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MANUAL DE PRCTICAS DE BIOQUMICA

PARA INSTRUMENTACIN QUIRRGICA
Dr. MIGUEL A. MIYARES CALS.
Doctor en Medicina. Universidad de Oriente. Cuba.
Especialista de Segundo Grado en Bioqumica Clnica
Doctor en Ciencias Biolgicas
Profesor de Bioqumica de UNIBOYAC
FUNDACIN UNIVERSITARIA DE BOYAC
CENTRO DE INVESTIGACIONES PARA EL DESARRO-
LLO
TUNJA
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PRESENTACIN
La enseanza de la Bioqumica en las distintas reas de Ciencias de la
Salud requiere de una metodologa especfica con nfasis en los aspectos
propios de cada una, orientados a dar una formacin ms profunda, es el
caso de la Carrera de Instrumentacin Quirrgica para la cual el profesor
Miguel Miyares ha preparado el presente manual que permitir a nuestros
estudiantes contar con un instrumento prctico y didctico para coadyuvar
en el proceso enseanza-aprendizaje.
El manual, fruto del trabajo docente tanto terico como prctico presenta
en forma clara el desarrollo de los laboratorios y los ejercicios que debe
realizar cada estudiante para un mejor resultado acadmico.
El presente aporte se halla enmarcado dentro de las lneas de Investigacin
de la Facultad de Ciencias de la Salud y avalado por el Centro de Investi-
gacin para el Desarrollo CIPADE a la vez responde a la poltica
institucional de que nuestros docentes respalden su tarea con los resulta-
dos de la bsqueda permanente de nuevas metodologas y nuevos desarro-
llos cientficos.
ROSITA CUERVO PAYERAS
Asesora Centro de Investigaciones para el Desarrollo
CIPADE.
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PRCTICA # 1
INDUCCIN AL LABORATORIO
El desarrollo de la asignatura de Bioqumica sera extraordinariamente rido y de difcil
comprensin si no se acompaara de algunas actividades complementarias que permitan
ilustrar algunos de los complejos eventos moleculares que transcurren en el interior de las
clulas y tejidos, por lo que se hace necesario instrumentar algunas prcticas de laboratorio
que cumplan con esta funcin.
Desgraciadamente la realizacin de las prcticas de bioqumica son usualmente de larga
duracin, gran complejidad y requieren de importantes recursos materiales, por lo que resul-
ta difcil adecuar estas necesidades con la realidad que impone el tiempo curricular, la habi-
lidad y destreza de los estudiantes en estos momentos iniciales de su formacin y los recur-
sos de que dispone el centro de altos estudios. De aqu se desprende que seleccionar experi-
mentos que puedan ilustrar eficientemente los conocimientos de bioqumica a los estudian-
tes de Ciencias de La Salud resulta una tarea difcil, aunque imprescindible.
De cualquier forma e independientemente del grado de complejidad y actualizacin de los
procedimientos empleados en esta tarea, se hace necesario que el estudiante rote por el labo-
ratorio de bioqumica y que conozca toda una serie de normas y cuidados que requiere esta
dependencia.
En UNIBOYAC existe un laboratorio de Bioqumica, por donde pasan los estudiantes que
cursan estas asignaturas en las diferentes carreras de la universidad y que cuenta con un
reglamento que debe ser conocido antes de iniciar el trabajo en esta instalacin, por lo cual a
continuacin pasamos a transcribirlo textualmente:
REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO.
El laboratorio es un sitio exclusivo de trabajo, en l se aprende observando, ensayando,
compartiendo las dudas e inquietudes con los compaeros y el profesor; es un lugar que
requiere un comportamiento muy especial y cuidadoso, porque cualquier error, imprevisin,
mal manejo o descuido pueden ocasionar graves perjuicios personales a los compaeros o a
la Institucin.
Se presentan a continuacin las normas que los estudiantes debern seguir al asistir a esta
dependencia:
1.- El estudiante debe ser puntual en su prctica y disponer adecuadamente de su tiempo en
el laboratorio, para no trastornar las prcticas de los grupos siguientes. Es indispensable
leer, analizar y despejar dudas e inquietudes sobre la gua de trabajo correspondiente
antes de ingresar al laboratorio.
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2.- Siempre se debe usar la bata blanca de trabajo, de manga larga y mantenerla totalmente
abotonada durante toda la prctica; el estudiante que no porte debidamente la bata no ser
admitido en el laboratorio. La bata es de uso exclusivo de esta dependencia.
3.- Colocar en el sitio asignado, por el personal del laboratorio, los tiles, sacos y dems objetos
personales. Nunca colocarlos sobre las mesas de trabajo. No utilizar las mesas de trabajo
como asientos.
4.- Revisar el material asignado antes de iniciar la prctica, verificar si est completo y en buen
estado. Los estudiantes deben firmar la hoja de control y entregarla al Coordinador o al
Laboratorista. TODO EL SUBGRUPO O EQUIPO DE TRABAJO ES RESPONSA-
BLE DEL MATERIAL ASIGNADO Y TODO EL GRUPO ES RESPONSABLE DEL
MATERIAL DE USO GENERAL Y DE LA INSTALACIN. Despus de entregar fir-
mada la hoja de control no se acepta ninguna reclamacin.
5.- Localizar las duchas de emergencia, el extintor de incendios y el botiqun de primeros auxilios.
Conocer y hacer uso correcto de ellos.
6.- Se prohibe fumar, ingerir alimentos slidos o lquidos dentro del laboratorio y durante la
prctica.
7.- El laboratorio es un sitio de trabajo serio, donde las bromas y los juegos pueden ocasionar
graves accidentes. Se debe mantener cordura, disciplina y un tono de voz adecuado.
8.- Durante la prctica mantener ORDEN Y LIMPIEZA, en las mesas de trabajo, as como en el
sitio asignado para materiales y reactivos de uso general.
9.- Antes de usar un reactivo o solucin LEER LAS ETIQUETAS E INTERPRETAR LOS
SMBOLOS DE SEGURIDAD, evitar el contacto con la piel, los ojos o la ropa. Utilizar los
medios de proteccin existentes, entre ellos las caretas asignadas para evitar la inhalacin de
gases o vapores txicos.
10.- Utilizar adecuadamente pipetas, pipeteadores o esptulas asignadas para cada uno de los
reactivos o soluciones preparadas, evitar contaminaciones y por ende la prdida total de los
reactivos. NO SE DEBEN RETIRAR LOS REACTIVOS Y/O LAS SOLUCIONES
DEL SITIO ASIGNADO, taparlos despus de su uso.
11.- Manejar cuidadosamente los equipos siguiendo las indicaciones dadas por el Profesor, el
Laboratorista o el Coordinador del laboratorio. No descuidar los equipos que se encuentren
en funcionamiento. Los equipos elctricos encindalos nicamente cuando sea necesario.
12.- Rotular adecuadamente con Nombre, cdigo estudiantil, grupo, carrera y materia los monta-
jes y ensayos realizados que requieran de un seguimiento por varios das. Ubicarlos en el
sitio asignado dentro del laboratorio. No interferir ni alterar dichos ensayos.
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EN EL LABORATORIO EXISTE UN PROGRAMA PARA MANEJO Y DISPOSI-
CIN DE RESIDUOS SLIDOS Y LQUIDOS. PARA ELLO TENGA EN CUENTA
LAS SIGUIENTES NORMAS:
13.- No arrojar desechos slidos, papeles, fsforos, agujas, lancetas, etc. al lavabo, al piso o
a las mesas de trabajo, deschelos en forma adecuada y en los recipientes asignados para
tal fin:
* Canecas de basura.
* Recipiente para desecho de agujas y lancetas.
* Recipiente para desecho de material de vidrio.
* Recipiente para desecho de materia orgnica como filtrados, vsceras, sangre, etc. y los
que se necesiten en cada una de las prcticas.
Los reactivos qumicos se deben desechar en los COLECTORES dispuestos para tal fin; al
terminar la prctica el estudiante debe diluir en agua los reactivos utilizados y verterlos en los
colectores segn la naturaleza qumica de estos. Al iniciar la prctica el Profesor o Laboratorista
advertirn en cuales de los colectores que se mencionan a continuacin deben ser dispensa-
dos los residuos lquidos resultantes:
* COLECTOR A: Disolventes orgnicos y soluciones de sustancias orgnicas exentas de
halgenos.
* COLECTOR B: Disolventes orgnicos y soluciones de sustancias orgnicas que con-
tengan halgenos.
* COLECTOR C: Soluciones salinas.
De esta forma se evitar el deterioro de tuberas de desage, la contaminacin del sitio de
trabajo y de los cuerpos de agua receptores,
14.- Al finalizar la prctica y despus de disponer correctamente de los residuos, lavar el
material con precaucin, limpiar el sitio de trabajo y ubicar las butacas debajo de las
mesas de trabajo; organizar el material y entregarlo a la persona encargada, para reci-
bir el visto bueno de entrega. LOS ESTUDIANTES NO SE DEBEN RETIRAR
DEL LABORATORIO SIN HABER REALIZADO CORRECTAMENTE LA
ENTREGA.
15.- En caso de prdida, ruptura de materiales o contaminacin de algn reactivo, los estu-
diantes responsables debern retornarlo al laboratorio antes de la prctica siguiente, de
lo contrario no podrn ingresar al laboratorio y su paz y salvo ser retenido. El material
repuesto debe tener las mismas condiciones o especificaciones del perdido y debe pre-
sentarse la factura correspondiente.
16.- Verificar las llaves de gas, grifos de agua e instalaciones elctricas utilizadas. Disponer
de ellas nicamente cuando sea necesario.
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PARA CUALQUIER ORIENTACION Y/O DUDA EN SU TRABAJO PRCTICO,
DIRJASE A SU PROFESOR, LABORATORISTA O MONITOR, AS EVITAR EL
INCUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS DISPUESTAS EN ESTE REGLAMENTO.
DE SU RESPONSABILIDAD FRENTE AL LABORATORIO DEPENDE EL XITO
O EL FRACASO DE LAS PRCTICAS.
La incidencia en las faltas de disciplina y negligencia dar lugar a sanciones que se notifica-
rn a las respectivas Direcciones de Carrera.
Las normas generales anteriormente expuestas son aplicables a cualquier asignatura que tra-
baje en el laboratorio de Qumica y Bioqumica de UNIBOYAC. En particular la asignatu-
ra de Bioqumica y Laboratorio de la Carrera de Instrumentacin Quirrgica tiene caracters-
ticas propias que deben ser normadas adicionalmente:
NORMAS ADICIONALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE
BIOQUMICA PARA LOS ESTUDIANTES DE LA CARRERA DE INSTRUMEN-
TACIN QUIRRGICA.
1.- Los estudiantes podrn asistir a la prctica slo en el da y hora asignados en la programa-
cin del semestre. Si un alumno se ausentara a una prctica, an por motivos muy justifi-
cados, NO PODR RECUPERARLA EN NINGN OTRO HORARIO. Si la ausen-
cia fuera injustificada su evaluacin ser de 0, en caso contrario se desestimar en el
momento de sacar el promedio de calificacin de las actividades de evaluacin peridica.
2.- La entrada al laboratorio ser a la hora exacta, NO SE PERMITIR LA ENTRADA
AL MISMO DESPUS DE CERRADA LA PUERTA DE ACCESO, y se considerar
consecuentemente como una ausencia injustificada.
3.- Para poder realizar la prctica el estudiante debe llevar su MANUAL DE PRCTICAS
DE BIOQUMICA, caso contrario no se le permitir su ingreso al laboratorio y se con-
siderar como ausencia injustificada.
4.- El estudiante no podr abandonar injustificadamente el laboratorio durante el transcurso
de la prctica, so pena de que se le considere ausencia injustificada. Si por cualquier
motivo de causa mayor tuviera que abandonar el local, se le considerar como ausencia
justificada. Una vez que se abandone el local, por cualquier causa, el estudiante no se
podr reintegrar al mismo.
5.- Para el desarrollo del trabajo prctico los estudiantes se agruparn en equipos de trabajo
integrados por un mximo de 5 estudiantes. Los equipos de trabajo se conformarn en la
primera prctica mediante la asociacin voluntaria de sus integrantes. Una vez conforma-
dos los equipos no se aceptarn modificaciones
6.- Durante el desarrollo del trabajo prctico el estudiante debe ir haciendo los apuntes que se
le orientan en el cuaderno de trabajo e ir respondiendo las preguntas que se le postulan en
el mismo.
7.- En la siguiente actividad acadmica, posterior al laboratorio, el profesor seleccionar uno
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de los Manuales de Prcticas por cada equipo para realizar su revisin y calificacin. Esta
calificacin ser extensible al resto de los integrantes del equipo. El profesor devolver el
Cuaderno ya calificado el prximo da hbil despus de entregados los Cuadernos. Caso
contrario deber asignarle la mxima calificacin a todos los estudiantes que realizaron
el trabajo prctico. Los estudiantes recogern su cuaderno en el propio laboratorio o en el
saln de clases.
