003), y es capaz de aumentar la expresin de enzimas antioxidantes como la metionina sulforeductasa, necesaria para corregir la modificacin oxidativa de protenas en sus residuos metionina(Alamurietal.,2006). UnadelascaractersticasdelainfeccinporH.pyloriessu alto grado de infiltracin linfoctica (Allen, 2001). Los neutrfilos y clulas mononucleares infiltran la mucosa
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estomacal infectada por H. pylori ocasionando inflamacin y produccin de especies reactivas del oxgeno. Se ha observado que ciertas protenas acuosolubles de H. pylori son capaces de primar a los neutrfilos, incrementando su capacidad para producir ROS y quimioquinas cuando se usan agentes inductores como el PMA y el fMLP (Shimoyama et al., 2003; Nrgaard et al., 1995). Satin y colaboradores (2000), informaron que la protena HPNAP es uno de los factores que estimulan a la NADPH oxidasa en neutrfilos, si bien, se observ un retardo en el patrn de respuesta (medido como quimioluminiscencia incrementada para luminol), en comparacin con los agentes convencionales que inducen el estallido respiratorio. Especficamente, los autores observaron que la produccin de ROS alcanz un mximo entre 4060 minutos despus de la incubacin. Hp induce la migracin delosneutrfilosdesdeloscapilaresalalminapropriaya la zona glandular de la mucosa, especialmente en las proximidades de los cuellos glandulares, donde se encuentranlasclulasgerminales. Los neutrfilos son activados por factores citotxicos del propio Hp (como Nformilmetionilleucilfenilalanina) y por la IL8 procedente de las clulas del epitelio tras la adhesin bacteriana (Mooney et al., 1991). Aun ms relevante es que Hp posee la propiedad nica de alterar la distribucin de NADPH oxidasa en los neutrofilos (Allen et al., 2005). Lo anterior se explica por un ensamblaje anmalo del complejo funcional NADPH oxidasa en la membrana celular y no en el fagosoma. Especficamente, mientras el flavocitocromo b558 puede ser adquirido por los fagosomas, las subunidades p47phox o p67phox no puedenserreclutadaseficientemente. Los factores responsables de ste tipo de evasin aun no han podido ser identificados. La evidencia sugiere que se tratara de molculas sensibles al calor, resistentes al tratamiento con formalina y localizadas en la superficie de H. pylori. Estos ltimos factores no seran requeridos para estimular el estallido respiratorio de los neutrfilos. Por otro lado, el resultado de investigaciones previas indican que las citotoxinas CagA y VacA son innecesarias para la activacindelosneutrfilos(Danielssonetal.,2000).Otros autores sugieren que la adhesina SabA de H. pylori podra jugar un papel preponderante como factor activador de neutrfilos (Unemo, et al., 2005). De cualquier modo, este mecanismo le permite a H. pylori desviar la produccin de anin superxido hacia el exterior, evitando su acumulacin en el fagosoma. De acuerdo a dicho mecanismo, Hp actuara concertadamente con los neutrfilos para producir ulceracin gstrica y adems evadir su destruccin una vez fagocitado. Consistente con loanterior,sehaobservadoqueladensidaddeneutrfilos infiltrantes se correlaciona directamente con la habilidad de Hp para causar dao a la mucosa gstrica. Por otra parte,eldaoprovocadoporlasERONsobrelasclulasdel epitelio gstrico permite que Hp pueda acceder a una

fuente adicional de nutrientes. Respecto a la capacidad que tienen los macrfagos activados en la mucosa gstrica para producir xido ntrico, especie reactiva que en conjunto con otras persigue la eliminacin del patgeno, cabedestacarqueHppuedelimitarlosefectosbactericidas del NO., tanto in vitro como in vivo, gracias a que expresa (gen rocF) una actividad arginasa capaz de sifonar la L arginina lejos de la iNOS del husped (revisado por Peek, 2005). Un beneficio adicional asociado a la alta actividad arginasa de Hp es la generacin de urea (y ornitina) durante la hidrlisis de arginina. Si bien la arginasa puede ser inactivada por diversas ERON (McGee et al., 2006), y desnaturalizada por altas concentraciones de urea, Hp utiliza una tioredoxina (Trx1) como chaperona para recuperar la actividad cataltica de la arginasa. Por tanto, se considera que el sistema arginasa/Trx1 actuara en forma concertada como sistema de adaptacin y defensa contra el estrs oxidativo resultante de la respuesta inmunocelular. 2.3. Efectos de la respuesta inmunocelular y del estrs oxidativosobreelhusped Sumado al dao directo inducido por los ERON sobre la mucosa gstrica, los eventos que conducen al proceso inflamatorio anteriormente discutido, llevan a aumentar in vivo (en mucosa gstrica y a nivel sistmico) diversos parmetros de dao oxidativo a lpidos (reflejado como aumentoenlosnivelesdeMDAeisoprostanos)(Davetal., 2005; Drake IM et al., 1998 ) y al DNA (aumentada excrecin de 8hidroxiguanidina) (Smoot et al. 2000; Ladeira et al. 2004; Siomek et al. 2006). La respuesta inmunocelular produce, adems, ciertos eicosanoides biolgicamente activos a travs de un mecanismo de peroxidacin del cido araquidnico catalizada por radicalesdeloxgeno(Davietal.,2005). Se ha planteado que el dao que en etapas tempranas (niez y adolescencia) genera Hp sobre el DNA estara asociado con el desarrollo de varios tipos de cncer en la etapa adulta (Hatakeyama, 2004). Sin embargo, tal extrapolacin no puede ser directa debido a que el desarrollo del cncer en respuesta a un agente carcinognico puede tomar entre 20 a 40 aos. No obstante, se debe recordar que las ERON son una de las explicaciones ms socorridas cuando se trata de buscar la posible asociacin entre desarrollo de cncer y Hp (Kawanishi 2006; Schotterfeld, 2006). Por otra parte, se ha demostrado tambin un aumento del cido hipocloroso (HClO) en mucosa gstrica de individuos infectados por Hp (Matthews, 2005). El HClO es un potente prooxidante generado a partir de H2O2 (en presencia de CI ) por la enzima mieloperoxidasa (MPO), liberada desde neutrfilos activados. El HClO es capaz de reaccionar rpidamente con el NH3 generado a nivel local por la enzima ureasa, para
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formarmonocloroamina(NH2Cl).Esteltimocompuestoes altamente lipoflico y por tanto capaz de atravesar fcilmente membranas biolgicas, facilitando la oxidacin de macromolculas al interior de las clulas epiteliales. Se ha observado, adems, que NH2Cl es capaz de inducir la infiltracin y activacin de neutrfilos en la mucosa gstrica de manera similar a lo observado por Hp (Matthews, 2005). A su vez, se ha encontrado que ciertos mecanismos endgenos de defensa antioxidante como el glutatin (GSH) y el cido ascrbico estn disminuidos en mucosas infectadas por este agente (Arend, 2005; Naito, 2002; Ernst, 1999). Ms an, en la mucosa gstrica de pacientes infectados, relativo a pacientes Hp(), no solo los niveles de GSH estn disminuidos, sino que tambin los de la enzima GSHtransferasa (Verhlust et al., 2000; Shirin et al.,2001;Jungetal.,2001). Lo anterior conlleva una mayor produccin local de ERON, las que al acumularse pueden va regulacin de ciertos genes, e induciendo dao oxidativo al ADN aumentar el riesgo de desarrollo de cncer gstrico (Smoot et al., 2000; Pignatelli et al., 1998). Cabe mencionar que bajo condiciones desfavorables (por ejemplo, de estrs oxidativo), Hp es transformado desde la forma bacilar original a la cocoide. Slo esta ltima es capaz de generar radicales hidroxilo, reconocidos como la especie de mayor reactividad hacia sustratos biolgicos (Nakamura et al., 2000). Se ha descrito que en mucosa gstrica de sujetos asintomticos, la erradicacin de Hp mediante terapia tradicional conduce a una normalizacin de los niveles de actividad de ciertas enzimas antioxidantes (como iNOS y catalasa)(Felleyetal.,2002). 3. ASPECTOS GENERALES A CONSIDERAR EN RELACIN CON EL EFECTO DE LOS POLIFENOLES SOBRE Helicobacter pylori. Dado que el estrs oxidativo asociado a la respuesta inmune que sucede a la presencia de este patgeno representa uno de los principales mecanismos de dao al epitelio gstrico, parece muy relevante disponer de eficientes sistemas antioxidantes (tanto endgenos como dietarios) en la zona colonizada por Hp. Sin embargo, las estrategias de supervivencia con que cuenta Hp contra el estrs oxidativo, hacen surgir la interrogante de cun beneficiosa puede ser la administracin o ingesta de antioxidantes. Los antecedentes que a continuacin sern revisadossugierenqueestoscompuestospodrantenerun efecto protector no slo para el husped (citoprotegiendo el epitelio), sino tambin sobre Hp (contribuyendo a sus defensasantioxidantes). Tericamente,alaumentarlacapacidaddeHpparalidiar con las ERON generadas por el sistema inmune del husped, se aumentara tambin la posibilidad de que la

colonizacin del epitelio por Hp persista en el tiempo. No obstante, estudios en los cuales se han evaluado extractos de plantas ricos en compuestos antioxidantes dan cuenta de efectos antiHp tanto in vitro como in vivo (vide infra; Nostro et al., 2005; Mahady et al., 2005; Ustun et al., 2006). La actividad antiHp de dichos preparados parece, sin embargo, estar asociada a determinadas especies vegetales de uso mdico y/o alimenticio, y por consiguiente pudiera estar limitada a slo algunas familias fitoqumicas. Ejemplos de esto lo constituyen diferentes bayas (berries ricos en polifenoles), algunas crucferas (brcoli rico en glucosinolatos), propleos y especies con aceites esenciales. Sin embargo, dentro de los grupos de fitoqumicosmsestudiadosdestacanlospolifenoles. La importancia de estos compuestos en salud humana ha sido ampliamente revisada (Ross, 2002; HwaYoung Kim, 2003; KrisEtherton et al., 2004; Raumussen et al., 2005; Ramassamy, 2006). No obstante, lo disperso de la informacin relativa con su absorcin, metabolismo, distribucin y excrecin ha llevado a muchos investigadores a poner en duda algunos de los efectos de los polifenoles a nivel sistmico. De esta forma, se ha sugerido que el primer y principal sitio donde estos compuestospodranejercersuaccinantioxidante,serael tractogastrointestinal(RevisadoporClifford,2004). De acuerdo a antecedentes de la literatura, algunos compuestos polifenlicos poseen reconocida actividad bactericida, dada probablemente por mecanismos inespecficos que no necesariamente guardan relacin con su actividad antioxidante (citoprotectora) sobre las clulas del epitelio gstrico (PuupponenPimia et al., 2001). Una de las hiptesis que se ha aceptado como paradigma, es que los polifenoles ejercen parte de su actividad antimicrobiana mediante interacciones inespecficas con componentes de la membrana plasmtica (Mori et al., 1987; Haraguchi et al., 1998; Funatogawa et. al., 2004). Al respecto, se observ un efecto dosisdependiente al evaluar el dao provocado por algunos polifenoles en los modelosdeintegridaddeliposomasydealteracionesenla morfologa de Hp (Funatogawa et al., 2004). Sin embargo, este mecanismo es relevante y explica la actividad de taninos hidrolizables del tipo glico (telimagrandina I y II), para los cuales se determin valores de MIC hasta 7 8 veces inferiores a los obtenidos con los taninos condensados (procianidinas). Dado que slo algunas de las especies vegetales ricas en polifenoles muestran efectos antiHp, resulta evidente que los vnculos mecansticos entre las actividades antimicrobiana y antioxidante no son obligados (Correia et al., 2004; Shin et al., 2005). Debido a que, entre las molculas fitoqumicas bioactivas, los polifenolessonlosdemayorpresenciaenladietahumana, se han publicado varios estudios que relacionan su consumoconunefectosobreHp(Figura1).
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Figura1.

EstructuradediferentespolifenolesconefectosobreHelicobacterpyloriosusfactoresdevirulencia.

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La mayora de dichos estudios, exceptuando aquellos realizados con t verde y cranberry, han contemplado la evaluacin de extractos obtenidos a partir especies vegetales de uso regional, no existentes en Chile. Considerando que la aplicacin de las terapias triples y cudruples es muy costosa, que presenta un alto nivel de reacciones adversas, y que junto a la aparicin de resistencia, su uso masivo sera controversial en poblaciones con infeccin endmica por Hp, se hace crecientemente necesario investigar el potencial que pudieran tener extractos vegetales usados como ingredientes de productos fitoteraputicos, nutracuticos, o alimentos funcionales. Dichos productos ricos en antioxidantes polifenlicos podran usarse en individuos colonizados asintomticos contribuyendo a disminuir la evolucin de otras patologas gstricas y extragstricas. Por otro lado, se ha explorado de manera creciente las potencialesrelacionessinrgicasentreproductosnaturales y los antimicrobianos usados convencionalmente para la erradicacin de Hp. Al respecto, en cepas de Hp con diferentegradosesusceptibilidadsehadescritoqueeluso combinado de extractos de jengibre o propleos con claritromicina posee un efecto sinrgico o aditivo sobre la inhibicin y el desarrollo de resistencia hacia ste antibitico,(Nostroetal.,2006). Tal como se describe ms adelante (seccin 3.1), una serie deestudiosenloscualessehaintentadoaislareidentificar los polifenoles presentes en plantas y alimentos, sugieren que la actividad antiHp de los concentrados polifenlicos estara asociada, mayormente, a los antocianos, flavonoides, taninos hidrolizables (gallotaninos y ellagitaninos) y taninos condensados (procianidinas) como los subgrupos ms activos (Tmbola et al., 2003). Sin embargo, dentro de un mismo grupo de compuestos fenlicos existen diferentes grados de actividad sobre Hp, lo que sugiere que los mecanismos de accin no son tan inespecficos como se pensaba. Por ejemplo, numerosos estudios realizados con flavonoides, concluyen que la mayor solubilidad en lpidos se asocia con un efecto bactericidamspotente(Hashimotoetal.,1998;Baeetal., 1999, 2001; Shin et al., 2005; Isobe et al., 2006; Ustn et al.,2006;Zhuetal.,2007). Se ha propuesto un nuevo mecanismo mediante el cual ciertos flavonoides de baja polaridad pueden ejercer un efecto antiHp. As, la actividad bactericida de quercetina [1],apigenina[2]y(S)sakuranetina[3],hasidoatribuidaa su capacidad de inhibir en forma competitiva a la hydroxyacylacyl carrier protein dehydratase (HpFabZ) (Zhang et al., 2008). La principal funcin de HpFabZ es participarenlafasedeelongacindurantelabiosntesisde cidos grasos saturados e insaturados. Dicha protena tambin es blanco de otros productos naturales como la juglona (hidroxi1,4naftoquinona, [4]), la cual es capaz de

inhibirla en forma competitiva (Park et al., 2006; Kong et al.,2008). 3.1. Antocianos,flavonoides,catequinas, proantocianidinasytaninoshidrolizables. Los pigmentos antocinicos son aquellos polifenoles que confieren el color a las frutas, flores, cereales y algunos tubrculos. Uno de los productos que ms concentra antocianos es el jugo de cranberry (Vaccinium macrocarpon). Este ltimo ha sido estudiado, particularmente, por sus propiedades antimicrobianas. Estudios clnicos han demostrado que el consumo sostenidodejugodecranberryprevienelas(re)infecciones del tracto urinario en mujeres (Avorn et al., 1995; Henil et al., 2000; Kontiokari et al., 2001; Stothers, 2002; Di Martinoetal.,2006).Sehasugeridoquelospolifenolesde cranberry actuaran evitando la adhesin de E. coli al uroepitelio (Howell et al., 2002; 2005). Recientemente, las propiedades antimicrobianas de cranberry han sido extendidas a Hp. No obstante, aunque los antocianos contribuyen en forma importante a la capacidad antioxidante del cranberry, se ha demostrado que la inhibicin de la adhesin de Hp a la mucosa gstrica humana, se debera ms bien a sus constituyentes de alto peso molecular (procianidinas tipo A, [5]) (Burger et al., 2000). Basado en la evidencia arrojada por este ltimo estudio, Zhang et al. (2005) realizaron un ensayo clnico aleatorizado, placebocontrolado y doble ciego, en una poblacin adulta de Linqu (China). En tal estudio, se demostr que la administracin de 250 ml de jugo de cranberry (2 veces al da por 90 das) ayud a la supresin de Hp en un 14% de la poblacin estudiada. Estudios in vitro han demostrado que el jugo de cranberry asociado con otros extractos (Vitis vinifera; arndano y organo) inhibe el crecimiento in Vitro de Hp en forma sinrgica, correlacionndose la mayor presencia de polifenoles con unamayorcapacidadantioxidantedelacomplejamezcla ensayada (Lin et al., 2005; Vattem et al., 2005a). Al respecto, se debe considerar que tal complejidad se relaciona con la presencia de otros constituyentes como cidosfenlicos. Utilizando bioprocesamiento en estado slido (con los hongos Rhizopus oligosporus y Lentinus edodes), los mismos investigadores lograron aumentar la extraccin de los polifenoles de la pomasa de cranberry, obteniendo un producto con mayor efecto antiHp (Vattem et al., 2005b). En una aproximacin similar, otros investigadores (Correia et al., 2004) encontraron una actividad antiHp en extractos (ricos en quercetina y estructuras tipo bifenilos) de desechos bioprocesados de la pia (Ananas cosmosus). Sin embargo, en este ltimo estudio no se logr correlacionar la actividad antiHp con la capacidad antioxidante de los extractos empleados; estos ltimos concentraban compuestos con una mayor presencia de
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grupos fenlicos (asociados a las propiedades antioxidantes de los polifenoles) (Correia et al., 2004). En otro estudio donde se evalu la actividad antimicrobiana de 12 tipos de berries nrdicos sobre una serie de patgenos humanos, se encontr que Hp y Bacillus cereus fueron las bacterias ms sensibles. Interesantemente, aunque se observ que los niveles totales de polifenoles disminuyeron durante el almacenamiento en fro, la actividad antimicrobiana no fue modificada significativamente(Nohyneketal.,2006). Por otra parte, en atencin a su alta concentracin de polifenoles, se ha investigado tambin una posible accin antiHp en diferentes tipos de t. Estudios in vitro realizados con infusiones al 5% de t verde (Lung Chen, cv) demostraron la inhibicin de la multiplicacin de Hp (Yee et al., 2000), proponiendo que dicha actividad residira en la presencia de un flavan3ol conocido como galato de epigalocatequina (EGCG, [6]). El mismo equipo de investigadores, realiz posteriormente un estudio prospectivoentredosgruposdeindividuos,infectadoscon Hp (n = 42) y no infectados (n = 30), comparando el efecto del consumo de t con la presencia de Hp en biopsias gstricas. Se concluy que habra una relacin inversa y significativa entre el consumo de t y la infeccin por Hp (Yeeetal.,2002). A la luz de los antecedentes dados por la etnomedicina, ocasionalmente avalados por estudios experimentales de validacinfarmacolgica,sehanbuscadodiversosmodelos para explicar los mecanismos que posiblemente subyaceranalaaccinantiHpdelospolifenolespresentes en los recursos etnomdicos y alimenticios anteriormente referidos. Dentro de los mecanismos propuestos, se ha explorado la relacin entre el tipo de estructura de los polifenoles y su efecto como inhibidores de la actividad de VacA (medida como actividad vacuolizante y el flujo de urea transmembrana en clulas HeLa) (Tombola et al., 2003; Ruggiero et al., 2006). As, el resveratrol [7], la morina [8], el cido tnico [9] y el piceatanol [10] parecen compartir caractersticas estructurales que sugieren la existencia de interacciones especficas molculamolcula entreciertospolifenolesyVacA.Otrospolifenoles,conalta actividad antioxidante (incluso con mayor presencia de grupos fenlicos), como el cido ellgico [11] y la miricetina [12], se mostraron total o parcialmente inactivos hacia VacA, respectivamente. Estos ltimos compuestos estn presentes en cantidades variables en muchos alimentos de origen vegetal y se les puede encontrar en altas concentraciones en el vino, cerveza, chocolateamargoytverde. Recientemente, un antecedente adicional respecto a la existencia o bien ausencia de relacin entre actividad antioxidante de los polifenoles y actividad antiHp (medida como inhibicin de vacuolacin y del crecimiento de Hp)

emergi del estudio de 13 diferentes tipos de estructuras flavonoideas, todas con propiedades antioxidantes (Shin et al., 2005). Dentro de los compuestos evaluados, slo quercetina[1]ynaringenina[13](dosaglicones)inhibieron lavacuolacininducidaporHpenclulasHeLa. Como evidencia adicional en favor de la asociacin no obligadaentreactividadantioxidanteyefectoantiHp,Shin et al (2005) demostraron tambin que antioxidantes de estructuras tan dismiles como el cido ascrbico, el glutatin, la epicatequina [14] y el trolox (anlogo hidrosoluble del tocoferol) tienen en comn el ser inefectivos como inhibidores de VacA. Entre estos ltimos antioxidantes, se ha evaluado la accin inhibitoria del crecimiento de Hp para epicatequina y vitamina C, siendo activa slo esta ltima tanto in vivo como in vitro por un mecanismo aun no esclarecido pero que, en todo caso no estara asociado al efecto del pH (Zhang et al., 1997; Mabe et al., 1999: Wang et al., 2000). La literatura informa que otro hecho relevante es que algunos polifenoles inhiben la activacin de procaspasa3 a caspasa3 inducida por VacA, sin cambios en la expresin de las protenas Bax y Bcl2 (protenasantiapoptticas). Por lotanto,quercetinapuede proteger a las clulas gstricas de la apoptosis inhibiendo la accin vacuolante de la toxina VacA de Hp. Si bien estas propiedades antioxidantes y citoprotectoras para los compuestos sealados son reconocidas, llama la atencin que en otros modelos se observe una capacidad de inducir muerte y/o arresto de la proliferacin en lneas celulares inmortalizadas derivadas de tumores (Wang, 2000; Lu et al., 2002). Esta polifuncionalidad por parte de algunos compuestos fenlicos (EGCG por ejemplo), es evidente si seconsideraqueadems,stospodrangenerarambientes oxidativosdiferencialesquepermitanprotegeralasclulas del husped de las ERON y por otro lado promover la apoptosis de las clulas tumorales (Yamamoto, et al., 2003). Unahiptesisrecientementeplanteadaparaexplicarelpor qu solo ciertos antioxidantes polifenlicos se muestran activos contra Hp, considera el potencial efecto prooxidante que muestran ciertos polifenoles. La forma en que los polifenoles podran actuar como generadores de especies reactivas del oxgeno fue abordada por varios investigadores (Aragawa et al., 2003; Arakawa et al. 2002, 2004; Aoshima et al. 2005), y utilizando como modelo de polifenol, catequinas de t verde (cuya propiedad bactericidaesconocida),losautoresdemostraronqueapH 78 (o superiores), tal tipo de estructura es capaz de generar cantidades significativas de perxido de hidrgeno. De acuerdo a los autores, la generacin de perxidodehidrgenopodraexplicarelefectobactericida de los flavan3oles. La habilidad de las catequinas para generar perxido de hidrgeno sera favorecida por el arreglo de grupos hidroxilo en este tipo de molculas, lo + que permitira la disociacin del H en solucin y un
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electrnenelfenolquereducealoxgeno,generndoseen consecuencia anin superxido. El anin superxido posteriormente sufre reduccin por la catequina (ej. EGCG),loquellevaalaformacindeO22;adicionalmente, el protn se combina con el superxido generando H2O2. Este mecanismo no slo explicara la generacin de H2O2 producidapor catequinaspurassinotambinporpartede infusiones de t negro, t verde y t Oolong 4 4 4 correspondientes a 1.5 x 10 , 2.4 x 10 y 0.87 x 10 mol/l respectivamente. Estos niveles de H2O2 seran suficientes para ejercer una accin bactericida en cepas Gram positivas y negativas (Arakawa et al., 2004). Si bien es improbable que la generacin de H2O2 ocurra en el medio gstrico, podra especularse que el mayor pH del periplasma de Hp, dado por la actividad ureasa, supondra un ambiente favorable a la formacin de superxido en presencia de ciertos polifenoles. Por otra parte, cabe mencionar que cepas de lactobacilos entricos o gstricos, capaces de producir bacteriocinas, cido lctico y actico, son tambin capaces de generar concentraciones bactericidasdeH2O2(Fernndez,2003;Garcaetal.,2009). Interesantemente,losautoresobservaronqueelcocultivo de Hp con lactobacilos entricos o gstricos supone la inhibicindelcrecimientodeHp. 4.LAACTIVIDADDELOSPOLIFENOLESCOMOAGENTES GASTROPROTECTORESENLAINFECCINPOR Helicobacterpylori. Los polifenoles son constituyentes comunes de plantas medicinales y de uso alimenticio cuya principal ventaja radica en la baja toxicidad respecto de otras substancias. Tal como se describi anteriormente, muchos polifenoles en forma aislada han mostrado diferentes grados de actividadantiHp(seccin3).Cabenotar,sinembargo,que la evidencia de que un determinado componente de un extracto es activo contra Hp no necesariamente debe ser interpretada como evidencia de que el extracto, como tal, compartir tambin la actividad observada para el componente aislado. Si bien son escasos los estudios dirigidos a evaluar la actividad antiHp de los compuestos aislados, para algunos de los polifenoles se ha demostrado una actividad antiureasa y/o antiVacA. Este es el caso para los flavonoides (derivados de quercetina), las procianidinas (tipoB, [15]), y la floridzina [16]. En el caso de los flavonoides mencionados, Shin et al., (2005) ha descrito que dichos compuestos inhiben la vacuolacin inducida por Hp en clulas HeLa y que adicionalmente tendran una moderada actividad inhibitoria de la ureasa. Enelcasodelasprocianidinas,utilizandoextractosdeVitis vinifera ricos en procianidinas tipo B y C, Lee et al. (2006) observ que dichos compuestos son particularmente activosinhibiendolaureasa(yaaunaconcentracinde0.1 mg/mL).