8.- Los estudiantes, tambin por equipos de trabajo, entregarn en el modelo correspondien-
te el informe de la prctica. La fecha de entrega ser siempre en la primera actividad
docente de la semana siguiente a la realizacin de la prctica. Caso de no entregarse en
fecha este informe la calificacin ser de 0. El profesor debe entregar el resultado de la
calificacin del informe de prctica en la prxima actividad evaluada que tenga el estu-
diante. Caso contrario deber asignarle a los estudiantes la mxima calificacin de este
aspecto.
9.- En Bioqumica se trabaja con sustancias txicas, custicas y con material biolgico de
alto riesgo, como son tejidos animales, sangre animal y humana y saliva humana. LA
MANIPULACIN DE TODO ESTE MATERIAL DEBE REALIZARSE TOMANDO
TODAS LAS MEDIDAS DE PRECAUCIN NECESARIAS.
10.- La mayor parte de los llamados accidentes de laboratorio son el resultado del incumpli-
miento de alguna de las normas de trabajo o a negligencias, por lo que cualquier accidente que
se produzca en el laboratorio ser analizado y si resultara de este anlisis que fuera responsa-
bilidad directa de algn estudiante o grupo de estudiantes, los mismos sern sancionados con
la obtencin de 0 en la prctica correspondiente o la desaprobacin de la asignatura, de acuer-
do con la magnitud de los daos ocasionados. Esta medida se aplicar independientemente de
las sanciones legales y/o resarcimiento econmico que deriven de los hechos producidos.
11.- Cualquier repercusin en la salud de un estudiante o grupo de estudiantes, como conse-
cuencia de faltar al presente reglamento, especialmente en cuanto a la manipulacin de
sustancias txicas, custicas y contaminantes, es responsabilidad exclusiva del estudian-
te o grupo de estudiantes y exime a la Institucin de cualquier perjuicio que de ello
derive.
12.- Al finalizar la ltima prctica del semestre los estudiantes entregarn el Manual de Prc-
ticas para su calificacin. El profesor los calificar en el transcurso de la semana siguien-
te y entregar el resultado a los estudiantes en el propio laboratorio o lugar que previa-
mente se acuerde.
13.- La calificacin integral del Manual de Prcticas tendr un valor de 0,5 puntos de la nota final
de la asignatura, y ser informada a los estudiantes mediante la publicacin de una lista dos
das antes de la celebracin del acto del examen final.
14.- Las calificaciones de cada uno de los trabajos prcticos de laboratorio sern promediadas
y tendrn un valor total de 2,0 puntos para cada uno de los informes de las evaluaciones
peridicas. Los otros 3,0 puntos sern determinados por el promedio de las calificacio-
nes de los "quizes".
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A continuacin se desglosa la forma en que ser evaluado cada uno de los trabajos prcticos:
CALIFICACIN DEL TRABAJO PRCTICO.
Todos los trabajos prcticos sern calificados sobre la base de una escala que va de 0,0 a 5,0
y de acuerdo con la siguiente distribucin:
1.- Exposicin y anlisis de los resultados obtenidos en la
realizacin de los experimentos durante la prctica. 3,0 puntos
3.- Informe de la prctica. 2,0 puntos.
_________
TOTAL 5,0 puntos
OBJETIVOS DE LA PRCTICA.
1.- Organizacin del trabajo del laboratorio.
2.- Creacin de los equipos de trabajo.
DESARROLLO DE LA PRCTICA.
1.- Recepcin de los estudiantes por parte del personal del laboratorio. Presentacin de los mis-
mos.
2.- Formacin de los equipos de trabajo. Los estudiantes se agruparn en equipos de hasta 6
alumnos que conformarn el grupo de trabajo durante todo el semestre. Esta asociacin ser
voluntaria. Caso de no llegar a acuerdo el Profesor designar los equipos. Cada equipo ser
numerado y responder por el material que se le asigne en cada prctica, as como por el
material general de trabajo de forma rotativa.
3.- Asignacin del puesto de trabajo. Cada equipo de trabajo ser ubicado en un lugar que ser su
puesto fijo de trabajo durante todo el semestre.
4.- Anlisis del reglamento general del laboratorio. El Profesor o el Laboratorista impondrn a los
estudiantes de las clusulas del reglamento general y harn las aclaraciones pertinentes al
respecto tanto de oficio como a instancia de los estudiantes.
5.- Anlisis de las normas adicionales para Bioqumica. El Profesor impondr a los estudiantes de
las normas adicionales que deben ser cumplidas durante las prcticas de Bioqumica y har las
aclaraciones pertinentes al caso.
6.- Despedida de la prctica. Los estudiantes debern organizar su puesto de trabajo y abandonar
el local.
NOTA: ESTA PRIMERA PRCTICA NO TIENE CALIFICACIN. ES SLO IN-
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FORMATIVA.
INFORME DE LA PRCTICA
INSCRIPCIN
Nombre del Estudiante____________________________________. Cdigo:_____________
Semestre Acadmico _____________________________________. Grupo______________
Da de la semana en que se efecta la prctica: _____________
Hora en que se efecta la prctica: _____________
Nmero del Equipo de Trabajo asignado: _____________
Nombre del resto de los integrantes del equipo de trabajo.
1.- _______________________________________________________________________
2.- _______________________________________________________________________
3.- _______________________________________________________________________
4.- _______________________________________________________________________
Hago constar que me han sido ledos los reglamentos generales de trabajo en el laboratorio y
las normas particulares para Bioqumica, por lo que estoy impuesto de todas sus clusulas y
me someto a ellas:
______________________________________.
Firma del Estudiante.
NOTA: ESTE PRIMER INFORME CONSTITUYE UNA CONSTAN-
CIA Y NO SE DEVUELVE.
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PRCTICA # 2
PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS
AMINOCIDOS
INTRODUCCIN.
Los aminocidos son importantes compuestos qumicos que cumplen un nmero variado de
funciones dentro de la clula. Entre ellas tenemos:
1.- Constituyen las unidades monomricas de las protenas.
2.- Representan la nica fuente de nitrgeno metablicamente utilizable.
3.- Aportan entre un 10 y un 20 por ciento de la energa que utiliza diariamente la clula.
Desde el punto de vista qumico pueden definirse como aquellos compuestos qumicos org-
nicos que poseen al menos un grupo amino y otro carboxilo. Sin embargo esta definicin tan
amplia debe restringirse, pues en la clula eucarionte no existen sino los denominados
aminocidos protenicos, que seran aquellos que tuvieran enlazados sus grupos amino y
carboxilo a un mismo tomo de carbono (alfa) y que adems pertenecen a la serie estrica L,
toda vez que su sntesis es estereoespecfica.
Insertar AA
De lo anteriormente expuesto se desprende que en estos compuestos existe
una parte constante representada por el carbono alfa, el grupo amino y el
grupo carboxilo; por consiguiente todos los aminocidos tendrn propie-
dades fsico-qumicas comunes que derivan de esta caracterstica estruc-
tural. Sin embargo en ellos existe tambin una cadena lateral o grupo R,
de estructura variable, que identifica a cada aminocido particular, pero
que adems se emplea para efectuar su clasificacin, toda vez que entre estas cadenas latera-
les de los aminocidos se pueden encontrar rasgos comunes. Por supuesto que este grupo R
le estar confiriendo a cada aminocido caractersticas fsico-qumicas diferenciales.
Entre los diversos criterios que se pueden utilizar para establecer una clasificacin de los
aminocidos hemos seleccionado, para la presente prctica, el que considera la polaridad de
la cadena lateral de los aminocidos, pues es el que ms aplicacin tendr de acuerdo con los
objetivos que nos proponemos en el presente trabajo. As tenemos que los aminocidos,
siguiendo este criterio, pueden subdividirse en:
1.- Aminocidos no polares.
2.- Aminocidos polares.
a.- Sin carga elctrica apreciable
b.- Con carga elctrica apreciable: cidos.
bsicos
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La presencia de los elementos estructurales invariantes en los aminocidos le confieren a
estos compuestos caractersticas fsicas y qumicas comunes, tales como: ser sustancias pola-
res y por consiguiente presentar un elevado punto de fusin y de ebullicin y ser solubles en
solventes tambin polares. En cuanto a sus caractersticas qumicas manifestarn las reaccio-
nes propias de los grupos qumicos que poseen - de hecho los aminocidos experimentan
todas las reacciones posibles de los grupos amino y carboxilo- por lo que estas reacciones no
pueden ser utilizadas para caracterizar a los aminocidos.
Sin embargo en la presente prctica se aprovechar la reaccin de los aminocidos con la
ninhidrina, en la que participan tanto el grupo carboxilo como el amino, para la identifica-
cin de la presencia de estos compuestos y su utilizacin en el revelado de la cromatografa.
Desde el punto de vista qumico la ninhidrina no es ms que el hidrato de tricetohidrindeno:
Esta ninhidrina, como ya se ha mencionado, en presencia de com-
puestos que posean al menos un grupo amino y otro carboxilo reac-
ciona formando un derivado coloreado, generalmente de azul, y con
desprendimiento estequiomtrico de dixido de carbono, lo que per-
mite que esta reaccin sea a la vez un mtodo general para la estima-
cin cuantitativa y cualitativa de los aminocidos.
La presencia de color permitira la deteccin cualitativa de los aminocidos; y aunque tam-
bin se utiliza ampliamente en la estimacin cuantitativa, su utilidad queda limitada por la
dificultad que implica el hecho de que no todos los aminocidos expresan igual tonalidad de
color con este reactivo, incluso la prolina y la hidroxiprolina desarrollan una coloracin
amarilla en vez de azul. Por lo tanto la medicin de la intensidad de luz absorbida por el
desarrollo del color no resulta una magnitud exacta y este mtodo debe ser preferentemente
utilizado con fines cualitativos.
Si se deseara emplear esta tcnica con fines cuantitativos lo mejor sera la medicin
manomtrica del dixido de carbono liberado. Sin embargo las mediciones manomtricas
hacen que la manipulacin sea de mucho mayor complejidad tcnica y por ello en el trabajo
clnico diario, en el que no se requiere de extraordinaria exactitud, se prefiere utilizar el
mtodo colorimtrico. Si se tratara de un trabajo de investigacin bsica o fundamental s
resulta imprescindible el uso de la tcnica manomtrica.
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CARACTERSTICAS PARTICULARES DE LOS AMINOCIDOS.
La presencia de la cadena lateral (R) variable en los aminocidos le estar confiriendo a cada
uno de ellos caractersticas muy particulares que permitirn realizar su diferenciacin en el
laboratorio por medio de diferentes procedimientos tanto qumicos como fsicos.
De hecho, la variabilidad existente en estos grupos posibilitar que el aminocido particular
reaccione de modo diverso ante la presencia de reactivos que sean especficos para determi-
nados grupos; por ejemplo si el aminocido presentara un grupo fenilo en su cadena R reac-
cionara con el cido ntrico.
Desde el punto de vista de su solubilidad, aunque en sentido general todos los aminocidos
son solubles en agua debido a la presencia de su estructura invariante, su solubilidad variar
de acuerdo con la polaridad que presente su cadena lateral de manera que los aminocidos
clasificados como polares inicos sern mucho ms solubles en agua que aquellos que po-
sean grupos hidrofbicos en su cadena R. Esta propiedad permiti aplicarle a los aminocidos
una tcnica de separacin basada en la diferente solubilidad que presentan las sustancias ante
una mezcla de solventes de diferente polaridad. A este mtodo analtico se le denomin
CROMATOGRAFA, por haber sido descrito por primera vez al separar colorantes vegeta-
les.
CROMATOGRAFA
En 1906 el botnico ruso Tswett hizo un descubrimiento que en su momento result
intranscendente; pero que con el decursar de los aos dio origen a uno de los mtodos ms
utilizados y eficientes de la qumica analtica actual. Tswett empleando una bureta llena de
carbonato de calcio logr la separacin de la clorofila y la xantofila aplicando una solucin
de las mismas en el extremo superior de la bureta y dejando fluir continuamente un solvente
apropiado. Para su gran regocijo, comenzaron a aparecer en la columna de carbonato de
calcio una serie de bandas verdes, azules y amarillas que correspondan a los distintos
pigmentos de la mezcla, con lo cual comprendi que haba logrado separarlos entre s. Tswett
public su hallazgo en una revista cientfica; pero su descubrimiento pas prcticamente
inadvertido y se le consider como una curiosidad de laboratorio.
Varios aos despus comenz a surgir la idea de que el cromatograma de Tswett poda utili-
zarse, hacindole las adaptaciones y modificaciones oportunas, como un procedimiento sen-
cillo y rpido para la separacin de sustancias complejas, cosa que por mtodos qumicos
resultaba muy lento y engorroso. Con el trabajo de numerosos investigadores, el procedi-
miento cromatogrfico se ha desarrollado enormemente y hoy da es uno de los mtodos
analticos ms empleados.
En los aos de trabajo y de desarrollo de esta tcnica, la misma se ha ido modificando y
ganando en complejidad; pero al mismo tiempo en exactitud y precisin, por lo que ya es
posible su utilizacin con fines cuantitativos. Sin embargo para nuestros efectos prcticos de
formacin del instrumentador quirrgico no consideramos oportuno pasar a describir las
mltiples variantes que han surgido a partir de la idea original y nos limitaremos solamente a
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describir una de ellas, la cromatografa de particin en soporte de papel.
CROMATOGRAFA DE PARTICIN EN SOPORTE DE PAPEL
Este mtodo se basa en la propiedad que tienen ciertos compuestos de ser solubles, aunque
en magnitud diferente, en dos o ms solventes que son inmiscibles entre s y que se hallan en
contacto. Cuando se permite que pase un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio, el
compuesto se encuentra distribuido entre las dos fases lquidas de un modo caracterstico. La
expresin numrica de esta propiedad es el llamado coeficiente de particin (o de distri-
bucin) K, que se define como la relacin que existe entre la concentracin [A] del com-
puesto en el solvente A y su concentracin [B] en el solvente B, lo cual se expresara de la
siguiente forma:
[A]
K=
[B]
Como puede deducirse , K resulta caracterstica para un determinado compuesto qumico, un
sistema de solvente y todo otro conjunto de condiciones, dentro de las cuales se incluyen las
ambientales, ya que su valor quedar influenciado por cualquier factor que afecte la solubilidad
en cada uno de los solventes utilizados. Algunos de los factores ms importantes seran: la
temperatura, la presin atmosfrica y la presencia de otros solutos; podramos seguir enun-
ciando otros factores, pero entonces la lista se hara muy extensa y se excederan los objeti-
vos trazados.
En este mtodo uno de los dos solventes permanece estacionario y se le denomina fase fija,
en tanto que el otro se desplaza continuamente, por lo que se le denomina la fase mvil. Uno
de los sistemas de solventes ms sencillos que puede aplicarse es el de fenol saturado en
agua. En este caso concreto se utilizara un soporte de papel de filtro donde se aplicara la
mezcla de sustancias a separar y comoquiera que el papel tiene una pelcula invisible de agua
que lo recubre en toda su superficie, esta agua estara constituyendo la fase estacionaria, en
tanto que el fenol aplicado a uno de los extremos del papel comenzara a desplazarse, por
capilaridad, a lo largo del mismo y se constituye as en una fase mvil. Por supuesto que las
sustancias ms solubles en agua se irn quedando ms cerca del punto de aplicacin, en tanto
que las que sean ms solubles en el fenol, que es un compuesto relativamente apolar, irn
avanzando junto con este solvente y por lo tanto se irn separando.
Comoquiera que el tiempo que transcurre para la realizacin de este tipo de cromatografa en
la que la fase mvil se desplaza en contra de la fuerza de gravedad, demora mucho tiempo, en
nuestra prctica preferimos hacer la llamada cromatografa circular, en la que un papel de
filtro se coloca horizontalmente y as se evita el efecto anteriormente mencionado. Luego se
coloca el papel de filtro sobre una placa de Petri que contenga el solvente, se le adiciona un
sistema capilar que posibilite que el solvente alcance el papel de filtro, se tapa y se deja que
la fase mvil alcance el borde del papel.
Este procedimiento tiene la ventaja de ser muy simple (no necesita de equipos especiales) y
rpido, por lo que resulta ideal para que el personal inexperto obtenga resultados que sean
demostrativos.
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Otra de las ventajas de la cromatografa en papel es que si se mantienen la condiciones
estables, es decir que se emplee el mismo
tipo de papel, los mismos solventes y las
mismas condiciones ambientales, la movi-
lidad de una mancha correspondiente a una
sustancia pura es constante y por lo tanto es
posible identificar esa mancha por compa-
racin directa con una mancha patrn. Es
ms, an en ausencia de patrones es posi-
ble la identificacin a partir de los llamados
valores Rf, que es la relacin que existe entre
la distancia recorrida por la mancha y la re-
corrida por el solvente.
Distancia de la mancha
Rf =
Distancia del solvente
En el esquema mostrado anteriormente se ha representado un cromatograma donde se mues-
tra en tres de sus cuadrantes la corrida de una aminocido puro y en el otro cuadrante se
aprecia la separacin obtenida al aplicar una mezcla de los aminocidos anteriores.
REACCIONES QUMICAS DE LOS AMINOCIDOS
Entre las mltiples reacciones qumicas que pueden experimentar los aminocidos hemos
escogido tres representativas, que permiten efectuar la diferenciacin y/o identificacin de
algunos de ellos.
REACCIN DE ADAMKIEWICS.
La reaccin de Adamkiewics es especfica para los grupos indoles.
Se basa en la propiedad que tiene este grupo qumico de reaccionar con
gran nmero de aldehdos, entre ellos el formaldehdo, a travs de una
reaccin de condensacin mediada por la presencia de un agente deshidratante como el cido
sulfrico y generando as un derivado coloreado caracterstico. Esta reaccin es propia del
triptfano.
Insertar Adam
Debe sealarse que las protenas que contengan a este aminocido tambin daran positiva la
reaccin, pues el cido sulfrico presente provocara la desnaturalizacin de la protena con
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la subsiguiente exposicin al medio de los grupos indlicos existentes en las cadenas latera-
les de los aminocidos, entre ellos las del triptfano.
Adems la accin del sulfrico es tan enrgica que provocara la hidrlisis proteica y la
liberacin del susodicho aminocido
REACCIN XANTOPROTEICA:
La reaccin xantoproteica es especfica para los grupos fenilos sustituidos.
Insertar fenilo
En ella ocurrir la nitracin del grupo fenilo que posea una molcula orientadora
para posiciones orto del anillo cuando se ponga en contacto con el cido ntri-
co. La nitracin de este anillo determinar que el compuesto resultante tenga
un color amarillo; si en este estado se procede a modificar el pH del medio
tornndolo bsico mediante la adicin de un hidrxido de alguno de los meta-
les alcalinos se obtendra la sal correspondiente que tomara color naranja.
Insertar Xanto
De acuerdo con lo postulado anteriormente todos los aminocidos que presenten en su es-
tructura grupos fenilo sustitudos, como la tirosina y el triptfano daran positivo con la
reaccin xantoproteica.
En esta reaccin el cido ntrico producir la desnaturalizacin e hidrlisis parcial de las
protenas y por lo tanto las protenas que contengan a los aminocidos mencionados anterior-
mente tambin daran positivo con esta reaccin.
REACCIN DE LOS TIOGRUPOS:
La presencia de grupos -SH (sulfihidrilo o tiol) en un compuesto orgnico permite que
transcurra una reaccin en presencia del acetato de plomo en medio alcalino en la cual se
obtendr un precipitado negro de sulfuro de plomo de acuerdo con la siguiente secuencia
Insertar tio
Entre los tres aminocidos azufrados que existen: cistena, cistina y metionina, slo los dos
primeros darn positiva la reaccin de los tiogrupos, mientras que la metionina dara nega-
tivo al tener bloqueado su grupo tiol por la presencia del metilo.
OBJETIVOS
En la presente prctica nos proponemos los siguientes objetivos:
1.- Demostrar la utilidad de la reaccin de la ninhidrina para la identificacin de los
aminocidos.
19
2.- Realizar la separacin de los aminocidos contenidos en una mezcla por medio de la
cromatografa circular en papel.
3.- Comprobar la efectividad de la reaccin de Adamkiewics para la identificacin de los
grupos indoles e identificar el aminocido que contiene este grupo funcional.
4.- Ratificar la utilidad de la reaccin xantoproteica en la deteccin de grupos fenoles
sustituidos e identificar los aminocidos que contienen este grupo funcional.
5.- Demostrar que la reaccin de los tiogrupos identifica a los grupos sulfihidrilos y com-
probar su utilidad en la deteccin de aminocidos que posean este grupo funcional.
DESARROLLO
EXPERIMENTO # 1. REACCIN DE LA NINHIDRINA:
Prepare 4 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente:
Agite todos los tubos de ensayo y colquelos en un bao de agua en ebullicin durante 5
minutos.
Dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:
Insertar tubos4
Qu conclusiones puede Ud. sacar de estos resultados?
1 2 3 4
Tubo #
Reactivo
Albmina de huevo 0,5 ml - - -
Solucin de aminocidos - 0,5 ml - -
Sacarosa - - 0,5 ml -
Agua destilada - - - 0,5 ml
Ninhidrina 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
20
EXPERIMENTO # 2. CROMATOGRAFA CIRCULAR EN PAPEL.
Para la realizacin de esta experiencia Ud. debe utilizar guantes quirrgicos o de labo-
ratorio de ltex, ya que en sus manos se encuentran presentes diversos aminocidos
que contaminaran todo el material; adems el sistema de solventes utilizado contiene
una elevada concentracin de fenol que es altamente custico.
Despus de colocados los guantes y utilizando un l-
piz y regla, divida el papel de filtro que tiene en su
puesto de trabajo en 4 cuadrantes simtricos, tal como
se le muestra en la figura siguiente y proceda a apli-
car lo ms prximo al orificio central y en forma de
bandas finas las soluciones de aminocidos de acuer-
do a la distribucin que se le orienta en la propia figu-
ra.
Cuando termine de realizar la aplicacin proceda a
colocar el capilar que se encuentra en su puesto de
trabajo en contacto con el centro del papel de filtro y
ubique dicho papel sobre la placa de Petri que contie-
ne el sistema de solventes. Inmediatamente tape la placa de Petri y deje correr el solvente
hasta alcanzar el borde del papel.
Al terminar la corrida cromatogrfica extraiga el papel de filtro de la placa de Petri y djelo
secar mediante su exposicin al calor en contacto directo con una resistencia elctrica. Debe
tener cuidado de no quemar el papel de filtro. Finalizado este procedimiento de secado, dele
a su profesor el papel de filtro para que ste proceda a sumergirlo en un vidrio reloj en el que
previamente se coloca suficiente cantidad del reactivo de la ninhidrina. Se saca de inmediato
el papel de filtro del vidrio reloj y se coloca en el horno a 120C durante 5 minutos o hasta
que aparezcan en el mismo las manchas azul-violceas caractersticas de los aminocidos
con la reaccin de la ninhidrina.
Represente en el dibujo siguiente el resultado obte-
nido y calcule el valor de Rf de cada uno de los
aminocidos conocidos as como el de o los que se
encuentran en la mezcla de aminocidos.
Insertar cromato2
Una vez calculados estos valores de Rf, proceda a
identificar las diferentes manchas que se obtuvieron
de la corrida cromatogrfica de la mezcla de
aminocidos, considerando como # 1 la que se en-
cuentra ms cerca del orificio central del papel:
1.-
2.-
3.-

21
Explique la razn por la cual se produce esta separacin de los aminocidos:
EXPERIMENTO # 3. REACCIN DE ADAMKIEWICS.
Prepare 4 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente:
Debe tomar en cuenta dos medidas imprescindibles para que la tcnica funcione correcta-
mente:
1.- Despus de aadir el formaldehdo Ud. debe agitar los tubos de ensayo.
2.- Aadir el cido sulfrico muy lentamente y por las paredes del recipiente y no agitar el
tubo de ensayo.
Recuerde que la reaccin de deshidratacin mediada por el cido sulfrico es altamen-
te exotrmica y si lo adiciona muy rpido la solucin puede ebullir e incluso saltar y
producirle quemaduras.
La positividad se expresar mediante la formacin de un anillo de color violeta que se apre-
ciar en la interfase del sulfrico y el resto de la solucin.
A continuacin dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:
Insertar tubos4
Explique brevemente estos resultados:
1 2 3 4
Tubo #
Reactivo
Gelatina 0,5 ml - - -
Albmina de huevo - 0,5 ml - -
Triptfano - - 0,5 ml -
Agua destilada - - - 0,5 ml
Formaldehdo 3 gotas 3 gotas 3 gotas 3 gotas
cido sulfrico 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
22
Precise por qu existen diferencias entre el resultado obtenido con la albmina de huevo y
con la gelatina.
EXPERIMENTO # 4. REACCIN XANTOPROTEICA.
Prepare 5 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente:
Llevar los tubos al bao de agua hirviente y mantenerlos ah durante un minuto, Qu obser-
va?
Enfre los tubos de ensayo y adale a todos ellos 5 ml de solucin de hidrxido de sodio al
20 %. Qu observa?