En el caso de la floridzina, se ha encontrado que esta chalcona promueve una accin antiHp inhibiendo la actividad formadora de poros de la toxina VacA. La actividad antiVacA (IC50= 273 M) de floridzina es, sin embargo, extremadamente baja respecto a la del cido tnico (IC50= 2,7 M), observado como el polifenol ms activo en dicho estudio. Respecto al cido tnico, se ha establecido que ste (en asociacin con Npropilgalato) es muy efectivo en inhibir la gastritis en un modelo de ratn infectado por Hp o por VacA (Ruggiero et al., 2006). Adicionalmente, se ha comprobado que ciertos polifenoles dealtopesomolecularcomolasprocianidinasoligomricas extradas de lpulo, son capaces de formar complejos con VacA in vitro (Yahiro et al., 2005; aspecto revisado por Friedman, 2007). Yahiro observ que la interaccin entre las proantocianidinas oligomricas (con un grado de polimerizacin promedio equivalente a 22 unidades de catequina) y la toxina VacA constituye un potencial mecanismo de neutralizacin de virulencia de la bacteria. Dichos compuestos fueron efectivos bloqueando la unin de VacA a sus receptores RPTP y RPTP, inhibiendo la unin no especfica de VacA a la membrana celular, disminuyendo la vacuolacin celular in vitro y atenuando enformasignificativalagastritis inducidaenratonesporla administracindeVacA. De la misma forma, Ruggiero et al, (2007) demostraron que la administracin de extractos de vino tinto y/o de t verde a ratones a los cuales se les indujo gastritis por infeccin con Hp o por administracin de la toxina VacA, tienen un claro efecto gastroprotector, sugiriendo que la toxina sera un potencial blanco molecular de los polifenoles presentes en los extractos utilizados. Interesantemente, Hamauzu et al., 2006, observ que en relacin a los extractos de pulpa de manzana, extractos de pulpa de membrillo tienen un efecto antiulcerognico claramente mayor sobre la injuria gstrica inducida por etanol y HCl. Los autores sugieren que la diferencia en la efectividad antiulcerognica de dichos extractos residira en la notablemente mayor concentracin de procianidinas con un alto grado de polimerizacin promedio en la pulpa del membrillo (DP=29) relativo a la pulpa de manzana (DP=3). En relacin a esto ltimo, Saito et al., (1998) haba reportado previamente que extractos de semilla de Vitis vinifera,ascomosusprocianidinas(dealtoPM),tienenun efecto antiulcerognico; los autores postularon que parte de dicho efecto se debera a la fuerte unin de estos compuestos a protenas presentes en la mucosa gstrica, permitiendo la formacin de una barrera protectora con potencialactividadantioxidanteyantiinflamatorialocal. En efecto, recientemente se ha establecido que extractos depulpademanzana,ricosenpolifenoles,promuevenuna accin antioxidante y citoprotectora en cultivos primarios
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de clulas de mucosa gstrica (MKN28) sometidas a un sistema xantinaxantino oxidasa, como generador de radicales anin superxido (Grazziani et al., 2005). El efecto protector de dichos extractos ha sido observado tambin en un modelo in vivo de injuria a la mucosa gstrica inducida por la administracin de indometacina Grazzianietal.,2005).Interesantemente,eldaooxidativo y las lesiones a la mucosa gstrica inducidas por indometacina son exacerbadas por la infeccin con Hp (Arendetal.,2005).
Figura1.

12Otetradecanoilforbol13acetato). El efecto de los polifenoles sobre el estallido respiratorio inducido por PMA y fmlp en neutrfilos ha sido reportado por Limasset y colaboradores (Limasset et al., 1993). Los autores evaluaron el efecto de 34 polifenoles sobre la produccin de ROS concluyendo que sta depende del estmulo, llegando en algunos casos a ser opuesta. Lo anterior sugiere que existen diferentes mecanismos mediante los cuales estos compuestos pueden inhibir la produccin de especies reactivas es dicho contexto celular. En otro trabajo, Krol y colaboradores (1992) estudiaron 14 flavonoides, confirmando que un grupo hidroxilo en el C3, dos hidroxilos en el anillo B y la presencia de un doble enlace entre C2 y C3, son de vital importancia para la inhibicin de la produccin de ROS en neutrfilos. Los mismos investigadores adems sugieren que la liposolubilidad podra ser una de las propiedades preponderantes para que la actividad de los flavonoides sea relevante en dicho sistema celular. Posteriormente, Limasset et al., (1999) evaluaron un grupo de 18 polifenoles y algunos de sus metabolitos putativos como algunos cidos fenlicos. Ellos observaron que los metabolitos resultaron ser inhibidores menos potentes y especficos que los compuestos parentales. Moreira y colaboradores (2007) estudiaron el efecto de cuatro flavonoides (quercetina [1], miricetina [12], canferol [17] y galangina [18]) sobre la produccin de ROS en neutrfilos de conejo estimulados con dos receptores del complemento (FcR, CR). Interesantemente, aunque la actividad de los flavonoides sobre la produccin de ROS pareci ser independiente del receptor estimulado, s mostr estar directamente relacionada con la liposolubilidad del compuesto estudiado e inversamente correlacionadaconelnmerodehidroxilospresentesenel anillo B. Como se indic previamente, debido a la alteracin en el ensamblaje del complejo NADPH oxidasa, la produccin de ROS inducida por Hp podra ser responsable de la exacerbacin del dao a la mucosa gstricaporlotanto,lapresenciadeantioxidanteseficaces en la biofase donde ocurre este fenmeno es muy importante. En estudios realizados por nuestro grupo, los flavonoides presentes en un extracto de manzana (APPE) fueron capaces de neutralizar la produccin de ROS y atenuareldaoalamucosadeanimalesinfectadosconHp (Pastene et al., 2009b). El APPE posee una importante concentracin de glicsidos de quercetina (58% del total de polifenoles), siendo la rutina [19], hipersido [20], isoquercitrina [21] y quercitrina [22] los ms importantes. Estos resultados nos permitieron concluir adems, que mientras algunos compuestos fenlicos ayudan por sus consabidas propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, otros neutralizan factores de virulencia como la ureasa, VacA y las adhesinas de este patgeno (Pastene et al., 2010). En efecto, utilizando el mismo APPE, previamente habamos descubierto que la ureasa de Hp poda ser inhibida en forma muy eficiente. Sin embargo, tal efecto
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PrincipalesblancosmolecularesdelospolifenolessobreH.pylori. Enotroestudio,sehaestablecidoqueextractosdecscara de manzana inhiben, tanto in vitro como in vivo, la activacin de AP1 y la transformacin neoplsica (Ding et al., 2004). La activacin del complejo AP1 es uno de los eventosclavesenlapromocindetumoresmediadaporla citotoxina CagA de Hp. Al respecto, se ha sugerido que los polifenolesdemanzanapodraninhibirlaactivacindeAP 1 interfiriendo con la sealizacin va MAP kinasas, ERK y JNK. Mediante experimentos de ESR, Ding et al. (2004) confirmaron el efecto estabilizador de los extractos de manzana sobre los radicales OH. y O2.. Esto ltimo sera particularmente relevante dado que, ERKs, JNKs y p38 son molculas activadas en respuesta a estmulos oxidantes. Finalmente, en estudios adicionales conducidos en ratones,losmismosautoresdemostraronquelosextractos tambin inhiben la induccin de tumores por TPA (ster


slo pudo ser asociado al otro grupo de polifenoles identificados en la manzana, las proantocianidinas (Pastene et al., 2009a). Las proantocianidinas se conocen tambin como taninos condensados y son abundantes en varias plantas medicinales como el Espino blanco, Ginkgo biloba e hiprico pero, adems son constituyentes normales de ciertos alimentos como el chocolate, vino tinto, jugo de cranberry y manzana. En dichos frutos, normalmente las cscaras y/o semillas concentran proantocianidinas y pueden ser utilizados como fuente para su obtencin a bajo costo. As, en otra iniciativa ideada por nuestro laboratorio (PFT014, Universidad de Concepcin), las cscaras de paltas fueron aprovechadas para la obtencin de un polvo enriquecido en proantocianidias con elevado poder antiuresico (Chvez etal.,2011).Esteproyectodioorigenaotrofinanciadopor Innova BioBio (2012) que tiene por objeto realizar los estudios de diferentes variedades, optimizacin del rendimiento y desarrollo de operaciones de escalamiento con el fin de calcular la rentabilidad de la produccin del extracto de cscara de palta. Sin embargo, hasta ahora, los estudios llevados a cabo con las procianidinas de manzana y palta slo nos haban permitido visualizar la importancia del grado de polimerizacin sobre la actividad inhibitoria de la enzima. Producto de estudios realizados en proantocianidinas obtenidas de otras fuentes vegetales, qued de manifiesto que la naturaleza de los monmeros que las originan y probablemente las diferentes conformaciones espaciales que adoptan en solucin, son factores crticos en su actividad biolgica. Tal situacin representa un grado de complejidad adicional y que motiv que recientemente nuestro grupo de investigacin se adjudicara el proyecto Fondecyt titulado Structure activity relationship of natural and semisynthetic proanthocyanidins as antiHelicobacter pylori molecules through the inhibition of its urease activity and adherence to AGS cells (N11110442). Esta iniciativa aborda por primera vez en nuestro pas la investigacin de interacciones qumicobiolgicas entre Hp y polifenoles, centrndose en las proantocianidinas extradas de diversas materias primas como plantas medicinales, orujos de uva, pomasa de cranberries y las cscaras de manzana y paltas, pornombraralgunas. 5.CONCLUSIONES En virtud de los antecedentes que indican que algunos polifenoles muestran una interesante actividad antiHp (ya seapromoviendounaaccinantimicrobianadirecta,obien indirectamente afectando la virulencia y/o sobrevivencia de la bacteria). Tal como se observa en la Figura 2 los potenciales blancos moleculares o sitios de accin que los compuestos polifenlicos pudieran tener como agentes destinados a complementar el manejo de la infeccin por Hp y/o de sus consecuencias. Algunos de estos blancos

moleculares (Ureasa, VacA, flagelos, adhesinas), estn siendo estudiados en profundidad por nuestro grupo de investigacin. Sin embargo, la inhibicin de otros factores altamenterelevantesyespecializadoscomolatoxinaCagA, permanecenaundifcilesdeneutralizar. Los productos fitoteraputicos y alimentos diferenciados (funcionales), debieran estar orientados en primera instancia a la prevencin y en segundo lugar a complementar las estrategias teraputicas existentes. Si bien algunos polifenoles pueden interaccionar especficamente con varios factores de virulencia de la bacteria, incluso comprometiendo su viabilidad, otros lo hacen en forma muy inespecfica. Claramente, se requiere mucha evidencia preclnica y clnica que avale la real contribucin de muchos productos enriquecidos en polifenoles en el manejo eficaz de esta infeccin y sus alcancesintrayextragstricos. AGRADECIMIENTOS Proyecto Fondecyt N 11110442, INNOVA BIOBIO 12.57 EM.TES (12.171), CONICYT Programa Formacin de Capital Humano Avanzado/ Beca de Magster en Chile, Ao Acadmico 2012 15550904, Proyecto Interno Universidad deConcepcinN212.085.0331.0 BIBLIOGRAFA:
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ARTCULODEREVISIN

COMPUESTOSNEUROACTIVOSOBTENIDOSDESDEFUENTESNATURALES:CARACTERIZACIN FARMACOLGICADENEUROMODULADORESDELSNC.
(Neuroactivecompoundsobtainedfromnaturalsources:PharmacologicalCharacterizationofCNS neuromodulators) JorgeFuentealbaArcos1,Ph.D.,LeonardoGuzmn2,Ph.D.yLuisG.Aguayo3,Ph.D

UnidaddeScreeningdeCompuestosNeuroactivos, LaboratoriodeNeurobiologaMolecular, LaboratoriodeNeurofisiologa,Departamento deFisiologa,FacultaddeCs.Biolgicas,UniversidaddeConcepcin,Chile.

RESUMEN

La bsqueda de compuestos bioactivos presentes en la biosfera, es un esfuerzo milenario de las civilizaciones que se ha enfocado a obtener productos, molculas y finalmente frmacos que ayuden a aliviar, tratar o recuperar al organismo de una situacin patolgica o anormal. Desde los egipcios (papiro de Ebers), pasando por los rabes hasta nuestros das, la fuentes naturalespresentesenlabiomasanoshanproporcionadoinvaluablesrecursos,conunaltopotencialteraputicoparasuusoen medicina humana. Claros ejemplos de irremplazables herramientas farmacolgicas, que ha impactado en el desarrollo del ser humano, son las penicilinas, la efedrina, y la cocana por ejemplo. Molculas como las mencionadas, han demostrando tener perfilesfarmacolgicosdiversosenefectosypotencias,permitiendodealgunaformalacaracterizacindereceptoresydeotra, el desarrollo de medicamentos de amplio uso (o abuso). Desde la alquimia a nuestros das, el deseo por buscar la fuente de la vida eterna, se ha transferido a la ciencia moderna, como la responsabilidad de encontrar nuevas alternativas farmacolgicas capaces de resolver los problemas asociados al envejecimiento, en especial aquellas relacionadas al deterioro fisiolgico o patolgico del sistema nervioso. Preservar en el tiempo las funciones cognitivas del individuo, o retrasar su deterioro, nos desafan permanente y urgentemente a encontrar soluciones para patologas como el Alzheimer, ELA y Parkinson, que hasta el momento, no tienen una cura definitiva. Este trabajo, revisa los principales hallazgos de nuestras investigaciones, relacionadas con la caracterizacin farmacolgica de compuestos neuroactivos obtenidos desde la naturaleza nativa del pas. Cabe mencionar, que de los compuestos estudiados, algunos como la tutina, una sesquiterpenolactona obtenida de Coriaria ruscifolia: se proyecta como un potente agente neurolptico; NE10, un neuroesteroide obtenido desde un residuo de celulosa (tail oil): como un sedante no hipntico que potencia los efectos de acepromazina; o un conjunto de polifenoles obtenidos de maqui, que han demostrado una potente actividad neuroprotectora en un modelo de Alzheimer, son parte de los resultados msrelevantescomentadosenestarevisin. Palabrasclaves:Neuroproteccin,tutina,Alzheimer,ReceptordeGlicina,ReceptordeGABAA,epilepsia.
PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCCIN Desde tiempos milenarios, el ser humano ha utilizado sus capacidades cognitivas y racionales para observar la naturaleza y encontrar en ella sustancias, preparados y finalmente frmacos de enorme relevancia para su salud, subienestar,sudesarrolloyevolucin.

As ejemplo, el papiro de Ebers, es una de la primeras referencias de medicina, donde se recopilan antecedentes de ms de 700 sustancias con aplicacin teraputica (HallmannMikolajczak 2004; York et al. 2010).

Correspondencia a: Dr. Jorge Fuentealba Arcos, Departamento de Fisiologa, Facultad de Cs. Biolgicas, Universidad de Concepcin. Barrio Universitario s/n Concepcin.POBOX160C.Telfono:560412661082.CorreoElectrnico:jorgefuentealba@udec.cl

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Pedacio Dioscrides y Galeno fueron dignos representantes de la medicina griega, que tambin hicieron significativos aportes al estudio y aplicacin de sustancias naturales en el tratamiento de enfermedades. Este proceso de conocimiento y desarrollo, detenido durante la inquisicin, reserv el estudio de las propiedades teraputicas de plantas y otras especies, a conventos y monasterios durante ese perodo (ej.: El licor monacal y el Benedictino). Los alquimistas (s XVI), fueron los responsables de dar un nuevo impulso al estudio de las
Tabla1.

sustancias de origen natural, en especial Paracelso, un alquimista pionero en su poca. De ah en adelante, el desarrollo de conocimiento basado en el estudio de los compuestos activos presentes en plantas y diferentes especies de la biomasa conocida, sufre un crecimiento vertiginoso y van apareciendo detallados estudios de principios activos que han marcado la historia de la farmacologa,comoporejemploelacidoacetilsaliclico, las penicilinas, la cocana, y otras sustancias neuroactivas que sedescribenenlatabla1.

CNVD: Canales de Sodio Voltaje Dependientes; CCVD: Canales de Calcio Voltaje Dependientes; TRVP: Receptores Vanilloides; RGly: Receptores de Glicina; RGABAA:ReceptoresdeGABAtipoA;RN:ReceptorNicotnico;RM:ReceptorMuscarnico;SK:CanalesdePotasioactivadosporCalciodeBajaconductancia.

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El estudio y caracterizacin farmacolgica de molculas, principios activos o preparados de origen natural, con actividad en el sistema nervioso, han contribuido significativamente al entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares con que se regulan las funciones neuronales, as la cocana se transformo en 1884 en el primer anestsico local utilizado en oftalmologa (Aguayo et al. 2006), por su accin bloqueadora de canales de Na+ voltaje dependientes (Strichartz 1988) y por ende, de la transmisin del impulso nervioso. Una aplicacin similar se dio al curare (S. toxifera), aplicado en anestesia general ya en la dcada de los 40s (Griffth 1942), pero esta vez con una accin bloqueadora sobre el receptor nicotnico muscular (RNM), lo que inhibe la comunicacin entre la moto neurona eferente y el msculo en la placa neuromuscular, y as la contraccin muscular (tono). Por otra parte, el bloqueo de Canales de Ca2+ voltaje dependientes (CCVD), por medio del uso de toxinas provenientes de diferentes fuentes, como caracoles marinos y araas, han permitido la caracterizacin farmacolgica y el entendimiento del rol que cumplen los diferentes subtipos de canales de Ca2+ a nivel neuronal (Olivera et al. 1984; Monje et al.1993; Olivera et al. 1994); especialmente su contribucin en los mecanismos claves de la sealizacin celular, como por ejemplo la exocitosis (Berridgeetal.2003;Garciaetal.2006). El incremento progresivo en la prevalencia de enfermedades neurodegenerativas producto del incremento en las expectativas de vida (Alzheimers Association2012),noshaobligadonuevamenteamirarlos potenciales que tiene la naturaleza, buscando en ella, alternativas teraputicas tiles en el tratamiento de enfermedadesquehoyendanotienenunacuradefinitiva o un tratamiento eficiente; Es el caso de la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Parkinson (PK). Considerandoquemuchosdeloscompuestospresentesen la naturaleza son altamente selectivos (ver tabla 1) y de altsima potencia (la mayora acta en el rango pMnM, (Aguayo et al. 2006)), es que resulta atractivo centrar los esfuerzos en obtener nuevos principios activos de origen natural, que nos permitan plantear alternativas en el desarrollofrmacos,ofitofrmacostilesenlamodulacin del SNC y en el tratamiento de las enfermedades que lo afectan. El objetivo de esta revisin es repasar los principales hallazgos cientficos obtenidos en el Laboratorio de Screening de Compuestos Neuroactivos del Departamento deFisiologadelaUniversidaddeConcepcin,enelcualse han caracterizado farmacolgicamente, una serie de compuestos neuroactivos con una potencial proyeccin hacia fitofrmacos o formulaciones nutracuticas tiles en patologas neurodegenerativas con AD y PK. Una Historia de investigacin de los ltimos 7 aos, de la que han sido

testigos las reuniones de la Sociedad de Farmacologa de Chile. TUTINAUNAPOTENTETOXINACONPOTENCIAL APLICACINCOMONEUROLPTICO/ANSIOLTICO. La tutina, es una sesquiterpenolactona que fue obtenida y purificadaapartirdelfrutomadurodeCoriariaruscifolia,y que presenta como farmacforo un anillo picrotoxoide similar a la clsica picrotoxina (figura 1A). Nuestro inters en estudiarla naci de un reporte clnico de una intoxicacin en nios que consumieron este fruto por error, y que tuvo un desenlace fatal en uno de los casos (Hoffmann1982).
Figura1.

A. Estructura qumica de picrotoxina (izquierda) y tutina (derecha), ntese las similitudes estructurales y las diferencias en los epxidos del anillo biciclo. B corrientes sinpticas espontneas de neuronas espinales en condiciones control (izquierda) y en presencia de tutina (200 M) medidas por la tcnica de patch clamp (whole cell, voltage clamp)(tomado y modificadodeFuentealbaetal.,2007).

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Curiosamente, el fruto de esta planta (aparte de ser venenoso), es dulce, lo que puede atraer la curiosidad sin la necesidad de advertir de su peligro. Esta planta ha sido denominada comnmente como maqui del diablo por sus efectos txicos en seres humanos, como mioclonias y cuadros epileptognicos (Hoffmann 1982); o matarratones, por su letalidad para roedores. En un estudio que comenzamos a realizar en 2005, determinamos que tutina (11000 M) era capaz de bloquear las corrientes glicinrgicas medidas por electrofisiologa, en neuronas espinales de ratn; esto provocaunincrementoimportanteenlaexcitabilidaddela red neuronal (figura 1B), que adems mostraba ser concentracin dependiente (Fuentealba et al. 2007); Adicionalmente, ambos hallazgos se correlacionaron estrechamente con un incremento en las transitorios de 2+ Ca intracelular (probablemente por un predominio del tono AMPArgico); y con un incremento de los niveles citoslicos de CREB fosforilado, lo que en su conjunto representaba un drstico incremento de la actividad de la
Figura2.

redneuronal.Sinduda,queestosefectosdabansustentoa las descripciones de los cuadros de intoxicacin observados (mioclonas, convulsiones y ataques epilpticos) en humanos y roedores (Fuentealba et al. 2007). Adicionalmente,enunestudioposteriordecaracterizacin de los efectos de tutina en diferentes subtipos de los receptores de glicina expresados en un modelo heterlogo (clulas HEK), pudimos establecer la diferente sensibilidad, de los distintos subtipos de receptores de glicina estudiados, a la accin bloqueante de tutina; obteniendo IC50s de 35 M y 15 M para 1 y 2 respectivamente (Figura 2A, (Fuentealba et al. 2011)). Este antecedente es sumamente importante, ya que de acuerdo a investigaciones previas, en el proceso de maduracin neuronal, los receptores glicinrgicos neuronales (espinales) inmaduros, estn conformados fundamentalmente por la subunidad2 (van Zundert et al. 2004).

A.CurvaConcentracinrespuestadetutinaenreceptoreshomomricosdeglicina1y2expresadosenclulasHEK(tomadoymodificadodeFuentealbaetal., 2011).B.Efectosdepotenciacindetutinaenunmutantedelreceptor1deglicinaresistenteaetanol,ntesequeenausenciadepotenciacindelreceptorpor etanol,tutinasiguepotencindolo(tomadoymodificadodeFuentealbaetal.,2011).

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Esto quiere decir que los nios (sistemas neuronales inmaduros) son ms sensibles al efecto de la toxina (tutina), debido a la presencia principalmente de receptores 2, lo que al cambiar en el adulto, donde la composicin principal de estos receptores esta dado por la subunidad1, hace a un adulto ms resistente o tolerante al efecto de tutina y a los nios mucho ms sensibles (Fuentealba et al. 2011). Valindonos de herramientas de biologa celular, establecimos tambin, la importancia de algunos residuos en el dominio transmembrana 2 (TM2) del receptor de glicina para la accin inhibitoria de tutina. Al igual que picrotoxina, mutaciones en este dominio cambian las propiedades de conductancia del receptor (Hawthorne et al. 2005), y la susceptibilidad a la inhibicin ejercida por tutina. Sin embargo, lo ms curioso fue observar que bajas concentraciones de tutina, sta era capaces de inducir una potenciacin de receptores homo y heteromricos, no observada con picrotoxina, y que este potenciacin ocurra por una modulacin de un sitio distinto al que utiliza etanol (figura 2B) para potenciar a estos receptores (Castro et al. 2012); esto sugiere la presencia en el receptor de un sitio especfico de alta afinidad para esta accin, y otro de baja afinidad para el efecto inhibitorio (Fuentealba et al. 2011). Esta ltima observacin, proporciona un potencial importantsimo a la tutina, que insisto no presenta picrotoxina, y que representa la base para el desarrollo de una familia de molculas con actividad neurolptica; donde por ejemplo, por medio de estudios modelamiento (Perez et al. 2011), nos permita conocer en profundidad las estructuras claves del farmacforo y del receptor, que permitan el desarrollo futuro de principios activos con la mencionada actividad y conlaventajadeseraltamenteselectivos. POLIFENOLES,NEUROPROTECCINYALZHEIMER La enfermedad de Alzheimer es una patologa neurodegenerativa caracterizada por una falla cognitiva compleja y progresiva, que hasta el da de hoy no tiene un tratamiento farmacolgico efectivo (Arroyo et al. 2002; AlzheimersAssociation 2012). Los actuales tratamientos, dependiendo de la etapa en que se apliquen, solo pueden contribuir a una disminucin en la velocidad de progresin de la enfermedad (Corbett et al.). A pesar de que los voces especializadas apuntan a desarrollar buenos biomarcadores,quepermitanadelantareldiagnosticode la enfermedad (Hampel et al. 2010), la posibilidad de encontrar en la naturaleza, nuevos compuestos tiles en esta patologa, como lo es la galantamina, es una opcin quenopodemosdescartar.Lagalantamina,esunalcaloide obtenido desde la especie Galantus nivalis (campanilla de nieve), que modula alostricamente al receptor nicotnico neuronal (7 y 34) (Arroyo et al. 2002) y ha mostrado una eficacia moderada en el tratamiento de las etapas tempranasdelaenfermedad(Corbettetal.).