Dibuje en el espacio siguiente los resultados obtenidos:
Insertar tubos5
1 2 3 4 5
Tubo #
Reactivo
Albmina de huevo 2 ml - - - -
Fenol - 2 ml - - -
Triptfano - - 2 ml - -
Fenilalanina - - - 2 ml -
Agua destilada - - - - 2 ml
cido ntrico. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
23
Explique brevemente los resultados obtenidos y diga a qu conclusin se puede llegar.
Compare los resultados obtenidos con el triptfano y la fenilalanina. Explique la diferencia
observada.
EXPERIMENTO # 5. REACCIN DE LOS TIOGRUPOS.
Prepare tres tubos de ensayo de la forma siguiente:
Llevar al bao de agua hirviente y mantenerlo ah por espacio de 10 minutos. Transcurrido
este tiempo proceda a comparar el resultado del experimento.
Dibuje los resultados obtenidos:
Insertar tubos3
Explique por qu la albmina manifiesta este resultado.
1 2 3
Tubo #
Reactivo
Albmina de huevo 1 ml - -
Cistena - 1 ml -
Agua destilada - - 1 ml
Hidrxido de potasio al 40 % 1 ml 1 ml 1 ml
Acetato de plomo al 10 % 3 gotas 3 gotas 3 gotas
24
25
INFORME DE LA PRCTICA
PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS
AMINOCIDOS
EQUIPO #____________DA_________________HORA_____________.
INTEGRANTES:
1.-___________________________________________________________________
2.-___________________________________________________________________
3.-___________________________________________________________________
4.-___________________________________________________________________
5.-___________________________________________________________________
1.- Por qu se utiliza agua destilada en todos los experimentos qumicos de esta prctica?
2.- Por qu la albmina de huevo tiene diferente resultado cuando se realiza la reaccin de
la ninhidrina con relacin al resto de los resultados?
3.- De acuerdo con sus resultados diga qu aminocidos se encuentran formando parte de la
albmina de huevo.
4.- Sobre la base de la estructura qumica de los aminocidos utilizados, explique por qu se
produce diferente migracin en la cromatografa
26
27
PRCTICA # 3
PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LAS PROTE-
NAS
INTRODUCCIN
Las protenas son macromolculas compuestas por unidades de L--aminocidos que se
unen entre s mediante enlaces peptdico y que alcanzan un peso molecular igual o superior
a 5 000 D.
El enlace peptdico, caracterstico de estos compuestos, resulta de la reaccin del grupo
carboxilo de un aminocido con el grupo amino de otro aminocido, lo cual da lugar a un
enlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas caractersticas peculiares como son:
1.- El enlace C-N tiene cierto carcter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la
molcula
2.- El oxgeno y el nitrgeno quedan en posicin trans.
3.- Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.
4.- La rotacin de la molcula formada queda restringida a los carbonos .
El gran nmero de aminocidos que componen a la molcula proteica determina que su
estructura sea extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos preci-
sados a dividirla artificialmente en los llamados niveles de organizacin de la estructura
proteica, de los cuales se describen habitualmente 4, aunque algunos autores llegan a des-
cribir 5 y ms.
Por supuesto que toda organizacin estructural que implique determinado orden requiere de
la presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las protenas estara constituida
por diferentes tipos de enlaces o interacciones fsicas y qumicas que se enuncian en el cua-
dro siguiente:
Nivel de organizacin Enlaces que lo mantienen.
Primario Enlace peptdico
Secundario Puentes de hidrgeno entre los elementos del enlace peptdico
Puentes de hidrgeno entre las cadenas laterales de los
aminocidos, interaccin hidrofbica, interaccin electrosttica,
puente disulfuro, enlace ster.
Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario ms las fuerzas de Van der Walls
Terciario
28
La complejidad estructural de las protenas se manifiesta desde el punto de vista funcional en
una gran diversidad de funciones biolgicas. A pesar de ello y llevado hasta las ltimas
instancias, las funciones biolgicas de estas macromolculas pueden comprenderse basadas
en una sola propiedad inherente a estos compuestos, la de poseer caractersticas
informacionales.
En las macromolculas informacionales la estructura del compuesto lleva implcita la pre-
sencia de una codificacin con sentido biolgico. Esta informacin contenida en la estructu-
ra puede ser de dos grandes tipos: la informacin secuencial y la conformacional.
La informacin secuencial depende exclusivamente del modo en que se organizan las dife-
rentes unidades monomricas que componen a la macromolcula; en otras palabras, depende
del orden en que se ubican los aminocidos dentro de la cadena proteica. En tanto que la
informacin conformacional residir en la estructura tridimensional de la molcula. Lgica-
mente la informacin conformacional depender de la secuencial y el cambio de tan slo un
aminocido por otro en la estructura de las protenas puede implicar por tanto una modifica-
cin de su estructura tridimensional y por ende una alteracin de la informacin conformacional
Como resultado de la existencia de la informacin conformacional, en las protenas aparece
una caracterstica fundamental para su funcionamiento que es el reconocimiento molecular.
El reconocimiento molecular es la propiedad que tienen las protenas de poder unirse
selectivamente con otras molculas gracias a la existencia de una complementaridad elctri-
ca y estrica que le permiten interactuar con dichas molculas. Esta propiedad citada, por
consiguiente, depende fundamentalmente de las cadenas laterales de los aminocidos que
como ya ha sido mencionado representan la parte variable de la estructura de los aminocidos,
y de ah el hecho de la gran variabilidad de funciones de las protenas y su posibilidad real de
reconocer un nmero prcticamente infinito de compuestos.
Por supuesto que para que se produzca el reconocimiento molecular la estructura tridimensional
de la protena tiene que estar intacta y deben existir en el medio circundante condiciones de
pH que le confieran a esta macromolcula un estado inico compatible con la molcula a
reconocer.
De lo anteriormente expuesto se deduce que el estado inico de la protena experimentar
modificaciones en dependencia del pH del medio. Esto se debe a la presencia de los grupos alfa
aminos, alfa carboxilos y a la existencia en la cadena lateral de los aminocidos de diferentes
grupos ionizables, cuya forma inica variar de acuerdo a las condiciones del medio.
Como podr apreciar existe una forma en cada uno de los aminocidos que al sumar el
nmero total de cargas positivas y negativas el resultado ser igual a 0, y por consiguiente si
se colocara bajo la influencia de un campo elctrico no migrara hacia ninguno de los polos.
A este valor del pH en el que un aminocido en solucin colocado bajo la influencia de un
campo elctrico no migra ni hacia el nodo ni hacia el ctodo porque sus cargas elctricas
estn compensadas se le denomina PUNTO ISOELCTRICO (pI). Cuando el aminocido
29
se encuentra en un pH por debajo de su punto isoelctrico su carga ser positiva, en tanto que
si el valor del pH del medio es superior al punto isoelctrico su carga neta ser negativa y
migrar hacia el nodo.
En las protenas tambin se reconoce la existencia del pI el cual se define como el valor del
pH en el cual una protena en solucin colocada bajo la influencia de un campo elctrico no
migra ni hacia el nodo ni hacia el ctodo porque sus cargas elctricas estn compensadas.
Para el caso de las protenas los grupos amino y carboxilo de los aminocidos consti-
tuyentes no tienen prcticamente ninguna influencia en la determinacin del pI puesto que
los mismos se encuentran comprometidos en el establecimiento de los enlaces peptdicos.
Lo determinante en la aparicin del estado inico de las protenas sern, por tanto, funda-
mentalmente las cadenas laterales de los aminocidos ionizables constituyentes y de ah que
se haya mencionado con anterioridad que la funcin de reconocimiento molecular de las
protenas dependiera de ellos en gran medida, puesto que seran los que estaran establecien-
do la compatibilidad o incompatibilidad elctrica con la sustancia a reconocer.
El otro aspecto a considerar en relacin con el reconocimiento molecular, como ya se men-
cion, es la complementaridad estrica que depender de la integridad de la estructura
tridimensional de las protenas. Si se produjera la desnaturalizacin de las mismas, por con-
siguiente se estara no slo cambiando las propiedades fsicas y qumicas de las protenas,
sino que tambin se perdera su funcin biolgica.
Se entiende por desnaturalizacin el cambio de la conformacin proteica como resultado de
la accin de agentes fsicos o qumicos y trae como consecuencia la modificacin de las
propiedades fsicas, qumicas y biolgicas de las protenas.
En la presente prctica nos proponemos estudiar un mtodo de reconocimiento o identifica-
cin de las protenas, as como determinar el pI de una protena y verificar que la
desnaturalizacin modifica las propiedades fsico-qumicas de las mismas.
Para dar cumplimiento al primer propsito utilizaremos la reaccin del biuret; mientras que
para los otros dos emplearemos las caractersticas de solubilidad de las protenas.
REACCIN DEL BIURET.
El biuret es un compuesto qumico resultante del calentamiento de la urea, segn se muestra
en la reaccin siguiente.
Insertar biuret1
FORMACIN DEL BIURET A PARTIR DE UREA
La reaccin del biuret tambin dar positiva con todos aquellos compuestos que como los
30
que se muestran a continuacin posean grupos carbamidas (-CONH
2
) consecutivos o separa-
dos por un tomo de nitrgeno o de carbono.
COMPUESTOS SIMILARES AL BIURET
Insertar biuret1b
Las protenas, al tener los enlaces peptdicos separados por el carbono tienen una estructu-
ra similar a la de la malonamida y por tanto darn positivo con este reactivo. Cabe destacar
que en el reactivo del biuret no se encuentra presente la sustancia que le da el nombre a la
reaccin, sino que este nombre deriva del hecho de haber sido esta sustancia la que se descu-
bri histricamente como la primera que desarroll color al ponerla en contacto con los iones
cpricos. Posteriormente se comprob que otros compuestos, como la malonamida y la
examida, de estructura qumica similar tambin daban positiva la reaccin.
El reactivo del biuret consiste, en esencia, en una solucin de sulfato cprico a la que se le
adicionan otros compuestos que evitan que los iones cpricos puedan reducirse, ya que se
fundamenta en la formacin de un complejo rgano metlico con el ion cprico, que en
medio alcalino toma una coloracin violeta. Este complejo se muestra en el dibujo siguiente,
donde se ve como el ion cprico forma un complejo de coordinacin con el agua y con los
nitrgenos de enlaces peptdicos consecutivos.
COMPLEJO DE COORDINACIN ORGANO-METLICO RESUL-
TANTE DE LA REACCIN DEL BIURET.
Insertar biuret2
La reaccin del biuret tiene tambin importancia cuantitativa, pues el color resultante de la
formacin del complejo de coordinacin sigue las leyes de Lambert y Beer y por lo tanto
resulta de utilidad prctica para conocer el contenido de protenas en una solucin, siempre y
cuando la concentracin de la misma sea relativamente elevada, pues la sensibilidad del
mtodo no permite discriminar pequeas variaciones del contenido proteico. Esta tcnica es
muy empleada en la prctica mdica para la cuantificacin de protenas en diferentes lqui-
dos biolgicos como son la sangre y el lquido cefalorraqudeo.
SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS.
31
En trminos generales las protenas son solubles en agua y en soluciones diluidas de cidos,
bases y sales; sin embargo esto es muy variable pues depender de la composicin
aminoacdica de la misma. Mientras mayor sea el nmero de aminocidos polares ms solu-
ble ser la protena en soluciones acuosas; pero a medida que se incremente el contenido de
aminocidos apolares esta solubilidad ir disminuyendo y se irn haciendo cada vez ms
solubles en solventes orgnicos.
La solubilidad en agua de las protenas depende en primera instancia de la interaccin que
ejercen los grupos polares de las cadenas laterales de los aminocidos constituyentes con el
agua, de manera que mientras ms polar es la protena mayor ser su interaccin con el agua
del medio y lograr crearse una capa de molculas de agua que recubren a la macromolcula,
a la que se denomina agua de solvatacin; por consiguiente cualquier efecto o agente que
excluya el agua de solvatacin provocar la precipitacin de las protenas.
De esta manera si se modifica el pH del medio hasta alcanzar el valor del pI de la protena,
aunque no se eliminan las cargas de la protena, sta s estar en un estado elctricamente
neutro y la interaccin agua-protena ser ms dbil y por lo tanto las mismas precipitarn. A
este procedimiento se le denomina precipitacin isoelctrica de las protenas y adems de per-
mitir estimar el pI de una protena, con l tambin se podr efectuar la purificacin parcial de
las mismas. Est metodologa ser utilizada en esta prctica con el fin de determinar el pI de la
casena.
La adicin de sales neutras a una solucin de protenas tendr un efecto diferente de acuerdo
con la concentracin en que se adicione la sal. Si la concentracin de la sal es baja, la misma
constituir un puente entre la protena y el agua de solvatacin que permitir que la solubilidad
de la macromolcula se incremente; sin embargo si se aade sal en exceso la misma provoca-
r la sustraccin del agua de solvatacin de la protena y estas ltimas precipitarn. A este
procedimiento de disminuir la solubilidad en agua de las protenas se le denomina salting
out o precipitacin salina.
La desnaturalizacin de las protenas tambin traern como consecuencia la disminucin de
la solubilidad de las mismas, siempre que esta desnaturalizacin se haga irreversible gracias
a la accin de un agente desnaturalizante muy enrgico como seran las altas temperaturas o
los cidos y las bases fuertes. Este efecto ser el resultado de la liberacin de los grupos
apolares de las protenas que normalmente se encuentran localizados en el interior de las
protenas globulares; pero que al distorsionarse su estructura tridimensional quedaran ex-
puestos al medio, adems, en estas condiciones las protenas se encuentran con ms grupos
reactivos disponibles, e interactuarn unos con otros provocando la formacin de agregados
protenicos (cogulos) que no podrn mantenerse en solucin.
Combinando la accin de la desnaturalizacin proteica y la precipitacin salina, en esta prc-
tica demostraremos la posibilidad de extraer todas las protenas de una solucin, conservan-
do los otros componentes. Este proceder es extraordinariamente importante en la prctica
mdica en la determinacin de compuestos diferentes a las protenas en los lquidos biolgi-
cos, ya que las protenas en muchas ocasiones interfieren con el desarrollo de la tcnica que
se debe emplear y por lo tanto deben ser eliminadas. Tambin se emplea cotidianamente en la
esterilizacin del instrumental quirrgico y es la base de algunas maniobras de asepsia y
antisepsia del rea quirrgica y de las manos del personal que participa en la ciruga.
OBJETIVOS
32
En la presente prctica nos hemos propuesto los objetivos siguientes:
1.- Demostrar la utilidad de la reaccin del biuret en la deteccin cualitativa de las protenas.
2.- Determinar el pI de la casena mediante el estudio de su solubilidad a diferentes valores
de pH.
3.- Realizar un filtrado libre de protenas utilizando el mtodo de Nelson.
4.- Demostrar que al realizar el filtrado libre de protenas no se pierden las otras sustancias
presentes en la solucin.
DESARROLLO.
EXPERIMENTO # 1. REACCIN DEL BIURET.
Prepare 3 tubos de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente:
Espere 10 minutos y observe los resultados. Dibuje en el espacio siguiente los resultados
obtenidos:
Insertar tubos3
Cules fueron las soluciones que dieron positivo con la reaccin?
Considera Ud. que los aminocidos interfirieron con el desarrollo del color de la reaccin.
EXPERIMENTO # 2. OBTENCIN DE UN FILTRADO LIBRE DE PROTENAS.
1 2 3
Tubo #
Reactivo
Casena 1 ml - -
Aminocidos - 1 ml -
Casena+aminocidos - - 1 ml
Reactivo del Biuret 4 ml 4 ml 4 ml
33
Prepare tres tubos de ensayo siguiendo las orientaciones del cuadro siguiente:
Para que los resultados sean confiables, Ud. debe agitar cada uno de los tubos de ensayo
vigorosamente despus de aadir cada uno de los reactivos.
Describa qu ha sucedido en cada uno de los tubos de ensayo.
Proceda ahora a filtrar cada uno de los tubos de ensayo anteriores y describa en el siguiente
espacio cmo es el aspecto de cada uno de estos tubos. Guarde los filtrados libres de prote-
nas (FLP) para utilizarlos en el prximo experimento.
EXPERIMENTO # 3. CARACTERIZACIN DE LOS FILTRADOS LIBRES DE PRO-
TENAS.
Prepare 6 tubos de ensayo segn se describe en el siguiente cuadro:
Lleve los tubos del 4 al 6 al bao de agua en ebullicin y mantngalos ah durante 5 minutos
1 2 3
Tubo #
Reactivo
Casena 1 ml - -
Aminocidos - 1 ml -
Casena + aminocidos - - 1 ml
Hidrxido de Bario 4,5 % 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml
Sulfato de Zinc 5 % 4,5 ml 4,5 ml 4,5 ml
1 2 3 4 5 6
Tubo #
Reactivo
FLP casena - - 1 ml 1 ml - -
FLP aminocidos. - 1 ml - - 1 ml -
FLP casena+aminocidos 1 ml - - - - 1 ml
Reactivo de Biuret 4 ml 4 ml 4 ml - - -
Ninhidrina - - - 1 ml 1 ml 1 ml
34
Observe los resultados obtenidos y dibjelos en el espacio siguiente.
Insertar tubos6
Qu ha sucedido con la reaccin del biuret?
Qu ha sucedido con la reaccin de la ninhidrina?
Interfiri la obtencin del FLP con la deteccin de los aminocidos? Por qu?
EXPERIMENTO # 4. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA
CASENA
En el cuadro que se le muestra a continuacin se describe la forma en que Ud. debe preparar
los 9 tubos de ensayo necesarios para este experimento.
Debe tener cuidado de agitar cada uno de los tubos de ensayo cada vez que aade un reactivo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tubo #
Reactivo
Agua 8,4 ml 7,7 ml 8,8 ml 8,5 ml 8,0 ml 7,0 ml 5,0 ml 1,0 ml 7,4 ml
Ac. actico 0,01 N 0,6 ml 1,3 ml - - - - - - -
Ac. actico 0,1 N - - 0,2 ml 0,5 ml 1.0 ml 2,0 ml 4,0 ml 8,0 ml -
Ac. actico 1,0 N - - - - - - - - 1,6 ml
Casena 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
pH resultante 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5
35
La aparicin de turbidez estar manifestando la insolubilidad de las protenas, luego donde
mayor turbidez exista menor solubilidad tendr la protena.
Describa los resultados de la experiencia anterior inmediatamente despus de terminada.
Espere 5 minutos y vuelva a describir los resultados observados.
Escriba el valor del punto isoelctrico de la casena y explique por qu lleg a esa conclu-
sin.
36
37
INFORME DE LA PRCTICA
PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LAS PROTE-
NAS
EQUIPO #_____________DA_______________HORA_____________.
INTEGRANTES:
1.- _____________________________________________________________________
2.- _____________________________________________________________________
3.- _____________________________________________________________________
4.- _____________________________________________________________________
5.- _____________________________________________________________________
1.- Cules de las soluciones ensayadas dio positiva con la reaccin del biuret? Por qu?
2.- Por qu cambia el aspecto de las soluciones que tienen protenas cuando se adiciona el
reactivo de Nelson?
3.-Por qu cambia nuevamente su aspecto despus que se filtran?.
4.- Describa el procedimiento que se us para determinar el pI de la casena. Explique por qu
38
39
PRCTICA # 4
CINTICA ENZIMTICA
INTRODUCCIN
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica, gran eficiencia cataltica,
elevada especificidad y susceptibles de ser regulados en su accin.
Como protenas que son, su funcionamiento transcurre mediante el reconocimiento molecular.
De esta manera, las enzimas poseen un lugar de la protena enzimtica que se une ntima-
mente con el sustrato y al que se le denomina SITIO ACTIVO o CENTRO ACTIVO. Todas
las propiedades de la enzima dependern entonces de la estructura del sitio activo.
Para el estudio de la estructura del sitio activo, ste se ha dividido artificialmente en diferen-
tes componentes:
1.- El esqueleto covalente.
2.- Los grupos de fijacin del sustrato.
3.- Los grupos catalticos
4.- Los grupos ambientadores.
El esqueleto covalente del sitio activo estar formado por aquellos sectores de la cadena
peptdica, no necesariamente consecutivos, que le dan forma y que frecuentemente se en-
cuentran formando un dominio de la molcula proteica. Por supuesto que de la conformacin
del sitio activo depender en gran parte el reconocimiento molecular pues es el que estar
determinando la posibilidad de la complementaridad estrica entre la enzima y el sustrato.
Los grupos de fijacin del sustrato son los otros elementos que participan en el reconoci-
miento molecular, ya que son cadenas laterales de aminocidos presentes en el centro activo
y que se interrrelacionarn con el sustrato por medio de atracciones electrostticas, puentes
de hidrgeno u otras interacciones, incluso enlaces covalentes, que garanticen la ms ntima
unin con el sustrato y que ste quede colocado con la orientacin ptima para el funciona-
miento de los grupos catalticos. En lo anteriormente expuesto queda implcito que del esta-
do de ionizacin de las cadenas laterales de estos aminocidos que constituyen los grupos de
fijacin del sustrato depender la complementaridad elctrica entre la enzima y el sustrato.
Por supuesto que los grupos catalticos tambin sern cadenas laterales de los aminocidos
ubicados en el centro activo y a ellos corresponde la actividad cataltica de la enzima.
Los grupos ambientadores del sitio activo son por regla general cadenas laterales de
aminocidos hidrofbicos que estn garantizando la exclusin del agua del espacio interno
del sitio activo de manera que sta no interfiera con la reaccin y que slo pueda entrar a este
espacio cuando se necesite como sustrato y por lo tanto exista algn grupo fijador para ella.
40
De las caractersticas del centro activo dependern todas las funciones de la protena
enzimtica, en otras palabras: su accin, su eficiencia y su especificidad.
Entre las propiedades ms importantes de las enzimas encontramos a la especificidad, enten-
dindose como tal a la caracterstica que tienen estos compuestos de actuar sobre un sustrato
o sobre un grupo estructuralmente parecido de sustratos, catalizando una y slo una de las
posibles transformaciones que pueda experimentar dicho sustrato.
CINTICA ENZIMTICA.
La cintica qumica es la rama de la qumica que se ocupa de estudiar la velocidad y los
mecanismos de las reacciones. Al aplicar esta rama general a la accin de las enzimas se
habla entonces de la cintica enzimtica.
Se considera a la velocidad de la reaccin como una expresin de la rapidez conque transcu-
rre la misma y se puede calcular, bien como la cantidad de sustancias reaccionantes que
desaparecen en la unidad de tiempo o como la cantidad de productos que se forman en la
unidad de tiempo. Para los efectos de la presente prctica se va a utilizar para expresarla la
desaparicin del producto.
Entre los diferentes factores que modifican la velocidad de la reaccin enzimtica tenemos:
1.- Concentracin de la enzima.
2.- Concentracin del sustrato.
3.- Concentracin de coenzimas.
4.- pH
5.- Temperatura.
6.- Inhibicin enzimtica.
De todos ellos el 1,2 y 6 tendrn gran repercusin en la regulacin del metabolismo celular
en tanto que los otros estarn directamente vinculados con el proceso de salud y enfermedad.
En el momento de estudiar cada uno de estos factores debe tenerse en cuenta un aspecto
importante que es el de mantener constantes todos los otros factores que modifican a la
velocidad de la reaccin enzimtica, pues de otra forma las variaciones que se encontraran
seran imposibles de explicar. Evidentemente resulta fcil o relativamente fcil controlar
factores como pH y temperatura; sin embargo, el hecho de que la reaccin implica necesaria-
mente una modificacin permanente de la concentracin del sustrato, este ltimo factor re-
sulta imposible de mantener constante y por lo tanto tiene que utilizarse un artificio que
garantice al menos que su variacin de concentracin pueda considerarse despreciable para
los efectos prcticos. Esto se realiza midiendo la llamada velocidad inicial (V
0
) que se define
como la velocidad que alcanza la reaccin cuando no se ha consumido ms del 10 % del
sustrato inicialmente aadido; por supuesto que trabajando con sustrato en exceso, esta va-
riacin es despreciable y da margen de tiempo para hacer las mediciones necesarias
41
Otro aspecto importante para realizar con calidad el trabajo a desarrollar con las enzimas es
el de garantizar su pureza, es decir, que no exista en el medio ninguna otra enzima que
pudiera actuar simultneamente con la que se desea investigar. Este trabajo de purificacin
enzimtica constituye, sin lugar a dudas, una de las tareas ms difciles que puede enfrentar
un investigador ya que conlleva diferentes pasos que requieren de mucho cuidado. En primer
lugar se debe seleccionar adecuadamente el organismo y tejido en el que la enzima se en-
cuentre en elevada concentracin, posteriormente tiene que producirse la ruptura de la clula
evitando que se pierda, mediante desnaturalizacin, la actividad de la enzima y una vez
logrado esto comenzar a eliminar por diversos procedimientos el resto de las protenas exis-
tentes en el material de trabajo. Dentro de los mtodos de purificacin ms utilizados se
encuentran: la precipitacin isoelctrica y salina, la electroforesis, la cromatografa y la
ultracentrifugacin preparativa.
Para evitarnos todos estos trabajos en la presente prctica se ha seleccionado a la enzima
-amilasa salival, antiguamente denominada ptialina, como el objeto de estudio, ya que esta
enzima es de fcil adquisicin, pues se encuentra directamente suspendida en una solucin
de muy fcil obtencin y es prcticamente la nica enzima existente en la saliva. Por otra
parte el sustrato natural de esta enzima, el almidn, tambin se consigue fcilmente y resulta
relativamente econmico y muy estable.