En funcin de ello, nuestro grupo ha centrado sus esfuerzos en el estudio de la fisiopatologa de la enfermedad a travs del uso de modelos neuronales in vitro, y en ellos hemos caracterizado ampliamente el efecto del pptido A (Cuevas et al.; Parodi et al. 2010; Sepulveda et al. 2010). As, focalizamos nuestro inters inicial, en buscar molculas que puedan modular algunas de las vas alteradas en esta patologa, y la generacin aumentada de radicales libres en ellas (AdamVizi et al. 2006). Deacuerdoaestosantecedentes,molculasconcapacidad antioxidantes de alta potencia, que proporcionasen a la mitocondria,unsoportefrentealageneracinderadicales libres descrita en la enfermedad, se planteaba como un buen punto de partida. Por lo tanto, trabajamos en obtener un extracto enriquecido en polifenoles desde un fruto que tuviese una alta cantidad de antioxidantes (polifenoles) descrita, como por ejemplo, el arndano (Vaccinium corymbosum). As, utilizando como modelo de estudio neuronas hipocampales de rata, tratadas con pptido amiloide (A, oligomeros solubles), ensayamos los efectos neuroprotectores de un extracto de arndanos enriquecido en polifenoles, lo llamamos BB4. Incubaciones crnicas con A (24 h) mostraron una drstica reduccin de la actividad sinptica espontnea (medida por electrofisiologa), como tambin del nmero de vesculas de neurotransmisores contendidos en las clulas (inmunomarcaje de SV2, SNAP25, etc); ambos parmetros, fueron revertidos parcialmente por la co incubacin del pptido con BB4 (0.81 mg/mL), mientras que la actividad de transientes espontneas de Ca2+ citoslico, experimentaron una recuperacin entre 2530% (Fuentealba et al. 2011). Adicionalmente, observamos que el pptidoA era capaz de inducir la fuga de ATP desde el citosol al medio extracelular, lo que hasta el momento no habasidodescrito. Esta observacin, nos inst a redirigir nuestra atencin, trabajos previos de nuestro grupo, han demostrado que el pptido A es capaz de formar un poro de alta conductancia a Ca2+, silenciar la actividad sinptica y depletar los terminales sinpticos de vesculas de neurotransmisores (Parodi et al. 2010; Sepulveda et al. 2010); pero hasta el momento no se haba descrito la posibilidad de que molculas de relevancia fisiolgica escaparan del citosol a travs de este poro; por lo tanto, estudiamos si el extracto BB4 podra tener una accin sobre los niveles intra y extracelulares del ATP, de esta forma intentar asociar de alguna forma los mecanismos txicos del pptido con la disfuncin mitocondrial. As, en el efecto neuroprotector de BB4 mostr ocurrir por un mecanismo diferente a la directa accin sobre el potencial de membrana mitocondrial; de hecho, BB4 prevena eficientemente la accin txica de un desacoplante mitocondrial clsico (FCCP, 20 M) en aproximadamente un 80%, pero era incapaz de revertir el cambio en el
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potencialdemembranamitocondrialinducidoporA.Esto sugera que el efecto de este extracto transcurra por una accin previa al desbalance en la generacin de radicales libres (e interferencia con el potencial de membrana mitocondrial). Finalmente pudimos constatar, que BB4 ejerca una accin sobre el estado de agregacin de las especies oligomricas del pptidoA, con lo cual alteraba sus propiedades txicas (perforantes) y disminua as, la sobrecargadeCa2+citoslicoymitocondrial,laprdidadel potencial de membrana mitocondrial y los efectos txicos que llevaban a la muerte a las neuronas hipocamapales (Fuentealba et al. 2011). Sin embargo, esto no descarta que las propiedades antioxidantes de los polifenoles contenidosenelextracto,tenganunefectoantioxidante,y seguramente constituyen un mecanismo adicional de proteccin en etapas crnicas de uso. Con estos hallazgos pudimos plantear que BB4 podra ser un importante complemento nutricional o un coadyuvante en la prevencin de la aparicin de este tipo de patologas en individuos adultos mayores, los que nos hizo acreedores a unimportantepremioanivelnacional. Siguiendo con el razonamiento anterior, respecto a la actividaddelospolifenolescontenidosenespeciesyfrutos nativadeChile,yconunavisindedesarrolloquepotencie suriqueza,quisimosestudiarunosdelosfrutosnativosdel pas que tiene descrito, un alto contenido de molculas polifenlicasyunapotentecapacidadantioxidante(Rubilar et al. 2011), y por ello nos enfocamos en el maqui (Aristotelia chilensis). Preparamos como en el caso anterior, con la ayuda del laboratorio de Qumica de Productos Naturales de la Facultad de Cs. Naturales y Oceanogrficas de nuestra Universidad, un extracto a partir de fruto fresco maduro enriquecido en polifenoles (MQ), y ensayamos sus capacidades neuroprotectoras en nuestro modelo neuronal de neurodegeneracin. ObservamosqueMQeracapazdeprotegeralasneuronas, manteniendo la viabilidad celular (MTT) en un 95% frente al estimulo txico deA (0.5 M, 24 h), lo que se asoci a un mantenimiento de la citoestructura neuronal. En paralelo, parmetros de actividad de la red neuronal como 2+ son la frecuencia de oscilaciones transitorias de Ca citoslico (Figura 3A) y la actividad electrofisiolgica espontnea (Figura 3B), tambin presentaron una proteccin frente al estimulo txico de A; mientras que un efecto similar se observ en el inmunomarcaje de protenasclavesdelaexocitosis(SV2). Finalmente, estudios cinticos y de fluorescencia, demostraron que el extracto MQ tiene una alta potencia en cambiar el estado y la velocidad de agregacin del pptidoA, impidiendo la formacin de especies txicas y favoreciendo la sobrevida neuronal con una mayor eficiencia de lo que habamos observado previamente con BB4.

Figura3.

A. Registros originales de las oscilaciones transitorias de Ca2+ citoslico registradas por microfluorimetra (Fluo4AM) en neuronas hipocampales de rata, en presencia de A (0,5 M) y MQ (0,81 mg/mL, B. Corrientes sinpticas espontneas obtenidas por patch clamp en similares condicionesqueenA.(tomadoymodificadodeFuentealbaetal,2012).

Tomando en consideracin estos hallazgos, continuar con el desarrollo de productos naturales que permitan mejorar la calidad de vida de las personas, constituyen un hito relevante, ms an si esto se alcanza con investigacin nacional, con fuentes naturales nativas del pas, y con recursospblicosdeapoyoalainvestigacin.

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Ello proporciona un valor agregado al conocimiento cientfico generado, y as mismo, a las potencialidades de desarrollo tecnolgico e innovativo del pas. El uso de extractos enriquecidos en polifenoles, pueden representar unaimportanteutilidadenlaprevencindeenfermedades neurodegenerativas, por medio de un consumo permanente de frutos o preparados nutracuticos, de forma de mantener una alta calidad en la ingesta de alimentos, y a la vez nos permite desarrollar un paradigma similar al propuesto al consumo moderado de vino tinto, que se ha establecido como un reductor de riesgo cardiovascular en su consumo crnico. Siguiendo este razonamiento, estamos en condiciones de plantear que el consumo crnico de maqui y sus polifenoles ayudaran a reducir el riesgo de padecer o retrasar la aparicin de enfermedadesneurodegenerativastipoAlzheimer. SEDANTES,AGENTESDOPAMINRGICOSY MODULADORESNICOTNICOS Sin duda que el espectro de usos y aplicaciones farmacolgicas de los compuestos presentes en la naturaleza, con accin en el sistema nervioso central son mltiples; as, hemos desarrollado estudios con un derivado esteroideo de progesterona obtenido desde un residuo industrial forestal, que es capaz de potenciar los efectos sedantes de acepromazina y se proyecta como un posible coadyuvante inductor de anestesia en medicina veterinaria. Adicionalmente, un compuesto purificado desde la hoja de un rbol nativo chileno, ha demostrado una accin dopaminrgica muy importante y selectiva, lo que proyecta su uso hacia el desarrollo de anlogos con aplicacin en la enfermedad de Parkinson. Y por ltimo, nuestras recientes investigaciones nos han permitido caracterizarlosefectosdeunalcaloideobtenidodesdeuna especie considerada maleza, que crece en nuestros campos, y que tiene una potente accin neuromoduladora y protectora, la cual cursa sus efectos a travs de un receptor nicotnico neuronal y que se encuentra an en fasedeestudio. Por tanto, podemos concluir que utilizando los modelos adecuados, y haciendo las preguntas correctas a los modelos de estudio, podemos alcanzar resultados con una importante proyeccin para el desarrollo de nuevos preparados nutracuticos o fitofrmacos de aplicacin en la prevencin y cuidado de patologas que afectan al SNC. Sin duda la evidencia obtenida por cientficos en todo el mundo y los aportes que hemos hecho en nuestro laboratorio, apuntan a que las fuentes naturales nos pueden proporcionar una gama de molculas neuroactivas altamente potentes y selectivas que potencien el desarrollo de la farmacologa desde las fuentes originales: lanaturaleza.

AGRADECIMIENTOS: LaasistenciaeditorialdeLaurie Aguayo,hasido claveenel desarrollo de estos trabajos. La asociacin con el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas de la Universidad de Concepcin, Dres. Claudia Prez, Jos Becerra y Mario Silva, ha sido clave en la obtencin de los extractos, y por ende, en la consecucin de estas investigaciones. Estas investigaciones han contado con el apoyo financiero de Innova Biobo (05B1397L7), Fondecyt (11090091 JF) y la UniversidaddeConcepcin(DIUC208.033.102.1.0) BIBLIOGRAFA:
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ARTCULODEREVISIN

AVANCESENLASINVESTIGACIONESFARMACOLGICASYTOXICOLGICASCONELEXTRACTO ACUOSODELACORTEZADELRBOLDEMANGO(MangiferaindicaL.).
(Advancesinpharmacologicalandtoxicologicalinvestigationswiththestembarkaqueousextractofthe mangotree(MangiferaindicaL.) GabinoGarrido,Ph.D.yMariselaValds,M.Sc.
DepartamentodeCienciasFarmacuticas,FacultaddeCiencias,UniversidadCatlicadelNorte,Antofagasta,Chile.

RESUMEN

El extracto de Mangifera indica L se usa en la prctica etnomdica para la mejora de la calidad de vida de pacientes con diferentes patologas. El presente estudio pretendi hacer una revisin de los avances que han tenido las investigaciones farmacolgicas y toxicolgicas llevadas a cabo con un extracto acuoso estandarizado de la corteza del rbol de mango. Se revisaron las publicaciones de la composicin qumica principal, que comprende un total de nueve derivados polifenlicos y diferentesmicroelementoscomozinc,cobreyselenio.Elextractodemostr,fundamentalmente,actividadesantioxidante,anti inflamatoria e inmunomoduladora, analgsica y antialrgica, con un mecanismo de accin relacionado con la capacidad 2+ secuestradora de especies reactivas de oxgeno y de interaccin con Fe , la inhibicin de la produccin de citocinas pro inflamatorias, IgE y eicosanoides, de la actividad de fosfolipasa A2 y ciclooxigenasa 2 y de la activacin del NFB. Segn los reportes revisados, el extracto es seguro para su administracin en humanos debido a su bajo potencial de toxicidad. Se realizaron varios estudios clnicos aleatorizados, estudios piloto, serie y reporte de casos con diferentes formas farmacuticas quecorroboraronloshallazgosencontradosenlafasepreclnicaoaportaronnuevosconocimientosqueleatribuyenalextracto unvaloragregadoimportante. Palabrasclaves:Mangiferaindica,Mango,Vimang,Farmacologa,Toxicologa,Estrsoxidativo,Inflamacin,Dolor
PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCCIN El mango (Mangifera indica Linneo, Anacardiaceae) es uno de los frutos ms importantes desde el punto de vista econmico(FAO,2012). El producto principal del rbol de mango es el fruto maduro entero, que puede ser consumido crudo o procesadoenunavariedaddeproductosquegarantizanun suministro constante del fruto durante todo el ao (Singh, 1990). Industrialmente, hay tres partes de inters del fruto del mango a saber: la pulpa, la cscara y la semilla. Tradicionalmente la pulpa de mango es el principal punto focal de la utilizacin del fruto a escala industrial. Esta es un intermediario importante para la produccin de bebidas, como un ingrediente saborizante en la industria lctea y en formulaciones de alimentos para bebs (Nanjundaswamy, 1998). Su composicin qumica vara dependiendo de muchos factores como la variedad, la localidad,elclima,ylaetapademadurez. Enelprocesoindustrialdelfrutoseobtienensubproductos como la piel y la semilla (carozo y nuez o almendra), que representan aproximadamente el 3560% del fruto.

Correspondence to: Dr. Gabino Garrido,Q.F., Departamento de Ciencias Farmacuticas, Facultad de Ciencias, Universidad Catlica del Norte, Angamos 0610, Antofagasta,Chile.Tel.:5655355631,Correoelectrnico:ggarridog@ucn.cl

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Estos se descartan como desechos y se convierten en una fuente de contaminacin debido a las altas concentraciones de compuestos fenlicos residuales (y el alto costo que representa su tratamiento), que pueden tener efectos ambientales perjudiciales, principalmente debido a que estos compuestos podran inhibir la germinacin de las semillas. Recientemente (Maisuthisakul & Gordon, 2009), se mostr que la cscara constituye aproximadamente entre el 1520% de la fruta, mientras que las semillas representan del 2060% del peso de la fruta entera, dependiendo de la variedad de mango, y el ncleo interior de la semilla de 4575% de la semilla entera. Estos subproductos del mango se han estudiado comoantioxidante(Abdallaetal.,2007;Dortaetal.,2012), antibacteriano (Vaghasiya et al., 2011), hipoglucemiante (Rajesh et al., 2008; Gupta & Gupta, 2011), anti hipercolesterolmico (Anila & Vijayalakshmi, 2002) e inductor de apoptosis (Kim et al., 2012), entre otros. Por ejemplo, la cscara de mango es una fuente rica de compuestos bioactivos como los polifenoles, carotenoides, vitaminas C y E, fibra diettica y enzimas. Adems, la cscara de mango podra ser una fuente rica de compuestos bioactivos, y enzimas tales como proteasa, peroxidasa y polifenol oxidasa (Mehrnoush et al., 2012). Esta cscara, si es convenientemente procesada, podra proporcionar productos tiles con los que se pudieran equilibrar los costes de tratamiento de residuos y tambin disminuir el costo del producto principal. Por lo tanto, existe un margen para el aislamiento de estos ingredientes activos y tambin el uso de cscara de mango como un ingredienteenproductosalimentariosprocesados. Asimismo, la almendra de la semilla contiene aminocidos esenciales, protenas, grasas, carbohidratos, fibra, y es una buena fuente de polifenoles, fitoesteroles como campesterol, sitosterol y tocoferoles y est libre de materiales txicos como el cido cianhdrico (Ajila et al., 2007). Debido a las investigaciones anteriores, se ha sugerido que la almendra de la semilla de mango podra ser utilizado como una fuente potencial de ingredientes alimentarios funcionales (Khammuang & Sarnthima, 2011), que pudieran ser comercialmente valiosos en la industria delaceitevegetalyenconfitera,entreotros(Pereiraetal., 2011). Las hojas y la corteza del rbol tambin han sido utilizadas paradiferentesfines,fundamentalmentemedicinalesysus aplicaciones cubren un amplio espectro de enfermedades, pero las citadas con mayor asiduidad son los dolores (menorrgicos, dentales, musculares y articulares), las infecciones cutneas (escabiosis, epidermofitosis, micosis), las diarreas, la sfilis, la tuberculosis y algunas enfermedadescrnicas,talescomoladiabetesylaanemia. El uso de la corteza del rbol de mango como materia

primavegetalparalapreparacindeextractosacuosospor diferentes vas (maceracin, percolacin, decoccin e infusin), forma parte de la cultura popular en ms de 30 pases, fundamentalmente de los llamados del Tercer Mundo, segn reportes documentados desde hace ms de 200aos(Napralert,2007). En los ltimos 12 aos ha habido un auge en las publicaciones relacionadas con las actividades farmacolgicas de diferentes extractos, obtenidos de diversas partes del rbol de mango, pero ha sido el extracto acuoso de la corteza del rbol el que ms ha llamado la atencin de un grupo de cientficos que ha publicado cerca de 80 artculos relacionados con la tecnologa qumica y farmacutica, la composicin qumica y, principalmente, la evaluacin farmacolgica preclnica, la toxicologa y los estudios clnicos; as como el papel que desempea en la actividad farmacolgica del extracto la xantona glicosilada mangiferina, que constituye el componentemayoritariodentrodeste. En esta revisin se analizarn los avances realizados en las investigaciones farmacolgicas y toxicolgicas llevadas a cabo con el extracto acuoso de la corteza del rbol de la especie Mangifera indica (mango) y su utilidad potencial en diferentes patologas. Esta hiptesis es soportada por evidencias preclnicas y clnicas importantes, tanto para el extractocomoparalamangiferinapresenteenste. ESTUDIOSETNOBOTNICOSYETNOMDICOS El rbol del mango es perenne y alcanza de 1530 m de altura, puede vivir por ms de 100 aos y desarrollar un tronco con ms de 4 m de dimetro. El origen del mango ha sido establecido en Asia, particularmente en la regin IndoBurmese, en las laderas del Himalaya (Tjiptono et al., 1984). El fruto se cultiva desde los tiempos prehistricos, hace ms de 6 000 aos, siendoconsiderado como el fruto tropical ms antiguamente cultivado por el hombre. Aparecen referencias al mango en las Sagradas Escrituras en Snscrito, las leyendas y el folklore hind 2 000 aos a.C. y se refieren a l como de origen antiguo. En la India, el rbol de mango ha sido objeto de gran veneracin (Sawangchoteetal.,2009). Lasracesdelvocablo,porunladosesealaquelapalabra en snscrito para el mango es amra, lo que significa "de la gente"o"delpueblo",ysesealaasporquefueregistrado en ese idioma por primera vez en la historia de la humanidadhacemsde4000aos. Por otra parte, se dice que el nombre del fruto, as como delrbol,derivadelportugus"manga"queserefiereaun
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trmino malayo que se pronuncia "mangga" o "mangka", asonancias que se encuentran sobre los pendientes del Himalaya y como consecuencia, la transposicin en las diferenteslenguasmodernasconservalaradical"mango". Por tanto, las diversidades de nombres para el mango en todo el mundo reflejan las culturas y los idiomas hablados por las personas que lo cultivan (Bally, 2006). Muchos de los nombres tienen derivaciones comunes, lo que refleja losorgenesylapropagacindelrboldemangojuntocon el crecimiento de las comunidades humanas. Por ejemplo, en las islas del Pacfico esta especie es conocida comnmente como idele (Palau), kangit (Chuuk, Pohnpei), mago (Niue, Samoa, Tuvalu), manako (Hawaii), manggo, am (Fiji), mangko (Kiribati), mango (Ingls), mango (Tonga), mangot, mangue, manguier (Francs), mangueira (Yap) y en otras regiones como aam, am, amb (Hindi), ampleam (Tamil), bobbie manja, kanjanna manja, maggo, manggaboom, manja (Holands), ma muang (Indochina), mamung (Tailandia), manga, mango (Espaol), manga, (Portugus), manga, mempelam, ampelam (Malasia), mangga (Tagalog), mangga, mempelam (Indonesia), mango (Ilokano), mango (Nueva Guinea, Pidgin), Mangobaum (Alemn), mwngx (Laos), paho (Bisaya, Filipinas), svaay (Cambodia), tharyetthi (Myanmar), xoi (Vietnam). Entre los frutos tropicales comercializados internacionalmente, el mango ocupa el tercer lugar slo superado por el pltano y la pia, tanto en cantidad como en valor (Yaacob & Subhadrabandhu, 1995) y el quinto de laproduccintotaldeloscultivosfrutalesmsimportantes del mundo (FAO, 2012). La produccin mundial de mangos se estima en ms de 26 millones de toneladas por ao. La Indiaocupaelprimerlugarentrelospasesproductoresdel frutodemangoenelmundo,querepresentanel54,2%del total de estos frutos producidos en todo el mundo y es comercialmenteelcultivofrutcolamsimportantedeeste pas, con ms de mil variedades conocidas hasta la fecha. Durante el perodo 20082009 este pas produjo alrededor de 13,6 millones de ton., el segundo lugar lo ocup China (~4 millones ton.), seguido de Tailandia (2,5 millones de ton.), Indonesia (2,2 millones ton., Mxico (~1,9 millones ton.), Pakistn (~1,8 millones ton.) y Brasil (~1,2 millones toneladas). Otros pases productores importantes de mango son: en Asia, China y Filipinas; en frica, Nigeria, Egipto, Congo, Costa de Marfil, Sudfrica y Ghana y en Amrica Latina, Hait, Cuba, Colombia, Venezuela, Ecuador yPer(FAO,2012). Las diferentes partes del rbol de mango tambin se han utilizado por sus propiedades medicinales. Alrededor del 80% de la poblacin mundial, principalmente de los pases no desarrollados, tienen en los extractos de productos naturales y sus derivados su primera opcin para el tratamiento teraputico en la Atencin Primaria de Salud (Mahadi, 2001). Las hojas de mango en Tonga se usan

como infusiones y se utilizan junto con la naranja y otras especies para hacer una pocin para el tratamiento de las recadas durante alguna enfermedad (Thaman & Whistler, 1996).EnGhanasehiervenlashojasconfrutascortadasde Citrus aurantifolia contra la malaria (Asase et al., 2010). Tambin en Nigeria se utilizan las hojas contra esta enfermedad (Aiyeloja & Bello, 2006, Ene et al., 2010), como febrfugo (Idu & Onyibe, 2007) y contra la diabetes (Gbolade, 2009). En la India, la diabetes tambin ha sido tratada con una bebida hecha a partir de la infusin de las hojas frescas (Natarajan et al., 2010). Estas hojas frescas tambinseutilizanparacombatirlosvmitos,ladiarrea,el dolor estomacal, el agrietamiento de pies (Rout & Panda, 2010) y el clera (Kar & Borthakur, 2008). El jugo de stas se aplica localmente en los ojos para la conjuntivitis (Upadhyay et al., 2010), problemas gstricos, lceras y diarrea. (Das et al., 2008). Tambin la diarrea y la disentera son tratadas con extracto de las hojas (Kalita & Bora,2008;Biradar&Ghorband,2010;DeWetetal.,2010; Upadhyay et al., 2010). Adems, stas son usadas para tratar las erupciones de la lengua (Jain et al., 2010), en cataplasma para cicatrizar heridas recientes o crnicas (Agyare et al., 2009) y en forma de polvo para aumentar la fortaleza de los dientes (Natarajan et al., 2010). Hervidas en agua se usan como estimulante, aplicadas en el bao despus del parto (Rajith et al., 2010) o para tratar el reumatismo (Silja et al., 2008) y mezcladas con hojas de Ficus bengalensis y Ficus religiosa se usan contra el sangramiento (Ponnusamy et al., 2009). En Brasil se empleancontrainfeccionesvaginales,sfilis,gripecontosy congestin (CoelhoFerreira, 2009). En Camern la decoccin de las hojas tiernas se aplica contra la tos, el dolor de garganta y el asma (Focho et al., 2009b; Noumi, 2010). En la India y Pakistn se utiliza la pulpa del fruto contra la ictericia y el hepatitis (KhanMarwat et al., 2012; Pawar, 2012). Tambin en la India, la pulpa del fruto se reporta para tratar la malnutricin y el desbalance en la dieta (Singh et al., 2007; Pushpangadan & George, 2010), el estreimiento (Satapathy, 2010), la tos (Gupta et al., 2010) y la picadura de escorpin y como remedio para el agotamiento y el golpe de calor (Upadhyay et al., 2010). La mitad del fruto muy maduro se come con sal y miel y se utiliza para el tratamiento de trastornos gastrointestinales, biliares, de la sangre y el escorbuto. Los mangos maduros sonunaricafuentedevitaminaAyseutilizanparatratarla deficiencia de esta vitamina, como la ceguera nocturna (Pushpangadan & George, 2010). Muchos de los usos tradicionales medicinales del mango en la India implican comer el fruto verde. Debe tenerse en cuenta que el fruto verdecontieneunagrancantidaddelasaviatxica(Rozas Muoz et al., 2012) que cuando se consume en exceso puede causar dermatitis alrgica, irritacin de la garganta, indigestin,disenterayclicos.
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La resina del rbol tambin se aplica en la India sobre las encas y los dientes dos veces al da contra la piorrea (Shukla et al., 2010), el agrietamiento de pies y piel, vmitos, diarrea y dolor estomacal (Natarajan et al., 2010; Rout & Panda, 2010), extraccin de diente (Patil & Patil, 2010), picadura de escorpin (Kulkarni & Adwit, 2011) y desrdenesdelapiel(Prashantkumar&Vidyasagar,2008). Desde el punto de vista etnomdico, en la India, la almendra de la semilla se emplea para tratar la diarrea crnica (Tetali et al., 2009), el asma, para expulsar lombrices y otros gusanos en las lceras (Rajendran et al., 2008a) y para problemas urinarios (Ballabh et al., 2008). Adems, se ha reportado para curar los vmitos y la disentera (Silja et al., 2008). Se ha observado que tradicionalmente en las tribus de la India comen la almendra de la semilla del mango asada durante algn perodo de inanicin, por su contenido de almidn. El polvo de la almendra tambin es usado como astringente en sangramientos. Por lo tanto, se supone que es adecuadoparaelconsumohumano(Ramtekeetal.,1999). La corteza del rbol en Samoa, ha sido un remedio tradicional, como infusin, para las infecciones de la boca en los nios (Thaman & Whistler, 1996). En la India, los extractos acuosos de la corteza se utilizan para la diarrea y en gargarismos para los trastornos de garganta, lceras bucales y olor ftido bucal (Ganesan, 2008). Tambin la corteza se usa como anticonceptivo (Henry et al., 1996; Bhogaonkar & Kadam, 2006), astringente, aperitivo, antihelmntico, contra la gonorrea, el asma, afrodisaco, para prolongar la eyaculacin (Kadavul & Dixit, 2009; Jain et al., 2010) y mezclada con otras plantas contra la insolacin y el clera (Pooman & Singh, 2009). La decoccin de la corteza fresca (Upadhyay et al., 2010) o seca se emplea contra la diarrea y la disentera (Nath & Choudhury, 2010; Purkayastha et al., 2007) y la difteria (Pawar & Patil, 2007a). El jugo de la corteza se utiliza contralaictericia(Sarkar&Das, 2010)ylacortezadeltallo como cicatrizante (Kuvar & Bapat, 2010). En Camern, la corteza del tallo se usa contra el asma (Noumi, 2010), el reumatismo (Jiofack et al., 2008) y la sfilis (Focho et al., 2009a), en Nepal contra los dolores abdominales, disentera, diarrea, hepatitis, enfermedades de la piel, como antiparasitario y antiespasmdico (Ghimire & Bastakoti, 2009), en Ghana como cataplasma en heridas recientes o crnicas (Agyare et al., 2009), en Uganda contra la tuberculosis y el VIHSIDA (Lamorde et al., 2010; Tabutietal.,2010),enNigerialadecoccinseusacontrala malaria(Eneetal.,2010)yenBrasillainfusinseaplicaen quistes de ovario, mioma uterino y contra la tos (Coelho Ferreira,2009). USOETNOMDICOENCUBA Como se ha visto, existe un conocimiento etnomdico documentado del uso de la corteza del rbol de mango en