Otro de los cuidados que se deben mantener al trabajar la cintica enzimtica o al manipular
cualquier muestra de enzimas es el de garantizar que durante todo el tiempo en que se est
trabajando no se vaya a producir la inactivacin de estas protenas. Existen mltiples facto-
res que pueden inactivar a una enzima mediante su desnaturalizacin que incluyen desde un
material de laboratorio sucio y por consiguiente contaminado con sustancias que puedan ser
agentes desnaturalizantes o inhibidores de la enzima hasta el poco control de la temperatura
y el pH. Otra gran ventaja en la utilizacin de la -amilasa salival es que la misma es relati-
vamente termoestable y no se desnaturaliza sino a temperaturas elevadas.
INHIBICIN ENZIMTICA
La inhibicin enzimtica es el mecanismo mediante el cual algunas sustancias qumicas de-
nominadas inhibidores producen una supresin de la actividad enzimtica o al menos una
disminucin de su velocidad de reaccin, al afectar la eficiencia cataltica de la enzima, su
afinidad por el sustrato o ambos parmetros cinticos simultneamente.
Resulta importante el estudio de la inhibicin enzimtica porque la de tipo no competitiva es
la responsable de gran parte de las intoxicaciones que sufre el ser humano y la competitiva,
adems de poseer el efecto anterior, tambin constituye un mecanismo importante que parti-
cipa de la regulacin metablica.
FUNDAMENTACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA -AMILASA
SALIVAL
Como se mencion anteriormente en esta prctica se utilizar la -amilasa salival como
enzima demostrativa, por lo tanto a continuacin se proceder a explicar someramente el
efecto cataltico de esta enzima.
42
La -amilasa salival es una enzima del grupo de las hidrolasas y especficamente de las
endohidrolasas, es decir que va a catalizar la hidrlisis de un enlace que se encuentra situado
interiormente en una macromolcula y no afecta en absoluto a los enlaces que se encuentran
en los extremos del sustrato. Ms especficamente esta enzima se cataloga como una
-endoglicosidasa porque cataliza la hidrlisis de los enlaces glicosdicos.
El sustrato natural de esta enzima lo constituye el almidn, aunque tambin puede actuar
sobre algunos otros polisacridos que como en el caso del glucgeno posean los mismos
enlaces y estructura parecida.
Insertar glucosa
El almidn es un polisacrido derivado de la unin de mltiples unidades de -D-glucosa.
En la figura que se representa a continuacin aparece la estructura de la glucosa, as como la
numeracin de sus tomos :
En el almidn las unidades de -D-glucosa que lo componen, se unen entre s mediante el
establecimiento de enlaces -1-4-O-glicosdicos y como es un compuesto que presenta ra-
mificaciones, el establecimiento de estas ramificaciones se hace por intermedio de enlaces
-1-6-O-glicosdicos. La estructura de ambos tipos de enlaces se representa a continuacin.
Insertar glicosdico
En el almidn existen dos tipos de cadenas diferentes, una que no se encuentra ramificada
llamada amilosa y otra que se encuentra muy ramificada y que se denomina amilopectina.
43
IAmbas molculas se imbrican entre s para
dar lugar a la aparicin del grnulo de al-
midn que constituye la reserva de com-
bustible biolgico en los vegetales.
Existen dos elementos que posibilitan la
imbricacin del grnulo de almidn: uno
es la propia estructura de la amilopectina,
que como se aprecia a continuacin per-
mite que entre sus mltiples ramificacio-
nes se entrelacen las distintas molculas,
y la otra es la caracterstica que tiene la molcula de amilosa de presentar una conformacin
helicoidal con seis unidades de glucosa por cada vuelta de la espira, que le permite interactuar
con otras molculas de su mismo tipo y con las ramificaciones de la amilopectina.
La glucosa que forma el almidn tiene la propiedad de ser un monosacrido reductor debido
a la presencia en su estructura del denominado carbono anomrico; sin embargo el almidn
pierde esta caracterstica de ser un agente reductor porque en su estructura todos los carbo-
nos anomricos de sus glucosas constituyentes se encuentran comprometidos en la forma-
cin de los enlaces glicosdicos, excepto unos pocos que forman los escasos extremos
reductores de la molcula; sin embargo la mayor parte de los extremos de esta molcula son
no reductores.
La propia estructura de la amilosa permiti disear una reaccin para la identificacin del
almidn que se puede hacer fcil y rpidamente en el laboratorio mediante la adicin de iodo,
el cual formara con la hlice del polisacrido un complejo de inclusin de color azul, tal
como se muestra en el siguiente esquema:
I n - s e r t a r
Lugol
El proceso de digestin del almidn transcurre mediante reacciones sucesivas de fragmenta-
cin de sus molculas constituyentes, tal como se muestra en la figura de la pgina siguiente.
DIGESTIN ENZIMTICA DEL ALMIDN POR LA -AMILASA
Insertar amilasa 1
Como se aprecia en esa figura, la fragmentacin sucesiva del almidn determina que vayan
apareciendo compuestos que presentan diferente coloracin con el reactivo de lugol, lo cual
constituye un excelente indicador que permite seguir el curso de la reaccin. Cabe destacar
que los productos finales obtenidos en este proceso son los disacridos maltosa e isomaltosa
y el trisacarido isomaltotriosa, sin que pueda alcanzarse la formacin de la glucosa, pues el
enlace glicosdico existente en estos disacridos es un enlace externo y la enzima no es
especfica para l.
44
OBJETIVOS
Los objetivos de la presente prctica son:
1.- Demostrar que en la saliva existe actividad de la enzima -amilasa.
2.- Comprobar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin.
3.- Determinar el pH ptimo de la enzima -amilasa salival.
4.- Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.
5.- Identificar un inhibidor de la enzima -amilasa salival.
DESARROLLO
RECOLECCIN DE LA MUESTRA DE SALIVA Y PREPARACIN DE LA SOLU-
CIN DE ENZIMA.
Lo primero que se debe hacer es recolectar la muestra de saliva para obtener una solucin de
enzima. Para ello enjuguese la boca varias veces con agua corriente y proceda a recoger en
un beaker de 50 ml limpio aproximadamente 2 ml de saliva. Adicinele a la saliva recogida
10 ml de agua destilada y mzclela bien. Filtre esta solucin de saliva y rotule a este tubo de
ensayo como solucin de enzima.
EXPERIMENTO # 1. DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD -AMILSICA EN
LA SALIVA.
Prepare 5 tubos de ensayo con 0,5 ml de cido tricloroactico (TCA) cada uno y rotlelos del
0 al 4. Prepare adems un tubo de ensayo segn se muestra en el cuadro siguiente. A este
tubo de ensayo le llamaremos tubo de reaccin:
45
Reactivos Cantidad
Almidn 1,0 ml
Agua destilada 4,9 ml
Cloruro de Potasio 1,0 ml
Buffer fosfato pH 6,9 0,1 ml
Agite bien este tubo de ensayo y proceda a adicionarle 1 ml de solucin de enzima e inmedia-
tamente, sin perder tiempo proceda a agitar y a extraer 1 ml de este tubo y adicionarlo
rpidamente al tubo rotulado 0 y al mismo tiempo comience a medir el tiempo. Cada minuto
subsiguiente Ud. debe repetir el paso anterior, es decir extraer una porcin alcuota de 1ml
del tubo de reaccin e irla adicionando a los tubos que contienen el TCA hasta alcanzar el
tubo marcado 4 minutos. RECUERDE AGITAR EL TUBO DE ENSAYO CADA VEZ
QUE AADA LA PORCIN ALCUOTA.
De inmediato adicinele a cada uno de los tubos de ensayo 2 gotas del reactivo de lugol.
A continuacin dibuje en el espacio correspondiente los resultados obtenidos con cada uno
de los tubos de ensayo despus de haber aadido el lugol.
Insertar tubos5
Qu funcin desempea el TCA?
Explique los resultados obtenidos.
46
EXPERIMENTO # 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA SO-
BRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN
Prepare 4 tubos de ensayo de la forma siguiente:
Recuerde que el tiempo de reaccin es necesario controlarlo cuidadosamente de manera
que la enzima acte en todos los tubos de ensayo de igual manera; para ello no adicione la
enzima hasta no haber preparado todos los tubos de ensayo y haberlos agitado. Comien-
ce el trabajo aadindole al tubo # 1 la solucin de enzima y agite nuevamente, mida el
tiempo en ese momento, transcurridos 30 segundos aada la enzima al tubo # 2, al cabo
de otros 30 segundos se le adiciona al tubo # 3 y al tubo # 4 se le adicionar la enzima
despus de otros 30 segundos. Recuerde que siempre debe agitar los tubos de ensayo.
Para detener la reaccin aada 0,2 ml de TCA a cada tubo de ensayo despus de haber
transcurrido 4 minutos de reaccin. Es decir se proceder en la misma forma secuencial
conque se aadi la enzima, de esta manera a los 4 minutos de haber adicionado la enzima al
tubo # 1 ser que se debe agregar el TCA a ese tubo y a los restantes se les adicionar el cido
en intervalos de 30 segundos.
Despus de haber detenido la reaccin en todos los tubos de ensayo, proceda a agregarle a
todos los tubos 2 gotas del reactivo de lugol y observe los resultados obtenidos reflejndolos
en el dibujo que debe pintar a continuacin.
Insertar tubos4
Explique los resultados obtenidos.
1 2 3 4
Tubo #
Reactivo
Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
KCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Almidn 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Agua destilada 1,2 ml 1,1 ml 1,0 ml 0,9 ml
Enzima 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,4 ml
47
EXPERIMENTO # 3. DETERMINACIN DEL pH PTIMO DE LA -AMILASA
SALIVAL.
Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo a las indicaciones siguientes:
Para agregar la enzima tiene que tener los mismos cuidados que con la reaccin anterior en el
control del tiempo, es decir irla adicionando secuencialmente cada 30 segundos y de igual
forma se debe agregar el TCA para detener la reaccin a los 4 minutos exactos de haber
aadido la enzima.
Una vez concluido todos los pasos anteriores adicione 2 gotas de lugol a cada uno de los
tubos de ensayo y dibuje los resultados en el espacio siguiente.
Insertar tubos5
Escriba el valor del pH ptimo de la enzima y explique cmo llega Ud. a esa conclusin.
1 2 3 4 5
Tubo #
Reactivo
Buffer pH 4,9 0,1 ml - - - -
Buffer pH 6,3 - 0,1 ml - - -
Buffer pH 6,9 - - 0,1 ml - -
Buffer pH 7,5 - - - 0,1 ml -
Buffer pH 8,9 - - - - 0,1 ml
KCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Almidn 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Enzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
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EXPERIMENTO # 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD
DE LA REACCIN ENZIMTICA.
Prepare tres tubos de ensayo de acuerdo con las indicaciones siguientes:
Despus de preparados los tubos de ensayo; PERO ANTES DE ADICIONAR LA ENZI-
MA, coloque el tubo # 1 durante 5 minutos en el bao de hielo y el tubo # 3 en el bao de
agua en ebullicin. Transcurridos estos 5 minutos y sin sacar los tubos de sus respectivos
baos de incubacin, aada la solucin de enzima y controle que el tiempo de reaccin sea de
4 minutos, adicionando el TCA en el momento apropiado.
Agrguele a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol, observe los resultados y dibjelo en el
espacio siguiente.
Insertar tubos3
Qu explicacin le da Ud. a los hallazgos encontrados.
1 2 3
Tubo #
Reactivo
Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
KCl 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Almidn 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Enzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
49
EXPERIMENTO # 5. IDENTIFICACIN DEL COFACTOR Y DE UN INHIBIDOR
DE LA ENZIMA -AMILASA SALIVAL.
La enzima -amilasa salival requiere como cofactor de la presencia de los iones cloruros; sin
embargo los iones fluoruros constituyen un inhibidor de la enzima y los bromuros no afectan
la velocidad de la reaccin. Sobre esta base se han preparado tres soluciones en las que en
cada una de ellas se encuentra uno de los iones mencionados, en forma de su sal de potasio.
Siguiendo las instrucciones que se brindan en el cuadro siguiente prepare 3 tubos de ensayo.
Recuerde adicionar la enzima de forma secuencial para controlar el tiempo y detener la reac-
cin con el TCA a los 4 minutos exactos de haberse iniciado la misma.
Aada a cada tubo de ensayo 2 gotas de lugol y observe los resultados. Exprselos mediante
un dibujo en el espacio siguiente:
Insertar tubos3
Cul es la solucin que se comport como inhibidora?
Cul es la solucin que se comport como activadora?
Cul es la solucin que se comport como inerte?
Cmo pudo Ud. diferenciarlas?
1 2 3
Tubo #
Reactivo
Solucin KCl 0,2 ml - -
Solucin KBr - 0,2 ml -
Solucin KF - - 0,2 ml
Buffer pH 6,9 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
Almidn 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Agua destilada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Enzima 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
50
51
INFORME DE LA PRCTICA
CINTICA ENZIMTICA
EQUIPO #_____________DA_______________HORA_____________.
INTEGRANTES:
1.- _____________________________________________________________________
2.- _____________________________________________________________________
3.- _____________________________________________________________________
4.- _____________________________________________________________________
5.- _____________________________________________________________________
1.- Por qu se utiliza la saliva como material biolgico en esta prctica?
2.- Cmo detect Ud. la actividad enzimtica de la saliva?.
3.- Qu factores estudiados afectaron la velocidad de la reaccin enzimtica ?. Por qu?
4.- Cul es el pH ptimo de la enzima?. Cmo Ud. lo determin?
5.- Cul fue la sustancia activadora y cul la inhibidora?. Cmo Ud. lo determin?
52
53
PRCTICA # 5
REACCIONES COLOREADAS DE MONO Y
DISACRIDOS
INTRODUCCIN
Los glcidos constituyen un importante grupo de compuestos que garantizan la realizacin
de diversas funciones de la clula.
Conceptualmente se conocen como glcidos a los compuestos qumicos que respondan a las
caractersticas de ser aldehidos o cetonas polihidroxilados, sus productos de oxidacin, re-
duccin, sustitucin, acetalizacin y polimerizacin.
De acuerdo con el nmero de sus unidades constituyentes los glcidos pueden ser clasifica-
dos en tres grandes grupos:
1.- Monosacridos.
2.- Oligosacridos
3.- Polisacridos.
Los monosacridos son las unidades ms sencillas de los glcidos y representan a su vez a
los monmeros que constituirn a los otros grupos clasificatorios.
Desde el punto de vista estructural los monosacridos con ms de 4 tomos de carbono
experimentarn una reaccin de hemiacetalizacin interna que les confiere caractersticas
cclicas. Las aldopentosas y las cetohexosas adoptarn una forma furansica en tanto que las
aldohexosas y las cetoheptosas se presentarn en forma piransica.
Como resultado de la hemiacetalizacin de los monosacridos aparece en su estructura el
denominado carbono anomrico. Este carbono tiene caractersticas especiales que determi-
nan entre otras cosas la aparicin de un tipo de ismeros (los anmeros) y le confiere a estas
molculas la propiedad de polimerizarse y as constituir los oligosacridos y los polisacridos.
Cuando se produce la unin de dos monosacridos a travs de un enlace glicosdico se obtie-
nen los denominados disacridos, de gran importancia en el metabolismo de los glcidos y
particularmente en su proceso de digestin, por lo que resulta necesario conocer a los princi-
pales representantes de este grupo de compuestos.
Insertar disacridos
54
Al observar estas estructuras se aprecia que al menos uno de los carbonos anomricos ha
quedado comprometido en la formacin del enlace glicosdico, en tanto que es comn que
otro de estos carbonos quede libre y permita que la molcula vaya creciendo hasta alcanzar
dimensiones que permitan considerarla como un polisacrido. En todo este proceso los enla-
ces glicosdicos que van apareciendo irn comprometiendo a los carbonos anomricos de
manera que slo uno, el de uno de los extremos permanecer libre. Debido a las caractersti-
cas reductoras que posee el carbono anomrico a ese extremo se le denominar extremo
reductor, en tanto que al otro extremo de la molcula, al no presentar dicho carbono anomrico
se le denomina extremo no reductor. Esta nomenclatura ser de gran utilidad cuando se pase
a estudiar el metabolismo de los polisacridos y en particular el del glucgeno.
De lo anteriormente expuesto se deduce que algunos de los glcidos presentarn la propie-
dad de reducir a algunas sustancias y de ah que los glcidos sern tambin clasificados
como reductores o no reductores; para lograr comprender esta nueva clasificacin debe pasar
a estudiarse las propiedades qumicas de los monosacridos.
PROPIEDADES QUMICAS DE LOS MONOSACRIDOS.
Los monosacridos, como aldehdos o cetonas polihidroxilados, presentarn todas las pro-
piedades qumicas propias de los grupos carbonilos primarios o secundarios as como de los
alcoholes. Comoquiera que stas son muy extensas, limitaremos su estudio a las que tienen
relacin directa con las reacciones que desarrollaremos en la presente prctica, es decir las
reacciones de reduccin y las furfurlicas.
REACCIONES DE REDUCCIN.
Los monosacridos como es sabido presentan un equilibrio entre las formas , y su estruc-
tura lineal y por lo tanto como todos los compuestos que presentan carbonos carbonlicos
experimentan una reaccin de tautomerizacin cuando se encuentran en solucin, lo que
determina la aparicin de otro equilibrio de su forma lineal en que aparecen tres estructuras
diferentes: la aldehdica, la enlica y la cetnica, tal y como se muestra en la figura siguiente:
Insertar cetoenol
La forma enlica resultante de este equilibrio tiene la propiedad de poder oxidarse fcilmen-
te y por lo tanto manifiesta poder reductor. Existen mltiples sustancias que pueden ser redu-
cidas por este grupo, entre las que se encuentran las sales de plata, el hidrxido de bismuto y
las sales cpricas. Todos estos compuestos han sido utilizados para la identificacin de los
monosacridos basados en sus propiedades reductoras; sin embargo gracias a la estabilidad
del reactivo y a la facilidad de su realizacin se ha impuesto la utilizacin de las sales cpricas
y especialmente el reactivo de Benedict.
ALDEHIDO CETONA ENOL
TAUTOMERISMO CETO-ENLICO
55
El reactivo de Benedict est compuesto por una solucin de sulfato cprico y de citrato y
carbonato de sodio, que le confieren a la solucin un pH alcalino y evitan que los iones
cpricos se reduzcan espontneamente en presencia del oxgeno ambiental. El medio alcalino
hace que la reaccin transcurra con mayor facilidad y por lo tanto todas aquellas sustancias
que posean poder reductor darn positivo con este reactivo, y entre ellas por supuesto todos
los monosacridos y algunos disacridos. La reaccin se muestra en la siguiente figura:
Insertar Benedict
En ella se aprecia que los iones cpricos son reducidos a xido cuproso que es una sustancia
insoluble de color rojo ladrillo caracterstica de la positividad de esta reaccin. La transfor-
macin de los monosacridos no se representa puesto que el mecanismo ntimo de la reac-
cin es extraordinariamente complejo y a partir del glcido se ha podido comprobar que se
obtienen ms de 93 compuestos diferentes como resultados de enolizaciones, epimerizaciones
y polimerizaciones que se producen posteriores a la oxidacin del compuesto.
Si se cambia el pH de la solucin de manera que resulte cido, se lograr tambin que las
sustancias reductoras ms potentes mantengan la positividad; pero aquellas que slo tienen
un dbil poder reductor no lograrn reducir al cobre. Esta propiedad posibilit desarrollar
una reaccin de diferenciacin de los monosacridos y los disacridos. Un cientfico llamado
Barfoed utiliz un reactivo compuesto por acetato cprico y cido actico, con lo que slo
los monosacridos eran capaces de reducir al cobre, en tanto que los disacridos que tienen
menor poder reductor al tener comprometido uno de sus carbonos anomricos en el estable-
cimiento del enlace glicosdico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo. Por
supuesto que al tener la solucin un pH cido resulta necesario controlar rigurosamente el
tiempo de la reaccin, pues si ste se prolongara se producira la hidrlisis cida del enlace
glicosdico con la consiguiente liberacin del carbono anomrico y la aparicin de nuevos
grupos reductores que falsearan el resultado.
REACCIONES FURFURLICAS.
Los otros tipos de reacciones que analizaremos son las que se derivan de la propiedad que
tienen los cidos orgnicos fuertes de deshidratar a la molcula de los monosacridos de
manera que se obtiene un aldehdo cclico denominado furfural, el cual a su vez es capaz de
condensarse con algunos compuestos aromticos y rendir complejos coloreados que permi-
ten visualizar la reaccin. La reaccin de deshidratacin se muestra en la figura siguiente:
Insertar FURFU
En ella se ha modificado la estruc-
tura lineal de los monosacridos de
forma que se puedan apreciar los
grupos que originan las tres mol-
culas de agua; de igual forma slo
se han representado las reacciones
que tendran lugar con las aldosas;
en el caso de las cetosas la reaccin
sera igual, pero el grupo aldehdo
que se ha representado debe ser
sustitudo por una cetona. De esta
REACCIONES DE XIDO-REDUCCIN
MONOSACRIDOS
56
manera se puede concluir que para que se produzca la formacin del furfural se requiere que
las aldosas tengan al menos 5 tomos de carbono, en tanto que con las cetosas slo reaccio-
narn aquellas que tengan 6 o ms tomos de carbono.
De acuerdo con el tipo de cido que se use como deshidratante y del compuesto aromtico
que se emplee para la reaccin de condensacin se describen las diferentes reacciones
furfurlicas. En la presente prctica realizaremos tres de ellas que se describen a continua-
cin:
Reaccin de Molisch.
Esta reaccin se considera como una reaccin general de los monosacridos puesto que uti-
liza al cido sulfrico como agente deshidratante y este cido es un deshidratante muy enr-
gico y por lo tanto todos los monosacridos que tengan suficiente nmero de tomos de
carbono como para formar el furfural darn positivo con la reaccin. Adems, la fortaleza
del cido sulfrico determina que los enlaces glicosdicos presentes en los di y polisacridos
que existan en la solucin se hidrolicen y se descompongan en sus monosacridos constitu-
yentes, por lo que tambin darn positivos con este reactivo.
El agente condensante que posibilita la aparicin del color es el -naftol, el cual adems, en
presencia del cido sulfrico se sulfona dos veces y aparece un complejo coloreado de viole-
ta. Esta reaccin se representa a continuacin.
Insertar Molisch
Reaccin de Sellivanoff:
Esta reaccin es tpica de las cetosas, puesto que se aprovecha la caracterstica que tiene el
cido clorhdrico de ser un mejor agente deshidratante de stas que de las aldosas, por lo que
si se controla rigurosamente el tiempo el furfural se obtendr solamente a partir de los
monosacridos que presenten grupos carbonilos secundarios en su estructura.
El agente condensante empleado en la reaccin es el resorcinol y la representacin del com-
57
plejo obtenido se muestra a continuacin.
Insertar Sellivanoff
Otra precaucin que hay que tomar al realizar este ensayo es el de la concentracin utilizada
de los monosacridos, puesto que concentraciones superiores al 2 % tambin harn que la
reaccin d positiva con las aldosas.
Reaccin de Bial.
En esta reaccin tambin se usa como agente deshidratante al cido clorhdrico; pero en
presencia de cloruro frrico, de manera que en estas condiciones se deshidratan primero las
pentosas que las hexosas y por lo tanto constituye una reaccin de identificacin de las
primeras. El agente condensante es el orcinol, que al reaccionar con el furfural rinde un
complejo coloreado de verde que se puede apreciar en la siguiente figura:
Insertar Bial
De esta manera, en la presente prctica realizaremos 5 reacciones coloreadas de mono y
oligosacridos que nos permitirn, si no identificar a los monosacridos, al menos conocer
las caractersticas generales de estos que nos permitan realizar su clasificacin. De esta ma-
REACCIN DE BIAL.
58
nera los objetivos que nos trazamos en esta prctica se enuncian a continuacin:
OBJETIVOS
1.- Identificar la presencia de glcidos en una solucin mediante la aplicacin de la reaccin
de Molisch.
2.- Comprobar la especificidad para las cetosas de la reaccin de Sellivanoff.
3.- Ratificar que la reaccin de Bial es caracterstica de las aldopentosas.
4.- Verificar el poder reductor de los monosacridos mediante la reaccin de Benedict.
5.- Reconocer la presencia de monosacridos en solucin usando la reaccin de Barfoed.
DESARROLLO
EXPERIMENTO # 1. REACCIN DE MOLISCH.
Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con el siguiente cuadro:
Al preparar los tubos de ensayo debe tomar la precaucin de aadir cada uno los reactivos
excepto el sulfrico. Una vez que haya vertido todos los reactivos en el tubo de ensayo
proceda a agitarlo y entonces y slo entonces, aada el sulfrico muy lentamente y por las
paredes y no vuelva a agitar el tubo de ensayo. La positividad aparecer como la presencia de
un anillo de color violeta en la interfase formada.
Recuerde que el sulfrico es altamente custico y que si se le derrama produce quema-
duras. de igual forma la reaccin de deshidratacin es altamente exotrmica y si se
aade el sulfrico rpidamente ebullir y puede producirse la expulsin del lquido que
producir quemaduras. Tenga mucho cuidado !.