varios pases y, en particular, de la experiencia acumulada durante ms de 30 aos en la poblacin cubana (Guevara Garcaetal.,2004). Elusoespecficodelextractoacuosodelacortezadelrbol de mango (ECAM) en Cuba se ha realizado de manera emprica y mediante la experiencia acumulada por practicantes de la medicina natural y tradicional (Guevara Garca et al., 2004), cuyo trabajo ha sido el punto de partidaparalas investigacionesyeldesarrollodeunalnea de productos naturales denominada Vimang. A partir de dicho extracto y en dependencia del estado del paciente que se somete a este tratamiento popular, las personas han empleado formulaciones artesanales del ECAM como ladecoccin conel2%deslidostotales,parasuingestin por va oral en dosis de 30 mL, 34 veces al da; la locin tpica hidroalcohlica (alrededor del 5% de etanol), a partirdeladecoccin,queseaplicasobrelaslesionesdela piel, 34 veces al da, con un tiempo de aplicacin alrededor de los 30 min; la solucin hidroalcohlica (alrededor del 2% de etanol), a partir de la misma decoccin, que se aplica como un lavado vaginal o un enema rectal (entre 3 y 5 mL), 34 veces al da; y el ungento hidrfilo que contiene alrededor del 30% de la decoccin y que se aplica de forma independiente o posterior a la locin tpica sobre las lesiones de la piel. El tiempo de tratamiento ha sido variable y depende del paciente, con un promedio entre los seis meses y varios aos, segn el tipo de enfermedad. Estudios etnomdicos, publicados de forma parcial (Tamayo et al., 2001; Nez Sells,2005),hanreportadoqueelextractofueefectivoen patologas como diabetes mellitus tipo II, hiperplasia prosttica benigna, dermatitis, Lupus eritematoso, diferentes tipos de neoplasias, polineuropatas, hemorroides, cervicitis, as como infertilidad (fundamentalmente femenina), en algunos casos con remisintotaldelaenfermedad. COMPOSICINQUMICADELEXTRACTOACUOSODELA CORTEZADELRBOLDEMANGO El extracto es preparado por decoccin por una hora y posteriormente es concentrado por evaporacin y secado por spray died para obtener un polvo fino de color caf (ECAM), el cual funde a 210215 C con descomposicin (AcostaEsquijarosa et al., 2009). El ECAM es el ingrediente farmacutico activo estandarizado que se utiliza para la fabricacin de las formulaciones Vimang (ArsPampin et al., 2003; LemusRodrguez et al., 2006). La composicin qumica del extracto ha sido caracterizada por mtodos cromatogrficos (planar, lquido y gas), espectrometra de masa y espectrofotometra UVVis (Nez et al., 2002; 2007a,b; NezSells, 2005) y se podra resumir de la manerasiguiente: Polifenoles (3545%): mangiferina (componente mayoritario),cidoglico,cido 3,4dihidroxibenzoico,
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metil ster del cido glico, propil ster del cido glico, (+)catequina,()epicatequina,cidobenzoicoy propilsterdelcidobenzoico. Terpenoides (2530%): elemeno, selineno, guaieno, aromandreno, hinesol, edesmol, cicloartranoles, ledol, taraxerol, chamigreno y bulnesol. Esteroides(13%):Sitosterolycampestrol. Azcares libres (58%): galactosa, glucosa, arabinosa y fructosa. Polialcoholes(35%):sorbitol,mioinositolyxilitol. cidos grasos (13%): mirstico, palmtico, linoleico, oleico,esterico,eicosatrienoico,succnicoymalnico. Elementos (1%): calcio, magnesio, potasio, hierro, selenio,cobreyzinc.

publicacionesrelacionadasconelECAM,tambinserealiz una bsqueda de artculos en las BD PubMed, Scielo y DOAJ.

EVIDENCIAS FARMACOLGICAS PRECLNICAS REPORTADAS PARA EL EXTRACTO ACUOSO DE LA CORTEZADELRBOLDEMangiferaindica. Del total de las publicaciones relacionadas en el rea de Farmacologa y Toxicologa, encontradas en la BD de ISI Web of Knowledge, desde 1988 hasta junio de 2012, alrededor del 35% corresponde a los estudios llevados a cabo con el ECAM, que constituye el ingrediente farmacutico activo de las formulaciones farmacuticas que se comercializan en Cuba bajo la marca Vimang y registradas como nutracutico y medicamento de origen natural para su uso en procesos inflamatorios y de dolor. Paralaobtencindeunacoberturamsampliadeltotalde
Figura1.

ACTIVIDADANTIOXIDANTE Los resultados de la evaluacin de las propiedades antioxidantes del ECAM han sido publicados ampliamente (Martnez Snchez et al., 2000a,b; 2001a,b; 2003; Loy et al.,2002;Garridoetal.,2008). Han sido reportadas acciones de ECAM como: captura de cido hipocloroso, captura del radical superxido, captura de radical hidroxilo, accin quelante de hierro, efecto anti oxidante sobre ADN, inhibicin de la peroxidacin lipdica (IPL) espontnea, IPL catalizada por hierro, IPL microsomal (IPLM), IPLM catalizada por hierro, proteccin a la prdida de grupo sulfhidrilo (SH) proteicos, proteccin a la aparicindegrupocarbonilo(CO)proteicoseinhibicindel dao por isquemia/reperfusin heptica en ratas y en cerebro de Gerbil. Todas estas acciones fueron logradas a bajasconcentracionesdelextracto. La comparacin de la actividad antioxidante de ECAM con relacin a otros compuestos antioxidantes reconocidos tales como las vitaminas C y E, as como el betacaroteno, demostr que el extracto es similar (inhibicin a la peroxidacin lipdica) o superior (proteccin al dao oxidativo) a dichos compuestos (MartinezSanchez et al., 2000b). La posible explicacin del mecanismo molecular a travs del cual el ECAM ejerce su efecto antioxidante se muestraenlaFigura1.

Efectodelextractodelacortezadelrboldelmango(ECAM)sobreelbalanceredox.

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Muchospolifenolesfundamentansuactividadantioxidante no slo en la capacidad de secuestrar radicales libres, sino en su habilidad de acomplejar el hierro (Perron & Brumaghim, 2009; Chobot & Hadacek, 2010). El hierro es uno de los microelementos de mayor importancia para el organismo humano. Su capacidad de transitar por varios estadosdevalencialoconvierteenelementoesencialpara la actividad biolgica de un nmero relevante de molculas, de forma particular, aquellas que participan en reacciones de transferencia de electrones. Al mismo tiempo, esta habilidad lo transforma en un elemento con un peligro potencial, al catalizar la formacin de ERO, especialmente el radical hidroxilo, a travs de la reaccin de FentonHaberWeiss. El organismo ha desarrollado un mecanismo sensible para regular las concentraciones de hierro y evitar su participacin en procesos redox no deseados. En un nmero importante de patologas, esta delicadamaquinariaregulatoriaseveafectadaporfactores endgenos y exgenos y se producen acumulaciones del metal en tejidos y rganos, con el consiguiente dao oxidativoyalteracindelafuncindelaclula. En estudios recientes (PardoAndreu et al., 2005a), se demostr que el ECAM protegi las membranas mitocondrialesdeldaooxidativoinducidoporFe2+.LaCI50 del extracto frente a la peroxidacin lipdica inducida por 2+ Fe fue ms de 10 veces inferior a la CI50 cuando en lugar del hierro se utiliz, como inductor, el perxido de ter butilo (TBOOH). De la misma manera, el ECAM estimul la autoxidacin del Fe2+ a Fe3+ e impidi la reduccin de la forma frrica a la ferrosa por el cido ascrbico. La interaccin del ECAM con el hierro, incapacita al metal de participar en la generacin del radical libre hidroxilo a travs de la reaccin de Fenton. Adems, el ECAM mostr una potente inhibicin de la degradacin de la 2 3+ deoxiribosa mediada por Fe /EDTAascorbato 3+ Fe /EDTAhipoxantina/xantina oxidasa. El incremento en la concentracin de los ligandos utilizados (EDTA o citrato) caus una disminucin significativa en el efecto protector del ECAM (PardoAndreu et al., 2006a). Cuando el ascorbato se reemplaz por el radical anin superxido (formado por la actividad de la enzima xantina oxidasa/hipoxantina), la eficiencia protectora del ECAM estuvo inversamente relacionada con la concentracin de EDTA. Estos resultados indicaron que el ECAM no solo bloque la degradacin de la 2deoxiribosa a travs del secuestro de radicales hidroxilos, sino que parece actuar principalmente a travs del acomplejamiento de iones hierro, lo que previene su participacin cataltica en la reaccindeFentonHaberWeiss. La mangiferina (MF), por su abundancia relativa dentro del ECAM, parece ser la responsable principal de este comportamiento del extracto (PardoAndreu et al., 2005b; 3+ 2006a). El complejo MFFe (2:1) increment la capacidad secuestradora del radical superxido y la citoproteccin de

hepatocitos aislados expuestos a hipoxiareoxigenacin en comparacin con la MF sola. Adems, estudios in vivo de sobrecarga de hierro (PardoAndreu, et al., 2008) mostraron que el ECAM y la MF mejoran los indicadores sricosdecapacidadantioxidanteydaooxidativoenratas sometidasalaadministracini.p.deFedextrana;almismo tiempo que disminuyeron la acumulacin heptica de este 3+ metal. Tanto el ECAM como el complejo MFFe tambin fueron capaces de aumentar la viabilidad celular cuando clulas de tbulo proximal HK2 fueron expuestas a diferentes concentraciones de As (Garrido et al., 2012). Adems, se sabe que parte del mecanismo de dao que provoca el As es a travs de un componente de estrs oxidativoimportante(Flora,2011). En otro estudio (Remrez et al, 2005), se demostr que el ECAM no result citotxico en hepatocitos aislados de ratas en el rango de concentraciones de 51 000 g/mL despus de 24 h de exposicin de las clulas a ste. En ese modelo celular slo se observ un efecto citotxico moderado a las concentraciones de 500 y 1 000 g/mL cuando los hepatocitos fueron expuestos al extracto durante 72 h. Posteriormente, se public el potencial antioxidante del ECAM sobre los hepatocitos en cultivo lo que permiti evidenciar la actividad antioxidante del extracto en ese modelo experimental, como forma de evaluarsuefectosobredichorgano(Rodeiroetal.,2007). El ECAM fue capaz de reducir la peroxidacin lipdica en el cultivo y reverti significativamente la peroxidacin inducida por TBOOH, lo que se comprob por la disminucin de la produccin de MDA y un incremento de lasconcentracionesdeGSHanivelcelular. Por otra parte, otros estudios (PardoAndreu et al., 2005c) han mostrado que la acumulacin de productos de oxidacin de la MF (productos generados a partir de su accin antioxidante) induce la transicin de permeabilidad mitocondrial (TPM), debido a la capacidad que tienen de disminuir el contenido de grupos tilicos de la membrana mitocondrial, as como del glutatin. Estos productos, de posiblenaturalezaquinnica,sonelectrfilosdbilesconla capacidad de reaccionar con los grupos SH. Resultados similares se obtuvieron tambin para el ECAM (Pardo Andreu et al., 2006c). Este comportamiento debe beneficiar a aquellas clulas expuestas a una sobreproduccindeERO,comosucedeenalgunostiposde clulas cancergenas, en las cuales el desencadenamiento de la apoptosis mediada por TPM podra representar un mecanismo de defensa significativo para el organismo portador. Tambin se ha reportado que la MF manifest un efecto hepatoprotector contra el dao heptico inducido por tetracloruro de carbono. En este mismo estudio, la MF present una fuerte actividad antioxidante mediante el ensayo del 1,1difenil2picrilhidracilo (DPPH) (Pauletti et
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al.,2003;Daretal.,2005),loquefundamentloshallazgos de las propiedades secuestradoras de radicales libres in vitrodeestepolifenol. Por otra parte, MF ha demostrado efecto secuestrador del radical superxido producido por los sistemas hipoxantina xantina oxidasa y metosulfato fenazinaNADH; pero no fue capaz de inhibir la actividad de la xantina oxidasa, determinada por la produccin de cido rico como sustrato, ni modificar la respuesta contrctil inducida por fenilefrina o steres de forbol (como PMA) en anillos articos de rata (Leiro et al., 2003). Sin embargo, su aglicona noratiriol inhibi la generacin del anin superxido inducida por formilmetionilleucilfenilalanina (fMLP) y el consumo de O2 en neutrfilos de rata (Hsu et al., 1997). En un sistema libre de clulas, generador de radicales de oxgeno, noratiriol inhibi la generacin de superxido durante la autoxidacin del cido dihidroxifumrico y en el sistema xantinaxantina oxidasa. 2+ Noratiriol inhibi el aumento de Ca inducido por fMLP y la formacin de inositol trifosfato, as como las actividades de la fosfolipasa C citoslica de neutrfilos y la NADPH oxidasa. Los autores afirmaron que el noratiriol contribuye alareduccinderadicalessuperxidoatribuida albloqueo de la va fosfolipasa C, la atenuacin de la fosforilacin de la protena de tirosina inducida por fMLP y a la supresin de la NADPH oxidasa a travs de la interrupcin del transportedeelectrones. ACTIVIDADANTIINFLAMATORIAE INMUNOMODULADORA Existen mltiples evidencias que sealan la relacin existenteentreelbalanceoxidativoanivelcelularytisular, la respuestaal dolor y el desarrollo de la inflamacin, en la quesemuestraquelasespeciesreactivasdeoxgeno(ERO) activan las protenacinasas y fosfatasas, as como factores de transcripcin que promueven la biosntesis de citocinas proinflamatorias(Kyriakis&Avruch,1996;Cuzzocreaetal, 2001). Las citocinas, a su vez, promueven la aparicin de nuevasEROapartirdelaactivacindediversosfactoresde regulacin transcripcional, entre los que se encuentra el NFB(Karin&Neriah,2000;Li&Verma,2002). En estudios recientes se ha comprobado que el ECAM redujo la inflamacin inducida por carragenano, en ratas y cobayos, y formalina, en ratones, como modelos agudos inflamatorios (Garrido et al., 2001). En un modelo de inflamacin tpica en el que se indujo el edema por agentes irritantes (como el cido araquidnico o el PMA) en la oreja del ratn, ECAM, administrado de forma tpica (oreja), inhibi la inflamacin con una reduccin de la actividad de la enzima mieloperoxidasa en el tejido de las orejastratadasconPMA+ECAM(Garridoetal.,2004a).

De la misma manera, en un modelo de enfermedad peridontal inducida en perros (GarcaTriana et al., 2005), el ECAM (1%, disuelto en solucin salina fisiolgica), aplicado dos veces al da durante tres semanas, redujo de manera significativa el ndice gingival, la profundidad del surco gingival y la prdida sea, por lo que la administracin tpica del extracto atenu el desarrollo de laenfermedadperidontal. Porotraparte,elECAMinhibilaquimiotaxisdeleucocitos polimorfonucleares,loquepermiteregularlamigracinde clulas inflamatorias al sitio de inflamacin e inhibir la expresin de molculas de adhesin, relacionadas con los procesos de activacin del endotelio vascular y los procesos de trasmigracin de leucocitos y otras clulas inflamatorias al tejido inflamado. Adems, se pudo comprobar que ECAM inhibe la expresin de la molcula de adhesin ICAM1 cuando las clulas endoteliales son estimuladas con IL1 (Delgado et al., 2001; Beltrn et al., 2003). La capacidad quimiotctica de macrfagos peritoneales de rata tambin fue inhibida por ECAM (Garcaetal.,2002). Tambin, el ECAM inhibi la produccin de eicosanoides talescomoprostaglandinaE2(PGE2)yleucotrienoB4(LTB4), mediadores de procesos inflamatorios relacionados con la activacin de la va metablica del cido araquidnico, en macrfagosRAW264.7yJ774(Garridoetal.,2004a;2006). Este efecto podra deberse, al menos en parte (PGE2), a que ECAM inhibe la expresin de la enzima inducible encargada de la sntesis de estos mediadores, la ciclooxigenasa 2 (COX2), mediante la inhibicin del proceso de transcripcin de los genes que codifican para esta enzima en macrfagos peritoneales murinos estimulados con lipopolisacrido bacteriano (LPS) e interfern gamma (IFN) (Leiro et al., 2004b). En este estudio, ECAM solo redujo, de forma significativa, la concentracin de ARNm de la enzima COX1 con la mayor concentracin evaluada (400 g/mL), lo que pudiera indicar que el extracto es capaz de inhibir selectivamente laisoformaCOX2queseinduceenelprocesoinflamatorio sin alterar la funcin biolgica de la enzima COX1. Adicionalmente, el ECAM inhibi la actividad de la fosfolipasaA2(PLA2)desecrecinsinovialhumana(Garrido etal.,2004a). En sistemas experimentales, en los que se emplearon clulas de musculatura lisa vascular, aisladas de arterias mesentricas de ratas normotensas y espontneamente hipertensas, se lograron demostrar los efectos de ECAM y la MF sobre la expresin de las isoformas inducibles de COX2ydeiNOS,ambossistemasenzimticosinvolucrados en la hipertensin arterial como enfermedad inflamatoria crnica, en la que desempean un papel protagnico los diversos procesos e intermediarios asociados a las funciones bsicas del endotelio vascular y la musculatura
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lisa vascular. Se comprob que ECAM inhibi con mayor efectividad la expresin de iNOS inducida por IL1 en ratas hipertensas respecto a las normotensas, mientras que el efecto inhibidor sobre la COX2 fue ms acentuado en las ratasnormotensas(Beltrnetal.,2004). ElECAMredujolacontraccininducidapornoradrenalinay otro agente vasoconstrictor (U46619) en arteria mesentrica de rata (Beltrn et al., 2004), efecto este que no se justifica a partir de sus propiedades anti inflamatorias. Sin embargo, la MF no mostr actividad vasodepresora, lo cual sugiere que el efecto de ECAM sobre la vasoconstriccin mediada por la expresin de COX2 e iNOS, est relacionada con la presencia de otros componentes del ECAM, cuyo efecto an est por demostrar. En un modelo murino de choque endotxico inducido por lipopolisacrido (LPS), el ECAM inhibi la produccin de TNF tanto en un modelo de administracin aguda como cuando se administr durante una semana por va oral. Se pudo comprobar que esta inhibicin est dada por la accin de ECAM sobre el trascripto primario de esta protena(ARNm)tantoenhgadocomoenpulmonesdelos animales tratados (Garrido et al., 2004b). En los modelos deinduccindeedemasauricularesporcidoaraquidnico y PMA, por administracin aguda oral de ECAM, se obtuvo una inhibicin de las concentraciones sricas de TNF (Garrido et al., 2004a). Adems, ECAM y MF inhibieron la produccin de esta citocina proinflamatoria en macrfagos RAW 264.7 y N9 activados con LPS e IFN (Garrido et al., 2004b). La accin de MF sobre macrfagos residentes del SNC en microglia (como la lnea celular N9) pudiera explicar la actividad neuroprotectora detectada en un modelo de neuroinflamacin y dao oxidativo inducido por estrs en el cerebro de ratas inmovilizadas (Mquez et al., 2012). El tratamiento previo con esta xantona, por va oral durante siete das, previno todos los efectos inducidos por el estrs como fueron: el incremento en las concentraciones plasmticas de glucocorticoides e IL1; la prdida del balance redox y la reduccin de las concentraciones de catalasa cerebral; el incremento de los mediadores proinflamatorios, tales como TNF y su receptor TNFR1, el NFB y la sntesis de enzimas, como iNOS y COX2; y el incremento de la peroxidacin lipdica. Estos resultados sugieren que la administracin de MF (o los extractos ricos en esta xantona) podra constituir una nueva estrategia teraputica en patologas neurolgicas neuropsiquitricas en las cuales exista una desregulacin del eje hipotalmicopituitarioadrenal, neuroinflamacin y undaooxidativo. Por otra parte, se investigaron los efectos del ECAM en un modelo de colitis ulcerativa inducida por sulfato sdico de dextrano(DSS)enratas(Mrquezetal.,2010).Paraello,el ECAM se administr en dos protocolos diferentes: en el

primero se administr el ECAM por va rectal, durante 7 das en cotratamiento con DSS, y en el segundo ECAM se administrunavezaldadurante14das(porsondaoral,7 das antes de la administracin de DSS y rectal por 7 das durante la administracin de DSS). Los resultados demostraron que el ECAM tiene propiedades anti inflamatorias que mejoran los signos clnicos, la reduccin de la ulceracin y la reduccin de la actividad MPO cuando se administra antes de DSS. Adems, la administracin del extracto por 14 das result en un aumento de GSH y la reduccin de las concentraciones de las sustancias reactivas de cido tiobarbitrico (TBARS) y de iNOS y la expresin de COX2, TNF y TNF R2 en tejido colnico, y una disminucin de las concentraciones sricas de IL6 y TNF. Los autores declararon que la administracin preventiva de ECAM, en un modelo de colitis inducida por DSS, parece ser el protocolo ms efectivo para disminuir el estrsoxidativoylainflamacinenestemodelo. Existe una estrecha relacin entre la inflamacin, el desbalance oxidativo y la respuesta inmune. La produccin de ERO puede modular la expresin de numerosas molculas(citocinas,anticuerpos,factoresdetranscripcin y otras) involucradas en la respuesta inmune, lo que ha permitido relacionar algunos trastornos en la inmunidad con el estrs oxidativo y los mecanismos de defensa antioxidante con las propiedades inmunomoduladoras de losfrmacos(Matsetal.,2000).Larespuestainflamatoria es parte y consecuencia de algunos tipos de respuesta inmune y varias de las citocinas producidas por macrfagos, clulas T y mastocitos conducen al reclutamiento celular, el incremento de la permeabilidad vascular, la vasodilatacin y otros eventos caractersticos de la inflamacin. Otro punto en comn entre estos fenmenosloconstituyelaactividaddelpropiomacrfago, pues es una de las principales fuentes de produccin de ERO, de mediadores proinflamatorios y es uno de los ejes centrales en la activacin de la respuesta inmune adaptativa que inducen la coestimulacin para la activacindelasclulasT. En macrfagos murinos, aislados y estimulados con LPS e IFN, ECAM redujo las concentraciones de ARNm de las citocinas TNF, IL1 y GMCSF, sin afectar las de IL6, e increment las de TGF. Adems, redujo la concentracin de TNF en el sobrenadante de cultivo de macrfagos peritoneales,loquepermiticorrelacionarlainhibicindel ARNm con la reduccin de la protena (Garca et al., 2002). Por su parte, la MF inhibi el aumento de iNOS y TNF en macrfagos de rata estimulados in vivo con tioglicolato y despus in vitro con LPS e interfern gamma (Guha et al., 1996). A concentracin de 100 mM redujo las concentraciones de sus ARNm. Sin embargo, a esta concentracin aumentaron los valores del transcripto primario del factor de crecimiento tumoralbeta (TGF) (Leiro et al., 2003). El hallazgo de que MF aumente la
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expresin gnica de TGF sugiere que este polifenol, o extractos que lo contengan, podra tener algn valor en la prevencin del cncer, enfermedades autoinmunes, aterosclerosisyotrasafeccionescardiovasculares. Por otra parte, el ECAM inhibi la produccin de xido ntrico (NO) en macrfagos RAW264.7 (Garrido et al., 2004b),ascomoenmacrfagosperitoneales(Garcaetal., 2002) estimulados con LPS e IFN. Se comprob que esta accin de ECAM est asociada a la reduccin de la concentracin de ARNm que codifica para la iNOS, lo que conduce a la inhibicin de la expresin de esta enzima, encargada de la produccin del NO a partir de Larginina (Leiroetal.,2004b). El ECAM tambin inhibi la activacin inducida por TNF del factor de transcripcin nuclear NFB en clulas Hela y Jurkat, con lo cual se impidi la degradacin del inhibidor citoplasmtico del NFB, o sea IB. Por tanto, la translocacindelNFBalncleodelaclulaysuposterior unin a elementos especficos en regiones promotoras de genes dianas para la produccin de protenas pro inflamatorias, tales como citocinas, molculas de adhesin yenzimas,entreotros,tambinfueinhibida(Garridoetal., 2005). Por otra parte, se comprob que ECAM redujo las concentraciones de ARNm del NFB en macrfagos peritoneales murinos estimulados con LPS e IFN sin afectarlaconcentracindeIB,loqueexplicaque,adems de inhibir su activacin, reduce la disponibilidad de NFB en el citoplasma celular y garantiza la presencia del inhibidorIB(Leiroetal.,2004a). Se piensa que uno de los componentes en el ECAM responsable de los efectos antiinflamatorio e inmunomodulador sea la MF, por lo que se realiz un estudio para demostrar los mecanismos de accin por los cuales esta xantona ejerce tales efectos (Leiro et al., 2004a). Todo ello se realiz a travs de la medicin del efecto sobre la expresin de diversos genes relacionados con la va de sealizacin del NFB, por lo que se demostr que sta inhibe la expresin de dos genes de la familia de Rel/NFB/IB, RelA y RelB, lo que indica un efecto inhibitorio sobre la seal de transduccin mediada porNFB;delfactor6asociadoalreceptordeTNF(Traf6), loquepudieraindicarunprobablebloqueodelaactivacin de NFB va LPS, TNF o IL1; de otras protenas involucradas en las respuestas a TNF y a la va apopttica disparada por dao al ADN, la que incluye el receptor de TNF(TNFR),eldominiodemuerteasociadoalreceptordel TNF (TRADD) y la protena que interacta con el receptor (RIP); del ligando extracelular de IL1, lo que indica, posiblemente, interferencia con la respuesta a IL1; de las citocinas proinflamatorias IL1, IL6, IL12, TNF y RANTES y citocinas producidas por monocitos y macrfagos como elfactorestimulantedecoloniasdegranulocitos(GCSF),el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrfagos

(GMCSF) y el factor estimulante de colonias de macrfagos (MCSF); de otras protenas de receptores toll like (adems de Traf6) tales como JNK1, JNK2 y Tab1; de Scya2 (Small Inducible Cytokine A2), una protena similar a la protena quimioatrayente de monocitos1 (MCP1); y de varias molculas de adhesin intracelular (ICAM) y la molcula de adhesin celular vascular VCAM1, la cual se encuentra aumentada en ateromas. La inhibicin de JNK1, unido a la estimulacin de cJUN y a la actividad secuestradora de superxido anteriormente mencionada, sugiere que la MF podra proteger a las clulas contra el daooxidativoylamutagnesis. Adems, MF bloque la activacin de NFB inducido por TNF y los genes dependientes de NFB como ICAM1 y COX2(Sarkaretal.,2004).Elefectoestuvomediadoporla inhibicindelaactivacindeIKKysubsiguientebloqueode la fosforilacin y degradacin de IB. De igual forma, la MF inhibi la fosforilacin de p65 inducida por TNF, as como la translocacin al ncleo y la activacin de NFB inducida por otros agentes proinflamatorios como PMA, ceramide y LPS. Tambin, inhibi la generacin de ERO inducida por TNF e increment al doble las concentraciones de GSH (un modulador de las concentraciones de NFB) en comparacin con otros antioxidantes. Al mismo tiempo, decrecieron las concentraciones de GSSG e increment la actividad de catalasa. MF y, por tanto, el ECAM, podra constituir un fuerte candidato para la terapia antioxidante y anti inflamatoria debido a su capacidad para inhibir la activacindeNFByalincrementodelasconcentraciones intracelularesdeGSH. Todas estas evidencias, tanto de experimentos a nivel molecular como en modelos animales, demostraron la influencia de ECAM sobre especies intermediarias de la reaccin inflamatoria, tales como molculas de adhesin (ICAM1), citocinas proinflamatorias (TNF y sus receptores TNF R1 y R2, IL1, GMCSF y TGF), enzimas (COX2, iNOS, PLA2), mediadores de la cascada del cido araquidnico (PGE2 y LTB4) y factores de transcripcin (NF B) que constituyen seales de activacin intercelular muy relevantes de la respuesta inflamatoria y del sistema inmune, asociadas a los procesos de dao tisular y activacincelularqueproducenlamayorpartedelasERO. De otra parte, los estudios llevados a cabo con MF indican que sta es un inhibidor de la expresin de genes como iNOS, TNF y NFB, lo que sugiere que esta xantona presenta un valor potencial en el tratamiento de desrdenes inflamatorios y(o) neurodegenerativos. Estos resultados tambin indican que la MF modula la expresin de un considerable nmero de genes que participan en la replicacin viral, la regulacin de la apoptosis, la tumorognesis, la inflamacin y enfermedades autoinmunes por lo que pudiera ser, en parte, la
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responsable de las actividades antiinflamatoria e inmunomoduladoradelECAM.

Un resumen de los efectos de ECAM sobre algunos de los mediadores proinflamatorios e inmunolgicos se puede apreciarenlaFigura2.

Figura2.

TNF NF- B

ECAM

ICAM-1

ADHESIN CELULAR
Citoplasma ADN GM-CSF NF- B Ncleo
Fosfolpidos Membrana

ECAM

PLA 2

AA Mediadores Proinflamatorios
ECAM ECAM
PGE 2 IL-1 TNF iNOS LTB 4 COX-2 LOX

NO . O 2-

ECAM

ONOO -

INFLAMACIN

CHOQUE ENDOTXICO

Mecanismo de accin antiinflamatoria del extracto de la corteza del rbol del mango (ECAM). El proceso de induccin de seales, resultado de la activacin del factor de transcripcin nuclearB (NFB) por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) se inhibe por el ECAM. Bajo condiciones patolgicas, la activacin de NF B inducida por TNF estimula la degradacin del inhibidor citoplasmtico (IB) del NFB. Despus de ese evento, NFB se trasloca al ncleo de la clula para inducir la sntesis deARNm de algunos mediadores proinflamatorios tales como el TNF, la xido ntrico sintasa inducible (iNOS), la ciclooxigenasa 2 (COX2), la interleucina 1 (IL1) y el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrfagos (GMCSF); as como molculas deadhesin que participanen el procesodela adhesin celular (como ICAM1). El ECAM tambin es capaz de inhibir otros mediadores importantes del proceso inflamatorio como la fosfolipasa A2 (PLA2), la prostaglandinaE2(PGE2)yelleucotrienoB4(LTB4).

En otros modelos experimentales, se demostr que ECAM modul la respuesta inmune humoral en ratones, mediante la inhibicin de la IgG2a y la IgG2b, inmunoglobulinas caractersticas de la respuesta Th1 activadora de macrfagos, pero sin afectar la produccin de IgM (Garca et al., 2003a). Este resultado se corresponde con el efecto inhibitorio de la actividad de macrfagos (Garca et al., 2002; Leiro et al., 2004b), e indica que ECAM pudiera utilizarse en enfermedades caracterizadas por la sobreproduccin de inmunoglobulinas.

La activacin de los linfocitos T es una etapa crucial de la respuesta inmune que conduce a un incremento rpido en la expresin de genes relacionados con la proliferacin y diferenciacin de estas clulas. La desregulacin de estos procesos conduce a estados inmunopatolgicos como las enfermedades autoinmunes y la inflamacin. Cuando los mecanismos de activacin de clulas inmunocompetentes, como los macrfagos y las clulas T, persisten por permanencia del estmulo antignico o por desregulacin de los mecanismos inhibitorios, se produce un estado de sobreactivacin celular que conlleva a la excesiva
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produccin de mediadores inflamatorios, lo que conduce a un proceso inflamatorio tal que puede terminar en una lesin tisular. Dichos procesos estn altamente implicados en la fisiopatologa de enfermedades tales como la artritis reumatoide, las enfermedades inflamatorias intestinales y el lupus eritematoso sistmico, entre otras (Issekutz et al., 1988;Alietal.,1997). El ECAM tambin inhibi la proliferacin de clulas T humanas estimuladas por un superantgeno de enterotoxina B de Staphylococcus aureus (Garrido et al., 2005). La activacin de los linfocitos T ha sido estudiada, tanto en la inflamacin crnica como en la aguda, ya que diferentespoblacionesdeclulasTalteranelbalanceentre el aclaramiento o eliminacin del patgeno y la induccin de dao tisular, lo que depende de los mediadores citocnicos que ellos secretan. La activacin por citocinas conduce a un incremento rpido en la expresin de genes relacionados con el crecimiento, la adhesin y diferenciacin de estas clulas. El tratamiento con ECAM inhibi la proliferacin celular mediada por el receptor de clulas T e inducida por SEB. Adems, fue estudiado el efecto del extracto sobre la expresin en la superficie celular de los marcadores de activacin CD25 en clulas T primarias, estimuladas con SEB. El extracto inhibi la expresin de este marcador en la superficie celular de los linfocitosT.Comoconsecuenciadelaactivacincelular,las clulas T primarias progresan a las fases S y G2M del ciclo celular, y en este estudio se evalu el efecto del ECAM sobre la progresin del ciclo celular en estas clulas T estimuladas. El tratamiento con el extracto previno la entradadelasclulasenlafaseSdelciclocelular. La muerte celular inducida por activacin (AICD, Activation Induced Cell Death) es esencial para la homeostasis del sistema inmune (Krammer et al., 1994) y su desbalance estrelacionadocondiversasenfermedadestalescomolas inmunodeficiencias y las autoinmunes (RieuxLaucat et al., 2003). La elevada expresin del CD95L asociada al incremento en la sensibilidad a la AICD que se observa en los individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana evidencia que este tipo de muerte celular contribuye, en parte, a la prdida progresiva de linfocitos T CD4+ infectados y no infectados que conduce a la desregulacin del sistema inmune en estos pacientes (Dockrell et al., 1999; Badley et al., 2000; Alimontietal.,2003). Los resultados experimentales demostraron que ECAM puede regular la sobrevivencia de linfocitos T humanos al inhibirlaAICDinvitro.Esteefectoseejercealdisminuirlas 2+ concentraciones intracelulares de ERO y Ca , seales tempranasinducidasqueestimulanalTCR(Tcellreceptor). LacapacidaddeinhibirlasEROsedemostradems,porla reduccin en la expresin de la enzima manganeso

superxido dismutasa (MnSOD), involucrada en la regulacin de los procesos de estrs oxidativo e inducida por la estimulacin del TCR (Hernndez et al., 2006a). Tambin, el ECAM actu sobre factores transcripcionales involucrados en la AICD. La disminucin de las concentraciones constitutivas de NFB en presencia del extracto determina una menor disponibilidad de este factor en la cascada de seales necesaria para la induccin del CD95L (Hernndez et al., 2006b). Por otra parte, el extracto disminuy la fosforilacin de la cinasa de cJun (JNK),loquerepercuteensuactivacinyenconsecuencia, en la activacin del factor AP1 (Hernndez et al., 2006a). El conjunto de efectos descritos conduce a la inhibicin observada de la expresin del ARNm del CD95L y determina que ECAM inhiba la AICD. En otro estudio (Hernndez et al., 2007) se demostr que los principales polifenolesquecomponenelECAM,comoMF,catequinay epicatequina son responsables, en parte, de la capacidad del extracto de regular la AICD en clulas T. Esto pudiera explicarse a travs de un mecanismo que involucra la disminucin de las concentraciones de ERO y Ca2+ inducidos por la activacin del TCR. En todos los casos el efecto fue inferior al mostrado por ECAM, lo que fortalece la hiptesis del efecto sinrgico que pudiera ejercer la mezcladecomponentesqueconformanelextracto. En la Figura 3 se muestra un esquema de los blancos potenciales de accin del ECAM sobre la cascada de sealizacin del CD95L estimulada durante la AICD en linfocitosThumanos. ACTIVIDADANALGSICA Los ensayos desarrollados con la finalidad de evaluar la accin antiinflamatoria del ECAM, en modelos in vitro e in vivo,mostraronactividadantiinflamatoriayanalgsica.De forma especfica, el ECAM redujo el dolor inducido por formalinaenlafasetardadela reaccindolorosa(Garrido etal.,2001,2004a,b,2005,2006). En la prueba de la formalina se acepta que la primera fase resulta de la activacin directa de las fibras aferentes primarias nociceptivas y refleja un dolor de tipo fisiolgico o nociceptivo (Vyklicky, 1979; Ren & Dubner, 1999; Wilson et al., 2006). Sin embargo, existen an dificultades en la comprensin de los mecanismos de la segunda fase. Estudios recientes sugieren que dicha fase resulta de un incremento de la excitabilidad de las neuronas del cuerno dorsal espinal (CDE) y se ha demostrado que la fase I es necesaria para el desarrollo de la fase II (Ren & Dubner, 1999). Este ensayo es considerado como un excelente modelo de dolor persistente de moderada intensidad, que se asemeja al dolor clnico en humanos (Ortega et al., 2002). La actividad del ECAM qued demostrada para la fase II, de ah sus potencialidades para el tratamiento del dolorpatolgicoysuaccinantihiperalgsica.
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En el modelo de dolor inducido por la aplicacin i.p. de cido actico se obtuvo un resultado similar al reducir el nmero de las contorsiones abdominales (Garrido et al., 2001). Este modelo estudia el dolor visceral o mixto provocado por este irritante que causa inflamacin peritoneal e hiperalgesia (Reichert et al., 2001).Tambin la MF ha mostrado efecto analgsico en este modelo y en el
Figura3.

del plato caliente en ratones, sin exhibir la actividad anti inflamatoria(Daretal.,2005). Ambos estudios (mediante la induccin de estmulos nociceptivos por formalina y cido actico) sugieren la potencialidad del ECAM para tratar las alteraciones del procesamientonociceptivoencircunstanciaspatolgicas.

TCR

ZAP70

Lck

PLC2

RE
Mn M nS SO OD D
3 1

R Rh ho o/ /R Ra ac c

ECAM

RR E OO S
M M K KK K4 4/ /7 7 4 p

C a2 +
EC AM lm lin CC aa lm oo dd uu lin aa Ca alc lcin ine eu ur rin a C in a

M iM E CA

JN K
p

ECAM

N F N F - B

Ju n

NFAT EC AM
6

p ro m o to r C D 9 5 L

T r a n s c r ip c i n
5

A p o p to s is

N c le o
EC AM

Blancos potencialesde la accin delextractode la corteza del rbol del mango (ECAM) sobre la cascada de sealizacindel CD95L estimuladadurante la muerte celular inducida por activacin (AICD) en linfocitos T humanos. (1) Disminucin de las concentraciones de ERO; (2) Disminucin de las concentraciones de Ca2+; (3)inhibicindelaexpresindeMnSOD;(4)inhibicindelafosforilacindeJNK;(5)inhibicindelaexpresindeARNmdelgenCD95L;(6)inhibicindelaAICD. RE:retculoendoplasmtico.

Como se ha mencionado, los resultados en otros modelos in vivo de inflamacin complementan los hallazgos anteriormente expuestos ya que el ECAM inhibe el edema delaorejainducidoporcidoaraquidnicoylossteresde forbol (Garrido et a., 2004a), que exploran con cierta selectividad las vas de la lipooxigenasa (LOX) y la COX, respectivamente. Adems, estudios bioqumicos adicionales en estos modelos demostraron una reduccin sistmica del TNF (Garrido et al., 2004b), el cual participa primariamenteenelestablecimientodelahiperalgesia.

La expresin de esta citocina proinflamatoria favorece la liberacin de IL1, IL6 e IL8, reduce el umbral de activacin de fibras C, induce la liberacin de neuropptidos como la sustancia P (SP) y el pptido relacionado al gen de la calcitonina (PRGC) y desencadena las vas dependientes de la COX, para la formacin de prostaglandinas (Garca et al., 2001; Covey et al., 2002; Wood, 2005; Xu et al., 2006). Adems, conjuntamente con el IFN, el TNF amplifica la produccin de aniones superxido por los neutrfilos y la biosntesis de NO, por aumento de la actividad de todas las isoformas de la NOS (Eliav et al., 2001; Zelenka et al., 2005). En los estudios in vitro (Garrido et al., 2004b), diseados para profundizar en
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el mecanismo de accin de los efectos descritos anteriormente, el ECAM inhibi la produccin de TNF y NO en lneas celulares de macrfagos RAW264.7 y de manera interesante el mismo resultado fue observado en macrfagos residentes del SNC en microglia (clulas N9). EnmacrfagosmurinosdespusdelaestimulacinconLPS e IFN redujo las concentraciones de iNOS y de su ARNm, as como de COX2 y su ARNm (sin efectos marcados sobre COX1), TNF; as como PGE2, que posee un reconocido papelcomomediadordelahiperalgesia(Kress,2005),eIL 1. La IL1 es considerada una molcula muy importante en el desarrollo de la hiperalgesia inflamatoria, por sus mecanismos indirectos sobre la liberacin de PG, la induccindereceptoresdebradicininayelaumentoenlas concentraciones locales del factor de crecimiento nervioso (Eliavetal.,2001;Zelenkaetal.,2005).

se observ una disminucin de las concentraciones de glutamato, en presencia del extracto y su xantona aislada, que lo hacen menos biodisponible para la interaccin con sus receptores, en especial el NMDA. Mltiples evidencias soportan la participacin de la va postsinptica receptor NMDANOGMPc en el proceso de hiperexcitabilidad del CDE que promueve el establecimiento de los estados dolorosos crnicos (Gao et al., 2005, Xu et al., 2007). Adems, se ha podido demostrar el decrecimiento de la muerte celular inducida por glutamato en cultivo de de concentraciones neuronas, en presencia submicromolares de MF, las cuales atenuaron la entrada 2+ de Ca mediada por receptores, el estrs oxidativo y la apoptosis (Gottlieb et al., 2006). MF disminuy la generacin de ERO y la prdida neuronal en clulas de hipocampo CA1de ratas que fueron sometidas a isquemia. Las ratas con isquemia y tratadas con MF tuvieron significativamente mejor comportamiento en tres pruebas de conducta dependientes de hipocampo en comparacin con las ratas isqumicas no tratadas. En estos estudios (Ibarretxe et al., 2006), se utilizaron concentraciones nanomolaresdeMF,lasqueprotegierondeformaparciala los oligodendrocitos; as como a las neuronas corticales de un dao mediano, pero no de uno intenso mediado por receptores AMPA (alfaamino3hidroxi5metilisoxazol4 propionato).Adems,MFatenulasobrecargaintracelular 2+ de Ca subsiguiente a la activacin de los receptores AMPA, un mecanismo que puede contribuir a sus propiedadesneuroprotectoras. La Figura 4 resume los posibles blancos moleculares de accindelECAMsobreeleventonociceptivo. ACTIVIDADANTIALRGICA

Se ha documentado que el NO producido por la xido ntrico sintasa neuronal (nNOS) y la iNOS, difunde fcilmente a travs de las membranas celulares y viaja a neuronas vecinas, glias y a la terminal nerviosa presinptica, donde puede activar sistemas de segundos mensajeros, con el consiguiente aumento del GMPc que activara a las protenas cinasas dependientes de GMPc y estas favoreceran la liberacin de glutamato (Vetter et al., 2001). Por otra parte, la PGE2 puede activar a la adenil ciclasa, va receptor EP2, y aumentar las concentraciones de AMPc, el que activara a sus protenas cinasas dependientes, como la protena cinasa A, la cual induce mayor liberacin de glutamato (Lui & Lee, 2004). De esta forma, los procesos presinpticos y postsinpticos se retroalimentan y exageran la seal excitatoria en el CDE. Asimismo, existe una elevacin de las concentraciones de PGD2, PGE2, PGF2, de la COX2 y del cido araquidnico en el SNC. Tambin, existen evidencias en animales y humanos que confirman los efectos antihiperalgsicos centrales de los antiinflamatorios no esteroidales durante la inflamacin o el dao nervioso (Shi et al., 2006). Estos antecedentes sugieren la posibilidad para la utilizacin teraputicadelECAMenestosestados. La evidencia de que el ECAM previno la activacin del NF B inducida por TNF y que no afecta la expresin de IB (Garrido et al., 2005), unific y dio soporte a todos los resultados anteriores. El ECAM pudiera utilizarse en el tratamiento de las alteraciones del procesamiento nociceptivo con las consecuentes implicaciones beneficiosassobrelainhibicindelacascadainflamatoriay lahiperalgesia. Estudios recientes in vitro (LemusMolina et al., 2009) en oligodendrocitos y en neuronas (muchas de ellas son interneuronas inhibitorias) apoyan los efectos favorecedores en la prevencin de la muerte neuronal excitotxica inducida por receptores NmetilDaspartato (NMDA) (Baymgrtner et al., 2002). En estos experimentos

En un modelo preclnico de alergia inducida por un nemtodo (Trichinellas spiralis) en ratones se demostr el efecto antialrgico y antihelmntico del ECAM y la MF, la reduccin en suero de los anticuerpos IgE especficos, y la actividad inhibitoria sobre la desgranulacin de las clulas mastoides,evaluadomedianteensayosdeanafilaxiapasiva cutnea (Garca et al 2003b). Otros estudios permitieron comprobar con mayor claridad el efecto del ECAM y la MF, sobrediferentesparmetrosdelarespuestaalrgica,como la produccin de IgE, la respuesta anafilctica, la respuesta cutnea al incremento de la permeabilidad vascular inducida por histamina y OVA, la liberacin de histamina de clulas mastocitarias, mediante un modelo de inflamacin alrgica inducido por ovoalbmina (OVA). Ambos productos demostraron una reduccin significativa del edema plantar en un modelo in vivo de inflamacin alrgica mediada por mastocitos y la proliferacin linfocitaria en respuesta a la OVA en ratones inmunizados. TantoECAMcomoMFinhibieronlaliberacindehistamina inducida por 48/80 en los mastocitos peritoneales de ratas (Garcaetal.,2006).
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Figura4.
Estmulos nociceptivos perifricos
GMPc PKA

consecuencia de la inhibicin de mediadores como la IgE, la histamina y de la capacidad de los linfocitos B y T para contribuiralarespuestaalrgica. EFECTOSPROTECTORESSOBRELAMOLCULADEADN (ESTUDIOSDEANTIMUTAGNESISY ANTIGENOTOXICIDAD) ElpotencialantimutagnicodeECAMfuerealizadotantoin vitro como ex vivo mediante el ensayo de Ames. En el ensayo in vitro se evalu la proteccin del ECAM frente a diferentes compuestos con reconocida actividad mutagnica. Por otro lado, en el estudio ex vivo los animales fueron tratados durante 30 das con dosis orales del ECAM y, a partir de estos animales, se obtuvo la fraccin microsomal heptica empleada como activador metablico en el ensayo de Ames (Morffi et al., 2012). Como resultado de estos estudios se demostr que el ECAM present actividad antimutagnica frente a diferentes mutgenos a los cuales se expone comnmente el hombre (bleomicina, ciclofosfamida, mitomicina C, cisplatino, dimetilnitrosamina, benzo(a)pireno, 2 acetilaminofluoreno, azida sdica, cido picrolnico y 1 nitropireno). Adems, el ECAM inhibi la actividad microsomal de CYP1A1, por lo que los autores manifestaron que, adems de la potente actividad antioxidante que presenta el extracto, ste pudiera ejercer su efecto quimiopreventivo debido a su capacidad de inhibir la actividad de algunas isoformas del citocromo P450.Adems,enunestudioinvivoenelqueseevaluaron los efectos de ECAM sobre el dao al ADN inducido por la bleomicina (Ensayo Cometa) en ratones NMRI, se demostr que la administracin del ECAM durante siete das protegi del dao primario al ADN (Cancino et al., 2001). El efecto radioprotector del ECAM frente a la radiacin gamma tambin ha sido evaluado (RosarioFernndez et al., 2010). En esta ocasin se utiliz el ensayo bacteriano SOS Chromotest (dosis de radiacin de 150 Gy), as como se evalu la peroxidacin lipdica y la actividad enzimtica mitocondrialeneritrocitos(dosisderadiacin250Gy),que son las clulas ms afectadas durante las sesiones de radioterapia. El ensayo SOS Chromotest indic que el extractonofuegenotxicoenpresenciaonodeactivacin metablica. Adems, se determin que el ECAM presenta actividad radioprotectora del material gentico. Los autores afirmaron que estos resultados demuestran que el extracto es capaz de proteger la estructura celular de los daos inducidos por la radiacin gamma a varios niveles: material nuclear, membranas celulares y sistemas enzimticos mitocondriales. Posiblemente, la MF sea la responsable de la radioproteccin demostrada por el extracto, por lo que se dise un estudio en el que los ratones se trataron con diferentes dosis de MF, una hora antesdelaadministracinde10Gyderadiacionesgamma.
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cinasa [Ca2+]
AMPc

Terminacin nociceptiva C

GMPc AC GLUT GC EP2 ECAM

NMDA

PLA2

ECAM

Neurona de proyeccin cuerno dorsal medular


ECAM iNOS

[Ca2+]
AA nNOS COX-2 NO ECAM PGE2

Posibles blancos moleculares susceptibles al extracto de la corteza del rbol del mango (ECAM) en el dolor crnico. ECAM podra disminuir la liberacin del glutamato (Glu) por la terminal nociceptiva a nivel del cuerno dorsal espinal (CDE); inhibir la activacin de la xido ntrico neuronal (nNOS) promovida por el aumento de las concentraciones del Ca2+citoslicogeneradoporlaaperturadelcanaldelreceptorNMDAque aumenta la magnitud de la despolarizacin y por la activacin de los receptores NK1 por la sustancia P (SP); activar la guanilato ciclasa, la cual aumenta las concentraciones de GMPc, cierra canales de K+ y activa cinasas dependientes de GMPc que promueven la liberacin de Glu; inhibirlaactivacindelafosfolipasaA2(PLA2)ylasntesisdemetabolitos del cido araquidnico (AA), en especial la PGE2 que en estas condiciones interacta conreceptores EP2 presinpticos que aumentan la actividad de adenilato ciclasa con la consiguiente formacin de AMPc que activa la PKA, dependiente de AMPc, la cual tambin induce liberacin de Glu; inhibir lasntesis oexpresin de citocinas, la iNOS y la COX2 mediada por el NFB; e inhibir la activacin de NFB. De esta manera ECAM podra inhibir la respuesta neuroinmune y la participacin glial en la hiper excitabilidadcentral.

Adems,conelobjetivodeestudiarlosefectosdelECAMy la MF sobre la respuesta a la inflamacin pulmonar y la produccin de citocinas Th2 se desarroll un modelo de asma alrgica inducida por OVA en ratones (GarcaRivera et al., 2011). Tanto ECAM como MF produjeron una marcada reduccin de la inflamacin de las vas areas alrededor de los vasos y los bronquios, inhibieron las citocinas IL4 e IL5 en el fluido broncoalveolar, las concentracionesdeIgEylaproliferacindelinfocitos. Estos resultados experimentales demostraron las propiedades antialrgicas del ECAM y la MF, como


La xantona redujo los sntomas de la enfermedad por irradiacin y demor la aparicin de la mortalidad comparado con el grupo no tratado e irradiado (Jagetia & Baliga, 2005). La accin radioprotectora de la MF se increment de manera dependiente de la dosis hasta 2 mg/kg y declin posteriormente hasta 100 mg/kg (dosis mxima utilizada). Tambin se calcul la dosis letal 50 (DL50)paraestepolifenol,lacualalcanzlos400mg/kgp.c. De esta forma MF protegi a los ratones de la enfermedad y la muerte inducidas por irradiacin con una dosis protectiva ptima de 2 mg/kg, la cual constituy 1/200 de la DL50. Asimismo, MF ha sido estudiada por su capacidad para reducir la frecuencia de clulas binucleadas micronucleadas inducidas por radiacin en linfocitos de sangre perifrica humana (Jagetia & Venkatesha, 2005). MF elev, de forma significativa, el ndice de proliferacin de las clulas irradiadas y redujo la peroxidacin lipdica inducida por H2O2 de modo dependiente de la concentracin.Delamismamanera,enunsistemalibrede clulas, MF inhibi la induccin de los radicales hidroxilo, superxido, DPPH y ABTS. Por tanto, se demostr que MF posee propiedades radioprotectoras al suprimir los efectos de los radicales libres que se inducen durante las radiaciones. Por otra parte, el arsnico (As) altera mltiples vas celulares que incluyen la expresin de factores de crecimiento, la supresin de protenas checkpoint del ciclo celular,promocinyresistenciaalaapoptosis,lainhibicin de la reparacin del ADN, las alteraciones en la metilacin del ADN, disminucin de la inmunovigilancia, y el aumento de estrs oxidativo, por la alteracin del equilibrio prooxidanteantioxidante(Flora,2011). Teniendo en cuenta las acciones demostradas tanto para ECAM como MF, sobre el estrs oxidativo y su posible proteccin contra el dao inducido por As, se dise un estudio en el que fueron analizados los posibles efectos protectores del extracto y algunos de sus derivados fenlicos (cido glico, catequina, quercetina y MF) sobre la citotoxicidad inducida por arsnico (As3+) en la lnea celulardetbuloproximalrenalHK2(Garridoetal.,2012). 3+ En clulas cultivadas durante 24 h en presencia de As , ocurri una prdida de la viabilidad celular, dependiente delaconcentracin,quefuesignificativamenterecuperada por ECAM, seguido de cido glico, catequina y MF. El 3+ complejo MFFe demostr ser ms eficaz ante dicha problemtica que MF sola. Tanto ECAM como los fenoles aumentaron significativamente la fraccin de clulas supervivientes. En las clulas pretratadas con ECAM o fenoles durante 72 h, la proteccin conferida por ECAM result disminuida en comparacin con los experimentos mscortos(24h).Lasclulaspretratadasconunacantidad subcitotxica de As3+ o cultivadas en presencia continua de baja concentracin de MF demostraron ser ms 3+ resistentes a As y mostraron un incremento tanto en la

cantidad de Pgp como del ARNm de ABCB1, mientras que las clulas cultivadas en presencia de albmina resultaron ms sensible. Los autores manifiestan que, debido a que todosloscambiosanteriorescompartencondicionesconla expresinactividad de glicoprotena P (Pgp), un transportadorpotencialmenteimplicadoenlaresistenciaa arsnico,lacapacidaddeECAMysusfenolesparamodular 3+ la citotoxicidad inducida por As sera, al menos en parte, dependientedesusinteraccionesconPgp. ACTIVIDADANTICANCERGENA Existen reportes en la literatura relacionados con la actividad anticancergena de extractos de mango que demuestran especificidad celular, aunque pocos que relacionen al ECAM con esta actividad a pesar que el extracto se utiliza en Cuba, desde el punto de vista etnomdico, para el tratamiento del cncer (Guevara Garca et al., 2004). Una posible validacin de este uso la ha realizado un grupo de investigadores (Delgado Hernndezetal.,2012)queevaluarontantoalECAMcomo a la MF en modelos de angiognesis, teniendo en cuenta que los procesos angiognicos son esenciales para el crecimiento y la proliferacin tumoral (De la Vega et al., 2012). ECAM y MF se evaluaron en dos ensayos antiproliferativos de clulas endoteliales y tres modelos in vitro de angiognesis humana como son los explantes de vasos sanguneos de placenta humana, el gel sobre gel (gelovergel, tipo sndwich) y ensayos en Matrigel. Tanto el extracto como la xantona inhibieron la formacin de tubos capilares en los dos primeros ensayos, mientras que MF aboli la neovascularizacin en el ensayo tipo sndwich. Ambos productos redujeron la produccin de TNF y la angiognesis inducida en clulas B16F10 en un modelodeangiognesisinducidaenMatrigelenratones. Por otra parte, otros extractos de mango han mostrado proteccin contra cncer de prstata en modelos in vivo e in vitro (Prasad et al, 2008) e inhibicin del ciclo celular en la fase G0/G1 de clulas HL60 (Percival et al., 2006), mientras que no han sido efectivos contra clulas de cncer de mama MCF7 (GarcaSols et al., 2009). Posiblemente, la MF o el lupeol (triterpeno), presentes en estos extractos, sean los responsables deesta actividad. La MF ha mostrado proteccin contra cncer de pulmn inducido por benzo(a)pireno en ratones (Rajendran et al., 2008b),loquepodraestarrelacionadoconlainduccinde la permeabilidad mitocondrial (PardoAndreu et al., 2006c). Por otra parte, en un estudio a corto plazo, la MF administrada en la dieta de las ratas inhibi el desarrollo de lesiones preneoplsicas inducidas por el carcingeno azoximetano (Yoshimi et al., 2001). En un estudio a largo plazo tuvo baja incidencia sobre la multiplicidad de la neoplasia intestinal inducida por dicho carcingeno. Adems, la proliferacin celular en la mucosa del colon fue reducida en las ratas tratadas con esta xantona. Estos
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experimentos sugieren que MF constituye un potencial agentequimiopreventivo. En otros estudios, MF tuvo una actividad inhibitoria del crecimiento de fibrosarcoma asctico en ratones (Guha et al., 1996). Mediante tratamientos con MF, tanto in vivo como in vitro, aument la citotoxicidad contra clulas esplnicas y macrfagos de ratones normales y con tumoresimplantados.EltratamientoinvitroconMFdelas clulas esplnicas de ratones a los que se les implant el tumoraumentlacitotoxicidaddeestasclulastumorales, tanto en aquellas sensibles como en las resistentes a clulasnaturalesasesinas(NK). De la misma manera, la administracin de MF protegi a clulas N2A (lnea celular de neuroblastoma murino) contra la citotoxicidad inducida por MPP+ (el metabolito activo de 1metil4fenil1,2,3,6tetrahidropiridina), el cual induce sndrome parkinsoniano en animales y humanos a travs de un mecanismo de neurotoxicidad comprometido con el estrs oxidativo (Amazzal et al., 2007). MF restaur el contenido de GSH y regul la expresin del ARNm de la superxido dismutasa y la catalasa, por lo que los autores plantearon que la MF podra utilizarse en la terapia de enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, en las cuales el estrs oxidativo desempea un papelcrucial. Por otra parte, los terpenoides, como el lupeol y otros relacionados tambin ejercen una variedad de actividades citotxicascontravariostiposdeclulastumoralescomoel melanoma murino B16 2F2, leucemia HL60, U937, K562, melanoma G36, carcinoma de pulmn humano A549 y adenocarcinoma de colon humano DLD1 (Chaturvedi et al., 2008), as como en modelos in vivo como la carcinognesis bucal inducida por 7,12 dimetilbenz(a)antraceno en el cachete del hmster (Palanimuthu et al., 2012). Probablemente, el potencial quimiopreventivo del lupeol radica en su actividad antioxidante y secuestradora de radicales libres y moduladora de los posibles efectos sobre las enzimas metabolizadorasdexenobiticosdefasesIyIIafavordela excrecin de metabolitos carcinognicos. Adems, esta molcula es capaz de actuar sobre otros mediadores moleculares involucrados en esta patologa como son: el factor NFB, las enzimas glutatin Stransferasa, glutatin reductasa, COX2, metaloproteinasa de matriz 2 y catalasa, receptor andrgeno, protena cinasa C alfa, forma celular de la protena inhibitoria FLICE (cFLIP), receptor de muerte 3(DR3),entreotros(Siddique&Saleem,2011). Por otra parte, los cidos fenlicos como el cido glico, que tambin se han reportado en los extractos de mango (NezSells et al., 2002), han mostrado inhibicin del crecimiento celular en lneas celulares humanas de esfago, gstrica, crvix, mama (MCF7), colon (HT29,

Col201) y murinas como Colon 26 (Faried et al., 2007). De la misma forma, se sabe que los galotaninos presentan actividadcontraelcncerdecolon(clulasT84yHCT116) (GaliMahtasib et al., 2001; Oh et al., 2001; Chen & et al., 2003; Chen & Lin, 2004; AlAyyoubi & GaliMuhtasib, 2007), clulas de cncer de mama (MCF7), as como en clulasTJurkat(Chen&etal.,2003;Chen&Lin,2004). ACTIVIDAD SOBRE CITOCROMO P450 Y GLICOPROTENA P.POSIBILIDADESDEINTERACCINCONFRMACOS El metabolismo de los frmacos es el mayor determinante del aclaramiento de los medicamentos, las diferencias individuales en la farmacocintica e, indirectamente, la eficacia clnica y la toxicidad de los frmacos. La industria farmacutica est llamada a comercializar los frmacos ms seguros con pocos efectos adversos, propiedades farmacocinticas predecibles e interacciones cuantificables frmacofrmaco, frmacoproducto herbal o frmaco alimento. El riesgo potencial de las interacciones entre derivados de plantas yfrmacoses de particular inters en la actualidad, justamente por el incremento del uso de los primeros. De esta forma, los hepatocitos representan el modelo ms apropiado para la evaluacin del metabolismo integrado de frmacos, productos herbales o alimentos, las correlaciones metabolismotoxicidad, mecanismos de hepatotoxicidad y las interacciones (inhibicin e induccin) de xenobiticos y enzimas que metabolizan frmacos. Tambin son ms rentables los estudios del perfil y la tasa metablica, la identificacin de los citocromos P450 involucrados, las interacciones potenciales frmaco frmaco o el papel de las enzimas polimrficas antes del iniciodelosensayosclnicos(GmezLechnetal.,2010). Estudios recientes (Rodeiro et al., 2008a,b) demostraron que la incubacin del ECAM con las clulas hepticas no modific la actividad de diferentes citocromos del sistema del CYP450 (CYP3A, 2E, 2D6, 2B6, 2C9 y 2C19). Slo se observ una inhibicin significativa, dependiente de la concentracin del CYP1A1/2, lo que se puede considerar como un resultado que puede fundamentar una posible actividad quimiopreventiva del ECAM, ya que este citocromo ha sido asociado con la activacin de diferentes mutgenos y carcingenos en el organismo. Adems, el ECAM provoc una induccin dos veces mayor de la actividad del CYP2B6 en estesistema celular. Mientras que en otro estudio (Rodeiro et al., 2012) se examinaron los efectos del ECAM y la MF sobre varias enzimas P450 y UDPglucuronosiltransferasas (UGTs) en hepatocitos humanos cultivados en el que se observ una disminucin, dependiente de la concentracin de ambos productos, de la actividad de las cinco enzimas P450 medidas (CYP1A2, 2A6,2C9,2D6y3A4).Paratodaslasactividadesseobserv una reduccin de al menos 50% a la concentracin ms
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alta (250 mg/mL). Adems, el ECAM redujo considerablementelaactividad UGT1A9(alrededorde60% a 250 mg/mL) y tuvo menos efectos sobre las otras UGTs. En contraste, MF (250 mg/mL) tuvo efectos mayores sobre UGT1A1 y 2B7 que sobre UGT1A9 (aproximadamente 55% frente a 35% de reduccin, respectivamente). La cuantificacin de ARNm especficos revel una reduccin en el contenido de ARNm de los CYP3A4 y 3A5, y un aumento de los ARNms de CYP1A1, CYP1A2, UGT1A1 y UGT1A9. No fueron observados efectos notables en las concentraciones de CYP2A6, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6 y 2E1. Los autores sugirieron que la actividad y(o) expresin de las principales enzimas P450 y UGT es modulada por el ECAM y que pudieran surgir interacciones potenciales con frmacos despus de una ingesta combinada de este extracto con los frmacos convencionales. Por lo tanto, si bienesciertoquenosiempresemanifiestanestasposibles interacciones cuando se pasa de modelos in vitro a in vivo, debenserexaminadoslosriesgospotencialesdeseguridad delECAMcuandosecoadministreconotrosfrmacos. Por otra parte, muchos compuestos derivados de plantas, incluyendo los polifenoles, son capaces de afectar la funcin de MDR1/glicoprotena P (Pgp ABCB1) transportador de mltiples frmacos, lo que conduce a posibles interacciones hierbafrmaco (Chieli & Romiti, 2008). Por ello, se realiz un estudio para evaluar los efectosdeECAMyalgunosfenolespresentesenlsobrela actividad de Pgp en una lnea celular de tbulo proximal HK2, en una sublnea celular Caco2 (seleccionada por su resistencia a vincristina, Caco2/VCR) y la sobreexpresin de Pgp (Chieli et al., 2009). Todos los compuestos investigados, a excepcin de catequina y cido glico, inhibieron la actividad de Pgp en clulas HK2, en el orden de mangiferina <noratiriol <quercetina <ECAM. Efectos similares se obtuvieron en clulas Caco2/VCR resistentes, pero fueron insignificantes en los de tipo salvaje, expresando bajas cantidades de Pgp. Para profundizar en el mecanismo por el cual ocurre esta inhibicin se realiz un estudio en el que se determin la capacidad potencial de los compuestos en estudio sobre el gen ABCB1 y la expresin de Pgp en las clulas HK2 que expresan constitutivamente este transportador (Chieli et al., 2010). Mediante western blot se demostr que hubo una disminucin dependiente de la concentracin de Pgp en clulas cultivadas en presencia de ECAM durante 72 h. El cido glico y la quercetina tambin disminuyeron las concentraciones de Pgp a todas las concentraciones estudiadas, mientras que la catequina fue casi ineficaz. Sin embargo,enlasclulasexpuestasaMFlacantidaddePgp mostr un incremento dependiente de la concentracin y del tiempo, por lo que fue dos veces mayor que los controles despus de 72 h. Tambin, noratiriol indujo Pgp a bajas concentraciones pero el efecto disminuy a concentraciones superiores. Los cambios en la cantidad de protena Pgp se correlacionaron con cambios relativos en

el contenido deARNm deABCB1 y con la actividad deflujo de salida del transportador. El inhibidor transcripcional 1 dribofuranosilbenzimidazole (DRB) inhibi el aumento de laexpresindeABCB1inducidoporMF,loquesugiereque el aumento podra ser debido a la regulacin transcripcional del ARNm de ABCB1. Las clulas tratadas con MF, que sobreexpresaron el transportador, estaban protegidas frente a la citotoxicidad de ciclosporina A, un sustrato conocido de la Pgp. El efecto protector tambin se observ en las clulas pretratadas con ECAM. Estos resultados demuestran que ECAM y los polifenoles presentes en l tambin pueden interactuar con ABCB1/P gp a nivel de expresin. Estos resultados demostraron, por primera vez, que ECAM y los polifenoles presentes en el extractopuedenafectaralaactividaddeltransportadorde mltiples frmacos Pgp ABCB1, lo que sugiere la posibilidaddeinteraccioneshierbafrmacoquedebanser estudiadas en profundidad, fundamentalmente en modelosinvivo. EVIDENCIASTOXICOLGICAS EstudiosdeToxicidad Estudios, realizados en roedores (ratas y ratones), demostraron que el ECAM es un producto que clasifica como No txico cuando se administra por dosis nica por las vas oral (DL50 > 5000 mg/kg p.c.) y tpica (DL50 > 2000 mg/kg p.c) (Garrido et al., 2009). Mientras que la toxicidad por dosis nica, va intraperitoneal (i.p.), en ratas permiti clasificar al producto como Txico, con una toxicidad diferencial entre los sexos, de modo tal que mientras la DL50enlashembrasfuede166,48mg/kgp.cenlosmachos fue > 500 mg/kg p.c., lo que indica que las hembras son ms sensibles al producto bajo estas condiciones experimentales.ElestudioenratonesdemostrquelaDL50 para las hembras fue de 273,14 mg/kg y en los machos de 219,67 mg/kg, sin mostrar, en este caso, diferencia entre los sexos. En estos ensayos los sntomas clnicos detectados seguidos a la administracin de ECAM fueron consistentesconlaclasificacindelproducto. EstudiosdeGenotoxicidad El potencial mutagnico y genotxico del ECAM se realiz mediante una batera de pruebas que incluyeron los estudios propuestos comnmente por las agencias nacionales e internacionales para investigar los efectos txicosdelproductodeensayosobreelmaterialgentico. ElECAMfueevaluadoenelensayodeAmesconelempleo delascepasTA1535,TA1537,TA1538,TA98yTA100,en presencia y ausencia de activacin metablica, pero ste no indujo efecto mutagnico hasta concentraciones de 5 000 g/placa, lmite mximo de evaluacin propuesto para esteensayo(Rodeiroetal.,2006). El potencial genotxico in vivo del ECAM fue determinado por la administracin por va oral (20 2 000 mg/kg p.c.) a
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ratones NMRI de ambos sexos. En este estudio de deteccin de dao primario al ADN no existieron evidencias de toxicidad en el hgado, principal rgano que ha sido demostrado metaboliza la mayora de los compuestos presentes en el extracto como son los polifenoles,losterpenosyloscidosgrasos(Walle,2004). A diferencia de lo observado in vitro, el ECAM no indujo dao primario al ADN en leucocitos desangre perifrica, ni enclulashepticasdelosanimalestratados,a pesardela dosis mxima utilizada, lmite mximo aceptado para este tipo de ensayos. Tampoco se observaron efectos genotxicoscuandoelECAMseadministrporvai.p.(50 200 mg/kg), lo que demostr que tampoco induce dao primario al ADN en leucocitos de sangre perifrica, ni en clulas hepticas de ratones NMRI de ambos sexos por esta va de administracin, bajo esas condiciones de ensayo(Gonzlezetal.,2007). El estudio de los efectos del ECAM sobre la induccin de microncleos fue realizado en linfocitos humanos de sangre perifrica en el que se demostr que el extracto present un efecto citotxico a la concentracin mxima ensayada(1500g/mL),peronoindujoclastogenicidaden elrangodeconcentracionesestudiado(1501500g/mL) despusde3y20hdeexposicin,enpresenciayausencia de activacin metablica, respectivamente (Rodeiro et al., 2006). En los estudios realizados in vivo se corrobor que el ECAM, administrado por va oral produjo una ligera citotoxicidad a la dosis mxima evaluada (2 000 mg/kg p.c.). Este evento no present repercusin clnica para los animales en el estudio y puede interpretarse como un indicador de evidencias de exposicin del rgano diana. Al analizarlafrecuenciadeMNnoexistirelacinconladosis de ECAM administrada, por lo que es posible afirmar que, de igual manera que en los ensayos in vitro, el extracto no indujoclastogenicidadaniveldelamdulaseaderatones NMRI, por lo que el nivel de dosis al que no se observan efectos adversos (NOAEL), bajo estas condiciones de ensayo, fue 2 000 mg/kg/da (Gonzlez et al., 2007). En adicin, la administracin i.p. de ECAM (50 200 mg/kg) a ratones NMRI de ambos sexos indujo una citotoxicidad moderada sobre el proceso de eritropoyesis a nivel de la mdula sea, pero no sobre los leucocitos de sangre perifrica de los animales tratados con el producto y tampoco indujo clastogenicidad en la mdula sea, por lo queelNOAELenesteensayofuede200mg/kg/da. De manera general, puede apreciarse que no existe relacin entre las dosis de ECAM administradas en los estudios realizados y la frecuencia de microncleos observada, ni tampoco en la respuestade daoprimario al ADN y el porcentaje de nucleoides altamente daados en los leucocitos de los animales tratados, lo que soporta la

hiptesis que la induccin de dao primario observada, in vitroenelensayoCometa,pudieraestarrelacionadaconla generacin de H2O2 en las condiciones de incubacin empleadas. La ausencia de genotoxicidad in vivo coincide, adems, con lo observado para otros polifenoles como la quercetina (Metodiewa et al., 1999) y la estrecha relacin entre el ambiente redox y la actividad genotxica descrita para algunos polifenoles (Skibola & Smith, 2000; Collins, 2005). De acuerdo a estos resultados, los autores sugirieron que el ECAM presenta un bajo potencial mutagnico y genotxicoinvitroynoesgenotxicoinvivo. EstudiosdeTeratognesis El potencial teratognico y(o) embriotxico del ECAM, administrado por va oral, fue ensayado durante la organognesis de ratas SpragueDawley, perodo de mayor susceptibilidad para la produccin de perturbaciones en la morfognesis normal de los rganos y tejidos del embrin. El ECAM no produjo muertes maternas ni signos clnicos relevantes en los diferentes grupos de tratamiento. Los anlisis estadsticos del consumo de alimentos y los incrementos de peso materno durante la gestacin no evidenciaron diferencias significativas entre los animales del grupo control y los administrados con ECAM. En relacin con los efectos del extracto sobre el desarrollo embrionario, no se obtuvo un incremento de las muertes en tero, retardo en el crecimiento, ni teratogenicidad. El nmero de madres con fetos no viables y el tamao de la camada no mostraron diferencias estadsticamente significativas entre las madres administradas con ECAM y las controles. Tampoco las prdidas postimplantacin (reabsorciones embrionarias como las muertes fetales) ni el peso de los fetos difirieron de forma significativa entre esos grupos. El anlisis de los esqueletos no evidenci malformaciones en el grupo de control, ni en los grupos tratados (Gonzlez et al., 2007). De acuerdo a estos resultados, el ECAM no es un agente inductor de aberraciones cromosmicas que no provoca alteraciones en la divisin celular, ni induccin de apoptosis a un nivel tal que cause embriotoxicidad en las condiciones experimentales expuestas, por lo que su NOAEL fue de 2 000mg/kg/da. En estos estudios el ECAM present un bajo potencial teratognico; sin embrago, es necesario enfatizar que la demostracin de la inocuidad de un producto sobre el proceso de la reproduccin involucra no slo la evaluacin de su potencial teratognico, tambin involucra el estudio de sus posibles efectos sobre otros indicadores como son: el ciclo estral, la conducta en el apareo, la fertilidad, y el desarrollo pre y postnatal de las cras (incluidos los estudios sobre la descendencia) y una evaluacin de su funcin reproductora, lo que permitira, unido a sus
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propiedades farmacolgicas, definir su posible utilizacin enmujeresgestantesynios. Otrosestudiostoxicolgicos Los estudios de irritabilidad, tanto del ECAM como de las formulaciones Vimang, demostraron que se est en presencia de un producto que clasifica como No Irritante por va oral, tpica, rectal, vaginal y ocular (Garrido et al., 2009). El resumen de los resultados de los estudios toxicolgicosrealizadosalECAMsemuestraenlaFigura5. EVIDENCIASDEFARMACOLOGACLNICA TeniendoencuentalaefectividaddemostradaporelECAM en el tratamiento y(o) prevencin de enfermedades El objetivo del estudio (PardoAndreu et al., 2006d) fue evaluar la mejora de la calidad de vida mediante la suplementacin con Vimang en el Adulto Mayor en la Atencin Primaria de Salud, de forma ambulatoria, para lo cual se incluyeron 31 adultos mayores de 65 aos, aparentemente sanos (Grupo 1), de forma aleatorizada, a los cuales se les suministr Vimang (tableta, 300 mg, tres veces al da) y se controlaron siete parmetros del estrs oxidativo: lacapacidadtotalantioxidantesrica(CTA),GSH (peroxidasa, reducido y total), sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS), superxido dismutasa (SOD) y potencial de peroxidacin (PP). Los resultados de la
Figura5.

humanasasociadasalestrsoxidativo,inflamacinydolor, sustentada por modelos in vitro e in vivo, as como del conocimiento el perfil toxicolgico del extracto, se reportan tambin los estudios sobre la tecnologa qumica (AcostaEsquijarosaetal.,2009a,b,2010;NuevasPazetal., 2012) y farmacutica (ArsPampin et al., 2003; Lemus Rodrguezetal.,2006)quenoslofacilitaronlarealizacin delosensayosanteriores,tambinpermitieronobtenerlas diferentes formulaciones que se usaran en la realizacin delosestudiosclnicos(NezSellesetal.,2007c). Ensayo clnico aleatorizado, a doble ciego, para medir el efecto sobre los indicadores sricos de estrs oxidativo y la calidad de vida en el adulto mayor en la Atencin PrimariadeSalud. evolucin del estrs oxidativo en este grupo se compararon con los de un grupo de 30 adultos no suplementados con Vimang (Grupo 2) y un grupo de 30 jvenes sanos (Grupo 3), con edades entre 25 y 30 aos a quienes se le realizaron las mismas determinaciones. Al Grupo 1 se le aplic el Cuestionario de Salud SF36, validado internacionalmente para evaluar la calidad de vida, que contempla nueve funciones: Funcin fsica, Rol fsico, Rol social, Dolor corporal, Salud general, Vitalidad, Rol emocional y Salud mental. Las determinaciones se realizaron a los tiempos cero (inicio del ensayo), 15, 30 y 60(finaldelensayo)das.

N O T X IC O
(o r a l y t p ic a ) T X IC O (i.p ) (ra ta s y ra to n e s )

N O T X IC O (o r a l, 9 0 d a s , r a ta s ) D o s is 2 0 0 0 m g /k g

S U B -C R N IC O S

N O T X IC O (o r a l, 1 8 0 d a s , r a ta s ) D o s is 2 0 0 0 m g /k g

AGUDOS

C R N IC O S

ECAM
T E R A T O G N E S IS G E N O T O X IC ID A D
N O T E R A T O G N IC O
(o r a l, r a ta s ) D o s is 2 0 0 0 m g /k g

IR R IT A B IL ID A D
N O IR R IT A N T E (p ie l, r e c to y o jo s ) IR R IT A B IL ID A D M N IM A (v a g in a ) C o n e jo s

N O G E N O T X IC O in v iv o
(o r a l, i.p ., r a to n e s ) D o s is 1 5 0 m g /k g (i.p .) 2 0 0 0 m g /k g (o r a l)

Resumendelosestudiostoxicolgicosrealizadosalextractodelacortezadelrboldelmango(ECAM).

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LasuplementacinconVimangmodificenelGrupo1,de forma significativa, cuatro de los siete marcadores del estrsoxidativoevaluados,alsercomparadosconelgrupo control (Grupo 2) no suplementado con Vimang a los 60 das de tratamiento: increment la actividad de la SOD extracelular y la CTA; al mismo tiempo redujo las concentraciones de TBARS y de glutatin oxidado (GSSG). Fue significativo que los valores de esos marcadores del estrs oxidativo en el grupo tratado alcanzaron los mismos valoresqueelGrupo3(jvenesentre25y30aos). Con relacin a la evaluacin de la calidad de vida, la suplementacin con Vimang mejor la autopercepcin de la salud en los adultos tratados en ocho de los nueve parmetros evaluados del Cuestionario SF36. Lo ms significativo de esta evaluacin fue la mejora en el parmetro Dolor corporal. Dicho parmetro fue el primero que mostr una diferencia significativa, a los 15 das de iniciado el tratamiento, y tuvo la mayor diferencia alfinaldelensayodetodoslosparmetrosevaluados.Slo un parmetro del Cuestionario SF36 (Rol emocional) no mostr una diferencia significativa al trmino del estudio. Los autores manifestaron que la reduccin del estrs oxidativo en el adulto mayor, mediante la suplementacin con Vimang implic una mejora de la calidad de vida, reflejado,sobretodo,enelaliviodelosdolorescorporales, unamayorautopercepcindemejoraenelestadogeneral desaludyundesempeosuperiordelaactividadfsica. Ensayo clnico aleatorizado, a doble ciego y controlado, para determinar el efecto sobre marcadores de estrs oxidativoylaprogresindelaenfermedadVIHSIDA El objetivo de este estudio fue evaluar la evolucin del estrs oxidativo en pacientes seropositivos VIH en condiciones de atencin sanatorial y dieta controlada y su efecto en la progresin de los marcadores inmunolgicos delaenfermedadylaevolucinclnicadelospacientes(Gil del Valle et al., 2002; Prez et al., 2003). Para ello, se dise un ensayo clnico aleatorizado, a doble ciego y controlado, en el que se evalu el efecto de las tabletas Vimang (ocho tabletas de 300 mg, diarias durante seis meses)vs.placebo.Alfinalizarelensayosepudoevaluarel comportamiento de 68 sujetos: 36 suplementados con tabletasVimangy32querecibieronplaceboenlosquese evaluaron variables de estrs oxidativo, hemoqumicas, inmunolgicas y nutricionales. Estos resultados se compararon con los obtenidos para un grupo de seronegativos(28sujetos). El grupo suplementado con las tabletas Vimang tuvo un incremento en plasma de TAS (Total Antioxidant Status), GSHyGPxyunareduccinenelpotencialdeperoxidacin, MDA, hidroperxidos totales en plasma, porcentaje de fragmentacin del ADN y SOD. Todas estas variables tuvieron una diferencia estadsticamente significativa

respecto al grupo placebo. La mejora en el estado redox en el grupo suplementado con Vimang fue del 56,3% con relacin al 3,7% del grupo placebo. No hubo diferencias significativas en las variables hemoqumicas y no se observaron efectos txicos a nivel plasmtico, renal, ni heptico. De las siete variables estudiadas, tres mostraron tendencia a la disminucin: eritrosedimentacin, transaminasa y cido rico. Tampoco se detectaron diferencias significativas entre el conteo de CD4 y CD8/CD38 del grupo tratado respecto al grupo placebo y hubo una tendencia hacia la reduccin en el receptor de CD95, aunque no se observ diferencia estadsticamente significativa(p=0,08). Enesteensayo,ladietafuecontroladaymonitoreadapara ambos grupos. El ndice nutricional de la ingesta de macro y micronutrientes durante el perodo de ensayo no mostr diferencias significativas entre los grupos. El aporte de nutrientes dentro de la dieta se mantuvo estable durante el tiempo del estudio, por lo que los autores aseguraron que los resultados slo se pueden adscribir al efecto del tratamiento.Estosnodetectaronreaccionesadversasenel gruposuplementadoconlastabletasVimang. Reportedecasosenasmabronquial

EstudiosrecienteshanmostradoevidenciasdequelasERO producidas por las clulas inflamatorias de las vas areas desempean un papel esencial en la patognesis del asma bronquial(Nadeemetal.,2003)yquedecrecelacapacidad endgena antioxidante en pacientes con esta patologa (Bowler & Crapo, 2002). Por lo tanto, se administraron cpsulas Vimang (300 mg, tres veces al da antes de las comidas, durante 12 semanas) a dos pacientes con grados de asma diferentes (lvarezLen et al., 2009). El diagnstico se estableci mediante interrogatorio, examen fsico y confirmado por pruebas de ayuda en las que se demostr la presencia de obstruccin bronquial por espirometra basada en el cumplimiento del criterio de FEV1/FVC < 80%. El paciente I (femenina, 39 aos) se diagnosticcomoasmamoderadapersistenteyelpaciente II (masculino, 43 aos) se diagnostic como asma severa persistente.Aestospacientestambinselesdeterminaron inmunoglobulina E (IgE) total en suero, protena catinica de eosinfilo (ECP) y la actividad de la metaloproteinasa9 (MMP9) a las 0, 6 y 12 semanas de tratamiento. Se pudo observar una disminucin de la actividad enzimtica de MMP9deformaproporcionalaltiempodetratamientoen ambos pacientes. Un comportamiento similar se obtuvo tambin para la IgE y la ECP. Desde el punto de vista funcional se logr el mismo comportamiento para el volumen expiratorio forzado (FEV1). Hubo una mejora clnicaevidente,dadaporelespaciamientodelossntomas diurnos (disnea, opresin torcica y sibilancia) y nocturnos (tos y sibilancia) a partir de la tercera semana de tratamiento. El paciente II no present sntomas agudos
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durante el estudio y tuvo necesidad de usar el salbutamol slo dos veces (una vez a la segunda semana y otra a la quinta semana). Result significativo que ninguno de los dospacientesconsumiesteroidesdurantelas12semanas detratamiento. Estudio piloto para determinar la eficacia en el tratamiento de afecciones dermatolgicas de alta incidenciaenlaAtencinPrimariadeSalud La piel, como rgano, no escapa a la accin deletrea que pueden ejercer las ERO a nivel subcelular, celular y tisular, cuando por la presencia de patgenos o por alteraciones de su fisiologa, se rompe el equilibrio redox, toda vez que existe una ntima relacin entre los procesos inflamatorios crnicos o agudos, el envejecimiento, el estrs oxidativo y la proteccin que ejercen los polifenoles (Afaq & Katiyar, 2011). Teniendo en cuenta estos antecedentes, se estudi la evolucin clnica de 345 pacientes portadores de afecciones dermatolgicas, atendidos en la Atencin Primaria (Guevara et al., 2007) los que usaron la crema Vimang 1,2%, tres veces al da, en las zonas lesionadas, conelfindeconocerdatosque permitieranun diseoms adecuado y establecer su viabilidad en afecciones dermatolgicasdealtafrecuencia. Enesteestudiosesiguilaevolucinde158pacientescon patologas de etiologa mictica. De ellos, 66 pacientes presentaron pitiriasis versicolor, 34 otras variedades de epidermofitosis, fundamentalmente en los pies; 34 presentaron intertrigo y 24 otras micosis que afectaban la pielylasmucosastica,nasal,bucal,vaginalorectal. Laevolucindelasmicosis,engeneral,tuvounatendencia significativa en el 39,2% de los pacientes hacia la Remisin Completa (RC, desaparicin de los sntomas y signos de la enfermedad en el curso del tratamiento, remisin completadelacrisisenelcasodeafeccionescrnicas)yen el 52,2% de ellos Remisin Parcial (RP, alivio significativo de los sntomas y signos de la enfermedad con reduccin enmsdeun70%delaextensindelaslesionesoregreso de los signos y sntomas a niveles inferiores a los del inicio delaconsulta,enelcasodelasafeccionescrnicas),frente a un 9% de casos en que la afeccin tuvo una No Remisin (NR, mantenimiento de los signos y sntomas de la enfermedad iguales a los existentes al inicio de la consulta o reduccin de la extensin de las lesiones en menos del 70%). Cada patologa en particular evolucion con la misma tendencia hacia la RC o RP. Este resultado podra atribuirse al efecto antiinflamatorio de la crema Vimang. Las atopias y el eczema, como reacciones de hipersensibilidad,tuvieronunatendenciahacialaRCenno ms de tres meses y slo pocos casos evolucionaron hacia la cronicidad. En este estudio, tambin se siguieron 35

pacientes con dermatitis atpica, de los cuales 22 tuvieron RP, 10 RC y 3 NR con el empleo de la crema Vimang . Adems, de los 21 pacientes con psoriasis 15 evolucionaron hacia una RP y de 10 pacientes con eczema, cincoevolucionaronhacialaRC.Demodogeneral,el59,1% delospacientesconpatologasdermatolgicasdeetiologa inmunolgica evolucion hacia la RP, el 30,3% evolucion hacia la RC y el 10,5% NR, lo cual se corresponde con las tendencias publicadas acerca de la evolucin de estas patologas con el uso de esteroides. Existe, por tanto, la posibilidad de reducir o evitar el empleo de corticoesteroides en estas patologas, con un efecto econmico y social muy beneficioso, por los efectos colateralesdeestetipodemedicamentos. Por otra parte, en 27 pacientes con acn juvenil, 17 presentaron RP y 7 RC, para un 100% de mejora en plazos de tratamiento que oscilaron entre los 25 y 60 das. De los 10pacientesconpiodermitis,cincoevolucionaronhaciaRP y cuatro hacia RC, para un 90% de mejora en esta patologa. Todos los pacientes con Herpes simplex y Herpes zoster remitieron parcial o totalmente la enfermedad. Esto corrobora resultados anteriores en los quesedemostrinvitro(Carballoetal.,2002),laactividad antiviraldelECAMfrentealHerpessimplextipo1(HSV1), no as para el tipo 2 (HSV2), as como la evolucin satisfactoria registrada en un reporte de caso de una pacienteconHerpeszoster(lvarezetal.,2002). En general, de 49 pacientes con afecciones de origen bacteriano o viral, el 63,3% evolucion hacia RP y el 30,6% haciaRC,locualresultelevadodeformasignificativa. En los trastornos de la pigmentacin, las arrugas y las quemaduras se observ una evolucin favorable hacia la RP o RC de las lesiones hipercrmicas e hipocrmicas (incluyendo el cloasma), en las que el origen es muy diverso y no existe medicacin especfica. En el caso de las arrugas,de18casostratados,15tuvieronRPy3RC. De los 345 casos comprendidos en este estudio el 52,5% evolucion hacia la RP, el 39,7% hacia la RC y el 7,8% NR. Los efectos adversos por la utilizacin de la crema fueron escasos y fundamentalmente se manifestaron en piel daada. Los autores consideraron importante sealar que la teraputica antiinflamatoria y antioxidante es inespecfica de estas patologas y puede accionar de modo facilitador sobre su evolucin, por lo que los resultados expuestos deben ser interpretados en el sentido de confirmar el importante sustrato inflamatorio y de estrs oxidativo que puede existir en cualquier afeccin dermatolgica o no, conindependenciadesuetiologa.

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Reporteyseriedecasoseneltratamientodeldolor Hay algunas evidencias que involucran a TNF en la sensibilizacin central (GarridoSurez et al., 2010). Las concentraciones de esta citocina proinflamatoria aumentan exponencialmente despus de una lesin del nervio y su aplicacin intracitica en ratas produce descargas ectpicas en fibras C y A, adems, anticuerpos neutralizantes antiTNF o inhibidores de la sntesis de TNF alivian el dolor neuroptico en la lesin de constriccin crnica y modelos de ligadura del nervio sitico(Zelenkaetal.,2005). Por otra parte, los ensayos clnicos han comenzado a demostrar que la inhibicin de TNF alivia algunos tipos de dolor neuroptico (Rajkumar et al., 2003). TNF promueve la sntesis de la sustancia P (SP), la adenosina, pptidos relacionados con genes de la calcitonina y el factor de crecimiento nervioso (NGF), as como, modula genes implicados en la expresin de otras citocinas (IL1, IL2, IL 6, IL8 e IFN) e induce su sntesis. Tambin, IL1 puede contribuir indirectamente al estado excitotxico, a travs de la liberacin de NO, ERO, eicosanoides y glutamato. Del mismomodo,sehareconocidoquelasERO,elTNFylaIL 1 pueden inducir dao por inhibir la capacidad de las clulas gliales para eliminar el glutamato de la hendidura sinptica (De Leo, et al., 2006). Por tanto, las acciones del ECAM y la MF sobre la expresin de TNF e IL1, previamente demostradas (Garrido et al., 2004b; Leiro et al., 2004a,b), podran explicar el efecto antialodnico y la disminucin de la frecuencia de dolor paroxstico en estudios experimentales (lvarez et al., 2002; Garrido Surezetal.,2009). TNF induce la potenciacin a largo plazo de fibras C en el cuerno dorsal espinal en ratas con dao de nervio y los inhibidores de NFB bloquean este efecto (Lin et al., 2007). NFB es expresado constitutivamente en el cerebro; sin embargo, su expresin se incrementa despus de una lesin de la mdula espinal y puede activarse por diferentesestmuloscomocitocinasproinflamatorias,NGF, PKC y glutamato. Tambin, NFB regula la expresin de varias protenas involucradas en la nocicepcin y la plasticidad neural tales como citocinas proinflamatorias, quimiocinas, iNOS, COX2 y prodinorfina (Romano et al., 2006).Ladinorfinapodramodularlafuncinimmunedela microglia y el astrocito, as como interactuar con el receptos de NMDA en neuronas y producir alodinia (Laughlin et al., 2000). El NFB es tambin un elemento clave en la regulacin de los procesos inflamatorios de clulas gliales reactivas, su inhibicin transgnica atena el dolor y la inflamacin despus del dao nervioso periferal (Fu et al., 2010). Por tanto, los efectos inhibitorios del ECAM, sobre la activacin del NFB inducida por TNF (Garrido et al., 2005), podra sugerir un efecto antialodnicodelextracto.

Adems, las ERO tambin estn involucradas en la sensibilizacin central y se ha supuesto que las concentraciones elevadas de ellas desempean un papel importante en la fosforilacin de la subunidad 1 del receptor NMDA (pNR1), a travs de la activacin de PKC y PKA en la mdula espinal (Kim et al., 2006; Gao et al., 2007). Todos estos antecedentes, unidos a las actividades farmacolgicas demostradas para el ECAM y MF podran inferir una actividad analgsica importante en ensayos clnicos(GarridoSurezeta.,2010).Paraello,seestudiel caso de una paciente con diagnstico de Sndrome Doloroso Regional Complejo (SDRC) tipo II, secundario a una lesin del plexo braquial, con seccin del nervio radial a nivel humeral que fue provocada por el desplazamiento de la fractura del hmero izquierdo (GarridoSurez et al., 2007). Al acudir a la consulta, la paciente presentaba cuatromesesdeevolucin,consntomassensoriales,dolor persistente quemante y paroxstico, alodinia mecnica, edema, cambios vasomotores hacia la hiperhemia y mano en flexin por prdida de la funcin motora de los msculos extensores del antebrazo, con el compromiso de la articulacin del carpo y hombro de limitacin severa y dolor de valor 5 en una escala numrica de Likert. El estudio de conduccin nerviosa mostr alteraciones mielnicoaxonales discretas del nervio mediano y mielnicoaxonales severas del nervio radial. Se instaur el tratamientoconVimang(2tabletasde300mg,cada8hy aplicacinlocaldecrema1,2%,3vecesalda)por4meses, asociado a los bloqueos simpticos y somticos para miembro superior y a la fisioterapia. La evolucin clnica y electrofisiolgica fue muy favorable. Mediante el seguimiento posttratamiento, a los dos meses del alta, despus de concluir las 10 sesiones de bloqueos y el tratamientosistmicoconVimang,noseobservedemani cambios de coloracin en la zona daada, mejor el trofismo de la piel, se conserv la flexoextensin de los dedos y la flexoextensin del carpo fue limitada pero posible. Por otra parte, se determin la actividad analgsica de la suplementacin con formulaciones Vimang en 15 pacientes con SDRC y la posible mejora de la capacidad funcional postratamiento (GarridoSurez et al., 2009). Para ello, los pacientes recibieron Vimang tabletas (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al da, antes de las comidas), crema (1,2% en el miembro afectado 3 veces/da) y un bloqueo simptico semanal durante 4 meses. Se introdujo la fisioterapia al mes de tratamiento. Las variables evaluadas fueron las puntuaciones diarias medias de dolor (PDMD) mediante una escala de Likert, el rea e intensidad de la alodinia mecnica dinmica, la alodinia al fro, somtica profunda y la frecuencia del dolor paroxstico. En los 15 pacientes las PDMD y el resto de las alteraciones sensoriales se redujeron significativamente
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desde la semana 23 de comenzado el tratamiento con respecto a los valores iniciales. La funcionalidad del miembro afectado, medida por la escala de Ennenking et al.modificada,aumentdesde22,7a78,7%. Porotraparte,serealizunestudiodereportedecasosen el que se determin el efecto de las formulaciones Vimang en pacientes con Herpes zoster (GarridoSurez, et al., 2011a). Los pacientes (n=12) recibieron tabletas recubiertas (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al da, antes de las comidas, por 30 das) asociadas con bajas dosis de amitriptilina (1025 mg/d) y fueron controladas las dosis de rescate del analgsico utilizado (dipirona). Adems de las tabletas, ellos utilizaron compresas que contenan una dilucin al 2% de Vimang en las lesiones de la piel. Fueron determinadas las PDMD mediante la escala de Likert y tambin fueron determinadas las variaciones en las dosis diarias de los frmacos usados concomitantemente. El efecto analgsico fueobservadodesdelaprimerasemanaenrelacinconlos parmetros iniciales y ninguno mostr neuralgia post herptica. Tambin hubo una disminucin significativa en la reduccin de la medicacin antidepresiva y la dosis de rescate analgsica con respecto a las dosis diarias iniciales. Nofueronreportadoseventosadversos. En otro estudio de serie de casos (GarridoSurez et al., 2011b) fueron analizados los efectos de tabletas Vimang (1 800 mg, dos tabletas de 300 mg, tres veces al da, antes de las comidas, por 120 das) en 12 pacientes con dolor asociado a zoster (seis con neuralgia herptica subaguda y seis con neuralgia postherptica). La terapia complementaria consisti en bajas dosis de amitriptilina (1025 mg/da) y crema Vimang 1,2% aplicada tpicamente. En este estudio se registraron las PDMD a travs de la escala de Likert, el rea y la intensidad de la alodinia,laintensidaddelaalodiniatrmicaylafrecuencia de ardor espontneo. Las puntuaciones de dolor y alteraciones sensoriales disminuyeron significativamente desde la cuarta semana, con respecto a los datos iniciales. Tampocosereportaroneventosadversos. Los autores manifestaron que los resultados obtenidos, tantoenelreportecomoenlaseriedecasos,sugierenque la suplementacin con Vimang sera beneficiosa para prevenir y tratar el dolor neuroptico, aunque resulta necesaria la realizacin de un ensayo clnico controlado paraaceptarestahiptesis. En otro reporte de casos se estudi la actividad analgsica de las tabletas y crema Vimang en pacientes portadores de osteoartritis (OA) de rodilla y la posible mejora de la capacidadfuncionalpostratamiento(Valverdeetal.,2009). Para ello, se estudiaron 10 pacientes con diagnstico clnico de imagen de OA de rodilla. La semana previa al inicio del tratamiento sus PDMD eran mayores de 4, segn una escala de Likert de 11 puntos. Se aplic el ndice de

capacidadfuncionaldeWOMAC(TheWestermOntarioand Mc Master Universities Osteoarthritis Index) en la consulta inicial y al concluir el estudio. Los pacientes fueron asignados aleatoriamente a tres grupos (grupo Vimang tabletas 900 mg/da [n = 4], grupo Vimang tabletas 1 800 mg/da [n = 3] y grupo Vimang tabletas 900 mg/da + crema Vimang 1,2% [n = 3]). La administracin de las tabletas se reparti en tres tomas cada 8 h y la crema se aplic tres veces al da con el mismo intervalo en la rodilla afectada durante tres meses. Todos los pacientes mostraron analgesia satisfactoria a partir de los 1521 das hasta los tres meses. Este efecto se relacion, al menos en parte, con la disminucin de la efusin sinovial que se observenlamayoradelasarticulacionesafectadas,pero fue independiente de la disminucin del grosor de la sinovial constatada por ultrasonografa. Se observaron ambos efectos, promocin e inhibicin de la proliferacin sinovial, independientemente de la analgesia. La inhibicin de la proliferacin de la membrana sinovial con respecto a los valores iniciales slo fue significativa en el grupo Vimang900.Los10pacientesmejoraronsucalidaddevida en relacin con el alivio del dolor y el aumento de la capacidadfuncionalsegnelndicedeWOMAC. De la misma manera que en los reportes o serie de casos anteriores resulta necesaria la realizacin de ensayos clnicos controlados para confirmar los hallazgos descritos enesaspublicaciones. CONCLUSIONES La presencia de una mezcla determinada de polifenoles, terpenoides, cidos grasos y microelementos, unido a un proceso de estandarizacin del extracto acuoso de la corteza del rbol de mango (ECAM) le otorgan a este ingrediente farmacutico activo de las formulaciones Vimang un importante perfil antioxidante, anti inflamatorio, inmunomodulador y analgsico manifestado en una inhibicin de la peroxidacin lipdica y una proteccin al dao oxidativo de la cadena de ADN mediante el mecanismo de secuestro de ERO, probablementeatravsdelaaccindeflavonoidesyotros polifenoles. Tambin a travs de la disminucin de la acumulacin de Fe2+ mediante la reaccin de acomplejamiento con la mangiferina (MF), lo que puede ejercer un mecanismo preventivo de proteccin a diferentes rganos. El ECAM protege a la mitocondria celular mediante la accin sobre diversos sistemas enzimticos,enlosquepuedenestarinvolucradosdiversos componentes qumicos del ECAM que impiden o disminuyenlaformacindeERO. Desde el punto de vista de la actividad sobre el sistema inmune, el ECAM inhibe la produccin de molculas pro inflamatorias, tales como NO, PGE2 y LTB4; enzimas involucradas en este proceso, tales como la PLA2, la iNOS y
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la COX2 y la expresin de molculas de adhesin como la ICAM1 e incrementa TGF. Todo ello vinculado con su efecto modulador sobre la inhibicin de importantes funcionescomolaquimiotaxis;laexpresindelascitocinas TNF y sus receptores TNF R1 y R2, GMCSF e IL1 mediante la inhibicin de la transcripcin de los genes que las codifican, la inhibicin de la produccin de isotipos especficos de inmunoglobulinas, como la IgG2a y la IgG2b sin afectar la produccin de IgM; la inhibicin de la proliferacin celular mediada por el receptor de IL2 en clulas T, a travs de la inhibicin de la expresin del marcador de activacin CD25 en la superficie de clulas T primarias; y la inhibicin de las vas de sealizacin intracelular mediadas por NFB en linfocitos T y en macrfagos, lo que conduce a la inhibicin de la produccin de mediadores moleculares que participan en losprocesosinmunolgicos,nociceptivoseinflamatorios. El ECAM inhibi la muerte celular inducida por activacin (AICD) en clulas T primarias mediante la disminucin de las concentraciones de ERO y Ca2+ inducidas por la activacin del receptor de la clula T, la inhibicin de la fosforilacin de la cinasa de cJun (JNK) que participa en la activacin del factor transcripcional AP1, la disminucin de la expresin del factor transcripcional NFB y la disminucin de la expresin del ligando de muerte CD95L. Estos resultados demuestran que el ECAM puede contribuir a prolongar la sobrevivencia de poblaciones de linfocitos T, lo que fundamenta la utilizacin de las formulaciones Vimang en el tratamiento de patologas en las que el fenmeno de la AICD este incrementado, como eselcasodelainmunodeficienciaasociadaalVIH. LaactividadanalgsicadelECAMquedmanifestadaporla inhibicindelafaseIIdelapruebadelaformalinaal1%,lo que sugiere que el ECAM pudiera actuar sobre el proceso de sensibilizacin perifrica, especficamente sobre el componente capsaicinasensitivoneurognico; la disminucin de la concentracin de glutamato y el aumentodelnmerodeneuronasviablesenunmodelode muerte neuronal excitotxica inducida por NMDA, lo que sugiere que el ECAM pudiera inhibir la va postsinptica glutamatoreceptor NMDANOGMPc implicada en el proceso de sensibilizacin central que subyace en los estadosdolorososcrnicos. El efecto antialrgico del ECAM tambin fue evidenciado mediantelareduccindelaproduccindeIgE,lainhibicin de la desgranulacin de las clulas mastocitarias, la reduccin de la permeabilidad vascular inducida por histamina, as como la liberacin de histamina de clulas mastocitarias, la reduccin de la respuesta proliferativa linfocitaria antgenoespecfica y la inhibicin de IL4 e IL5 enunmodelodeasmaalrgica. Las evidencias clnicas con el uso de formulaciones Vimang , en ensayos clnicos a doble ciego, en estudios

pilotos como en series o reportes de casos han demostrado que existe una correlacin significativa entre la disminucin de los marcadores del estrs oxidativo y de la inflamacin, el alivio de los sntomas clnicos, la recuperacindemarcadoreshemoqumicosylamejorade la calidad de vida en varias enfermedades crnicas, as comoenlaatencinalAdultoMayor. Losresultadosdelosestudiostoxicolgicospreclnicosyla ausencia de eventos adversos significativos en los estudios clnicos han demostrado que se trata de un producto que no presenta efectos txicos, mutagnicos, genotxicos, ni teratognicos en las condiciones experimentales a que ha sidosometido. Resulta necesaria la realizacin de ensayos clnicos controlados en patologas que transitan por un componente de estrs oxidativo, inflamacin o dolor para asegurar la eficacia de las formulaciones que contengan comoingredientefarmacuticoactivoalECAM. BIBLIOGRAFA:
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ARTCULODEREVISIN

MAQUI(Aristoteliachilensis):UNNUTRACUTICOCHILENODERELEVANCIAMEDICINAL
(Maqui(Aristoteliachilensis):aChileannutraceuticalofmedicinalrelevance) JorgeR.Alonso1,2,3,M.D.
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FacultaddeMedicinadelaUniversidaddeBuenosAires.DirectordeposgradodeloscursosdeFitofrmacosyNutracuticos,Fitodermatologa 2 yAlimentosFuncionalesyNutracuticos. Prof.AdjuntoCtedradeFarmacognosiayFitofarmaciadelaUniv.Maimnides(Argentina). 3 PresidentedelaSociedadLatinoamericanadeFitomedicina.

RESUMEN

Los nutracuticos conforman un grupo heterogno de alimentos, que ms all de cumplir con su rol meramente nutricional, se proclamancomoposeedoresdeunefectobeneficiosoparalasaludhumana.Entreestosalimentos,destacaelmaqui(Aristotelia chilensis), cuyos frutos han demostrado poseer una importante variedad de efectos biolgicos: analgsicos, antiinflamatorios y antioxidantes principalmente, que lo posicionan como abordaje complementario de procesos crnicos. Su alto contenido en antocianidinas y la presencia importante de derivados poliglicosados polares, hacen de los frutos de A. chilensis un interesante recursoparalaelaboracindeextractosantioxidantesparaserempleadosenalimentosynutracuticos.Almomentoelmercado norteamericanodesuplementosdietariosynutracuticoscuentaconvariosproductosenbaseaextractosdemaqui. Palabrasclaves:nutracuticos,maqui,Aristoteliachilensis,antioxidante,polifenoles.
PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCCIN Los nutracuticos conforman un grupo heterogneo de alimentos, que ms all de cumplir con funciones nutricionales y energticas, poseen cualidades benficas para la prevencin de muchas dolencias (especialmente crnicas) as como para el abordaje complementario de las mismas. Un nutracutico (trmino acuadoen1989 por el Dr. Stephen De Felice, Presidente de la Fundacin para la Innovacin en Medicina, de los EE.UU) se diferencia de un alimento funcional, fundamentalmente en su presentacin y forma de suministro hacia el paciente. En ese sentido, el nutracutico tiene forma de presentacin farmacutica (cpsulas, comprimidos, etc), en tanto el alimento funcional conserva su forma de alimento, y puede ser adicionado o enriquecido con diferentes sustancias que realzan sus propiedades biolgicas (por ej. yogures con lactobacilos,panconmayortenordefibras,etc). Otrosejemploslosconstituyenlasuvasrojas(atravsdela presencia de resveratrol, un gran antioxidante), la cscara de la semilla del plantago o psyllum (para reducir hipercolesterolemia y generar menor incidencia de cncer de colon), el brcoli (por medio del indol3carbinol, un compuesto con propiedades antitumorales), la soja (a travs de sus isoflavonas en el abordaje de trastornos climatricos), las semillas de cha y lino as como los pescados de mar fro (por su riqueza en aceites Omega3), el tomate (por su riqueza en licopeno, otro gran 1 antioxidante),etc . En los ltimos aos han cobrado mucha vigencia los denominados berries, que conforman un grupo de frutos de color rojo, violceo, morado, con alto contenido de polifenoles en su interior. Entre ellos destacan los arndanos, el grosellero negro, las frambuesas, las uvas, la murta y en el caso que nos ocupa en este artculo: el maqui.

Correspondenciaa:Dr.JorgeR.Alonso.SociedadLatinoamericanadeFitomedicina.Correoelectrnico:fitomedic@gmail.com

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CONSIDERACIONESBOTNICASYTAXONMICAS Reino:Plantae Clasificacin:Angiospermas Orden:Oxalidales Familia:Elaeocarpaceae. Gnero:Aristotelia Especie:chilensis NombreCientfico:Aristoteliachilensis(Molina)Stuntz. Sinonimias:A.glandulosaRuizetPavn,A.glabraMiers,A. macquiLHer. Nombrespopulares:maqui,maquei,queldrn,queldn, clon,cocln,koelon(Argentina,Chile),maki(Mapuche), Chileanblackberry(ingls). DESCRIPCINBOTNICA Se trata de un arbusto dioico, perennifolio de tronco dividido,quealcanzahasta4a5metrosdealtura.Contiene tallos rojizos, con ramas delgadas y flexibles. La corteza es lisa, blanda, siendo fcilmente desprendible. Las hojas son pecioladas, aovadolanceoladas, perennes, midiendo entre 4 a 9 cm, con bordes dentados y dispuestas en cruz con respecto al resto de las hojas del tallo. Las flores son pequeas, blanquecinas, de cinco ptalos, con numerosos estambres, estriles en el caso de pies femeninos, y estn siempre reunidas en inflorescencias axilares. Pueden ser hermafroditas o unisexuales (uno de los sexos atrofiado). Sus frutos son bayas pequeas de 5 mm, de color negro brillante o azuladas, que contienen de 2 a 4 semillas. 2 3 Florecedenoviembreadiciembreyfructificaenverano .

compuesta de 10 gneros y alrededor de 400 especies, distribuidas en las regiones tropicales y templadas del mundo(salvoelcontinenteafricano). ElmaquiescomnhallarleenlosparquesnacionalesLann, Nahuel Huapi y Los Alerces (Argentina) as como en los bosques andinos chilenos entre los paralelos 31 y 42: entre Illapel y Chilo, tanto en el Valle Central como en 4 ambas cordilleras e Isla Juan Fernndez . Crece en terrenos alterados, en general con buena exposicin a la luz, siendo una especie importante en el control de la erosin. Se desarrolla como especie secundaria, preferentemente en suelos hmedos, quebradas, faldas de los cerros o mrgenes de bosques 3. Suele ser de las primeras especies que invaden terrenos quemados o abandonados. Los bosques de maqui son denominados macales, siendo de crecimiento muy rpido en 4. condicionesdehumedadapropiadas HISTORIA En poca de la conquista, Alonso de Ovalle (1946) relataba sus hojas sirven en extremo contra quemaduras y otros accidentes que nacen del calor. Murillo, en 1889, mencionaba el poder antiinflamatorio del jugo de las hojas en afecciones de garganta. Vicua Mackenna en 1887, reseaba:delbenficomaquiseapovechanlosaborgenes para las diarreas como un poderoso astringente, y as sanlatodavalascasasgrandesdeSantiago4.Apesarde su fama, el maqui no form parte de la famosa Botica de los Jesuitas. El maqui es considerado uno de los tres rboles sagrados de los Mapuches. Junto al canelo y la laura forman el Rehue, es decir, el rbol sagrado de las rogativas. Es tambin un smbolo de paz o intencin pacfica y benvola y es ampliamente usadoen la medicina natural indgena. La denominacin maki en idioma 5 Mapuchesignificafruto . AGROTECNOLOGADECULTIVO No hay datos de cultivo. Su propagacin es por medio de semillas. Fueron llevados a cabo estudios de propagacin generativa para A. chilensis, siendo la inmersin de la semilla en agua fra durante 4872 hs como el mejor 6 mtododepretratamiento . PARTEUTILIZADA Seempleanlosfrutosysujugo,principalmente. USOSETNOMEDICINALES En uso interno, se utilizan los frutos como tnico,
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FotografiadelMaquiChileno(Aristoteliachilensis). http://en.wikipedia.org/wiki/File:Maqui_chileno.jpg

HBITATDISTRIBUCINGEOGRFICA Las Eleocarpceas conforman una familia botnica


antidiarreico, desinflamante, cicatrizante, diafortico, digestivo, expectorante, diurtico y purgante. Tambin puede usarse la infusin (de las hojas principalmente) como grgaras o buches en inflamacin de la mucosa orofarngea. La etnia Huilliche de Chile ha empleado los frutos de maqui tradicionalmente en forma de compresas externas para el tratamiento de heridas infectadas. Tambin el polvo de las hojas secas quemadas, como cicatriante de heridas. Los frutos e incluso las partes subterrneas, son ingeridos como alimento. Sus bayas dulces y muy jugosas son ingeridas directamente, o usadas para preparar una especie de chicha llamada tecu. En Chilo emplean el fruto mezclado con zarzamora, para combatir el dolor de garganta. Tambin pueden ser empleadas para hacer jugos frescos con azcar y agua, o usadas secas y molidas. Actualmente la comunidad Mapuche de Neuqun recolecta sus frutos para hacer jaleascaseras.Conlassemillassepreparauntipodeharina 7 8 artesanal OTROSUSOS Se emplea su madera para labores artesanales, la cual es frgil y sonora, sirviendo por ello para fabricar instrumentos musicales. Su jugo puede ser utilizado en la tincin de lanas de color amarronado para tornarlas rojo violceas, dado su alta concentracin de taninos. La corteza, fcilmente desprendible en tiras, se usa como cordel para amarras. Las ramas son muy utilizadas para prender fuego. Con la fermentacin de los frutos suelen 4. elaborarvino COMPOSICINQUMICA Alcaloides indlicos: aristona, aristoletina, aristotelinona, aristotelona, aristotelina, aristotelinina, protopina, serratolina, hobartinol, 8oxo9dehidohobartina, makonina, 8oxo9dehidromakomakina, 9dehidro8oxo makomakina91011 Flavonoides: quercetina 5,3'dimetilter, friedelina, malvidina, petunidina y cido urslico (extracto diclorometano). Quercetina 3ODglucsido y kempferol fueronidentificadosenelextractometanlico31213 Otros: cidos cafeico y ferlico 13, 3HOindol (extracto etanlico), cumarinas 1415, antocianidinas (3glucsidos, 3,5diglucsidos, 3sambubisidos y 3sambubisido5 glucsidos de delfinidina y cianidina). El componente mayoritarioentrelasantocianidinasresultserdelfinidin3 sambubisido5glucsido con un 34% del total 1617. Tambin se ha reportado la presencia de los cidos gentsico, glico, sinpico, pcumrico, hidroxibenzoico, vanllico, maconina, 8oxo9dehidrohobartina y 8oxo9 dehidromacomaquina.

Figura1.

COMPOSICINNUTRICIONAL Cada 100 g de frutos contiene 150 caloras, 0,8 g de protenas, 0,8 g de fibra cruda, 1,2 g de cenizas, 87 mg de calcio, 44 mg de fsforo, 30,5 mg de hierro y 296 mg de potasio. Contiene tambin un considerable porcentaje de vitaminaCyoligoelementos,destacandolapresenciadeBr, 18. Zn,Cl,Co,Cr,Vn,Tn,yMo Lashojasmadurasdelmaqui solo se diferencian de las jvenes por su menor contenido de potasio y mayor de sodio. Cabe sealar que los contenidos de magnesio, cloro, calcio, titanio y vanadio no varan entre hojas de plantas de sitios con diferente pluviosidadanual. FARMACODINAMIAACTIVIDADESFARMACOLGICAS Actividad analgsica y antiinflamatoria: Tanto el extracto diclorometano como el metanlico de los frutos de A. chilensis han demostrado poseer efectos antiinflamatorios muyimportantes,evidenciadosporvatpicaenelmodelo de inflamacin en roedores por induccin con TPA (12 deoxiforbol13decanoato) en el orden del 63,9 y 66% respectivamente. Tambin a nivel tpico demostr efectos muy significativos el extracto acuoso de los frutos, en modelos de inflamacin inducidos por cido araquidnico,
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del orden del 56,2%. An ms potente result la actividad antiinflamatoria de los extractos hexnico y diclorometano (89,2% para ambos). La actividad analgsica a nivel tpico fue demostrada por los extractos acuoso, diclorometano, metanlicoyporelextractocrudopurificadoenalcaloides, en los modelos de analgesia por formalina y tailflick (produccin de dolor por factor trmico) en ratas 131920. Asimismo, estos extractos lograron reducir la produccin de xido ntrico (3,7 25,5%) y prostaglandina E2 (9,1 89,1%)ylaexpresindexidontricosintasainducible(9,8 61,8%) y ciclooxigenasa2 (16,6 62%) en macrfagos 21 RAW264.7estimuladosporlipopolisacridos . El mecanismo de accin propuesto para la actividad analgsica de los extractos hexnicos, se considera que estara modulado por receptores serotonrgicos (5HT3), adrenrgicos (a1), colinrgicomuscarnicos (AChM) y por la va Larginina/NO (xido ntrico). En cambio la actividad antinociceptiva del extracto diclorometano estara moduladaporlasvasopioide,serotonrgica,adrenrgicay nitridrgica.Enelefectoanalgsicodelextractometanlico estaran involucrados los sistemas opioide, adrenrgico, colinrgico muscarnico y Larginina/NO. Los alcaloides (aristona, aristotelona, aristotelina y aristotelininia) demostraron relajar la musculatura lisa intestinal, explicando sus acciones antiinflamatorias y antiespasmdicas22. Actividadantioxidante:Loscompuestospolifenlicosdelos frutos de maqui han demostrado poseer efectos antioxidantes in vitro 2324. El jugo demostr sobre clulas endoteliales humanas, evitar la peroxidacin lipdica inducida por cobre. Dicha actividad protectora endotelial sera atributo principalmente del contenido en polifenoles del jugo y su efecto antioxidante frente a situaciones de estrs oxidativo 25. De igual modo la combinacin de jugo de limn y jugo de maqui demostr importantes efectos antioxidantes, frente a los radicales DPPH, anin 26 superxido y oxhidrilo . Se determin que el jugo concentrado de maqui presenta mayores contenidos de fenoles (12,32 mm Fe/100 g) y mayores capacidades antioxidantes en comparacin con los jugos de mora, arndano, cranberry, frambuesa y frutilla (3,10 mm Fe/100 g). Tanto el extracto acuoso como el metanlico de los frutos de maqui demostraron in vitro efectos antioxidantes en los modelos de inhibicin de xantinaoxidasa y DPPH, en el 13 orden del 52.9 y 62.7% respectivamente . Asimismo, el extracto crudo de las hojas y de los frutos mostraron actividad antioxidante, actuando sus polifenoles en la inhibicin de la enzima alfaglucosidasa, lo cual es importante por el rol que cumple esta enzima en el metabolismo de los carbohidratos, siendo benfico este 27 efecto para los pacientes diabticos . El compuesto 3HO indol tambin demostr importantes efectos antioxidantes 15.

Usos cosmticos: El extracto de maqui fue ensayado como conservante microbiano y antioxidante cosmtico. En tal sentido, se estudi la estabilidad fsicoqumica, sensorial y microbiana en funcin del tiempo, en diferentes condiciones de almacenamiento. De los productos elaborados,enningunoseobservdesarrollobacterianoni fngico, y se mantuvieron las caractersticas fsicoqumicas y sensoriales. Por sus propiedades antioxidantes, se posiciona el maqui como un muy buen producto anti age 28 . Otrasactividadesdeinters:Lashojasytallosdemostraron experimentalmente actividad relajante en msculo liso y actividad antibacteriana frente Sarcinia lutea y Staphylococcus aureus. Extractos totales de maqui evidenciaron in vitro actividad inhibitoria en clulas KB de 293031 . Sobre estmago de rata, carcinoma nasofarngeo diferentes fracciones de extractos de maqui mostraron efectosgastroprotectores19. En un estudio reciente se evalu los efectos de un concentrado de A. chilensis sobre la expresin de ciclooxigenasa (COX)2, vas de sealizacin y viabilidad en clulas de cncer de colon. El tratamiento de clulas Caco 2 con A. chilensis por 24 horas redujo la expresin de la protena y mRNA de COX2, y disminuy la actividad luciferasa regulada por NFB o NFAT. El tratamiento de clulas Caco2 por 4 horas con A. chilensis redujo transitoriamente los niveles citoplasmticos de IB, aument la fosforilacin de ERK1/2 y Akt y la expresin de cfos. Asimismo no se afect la viabilidad celular, en las concentraciones que redujeron la expresin de COX2. Estos resultados sugieren un potencial efecto anticancergenoyantiinflamatoriodeA.chilensis32. Los taninos del fruto le confieren al maqui propiedades astringentes y antidiarreicas. Por su parte, los polifenoles 27 delashojasevidenciaronefectosantihemolticosinvitro . La combinacin de jugo de limn y jugo de maqui demostr in vitro reducir la actividad de las enzimas acetilcolinesterasa y butilcolinesterasa, siendo el jugo de 26 limn el componente ms activo . Un trabajo experimental evalu el potencial neuroprotector de un extracto elaborado a partir de polifenoles del maqui (MQ) en un modelo de enfermedad de Alzheimer inducido por oligmeros solubles de amiloide (A). A tal fin se utilizaron cultivos de neuronas de hipocampo de ratas, pudindoseobservarneuroproteccincuandolasneuronas eran incubadas con amiloide (0.5 M) ms extracto de maqui por 24 hs. En el mecanismo de accin se pudo observar una recuperacin en la frecuencia de oscilaciones transitorias de los canales de calcio, comparado al grupo controlquerecibisoloamiloide(A=723%;A+MQ = 86 2%; n = 5) lo cual se correlacion con cambios positivosobservadosenlaactividadsinpticaespontneay en la preservacin de las ramificaciones dendrticas, siendo la actividad antioxidante del maqui el principal propulsor 33 deestoscambios .
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En cuanto al extracto metanlico de los frutos maduros, el mismo demostr actividad cardioprotectora frente a modelos de isquemia aguda por reperfusin en un estudio realizado in vivo en ratas34. A nivel metablico, fue evaluado in vitro la capacidad de algunos extractos de maqui para reducir la adipognesis y la acumulacin de lpidos en adipocitos. Al respecto, los extractos fenlicos demostraroninhibirlaacumulacinlipdicaentre4y10,8% en adipocitos maduros y entre 5,9 y 37,9% a travs de diferenciacin. De ah se desprende su utilizacin en productosreductoresdepeso35. EFECTOSADVERSOSY/OTOXICOLGICOS Se ha reportado que los flavonoides presentes en el extracto acuoso de las hojas, en contacto con sangre humana, generan cambios morfolgicos, alterando la forma discoidal del eritrocito hacia una forma equinoctica, lo cual se debera a su interaccin con fosfolpidos de la 14. membrana CONTRAINDICACIONES Nohansidoreportadas. STATUSLEGAL La planta se encuentra dentro del listado de especies reconocidas de uso tradicional medicinal humano por el 36 Ministerio de Salud de Chile . En Argentina no se encuentra en el listado positivo de especies de trmite simplificadopararegistrodemedicamentofitoterpico. FORMASGALNICAS Ante la falta de datos de formas galnicas oficinales, se comentarn a continuacin algunas formas de preparacin deacuerdoconlamedicinatradicional. Infusiones: Los frutos utilizados contra la diarrea y disenterasepreparanenbasea10gdefrutosfrescosen1 litro de agua hervida. Se deja reposar (tapado) durante 5 minutos y se procede a beber 2 tazas por da durante 3 das. En afecciones de encas, aftas e inflamaciones de amgdalas, anginas y catarros: se colocan 10 g de partes frescas o 5 g departes secas de la planta (preferentemente flores) en un litro de agua a punto de hervor. Dejar enfriar, filtrarybeber3tazaspordadurante1semana. Paralcerasinternasdelsistemadigestivo,lceras,gastritis yenteritissepreparaunainfusincon15gdehojasfrescas o secas, a las que se agrega un litro de agua a punto de

hervir.Dejarreposar5minutosyfiltrar. Uso externo: Se trituran 20 g de hojas secas y se aplican directamente sobre las heridas al menos 2 veces al da. La pomada se elabora en base a 30 g de frutos frescos trituradosenmortero,alocualseagregan100gdecrema base y 50 g de cera de abeja. Se procede a mezclar todo y calentarabaoMaradurante30minutosafuegomnimo. Seutilizaenprocesosinfecciososdrmicosycutneos.

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