Deje reposar los tubos durante 5 minutos y proceda a dibujar los resultados obtenidos:
1 2 3 4 5
Tubo #
Reactivo
Glucosa 2 ml - - - -
Sacarosa - 2 ml - - -
Ribosa - - 2 ml - -
Almidn - - - 2 ml -
Albmina de huevo - - - - 2 ml
Molisch 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas
cido sulfrico 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
59
Insertar tubos5
Qu puede concluir sobre los resultados obtenidos ?
Por qu la albmina de huevo que es una protena da un resultado positivo ?
EXPERIMENTO # 2. REACCIN DE SELLIVANOFF.
Para la realizacin de esta experiencia se deben de preparar 4 tubos de ensayo siguiendo las
instrucciones que aparecen a continuacin.
Lleve los tubos a un bao de agua hirviente durante 10 minutos exactos, al cabo de los cuales
proceda rpidamente a enfriar los tubos de ensayo bajo el flujo de agua corriente.
Por qu hay que controlar el tiempo y por qu se deben enfriar los tubos de ensayo ?
Dibuje los resultados obtenidos:
Insertar tubos4
Por qu la sacarosa result positiva en la reaccin ?
1 2 3 4
Tubo #
Reactivo
Glucosa 1 ml - - -
Fructosa - 1 ml - -
Galactosa - - 1 ml -
Sacarosa - - - 1 ml
Sellivanoff 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
60
EXPERIMENTO # 3. REACCIN DE BIAL.
Para realizar esta experiencia se requiere de la preparacin de 3 tubos de ensayo de acuerdo
con las siguientes instrucciones:
Mantenga todos estos tubos en bao de agua en ebullicin durante 10 minutos y proceda a
leer los resultados y a dibujarlos a continuacin.
Insertar tubos3
A qu conclusin puede Ud. llegar con respecto a la arabinosa ?
Por qu a estos dos ltimos experimentos hubo que darles calor ?
EXPERIMENTO # 4. REACCIN DE BENEDICT.
Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el prximo cuadro:
1 2 3
Tubo #
Reactivo
Glucosa 1 ml - -
Ribosa - 1 ml -
Arabinosa - - 1 ml
Bial 1 ml 1 ml 1 ml
1 2 3 4 5
Tubo #
Reactivo
Glucosa 1 ml - - - -
Fructosa - 1 ml - - -
Sacarosa - - 1 ml - -
Maltosa - - - 1 ml -
Lactosa - - - - 1 ml
Benedict 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
61
Mantenga los tubos de ensayo durante 5 minutos en el bao de agua hirviente y luego proce-
da a ver los resultados y dibujarlos a continuacin.
Insertar tubos5
Por qu la sacarosa dio negativo con esta reaccin ?
Qu diferencia observ entre los resultados de los monosacridos y los disacridos ?
EXPERIMENTO # 5. REACCIN DE BARFOED.
Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el prximo cuadro:
Mantenga los tubos de ensayo durante 5 minutos en el bao de agua hirviente. Recuerde
1 2 3 4 5
Tubo #
Reactivo
Glucosa 1 ml - - - -
Fructosa - 1 ml - - -
Sacarosa - - 1 ml - -
Maltosa - - - 1 ml -
Lactosa - - - - 1 ml
Barfoed 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
62
tener sumo cuidado con el control del tiempo que debe ser muy exacto.
Pasado este tiempo proceda a observar los resultados y dibujarlos a continuacin.
Insertar tubos5
A qu conclusiones generales puede Ud. arribar en este experimento ?
Qu diferencia observ entre los resultados de los monosacridos y los disacridos ?
63
INFORME DE LA PRCTICA
REACCIONES COLOREADAS DE MONO Y
DISACRIDOS
EQUIPO #_____________DA_______________HORA_____________.
INTEGRANTES:
1.- _____________________________________________________________________
2.- _____________________________________________________________________
3.- _____________________________________________________________________
4.- _____________________________________________________________________
5.- _____________________________________________________________________
1.- Escriba en el siguiente cuadro las especificidades de cada una de las reacciones que se
le mencionan:
Reaccin Especificidad
Molisch
Sellivanoff
Bial
Benedict
Barfoed
2.- De acuerdo con los resultados obtenidos en la prctica. Qu puede Ud. afirmar en
relacin con las caractersticas estructurales de?:
Sustancia Caractersticas estructurales
Glucosa
Fructosa
Galactosa
Ribosa
Arabinosa
Sacarosa
Maltosa
Lactosa
Almidn
Albmina de huevo
64
65
PRCTICA # 6
EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE LPIDOS
INTRODUCCIN
Los lpidos constituyen un importante y variado grupo de compuestos qumicos. Debido
precisamente a su gran variabilidad estructural resulta imposible establecer un concepto qu-
mico de estas sustancias y por ello se precisa definirlas operacionalmente, as se entiende por
lpido a todo material biolgico que sea extrable por medio de la utilizacin de solventes no
polares
Sin embargo, para su clasificacin s resulta til la agrupacin de estos compuestos de acuer-
do con sus caractersticas estructurales, y de esa forma los mismos se clasifican en:
1.- cidos Grasos.
2.- Grasas neutras.
3.- Ceras.
4.- Fosftidos de glicerina.
5.- Esfingolpidos.
6.- Lpidos isoprenoides.
Igual que diversa resulta la estructura de los lpidos, consecuentemente sus funciones biol-
gicas tambin sern muy variadas, de ah que a pesar de poder generalizar sealando que las
principales funciones que cumplen estos compuestos en el organismo son las de: servir como
combustible biolgico, constituir la principal reserva de energa del organismo, ser compo-
nentes estructurales importantes de la clula y el organismo y poseer muchos de ellos activi-
dad biolgica propia; deba sealarse que cada grupo clasificatorio adems cumple con fun-
ciones especficas.
Consecuentemente con su definicin, la obtencin de los lpidos tendr que realizarse utili-
zando como fuente algn tejido vivo y como material de extraccin a alguno de los solventes
no polares u orgnicos. A pesar de que en general todos los lpidos son solubles en estos tipos
de solventes resulta que, de acuerdo con las caractersticas estructurales que presentan, sern
ms o menos solubles en los diferentes tipos de solventes orgnicos: as el cloroformo ser
un buen diluente para casi todos ellos, en tanto que el etanol y la acetona sern ms especfi-
cos. La acetona resulta un buen disolvente de los esteroides, en tanto que el etanol lo ser
para los cidos grasos de cadena corta. De esta manera utilizando diferentes combinaciones
de solventes no slo se logra la extraccin de los lpidos a partir de la materia orgnica, sino
que tambin se podrn disear mtodos que permitan la obtencin selectiva de algunos de
ellos.
En la presente prctica utilizaremos la propiedad de solubilidad para aislar a partir del cere-
bro de conejo los lpidos presentes utilizando el equipo de Soxhlet
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Flujo del refrigerante
Flujo del solvente gaseoso
Flujo del solvente lquido
Como se aprecia en el esquema del equipo de Soxhlet: el cloroformo se ubica en el matraz, el
cual a su vez est inmerso en una manta de calefaccin elctrica regulada a una temperatura
de 65C para lograr la ebullicin del solvente. Los vapores del solvente ascienden por la
rama lateral del equipo y alcanzan el condensador, refrigerado por agua corriente, y luego de
volver al estado lquido cae en el vaso central del equipo. En este vaso central se encuentra el
dedal de extraccin de Soxhlet que contiene al tejido objeto de estudio. El solvente se va
acumulando y elevando su nivel hasta alcanzar la parte superior del sifn, que se muestra en
la parte derecha de la figura, y entonces se vaca en el matraz. Con esto se logra un circuito
cerrado de circulacin del solvente que permite que en mltiples ocasiones ste se ponga en
contacto con el material biolgico y as vaya extrayendo sus lpidos constituyentes.
Insertar Soxhlet.
El tejido nervioso tiene un alto contenido lipdico y por
lo tanto constituye una fuente ideal de este material.
Aprovechando esta caracterstica se proceder a extraer
los lpidos presentes en el encfalo utilizando al cloro-
formo como solvente. Con este procedimiento se logra-
r disolver a la mayor parte de los lpidos existentes que
sern colectados en el matraz del equipo y luego por
evaporacin del solvente se obtendrn los mismos.
En la presente prctica adems de realizar algunos expe-
rimentos de carcter general, emplearemos este extracto
para la identificacin de las propiedades fsico qumicas
de los lpidos obtenidos a partir del tejido nervioso.
PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS LPIDOS:
La primera y tal vez ms importante propiedad fsico-qumica de los lpido es su solubilidad.
Esta propiedad ha sido utilizada incluso para la propia definicin de estos compuestos; sin
embargo a pesar de ser cierto que la mayora de los lpidos son solubles en solventes apolares,
tambin es cierto que su solubilidad no es igual para todos ellos. Por ejemplo, existen lpidos
con cierto grado de polaridad y otros que son totalmente apolares; por consiguiente unos
sern ms solubles que otros ante determinado solvente orgnico. Es el caso de algunas
lecitinas que incluso precipitan en presencia de la acetona fra y el de los cidos grasos al ser
puestos en presencia del etanol.
SOLUBILIDAD DE LOS CIDOS GRASOS EN ETANOL
El etanol es un solvente que no es totalmente apolar y algo similar ocurre con los cidos
grasos que poseen en su estructura un grupo carboxilo polar y una cadena lateral
hidrocarbonada de longitud variable. De acuerdo con la longitud de esta cadena lateral y de
la presencia o no de dobles enlaces en la misma variar la solubilidad de los lpidos en el
etanol.
En sentido general se puede afirmar que mientras ms corta sea la cadena lateral de los
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cidos grasos ms solubles sern en el etanol y que a igual nmero de tomos de carbono la
mayor solubilidad en este alcohol se ver en aquellos cidos grasos que posean mayor nme-
ro de dobles enlaces. Esta propiedad la podremos demostrar en la presente prctica.
EMULSIFICACIN Y DETERGENCIA.
Como es de esperar resulta imposible mantener unido un sistema disperso integrado por una
mezcla de agua y grasa. Estos sistemas dispersos son coloides llamados emulsiones y quedan
constituidos por el agua que representa a la fase dispersante y la grasa que se comporta como
la fase dispersa fragmentndose en partculas denominadas micelas. Las dos fases se logran
mantener unidas slo si se contina la agitacin, pues tan pronto como regresan al reposo de
inmediato se separan.
En los seres vivos que son organismo absolutamente dependientes del agua se necesita con-
servar estables a estas emulsiones para lograr tanto el transporte como el metabolismo de las
grasas. Esto se consigue a travs de un mecanismo llamado la detergencia.
La detergencia es el mecanismo a travs del cual la adicin de una sustancia llamada deter-
gente garantiza la estabilidad de una emulsin.
En la figura que se muestra a continuacin se aprecia que al agitar el agua y la grasa se logra
la obtencin de una emulsin; pero cuando se permite el reposo del sistema ambas fases se
separan en un proceso denominado coalescencia; sin embargo al adicionar un detergente la
emulsin se estabiliza al impedir que las micelas coalezcan.
Insertar Emulsin
Los detergentes logran realizar esta actividad gracias a su estructura qumica. Independiente-
mente de su naturaleza qumica, todo detergente tendr una parte apolar y otra polar ionizable,
de manera que son sustancias anfipticas con afinidad tanto por el agua como por las sustan-
cias apolares.
En la siguiente figura se muestra una de las sales biliares, la del cido glicoclico, y en ella
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se aprecia que el anillo del esterano resulta apolar en tanto que el residuo de glicina es alta-
mente polar e incluso inico. Las sales biliares son los principales detergentes biolgicos
Insertar Sal biliar
Como resultado de su carcter
anfiptico las molculas de deter-
gente mantendrn su parte apolar
incorporada en el interior de la
micela mientras que su porcin po-
lar quedar en la superficie de la
misma y en ntimo contacto con el
agua por lo que constituir un me-
dio de unin entre la grasa y el agua; adems si dos micelas de estas se aproximaran la
igualdad de las cargas que mantienen en su superficie hara que ambas se repelieran y as se
logra evitar la coalescencia y por consiguiente estabilizar la emulsin.
En la siguiente figura se aprecia la interaccin entre cuatro micelas que se han formado con
el glicocolato de sodio. Se puede distinguir en el interior de cada una de estas micelas la
presencia de los anillos de esterano mientras que la porcin polar ha quedado en el exterior y
por lo tanto le confiere una carga negativa a toda esta superficie de la partcula. Debe sealar-
se que esta figura es slo una representacin esquemtica del proceso y que el nmero de
molculas de sales biliares que se mantienen unidas a cada micela es muy superior al que se
ha representado en la figura y por consiguiente la carga negativa externa es de magnitud
suficiente como para neutralizar la tendencia natural que tiene la grasa de volver a unirse.
Insertar y editar Miscela
REACCIONES DE HALOGENACIN DE LOS CIDOS GRASOS: